專利名稱：：肺炎鏈球菌3型多糖的純化的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明關于減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的改進方法，所述方法涉及加熱或pH調節(jié)步驟。
背景技術：
：在制備用于預防由有機體的肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌)造成的侵入性疾病的多價肺炎球菌結合疫苗中，使選定肺炎鏈球菌血清型生長以供應制備疫苗所需的多糖。細胞是在大發(fā)酵罐中生長，同時在發(fā)酵結束時通過添加脫氧膽酸鈉(DOC)或替代溶胞劑來引發(fā)溶胞。然后收集溶胞產物培養(yǎng)液用于下游純化并回收圍繞著細菌細胞的莢膜多糖。與載體蛋白結合后，多糖包含在最終疫苗產物中并賦予疫苗的目標種群對選定肺炎鏈球菌血清型的免疫性。盡管以此工藝產生的細胞溶胞產物包含目標多糖，但其還包含大量細胞碎片，其包括DNA、RNA、蛋白質和殘余培養(yǎng)基組份。傳統(tǒng)的處理涉及通過添加乙酸來使溶胞產物的最低限度pH值降低到6.6以幫助溶胞劑和一些雜質沉淀出。將此物質進行離心，隨后過濾以去除標稱尺寸大于0.45pm的大部分固體。然而，所述傳統(tǒng)的處理方法展示最低程度的雜質去除，同時隨后難以去除可溶蛋白以符合純化多糖規(guī)定。在針對某些血清型的試驗中，高含量的污染可溶蛋白尤其成問題。一些血清型、尤其肺炎鏈球菌3型產生大且粘的多糖鏈(例如，對于3型而言，2-3百萬道爾頓(Dalton)的葡萄糖/葡萄糖醛酸的鏈)，當細胞溶胞時這些多糖鏈釋放于生長培養(yǎng)基中。其粘性使其在離心后難以過濾，且在所述情況中，通過純化工藝已不足以去除蛋白質且導致試驗失敗。因此，需要用于自復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產物、尤其含肺炎鏈球菌3型多糖的溶胞產物去除蛋白質雜質的改良方法。
發(fā)明內容提供減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的改進方法。在一種方法中，將含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物在一定溫度下加熱一定時間以足以使溶胞產物中存在的蛋白質變性并使其聚集和沉淀。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)將溶胞產物加熱到至少6(TC并保持至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀；及2)從溶胞產物中分離5出沉淀物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物。在特定實施例中，將溶胞產物加熱到約6(TC至約7(TC并保持約30分鐘至約50分鐘。在另一特定實施例中，將溶胞產物加熱到約65。C并保持約40分鐘。在其它實施例中，分離步驟包含使用膜過濾器、尤其0.45pm孔徑膜過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在另一實施例中，分離步驟包含使用深度過濾器來過濾溶胞產物以去除沉淀物。在另一特定實施例中，從溶胞產物中分離出沉淀物的步驟包含使溶胞產物離心以去除沉淀物。在本發(fā)明另一實施例中，提供一種用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含涉及溶胞產物或分離物的pH調節(jié)的步驟。在此實施例中，pH調節(jié)步驟提高過濾性。在特定實施例中，使溶胞產物或分離物的pH值在過濾之前增加到至少8.0、特定而言在過濾之前增加到約8.0至約8.4之間、且更具體地在過濾之前增加到約8.2。在其它實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、尤其0.45)am孔徑膜過濾器過濾溶胞產物或分離物。在另一實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產物或分離物。在本發(fā)明另一實施例中，提供減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含將溶胞產物加熱步驟與涉溶胞產物或通過溶胞產物離心所產生的分離物的pH調節(jié)的步驟組合。在此實施例中，pH調節(jié)步驟提高過濾性。因此，在一個實施例中，所述方法包含以下步驟l)將溶胞產物加熱到至少6(TC并保持至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀；2)使溶胞產物離心并從溶胞產物中分離出沉淀的蛋白質以產生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8.0;并4)過濾分離物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約6(TC至約70'C并保持約30分鐘至約50分鐘、更具體地加熱到約6(TC并保持約40分鐘。在另一實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到介于約8.0至約8.4之間、具體地約8.2。在其它實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、更具體地0.45pm孔徑膜過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在另一實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在本發(fā)明另一實施例中，提供減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含pH調節(jié)步驟以使蛋白質聚集和沉淀。在此實施例中，所述方法包含以下步驟1)使所述溶胞產物的pH值降低到約3.0至約5.0以使蛋白質聚集和沉淀；2)使所述溶胞產物離心并從所述溶胞產物中分離出沉淀的蛋白質以產生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8.0;及4)過濾分離物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前使溶胞產物的pH值降低到約3.0。在另一特定實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到介于約8.0至約8.4之間、更具體地約8.2。在其它實施例中，pH調節(jié)步驟以使蛋白質聚集和沉淀進一步包含將溶胞產物加熱到至少6(TC并保持至少30分鐘，更具體地加熱到約6(TC至約7(TC并保持約30分鐘至約50分鐘，且甚至更具體地加熱到約6(TC并保持約40分鐘。在其它實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、更具6體地0.45pm孔徑膜過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在另一實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。圖1展示來自血清3型溶胞產物在各種加熱條件和保持時間的實驗室研究的多糖產率。數據展示為未加熱處理樣品值的百分數以展示經處理樣品的蛋白質損失相對百分比(100%相當于無損失)。圖2展示對于血清3型溶胞產物在各種加熱條件和保持時間下的實驗室研究的蛋白質產率。數據展示為未加熱處理樣品值的百分數以展示經處理樣品的蛋白質損失相對百分比(100%相當于無損失)。圖3展示時間(左邊)和溫度(右邊)對血清3型溶胞產物中蛋白質(頂部)和多糖(PS，底部)濃度的作用的經調節(jié)響應曲線圖。"經調節(jié)PSX"和"經調節(jié)蛋白質%"值分別代表多糖和蛋白質濃度在不同時間點和溫度點下相對于時間=0分鐘和室溫(其代表蛋白質和多糖濃度的100%值)的百分數。圖4展示由溫度和時間條件繪制的來自血清3型溶胞產物的總蛋白質百分比的等高線圖。剩余可溶蛋白的百分數展示于曲線圖上的彎曲線條中。在6(TC-7(TC下保持30-50分鐘的范圍由方框突出顯示。圖5展示SDS-PAGE凝膠，其展示可溶蛋白自經熱處理細胞的溶胞產物的去除。未經熱處理的泳道在左邊(IPPPN3-007)且經熱處理的泳道在右邊(IPPPN3-011)。圖6展示經過相同的沉淀物沉降時間之后比較經熱處理(右邊)和未經熱處理(左邊)血清3型溶胞產物的照片。圖7展示血清3型分離物的多糖(PS)濃度、蛋白質濃度、和相對過濾性隨分離物pH值變化的曲線圖。展示對應于5次試驗的5組條形圖。多糖濃度(mg/mL)和蛋白質濃度(g/10L)提供于左邊y軸上。相對過濾性值提供于右邊y軸上，其對應于使約3mL的血清3型分離物通過0.45(am針頭過濾器所需的相對力，其等級為1到5(1=容易，5=困難)。圖8展示依據分離物pH值比較血清3型分離物樣品通過深度過濾器隨時間的流率的曲線圖。流率(y軸)是通過計算每分鐘的過濾比率來測量，其中將時間(以分鐘表示)除以在這一分鐘內通過過濾器的分離物的總重量(以克表示)(比率越低，流率越高)。將分離物樣品調節(jié)至不同pH值(5.0至8.5)并使其在不同恒定壓力條件(5-20磅/平方英寸(psi))下通過過濾器。具體實施例方式本發(fā)明提供用于減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的改進方法，所述方法涉及與溶胞后加熱或pH調節(jié)有關的步驟。在某些方法中，將溶胞產物在一定溫度下加熱一定時間以足以使溶胞產物中存在的蛋白質變性并使其聚集和沉淀。在其它方法中，對溶胞產物、或通過使所述溶胞產物離心所產生的分離物進行pH調節(jié)以提高過濾性或使蛋白質聚集和沉淀。在其它方法中，將加熱和pH調節(jié)步驟合并以使蛋白質聚集和沉淀以及提高溶胞產物或分離物的過濾性。所述方法允許產生實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物或分離物。本文所用術語"實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物"或"實質上純的含血清3型多糖的分離物"是指已去除蛋白質而使得與去除蛋白質之前溶胞產物或分離物的蛋白質濃度相比溶胞產物或分離物的相對蛋白質濃度小于約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%或約1%蛋白質的細胞肺炎鏈球菌血清3型溶胞產物或分離物。用于量化細胞溶胞產物或分離物中的蛋白質濃度的方法已為此項技術習知且包括(例如)十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析、色譜和電泳(參見，例如道池(Deutscher，M.P.)(編輯)的蛋白質純化手冊(GwWeto尸Mn/cflriow)，圣地亞哥(SanDiego):美國學術出版社(AcademicPress,Inc.)(1990))。在一個實施例中，本發(fā)明提供包含加熱步驟用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物中的蛋白質雜質的方法。通過暴露于熱破壞蛋白質的天然結構且使其變性而不會影響多糖。隨后，變性蛋白聚集并沉淀，此改良溶胞產物的分離且能夠通過離心或過濾容易地去除固體。此加熱步驟將有效用于自含大量可溶蛋白質雜質的生物混合物回收或純化任何熱穩(wěn)定多糖且因此可用于其中可溶蛋白含量尚成問題的任何液相(例如，含DNA、RNA、多糖、寡糖、糖、脂肪酸和脂質的生物混合物)。因此，在一個實施例中，本發(fā)明提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含以下步驟1)將所述溶胞產物加熱到至少50°C、至少55°C、或至少6CTC并保持至少15或至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀；及2)從溶胞產物中分離出沉淀物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物。在特定實施例中，將溶胞產物加熱到約50^至約80°(:并保持約15-約60分鐘。在另一特定實施例中，將溶胞產物加熱到約6(TC至約7CTC之間并保持約30分鐘至約50分鐘。在另一特定實施例中，將溶胞產物加熱到約65'C并保持約40分鐘。如下文在試驗章節(jié)中更詳細的闡述，對于熱穩(wěn)定血清3型多糖，通過在65°C下加熱40分鐘去除了超過80%的蛋白質，同時多糖的損失最少。在其它實施例中，分離步驟包含離心或過濾以去除或減少溶胞產物中的蛋白質。特別地，在一個實施例中，分離步驟包含使用膜過濾器、尤其0.45pm孔徑膜過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在另一實施例中，分離步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。通常用于高體積過濾工藝(例如血清3型多糖的純化)的過濾器包括膜(或表面)過濾器和深度過濾器。膜過濾器主要通過尺寸排除起作用，其中欲過濾溶液中大于膜過濾器設定孔徑的所有雜質將截留在過濾器表面上。相反，深度過濾器包含具有使欲過濾溶液通過的隨意多孔結構的纖維或粒狀基質，且主要通過在整個基質深度上對雜質的隨意吸附和機械夾帶起作用。在本發(fā)明方法中，膜過濾器和深度過濾器二者可組合使用，其中深度過濾器收集較大雜質而表面過濾器捕獲較小雜質。在本發(fā)明另一實施例中，還提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或通過使所述溶胞產物離心所產生的分離物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含涉及溶胞產物或分離物的pH調節(jié)的步驟。在此實施例中，pH調節(jié)步驟提高過濾性。如本文所用，含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物的"過濾性"是指溶胞產物或分離物通過過濾器(例如膜過濾器或深度過濾器)的能力。因此，溶胞產物或分離物的經改良過濾性與(例如)以下有關溶胞產物或分離物通過過濾器的流率增加，使溶胞產物或分離物對過濾器的堵塞減少，或使給定體積的溶胞產物或分離物通過過濾器所需的壓力降低。從含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中去除雜質的傳統(tǒng)方法涉及通過添加乙酸使溶胞產物的最低pH值降低到6.6，隨后連續(xù)離心并濾除大于0.45(im的物質。此處理方法展示了最低程度的雜質去除，并且隨后在將產物送至純化處理之前很難通過膜過濾器或深度過濾器去除可溶蛋白。然而，本發(fā)明方法涉及以下發(fā)現此高分子量多糖的過濾性可直接隨pH值的改變而改變，且增加溶胞產物或分離物的pH值可提高過濾性而多糖血清3型的分子量大小或功能性無明顯損失。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或通過使溶胞產物離心所產生的分離物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含在過濾之前使分離物或溶胞產物的pH值增加到至少8.0的步驟。在另一實施例中，使分離物或溶胞產物的pH值在過濾之前增加到約8.0至約8.4、更具體地約8.2。溶胞產物或分離物的pH調節(jié)之后的過濾可涉及使用膜過濾器、尤其0.45)im孔徑膜過濾器過濾溶胞產物或分離物。在另一實施例中，過濾溶胞產物或分離物可涉及使用深度過濾器。在其它實施例中，提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含將溶胞產物加熱步驟與涉及溶胞產物pH調節(jié)的步驟組合。在一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)將溶胞產物加熱到至少50。C、至少55。C、或至少60'C并保持至少15或至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀；2)使所述溶胞產物離心并從所述溶胞產物中分離出沉淀的蛋白質以產生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8.0;和4)過濾分離物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約5(TC至約80'C并保持約15-約60分鐘。在另一特定實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約6(TC至約7(TC并保持約30分鐘至約50分鐘。在其它實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約65t:并保持約40分鐘。在另一特定實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到約8.0至約8.4、更具體地約8.2。在其它實施例中，過濾步驟涉及使用膜過濾器、尤其0.45nm孔徑膜過濾器過濾分離物。在另一實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在其它實施例中，提供用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含pH調節(jié)步驟以使蛋白質聚集并沉淀。在一個實施例中，所述方法包含以下步驟1)使所述溶胞產物的pH值降低到小于約5.0、4.5、4.0、3.5、或3.0、或降低到約3.0至約5.0以使蛋白質聚集和沉淀；2)使所述溶胞產物離心并從所述溶胞產物中分離出沉淀的蛋白質以產生分離物；3)使分離物的pH值增加到至少8.0;和4)過濾分離物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的分離物。在特定實施例中，在離心之前使溶胞產物的pH值降低到約3.0。在另一特定實施例中，在過濾之前使分離物的pH值增加到約8.0至約8.4之間、更具體地約8.2。在特定實施例中，過濾步驟包含使用膜過濾器、更具體地0.45pm孔徑膜過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在另一實施例中，過濾步驟包含使用深度過濾器過濾溶胞產物以去除沉淀物。在其它實施例中，用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的方法包含pH調節(jié)步驟以使蛋白質聚集和沉淀，其進一步包含將所述溶胞產物加熱到至少50°C、至少55'C或至少60'C并保持至少15或至少30分鐘以使蛋白質聚集并沉淀。在特定實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約50'C至約8(TC并保持約15-約60分鐘。在另一特定實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約6(TC至約70。C并保持約30分鐘至約50分鐘。在其它實施例中，在離心之前將溶胞產物加熱到約65'C并保持約40分鐘。提供以下實例以舉例說明而非加以限制。試驗肺炎鏈球菌3型產生極大且粘的多糖，當細胞溶胞時所述多糖釋放于生長培養(yǎng)基中。此溶胞目前是在發(fā)酵結束時利用脫氧膽酸鈉(DOC)來誘導。3型多糖看起來在寬溫度和pH值范圍內極其穩(wěn)定；然而，其粘性使其在離心后難以過濾，此導致無細胞培養(yǎng)液(CFB)的回收率低。以下實例闡述關于溶胞后加熱以使蛋白質變性并沉淀出以及pH調節(jié)以提高溶胞產物過濾性的研究。實例1.加熱步驟實施用于肺炎鏈球菌血清3型回收的加熱步驟是受需要在純化步驟之前降低蛋白質負載的驅使。經純化多糖的批料易于因殘余蛋白質含量高于5%w/w蛋白質/多糖的設定規(guī)定含量而使得批料不合格。因此實施以下試驗研究以表征在肺炎鏈球菌血清3型的純化和回收中使用加熱步驟的有效性和范圍。包括此加熱步驟的目的是使蛋白質含量減少同時維持高多糖含量。在實驗室中，將從中試設備試驗獲得的發(fā)酵細胞溶胞產物物質按等份加入獵鷹(Falcon)TM試管(碧迪生物科學公司(BDBiosciences),貝德福德(Bedford),麻薩諸塞州(MA))中并在水浴中加熱到不同溫度。所研究的溫度從5(TC至80'C，同時保持時間從15分鐘至240分鐘。將對照樣品置于周圍室溫(約2rC)下。然后使所有樣品在10樣品離心并使其通過0.45pm針頭過濾器(HTTuffryn⑧膜25mm針頭過濾器，低蛋白質結合，頗爾生命科學(PallLifeSciences),AnneArbor,MI)以提供用于多糖和蛋白質分析的物質。實驗數據是由統(tǒng)計軟件包(Cornerstone,來自應用系統(tǒng)科技公司(AppliedSystemsTechnologies,Inc.),Dunnellon,FL)來分析以確定溫度和時間對多糖和蛋白質含量的影響。多糖和蛋白質分析多糖分析是通過HPLC-SEC(高效液相色譜-尺寸排除柱)使用此項技術中已知的標準方法來實施(參見例如，艾吉拉(Aquilar，M.)"肽和蛋白質的HPLC:方法和方案(HPLCofPeptidesandProteins:MethodsandProtocols)"，Totowa，NJ:HumanaPress(2004))。圖l展示來自不同加熱時間的實驗室研究的多糖產率。所報告的數據是對照多糖含量的百分數，其中100%表示無損失。如圖1中所示，多糖產率相對于加熱時間和溫度而言穩(wěn)定。還收集了中試規(guī)模數據且在圖1中以"IPP"縮寫標明的數據點展示。所列出的時間反映了加熱時期、在所標明狀態(tài)下的加熱保持時期、和冷卻時期。與在實驗室中進行加熱相反，這些樣品是在實際發(fā)酵罐中熱處理之后獲得。在以中試規(guī)模測試的溫度和時間范圍內(30-50分鐘和60。C至7(TC),多糖損失在0-18%范圍內，其中大多數測試的損失為10%或更少。這在此物質下游處理的可接受范圍內。蛋白質分析是通過使用此項技術中已知的標準SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)方法來實施(參見例如，沃可(Walker，J.M.)"蛋白質技術手冊(TheProteinProtocolsHandbook)"Totowa，NJ:HumanaPress(2002))。凝膠的分析是借助凝膠成像系統(tǒng)(具有LabworksTMV.3軟件的UVP成像儀，UVP公司，厄普蘭德，加利福尼亞州(Upland，CA))以針對蛋白質標準物解釋總帶(泳道)密度。如圖2中所示，以實驗室規(guī)模和中試規(guī)模(以"IPP"縮寫標明的數據點)研究從5(TC至8(TC的溫度。蛋白質數據展示為未經加熱處理樣品的對照值的百分數以展示經處理樣品的蛋白質損失相對百分比。通過在6(TC的溫度下進行熱沉淀，15分鐘的加熱時間足以去除60%的可溶蛋白(參見圖2)。盡管在5(TC和55'C下出現明顯蛋白質減少，但由于在60'C下蛋白質去除量較高故將此溫度設定為中試設備作業(yè)的最低溫度。圖3展示由時間和溫度繪制的蛋白質和多糖濃度的經調節(jié)響應曲線圖。所展示的數據代表蛋白質和多糖濃度在不同時間點和溫度點下相對于時間=0分鐘和室溫(其代表蛋白質和多糖的100%值)的百分數。如圖3中所示，保持溫度對可溶蛋白去除具有重要影響，而保持超過15分鐘的持續(xù)時間并不重要。對于多糖(PS)產率而言，時間和溫度二者皆對PS損失展示有限的影響(<20%損失，這是下游處理可接受的)。圖4展示由溫度和時間條件繪制的來自血清3型溶胞產物的總蛋白質百分比的等高線圖。剩余可溶蛋白的百分數展示于曲線圖上的彎曲線條中。6(TC-70'C下保持30-50分鐘的范圍由方框突出顯示且代表經選定用于實施本文所述的加熱步驟的優(yōu)選11范圍。然而，如上文所述，還分析了更寬的范圍且所述范圍也展示有效。圖5展示以中試規(guī)模測試加熱步驟之后可溶蛋白的SDS-PAGE凝膠。左邊的凝膠展示來自無加熱步驟的中試規(guī)模發(fā)酵批料(IPPPN3-007)的結果且展示整個回收過程的完整蛋白質含量(pH調節(jié)前、pH調節(jié)后、離心后、和pH調節(jié)后的罐)。"pH調節(jié)后的罐"是指在過濾之前調節(jié)至給定pH值之后從分離物貯存罐中取出的樣品。使用IOO千道爾頓(KD)切向流純化超濾(UF)處理去除小于100KD的溶質，其是通過使用連續(xù)循環(huán)和過濾而逐漸用緩沖溶液代替初始懸浮介質并隨后濃縮溶液來實施。此UF處理步驟之后，據報告批料IPPPN3-007的蛋白質含量為31%蛋白質/多糖(以w/w計)。整個純化處理之后的最終蛋白質含量為9.9%(相對于多糖的w/w)，這使得所述批料不符合最終批料濃縮物(FBC)中的蛋白質《5X的規(guī)定。對于批料IPPPN3-011，在溶胞產物保持之后且在下游處理之前包括6(TC下保持30分鐘的加熱步驟。100KUF過濾之后的蛋白質含量為6.7%，且FBC蛋白質含量為2.5X，其符合FBC藥物中間體規(guī)定。如圖5中右邊的凝膠圖像所示，在回收作業(yè)期間的加熱步驟使得蛋白質含量顯著降低。關于此加熱步驟的中試規(guī)模數據的匯總還展示在表1中。試驗-001、-004、-005、-007和-013未使用加熱步驟。在這些試驗中，僅-001和-004符合55^w/w的目標蛋白質規(guī)定，此表明純化處理依舊難以除去UF處理步驟后的20%至35%的蛋白質負載。如表l中試驗-011、-012、-014、-015和-017所示納入加熱保持步驟，UF處理步驟之后蛋白質負載降低到3.1%至6.7%，其中純化多糖中的最終蛋白質含量為0.6%至2.5%。表1.在各種加熱條件和保持時間下超濾之后和最終批料濃縮物(FBC)中的蛋白質百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施加熱步驟還通過增加蛋白質聚集提高了分離效率，此允許更有效的分離。此步驟的作用繪示于圖6中，其中照片提供于周圍條件下過夜無攪拌保持之后未經加熱(左邊)和經加熱(右邊)細胞溶胞產物的比較。熱處理之后的介質明顯更清澈，此反映出蛋白質的更多聚集和沉淀。如以上所闡述的數據所示，包括加熱步驟對于去除蛋白質雜質來制造多糖來說很重要。最終多糖符合S5%W/W(蛋白質/多糖)的藥物中間體釋放標準，此表明產物相對于熱處理的穩(wěn)定性。實例2.pH調節(jié)和過濾步驟Prevna,疫苗中所包括的肺炎鏈球菌多糖的傳統(tǒng)過濾涉及使細胞溶胞產物連續(xù)離心，隨后深度過濾和膜過濾。如上所述，肺炎鏈球菌3型是大的多糖，其在溶液中有粘性且在傳統(tǒng)處理條件下不能充分過濾。由于這些問題，已進行試驗來改變此多糖的過濾特性。因此，實施研究來確定提高血清3型多糖溶液過濾性的方法。使用pH值作為變量，在實驗室中實施pH值對血清3型溶胞產物溶液的蛋白質去除和隨后其通過25mm直徑0.45pmHTTuffryn⑧針頭過濾器(頗爾生命科學(PallLifeSciences),ArmeArbor，MI)的過濾性的影響的初步研究。在離心之前，使用乙酸或硫酸將血清3型的發(fā)酵溶胞產物樣品的pH值調節(jié)至6.6(兩次試驗)、5.0(兩次試驗)、或3.0(—次試驗)試圖去除可溶蛋白。將溶胞產物離心并按等份加入獵鷹(Falcon)TM試管(碧迪生物科學公司(BDBiosciences),貝德福德(Bedford)，麻薩諸塞州(MA))，所述試管處于如下四種條件中的一種(其中使用3NNaOH(氫氧化鈉溶液)調節(jié)pH值)1)對照(無pH調節(jié))；2)pH值調節(jié)至7.0;3)pH值調節(jié)至8.0;和4)pH值調節(jié)至9.0。然后利用過濾約3mL物質所需的相對力使分離物通過0.45pm針頭過濾器。以上所述五次試驗的結果展示于圖7中，其展示血清3型分離物的多糖(PS)濃度、蛋白質濃度、和相對過濾性隨分離物pH值變化的曲線圖。多糖濃度(mg/mL)和蛋白質濃度(g/10L)值提供于左邊y軸上。相對過濾性值提供于右邊y軸上，其對應于使約3mL的血清3型分離物通過0.45pm針頭過濾器所需的相對力，其等級為1到5(1=容易，5=困難)。如圖7中所示，在除一個以外的所有各次試驗中較高pH值與提高的分離物過濾性有關。圖7中所展示的結果還表明，3.0的極低pH值可成功去除蛋白質，但與過濾難度增加有關。利用已確定的pH值的影響，接著實施受控實驗室研究來確定pH值對過濾能力的影響。自中試設備試驗獲得分離后材料并在實驗室中再次離心。將溶胞產物分成數份并在5.0至8.5的范圍內進行pH調節(jié)。將溶胞產物放置于施加恒定壓力的壓力容器中。使溶胞產物通過CUNO60SP深度過濾器(美國坤諾公司(CUNOInc.)，梅里登(Meriden)，康涅狄格州(CT))的管道并分析過濾器的能力。針對所測試的每一pH值(5.0至8.5)且在不同恒定壓力條件(5-20磅/平方英寸(psi))下實施這一過程。結果展示于圖8中，圖8依據分離物pH值比較了血清3型分離物樣品通過深度過濾器隨時間的流率。流率(y軸)是通過計算每分鐘的過濾比率來測量，其中將時間(以分鐘表示)除以在這一分鐘內通過過濾器的分離物的總重量(以克表示)(比率越低，流率越高)。如圖8所示，與在5.0或6.0的較低pH值下處理相比，在相同恒定壓力條件(IOpsi)下在7.0至8.5的較高pH值下處理獲得較快流率。在pH8.0下，10psi或20psi的恒定壓力與5psi相比也與較快流率有關。然后，實施納入上述pH調節(jié)步驟的中試規(guī)模試驗(中試規(guī)模試驗列于下表2中)。使含肺炎鏈球菌3型接種物的種子罐在發(fā)酵罐中生長。使細胞以化學方式溶胞并將溶胞產物離心或在離心之前進行熱處理。離心之后，調節(jié)pH值(試驗IPPPN3-015除外)并通過深度過濾器和0.45pm膜過濾器過濾溶胞產物，然后送至下游用于純化。將各次試驗中處理溶胞產物所需過濾器的數量用作過濾性的量度(過濾性越低，越頻繁堵塞過濾器且處理溶胞產物所需過濾器的數量越高)。表2展示，在有或沒有熱處理的情況下，僅需要一個深度過濾器和一個膜過濾器來處理各次試驗中調節(jié)至7.5或更高的不同pH值的溶胞產物。利用試驗-015，評價pH6.6對過濾性的影響。如所示，對于試驗-015，僅處理37L就需要三個過濾器組。即使在存在加熱步驟來去除蛋白質的情況下，試驗-015也獲得此結果。將來自試驗-015的剩余溶胞產物物質調節(jié)至pH8.2之后，一組過濾器即可處理剩余的68L。表2在中試規(guī)模下經pH調節(jié)的溶胞產物的過濾性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>116553/40/43*離心之前經熱處理的溶胞產物。根據圖7和圖8中所呈現的實驗室數據和中試設備設施的pH調節(jié)能力，確定處理作業(yè)的優(yōu)選pH值范圍為8.2±0.2以提高血清3型溶胞產物的過濾性。本文所用冠詞"一"("a"和"an")是指一個或一個以上(即，指至少一個)的所述冠詞的文法賓語。例如，"一個元件"意指一個或一個以上的元件。說明書中所提及的所有出版物和專利申請案均表現出本發(fā)明所屬領域的技術人員的水平。所有出版物和專利申請案均以引用的方式并入本文中，其程度如同將每一個別出版物或專利申請案特定地及個別地所指以引用方式并入本文中一樣。盡管為了清晰理解起見已通過例證和實例對本發(fā)明進行了較詳細的描述，但是顯然可以在隨附權利要求的范圍內實施某些改變或修改。權利要求1、一種用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)溶胞產物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含以下步驟a)將所述溶胞產物加熱到至少60℃并保持至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀；及b)從所述溶胞產物中分離出沉淀物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物。2、如權利要求l所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產物加熱到約6(TC至約70。C。3、如權利要求2所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產物加熱約30分鐘至約50分鐘。4、如權利要求3所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產物加熱到約65'C并保持約40分鐘。5、如權利要求l所述的方法，其中步驟b)包含過濾所述溶胞產物以自所述溶胞產物中去除沉淀物。6、如權利要求5所述的方法，其中所述溶胞產物是使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾。7、如權利要求6所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45pm孔徑膜過濾器。8、如權利要求l所述的方法，其中步驟b)包含使所述溶胞產物離心以自所述溶胞產物中去除沉淀物。9、一種用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含以下步驟a)使所述溶胞產物或分離物的pH值增加到至少8.0;及b)過濾所述溶胞產物或分離物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物或分離物。10、如權利要求9所述的方法，其中在過濾之前使所述溶胞產物或分離物的pH值增加到約8.0至約8.4。11、如權利要求IO所述的方法，其中在過濾之前使所述溶胞產物或分離物的pH值增加到約8.2。12、如權利要求9所述的方法，其中所述溶胞產物是使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾。13、如權利要求12所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45pm孔徑膜過濾器。14、一種用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含以下步驟a)將所述溶胞產物加熱到至少6(TC并保持至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀；b)使所述溶胞產物離心并從所述溶胞產物中分離出沉淀的蛋白質以產生分離物；c)使所述分離物的pH值增加到至少8.0;及d)過濾所述分離物其中產生實質上純的含血清3型多糖的分離物。15、如權利要求14所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產物加熱到約6(TC至約70°C。16、如權利要求14所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產物加熱約30分鐘至約50分鐘。17、如權利要求14所述的方法，其中步驟a)包含將所述溶胞產物加熱到約6(TC并保持約40分鐘。18、如權利要求14所述的方法，其中步驟c)包含使所述分離物的pH值增加到約8.0至約8.4。19、如權利要求18所述的方法，其中步驟c)包含使所述分離物的pH值增加到約8.2。20、如權利要求14所述的方法，其中步驟d)包含使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾所述分離物。21、如權利要求20所述的方法，其'中所述膜過濾器是0.45pm孔徑膜過濾器。22、一種用于減少或去除含血清3型多糖的細胞肺炎鏈球菌溶胞產物中的蛋白質雜質的方法，所述方法包含以下步驟a)使所述溶胞產物的pH值降低到約3.0至約5.0以使蛋白質聚集和沉淀；b)使所述溶胞產物離心并從所述溶胞產物中分離出沉淀的蛋白質以產生分離物；c)使所述分離物的pH值增加到至少8.0;及d)過濾所述分離物；其中產生實質上純的含血清3型多糖的分離物。23、如權利要求22所述的方法，其中步驟a)包含使所述溶胞產物的pH值降低到約3.0以使蛋白質聚集和沉淀。24、如權利要求22所述的方法，其中步驟c)包含使所述分離物的pH值增加到約8.0至約8.4。25、如權利要求24所述的方法，其中步驟c)包含使所述分離物的pH值增加到約8.2。26、如權利要求25所述的方法，其中所述分離物是使用至少一種選自由膜過濾器和深度過濾器組成的群組的過濾器來過濾。27、如權利要求26所述的方法，其中所述膜過濾器是0.45pm孔徑膜過濾器。28、如權利要求22所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產物加熱到至少60'C并保持至少30分鐘。29、如權利要求22所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產物加熱到約60。C至約70°C。30、如權利要求22所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產物加熱約30分鐘至約50分鐘。31、如權利要求22所述的方法，其中步驟a)進一步包含將所述溶胞產物加熱到約60'C并保持約40分鐘。全文摘要本發(fā)明提供減少或去除含血清3型多糖的復雜細胞肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)溶胞產物或分離物中的蛋白質雜質的改進方法，所述方法涉及與溶胞后加熱或pH調節(jié)有關的步驟。在某些方法中，將所述溶胞產物在一定溫度下加熱一定時間，所述溫度和時間足以使所述溶胞產物中存在的蛋白質變性并使其聚集和沉淀。在一個實施例中，將所述溶胞產物加熱到至少60℃并保持至少30分鐘以使蛋白質聚集和沉淀，更具體地加熱到約60℃至約70℃并保持約30分鐘至約50分鐘，且甚至更具體地加熱到約65℃并保持約40分鐘。在其它方法中，使所述溶胞產物或分離物的pH值增加到至少8.0、更具體地約8.0至8.4且甚至更具體地約8.2以提高過濾性。在其它方法中，將加熱和pH調節(jié)步驟組合以使蛋白質聚集和沉淀，以及提高溶胞產物或分離物的過濾性。在其它方法中，使所述溶胞產物或分離物的pH值降低到約3.0至約5.0以使蛋白質聚集和沉淀。所述方法允許制造實質上純的含血清3型多糖的溶胞產物或分離物。文檔編號C12P19/04GK101522906SQ200780037800公開日2009年9月2日申請日期2007年10月9日優(yōu)先權日2006年10月10日發(fā)明者埃里克·赫勒·休斯,布賴恩·道格拉斯·巴勒爾,李初順申請人:惠氏公司