專利名稱：：用于乙醇生產(chǎn)的再工程改造細(xì)菌的制作方法用于乙醇生產(chǎn)的再工程改造細(xì)菌相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2006年8月9日提交的美國(guó)系列號(hào)60/836,726的權(quán)利，60/836,726的全部?jī)?nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。政府資助研究本發(fā)明的資助部分上是由美國(guó)政府以美國(guó)農(nóng)業(yè)部01-35504-10669號(hào)資金和00-52104-9704號(hào)資金及美國(guó)能源部FG02-96ER20222號(hào)資金提供的。美國(guó)政府可在本發(fā)明和對(duì)本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)纖維素生物質(zhì)代表著供生物轉(zhuǎn)化成燃料和化工品的可再生碳水化合物來源，因此是吸引人的對(duì)基于石油的技術(shù)的替代(Arntzen和Dale,1999)。但是人們認(rèn)識(shí)到，從生物質(zhì)進(jìn)行的乙醇商品生產(chǎn)要達(dá)到其最大潛力，需要較高的速率和效率、簡(jiǎn)單的工藝和廉價(jià)的培養(yǎng)基(Ingram等.1998;Zhang&Greasham1999)。諸如大腸桿菌(EscAen'c/n'aCo")的細(xì)菌具有代謝木質(zhì)纖維素中含有的所有糖成分的天然能力。早先時(shí)候，環(huán)境耐久力、寬廣底物范圍和在礦物鹽培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)的能力這些特性被認(rèn)為是重要的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致了大腸桿菌被選擇作為代謝工程的平臺(tái)生物(platformorganism)(Alterthum&Ingram1989;Zhou等.2006a)。菌抹KOI1(ATCC55124)。因此大腸桿菌^皮通過將兩個(gè)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z;womow(Xswo&fo)基因(prfc,acZ/L&)整合到大腸桿菌的/y詔啟動(dòng)子后面來進(jìn)行工程改造生產(chǎn)乙醇(Ohta等.1991)。盡管大腸桿菌菌林的原養(yǎng)型特性，但是使用KOll菌抹還是需要復(fù)雜和昂貴的營(yíng)養(yǎng)物才能快速和有效地生產(chǎn)高乙醇濃度(Asghari,等.1996;Martinez等.1999;Underwood等.2004;York&Ingram1996)。盡管發(fā)現(xiàn)甜菜堿是有幫助的，但到目前為止，所作出的開發(fā)改進(jìn)的培養(yǎng)基和遺傳修飾的努力，在消除對(duì)復(fù)雜和昂貴的營(yíng)養(yǎng)物的要求方面基本上是不成功的(Underwood等.2004)。最近，大腸桿菌菌抹KOll被再工程改造(re-engineered),以快速和有效地在礦物鹽培養(yǎng)基中以高產(chǎn)率發(fā)酵糖類生成D(-)-乳酸(Zhou等.2006a和2006b)。但是，為了充分實(shí)現(xiàn)重組產(chǎn)乙醇細(xì)菌菌抹擔(dān)當(dāng)乙醇來源的潛力，需要這種細(xì)菌的既能在廉價(jià)礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)又能有效生產(chǎn)乙醇的新的改進(jìn)的菌抹。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分上基于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行代謝工程改造以生產(chǎn)乙醇的這個(gè)新策略的發(fā)現(xiàn)。具體的說，本發(fā)明提供了能克服低乙醇產(chǎn)率和復(fù)雜培養(yǎng)基要求的工程改造策略，低乙醇產(chǎn)率和復(fù)雜培養(yǎng)基要求之前約束了對(duì)細(xì)菌進(jìn)行工程改造以在礦物鹽培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙醇?，F(xiàn)有技術(shù)下的重組產(chǎn)乙醇細(xì)菌需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物來快速和有效地生產(chǎn)高乙醇濃度。大腸桿菌菌抹KOll(ATCC55124)是這種現(xiàn)有技術(shù)下的重組細(xì)菌的代表。菌抹KOU被通過將兩個(gè)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因(pdc，^//LB)整合到大腸桿菌的；_/7萬啟動(dòng)子后面來進(jìn)行工程改造生產(chǎn)乙醇(Ohta等.1991)。盡管菌林KOll的原養(yǎng)型特性及其代謝木質(zhì)纖維素中的所有糖成分的天然能力，但是使用它還是需要復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)物才能快速和有效地生產(chǎn)高乙醇濃度(Asghari,等.1996;Martinez等.1999;Underwood等.2004;York&Ingram1996)。盡管不想拘泥于理論，但本發(fā)明人還是確定出以下四個(gè)會(huì)造成重組生物如KOll在礦物鹽培養(yǎng)基中性能受限的因素(1)武斷選擇;y5作為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇生產(chǎn)基因在KOll中的整合位點(diǎn)；(2)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇生產(chǎn)基因不成套；(3)存在著抗生素抗性基因；和(4)存在著一14個(gè)或多個(gè)編碼參與干擾或以別的方式減少所產(chǎn)生的乙醇量的替代性和/或竟?fàn)幮源x途徑的酶的基因。本發(fā)明人已經(jīng)克服了這四個(gè)因素。由此，本發(fā)明提供能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和發(fā)酵并快速和有效地高濃度生產(chǎn)乙醇的重組細(xì)菌。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含整套(aflillcomplementof)異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到核糖體RNA操縱子中。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記被去除。在另外又一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因被失活。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因和一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因的重組細(xì)菌。在前述本發(fā)明各方面的每一個(gè)的實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌的一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)基因是異源基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含整合到核糖體RNA操縱子中的整套異源產(chǎn)乙醇基因和一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物，且其中重組細(xì)菌不含抗生素抗性標(biāo)記，且一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因被失活。15在某些實(shí)施方案中，核糖體RNA操縱子包含選自rmj、〃/五、rmC、rmD、rmG和？r"i7的基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，核糖體RNA操縱子包含rr/f基因。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明任何方面的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因包含;^c、^Z/l4和^//^。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因衍自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌已去除抗生素抗性標(biāo)記。在具體的實(shí)例中，從重組細(xì)菌去除的抗生素抗性標(biāo)記選自安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨千青霉素和氯霉素。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)在本發(fā)明的重組細(xì)菌中被失活的基因編碼參與NADH氧化的發(fā)酵途徑的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因是該細(xì)菌的內(nèi)源基因。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因是該細(xì)菌的異源基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因選自包含/0"-//^基因區(qū)域、W/l4、acW、t^/^、/W操縱子、ow」5和wg^的基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，adU基因、aW五基因、WA基因和/W操縱子編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，/0^4-zj/75基因區(qū)域、W/l4、acW、aW五、包含/W操縱子的基因和mg^是內(nèi)源基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，c"^4S基因是異源基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，W/l4基因被缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，W/l4基因是內(nèi)源基因。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組細(xì)菌還包含基因區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，/0^4-z/ZS基因區(qū)域是內(nèi)源基因區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，/od-;/5基因區(qū)域來自大腸桿菌。/oo4-//W基因區(qū)域首先被缺失以阻斷過量曱酸和乙酰-coA的產(chǎn)生，這一產(chǎn)生會(huì)通過用乙酰-coA作為底物每個(gè)乙醇消耗兩個(gè)NADH而降低產(chǎn)率。16在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因包含e^Z基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，e^Z基因是異源基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，e^Z基因來自惡臭假單胞菌(Rsewdomo"aspw"V/a)。e^Z基因能幫助減少乙酸乙酯這種非常微量的不需要的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在最終純化過程中從乙醇分離乙酸乙酯會(huì)增加工藝成本。產(chǎn)率變化微不足道，但純化成本可能很大。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因包含/ad基因和/ac;r基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，/acj基因和/acr基因是內(nèi)源基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，/a"基因和基因來自大腸桿菌。在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，mg^基因被缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，mg^基因是內(nèi)源基因。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因包含ce/y基因。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，ce/y基因是異源基因。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，ce/F基因來自菊歐文菌(五nWm'a根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，重組細(xì)菌在厭氧條件下生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。重組細(xì)菌還能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，礦物鹽培養(yǎng)基含有木糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有至少約7%木糖。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有甜菜堿。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌所產(chǎn)生的乙醇占在礦物鹽培養(yǎng)基中在厭氧條件下的總非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的40%以上。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)方面，重組細(xì)菌衍自革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是選自以下的革蘭氏陰性細(xì)菌不動(dòng)桿菌屬(^a'w"o^3C^")、葡糖桿菌屬(G/wcowo6(3"er)、埃希氏菌屬(EscAeWc/'a)、地桿菌屬(Geometer)、希瓦氏菌屬(57ze麗we〃a)、沙門17氏菌屬(5"a/w0"e〃a)、志賀氏菌屬OS/n'ge〃a)、腸桿菌屬(五"etera6a"e。、檸檬酸桿菌屬(Cz>oZ^cfe。、歐文氏菌屬(Sm7'm'a)、沙雷氏菌屬(Sm"a"a)、變形菌屬(/VWa^)、哈夫尼亞菌屬(/fo/m力)、耶爾森氏菌屬(Ferw'm'a)、摩才艮氏菌屬(Morg朋e〃a)、愛德華氏菌屬(五(ivvan^/e〃a)和克雷伯氏菌屬(尺/6&^/^)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，細(xì)菌是大腸桿菌C&cAen'c/'aco/0。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，細(xì)菌是催產(chǎn)克雷伯氏在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌是選自以下的革蘭氏陽性細(xì)菌芽孢桿菌屬(Bacz'〃t/力、才炎菌屬(C7oWnWwm)、孝奉狀桿菌屬(C。o^e6acten'wm)、土芽孢桿菌屬(GeoZad肌力、乳桿菌屬CLacto6""7fo)、乳球菌屬(Z/a"ococcw力、酒3求菌屬(Oewococcw力、鏈3求菌屬(6^e/tococcw力和真桿菌屬(五wZ)a"en^m)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌衍自大腸桿菌菌抹KOll(ATCC55124)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌衍自大腸桿菌菌抹SZ110(NRRLB-30951)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，重組細(xì)菌是大腸桿菌菌抹LY165(NRRLB-30952)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，重組細(xì)菌是大腸桿菌菌抹LY168(NRRLB-30953)。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供以下新的重組生物大腸桿菌菌林SZ110(NRRLB-30951);大腸桿菌菌抹LY165(NRRLB-30952);和大腸桿菌菌抹LY168(NRRLB-30953);大腸桿菌菌林BW34。在其他相關(guān)的方面，本發(fā)明提供以下重組大腸桿菌菌抹LY149、LY151、LY158、LY159、LY160、LY160im、LY161、LY163、LY168im、LY169、LY170、LY172、LY172im、LY173、LY178、LY180、LY186、BW34-XZ106、BW34-XZ107、BW34-XZ108、BW34-XZ109、BW34-XZ110、BW34-XZ111、BW34-XZ112、BW34-XZ113、BW34-XZ114、BW34-XZ115、BW34-XZ116、BW34-XZ117、BW34-XZ118、BW34-XZ119、BW34-XZ120、BW34-XZ121、BW34-XZ122、BW34-XZ123和BW34-XZ124。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及產(chǎn)生本文所述的本發(fā)明重組細(xì)菌的方法。該方法包括將整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到宿主細(xì)菌中，從而產(chǎn)生包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及將所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到核糖體RNA(rRNA)操縱子中。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，RNA操縱子包含選自〃/丄/r伍、〃/C、/r/￡>、；r/￡\〃/0!和〃///的基因。在還另一個(gè)具體的實(shí)施方案中核糖體RNA操縱子包含〃7￡基因。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及不含有抗生素抗性標(biāo)記的本文所述重組細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還提供去除一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記的步驟。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及滅活一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因。在還又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及整合一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的異源基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到宿主細(xì)菌的〃7五基因中、去除一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記和滅活一個(gè)或多個(gè)編碼乙醇生產(chǎn)所不需要的干擾或以別的方式減少所述整套產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因的步驟。在所述方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，被整合的所述整套異源產(chǎn)乙醇基因包含;6/c、ad/l4和aW5。在所述方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，pgc基因、^//L4基因和a^5基因衍自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述整套產(chǎn)乙醇基因被包含在無啟動(dòng)子的操縱子中。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該無啟動(dòng)子的搡縱子含有連接到戶A和ac/A5之間的5戶e/位點(diǎn)中的ad/L4基因。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，該無啟動(dòng)子的操縱子含有可去除的抗生素標(biāo)記。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該無啟動(dòng)子的操縱子用Tn5轉(zhuǎn)座子來整合。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素標(biāo)記用重組酶來去除。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素標(biāo)記選自安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨卡青霉素和氯霉素。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)基因通過缺失或突變來滅活。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)乙醇基因通過缺失來滅活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)的基因被滅活。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的任何方面的基因在所述整套異源產(chǎn)乙醇基因被整合前先被滅活。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)菌是大腸桿菌菌株K011(ATCC55124)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，重組細(xì)菌衍自SZ110(NRRLB-30951)。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含/ocJ-z/^基因區(qū)域的基因通過缺失來滅活。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)的基因被缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因包括Gdb4、W/Lfi"、W/L4和mg"。在另一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)源W/l4基因通過缺失來滅活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，W/L4基因在所述整套異源產(chǎn)乙醇基因被整合前先被缺失。在又一個(gè)實(shí)施方案中，異源ca"5基因通過缺失來滅活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，a/WB基因來自催產(chǎn)克雷伯氏桿菌。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法還包括用/""基因和/ac7基因替代ca^^基因的步驟。在具體的實(shí)施方案中，fo"基因和/"c;r基因來自大腸桿菌。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述方法還包括整合^/Z基因的步驟。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，e^Z基因來自惡臭假單胞菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，a^Z基因在所述整套產(chǎn)乙醇基因整合后再被整合。在所述方法的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，內(nèi)源mgW基因通過缺失來滅活。在一個(gè)實(shí)施方案中，lac操縱子被去除或滅活。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，lac操縱子被恢復(fù)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，從lac操縱子恢復(fù)的基因包含/ac丄/ac:r和/acZ。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含lac操縱子的基因來自大腸桿菌。在所述方法的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，/^基因被缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，"/y基因被整合。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，ce/y基因來自菊歐文菌。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，ca"S基因被整合。在又一個(gè)實(shí)施方案中，c"W5基因被整合到W/l4基因中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，caWS基因來自催產(chǎn)克雷伯氏桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括恢復(fù)/0"-//^基因區(qū)域的功能。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，/oo4-p/75基因區(qū)域的功能通過/o"-;/萬基因區(qū)域的同源重組來恢復(fù)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，/oa4-;y^基因區(qū)域的功能在所述整套產(chǎn)乙醇基因整合前先被恢復(fù)。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)菌是大腸桿菌菌株SZ110(NRRLB-30951)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌是大腸桿菌菌抹LY165(NRRLB-30952)。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，重組細(xì)菌是大腸桿菌菌林LY168(NRRLB-30953)。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，重組細(xì)菌能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，礦物鹽培養(yǎng)基包含木糖。在前述的本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及從寡糖來源生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括將寡糖與如上所述的本發(fā)明重組細(xì)菌在適于乙醇生產(chǎn)的條件下進(jìn)行接觸，從而從寡糖來源生產(chǎn)乙醇。在所述方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，寡糖選自木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素和果膠或者它們的組合。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的乙醇占總非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的40%以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括提供本發(fā)明的重組細(xì)菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括獲得本發(fā)明的重組細(xì)菌。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還包括將寡糖與重組細(xì)菌在礦物鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，礦物鹽培養(yǎng)基包含(每升)3.5gKH2PO4、5.OgK2HPO4、3.5g(NH4)2HPO4、0.25gMgS04'7H20、15mgCaCl2'2H20、0.5mg硫胺素和lmL痕量金屬儲(chǔ)液(stock),補(bǔ)力口有2(w/v)y。-9(w/v)。/。木糖。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將甜菜堿添加到礦物鹽培養(yǎng)基中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將MOPS添加到礦物鹽培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，礦物鹽培養(yǎng)基AMI培養(yǎng)基含有(每升)2.63g(NH4)2HP04、0.87gNH4H2P04、0.375g/LMgS04'7H20、0.149gKC1、.0163g甜菜堿HCl(pH7.4)和1.5mL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)力口2(w/v)%-14(w/v)。/o糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，AMl培養(yǎng)基含有木糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，AMI培養(yǎng)基包含至少約9%木糖。在還又一個(gè)實(shí)施方案中，痕量金屬儲(chǔ)液可在0.1MHCl中制備(每升1.6gFeCl3'6H20、0.2gCoCl2'6H20、O.lgCuCl2,2H20、0.2gZnCl2、0.2gNa2Mo04*2H20、0.05gH3BO3、0.33gMnCl2*4H20)。在前述的從寡糖來源生產(chǎn)乙醇的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中該重組細(xì)菌是通過包括如上所述的本發(fā)明方法的任一個(gè)步驟的步驟的方法來制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包含如上所述的本發(fā)明重組細(xì)菌和佳:用說明書的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用說明書是依據(jù)任何本發(fā)明的從寡糖來源生產(chǎn)乙醇的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包含糖來源。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。附圖簡(jiǎn)述圖1(A-L)示出了用于按本發(fā)明進(jìn)行菌林構(gòu)建的質(zhì)粒和DNA片段。小圖A-C分別顯示質(zhì)粒pL013497、pLOI3901和pLOI3491。小圖D顯示乙醇基因(pA,"J/l4,W/lS)和整合位點(diǎn)。小圖E和F分別顯22示質(zhì)粒pLOI3924和pLOI3920。小圖G顯示2456bpspLOI3940A^/-//!>^///。小圖H顯示4，082bps基因組PCR片段。小圖I-L分別顯示質(zhì)粒pEL04、pLOI3961、pLOI4162和pLOI3976E。圖2(A和B)的曲線圖示出了進(jìn)行菌株改良的基于生長(zhǎng)的選擇(growth-basedselection)。將攜帶有隨機(jī)的基于Tn5的插入(運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zwc^'fo)/^c-ai//L4-ac/A5-i^r-^w-7^7^々LY151群體在NBS礦物鹽培養(yǎng)基(9%木糖)中進(jìn)行38次系列轉(zhuǎn)移，作為對(duì)乙醇生產(chǎn)力的基于生長(zhǎng)的選擇。從最后一次轉(zhuǎn)移分離到菌抹LY158和LY159。各次轉(zhuǎn)移如下分組和均分(■),1-9次轉(zhuǎn)移(48小時(shí)間隔，接種物16mgdcw1-1);(▲)，第10-14次轉(zhuǎn)移(48小時(shí)間隔，lmM甜菜堿，接種物16mgdcwl-l);第15-24次轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔，lmM甜菜堿，接種物lOmgdcwl-1);(□)，第24-34次轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔，lmM甜菜堿，接種物lOmgdcwI-l);()，第35-38次轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔，lmM甜菜堿，接種物10mgdcwl-l)。小圖A.Y軸表示所產(chǎn)生的乙醇(g/升)。小圖B.Y軸表示細(xì)胞質(zhì)量。圖3(A-D)的曲線圖示出了重組大腸桿菌對(duì)9(w/v)%木糖的發(fā)酵情況。小圖A和B顯示培養(yǎng)基組成(Luria肉湯和NBS礦物鹽培養(yǎng)基+1mM甜菜堿)的影響。小圖C和D顯示曱基乙二醛合酶突變的影響(NBS礦物鹽十lmM甜菜堿)。各小圖的符號(hào)(*)，K011，在NBS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；(口)，KOll,在Luria肉湯中生長(zhǎng)；(▲),LY168,在NBS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；0),LY168,在Luria肉湯中生長(zhǎng)；(△),LY165,在NBS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。圖4(A-D)的柱圖顯示在含有9(w/v)%木糖的NBS礦物鹽培養(yǎng)基中的木糖發(fā)酵的產(chǎn)物。小圖A.菌林KOll,加入lmM甜菜堿；小圖B.菌抹LY165,不加甜菜堿；小圖C.菌抹LY165,1mM甜菜堿；小圖D.菌抹LY168,1mM甜菜堿。圖5(A和B)的曲線圖顯示進(jìn)行菌抹改進(jìn)的基于生長(zhǎng)的選擇。將LY168以24小時(shí)間隔和以在AMI培養(yǎng)基(9%木糖)中10mg細(xì)胞干重23(dew)1-1的接種物進(jìn)行系列29次轉(zhuǎn)移，作為對(duì)乙醇生產(chǎn)力的基于生長(zhǎng)的選擇。從最后一次轉(zhuǎn)移分離到菌抹LY168im。各次轉(zhuǎn)移如下分組和均分(o)，第l-5次轉(zhuǎn)移；(■)，第6-10次轉(zhuǎn)移；(▲),第11-15次轉(zhuǎn)移；(T)，第15-20次轉(zhuǎn)移;(),第20-25次轉(zhuǎn)移；()，第26-29次轉(zhuǎn)移。小圖A.Y軸表示所產(chǎn)生的乙醇(g/升)。小圖B.Y軸表示細(xì)胞質(zhì)量。圖6(A和B)的曲線圖顯示進(jìn)行菌抹改進(jìn)的基于生長(zhǎng)的選擇。將LY172以24小時(shí)間隔和以在AMI培養(yǎng)基(9%木糖)中10mgdewH的接種物進(jìn)行系列15次轉(zhuǎn)移，作為對(duì)乙醇生產(chǎn)力的基于生長(zhǎng)的選擇。從最后一次轉(zhuǎn)移分離到菌抹LY172im。各次轉(zhuǎn)移如下分組和均分(o)，第l-5次轉(zhuǎn)移；(■),第6-10次轉(zhuǎn)移；()，第11-15次轉(zhuǎn)移。小圖A.Y軸表示所產(chǎn)生的乙醇(g/升)。小圖B.Y軸表示細(xì)胞質(zhì)量。圖7(A和B)的曲線圖顯示進(jìn)行菌林改進(jìn)的基于生長(zhǎng)的選擇。將LY178E以24小時(shí)間隔和以在AMI培養(yǎng)基(10%木糖)中10mgdewH的接種物進(jìn)行系列12次轉(zhuǎn)移，作為對(duì)乙醇生產(chǎn)力的基于生長(zhǎng)的選擇。從最后一次轉(zhuǎn)移分離到菌抹LY180。各次轉(zhuǎn)移如下分組和均分(o)，第l-5次轉(zhuǎn)移；(■),第6-10次轉(zhuǎn)移；()，第11-12次轉(zhuǎn)移。小圖A.Y軸標(biāo)示所產(chǎn)生的乙醇(g/升)。小圖B.Y軸表示細(xì)胞質(zhì)量。圖8(A和B)的曲線圖顯示進(jìn)行菌株改進(jìn)的基于生長(zhǎng)的選擇。將LY180以24小時(shí)間隔和以在AMI培養(yǎng)基(14%木糖)中10mgdewH的接種物進(jìn)行系列25次轉(zhuǎn)移，作為對(duì)乙醇生產(chǎn)力的基于生長(zhǎng)的選擇。從最后一次轉(zhuǎn)移分離到菌抹LY186。各次轉(zhuǎn)移如下分組和均分(o)，第l-5次轉(zhuǎn)移；(■),第6-10次轉(zhuǎn)移；(▲)，第11-15次轉(zhuǎn)移；(V)，第15-20次轉(zhuǎn)移；()，第20-25次轉(zhuǎn)移。小圖A.Y軸標(biāo)示所產(chǎn)生的乙醇(g/升)。小圖B.Y軸表示細(xì)胞質(zhì)量。圖9(A和B)的曲線圖顯示催產(chǎn)克雷伯氏桿菌菌抹BW21(o)、BW34("、BW35(畫)和BW35pCPP2006(口)在0UM1中從90g/L葡萄糖的生長(zhǎng)(A)和乙醇產(chǎn)量(B)。圖10(A-C)的曲線圖顯示產(chǎn)乙醇的催產(chǎn)克雷伯氏桿菌菌株P(guān)2(■)、SZ22(□)、BW21()、BW34(o)和BW35pCPP2006A使用(A)50|ulSpezymeGC220每克纖維素、(B)50julSpezymeCE每克纖維素和(C)10050)ilSpezymeCE每克纖維素，100g/LSigmacell在SSF中的乙醇產(chǎn)量。圖11(A-C)的柱圖顯示使用(A)50|ilSpezymeGC220每克Sigamcell、(B)50piSpezymeCE每克Sigmacell和(C)100(il每克Sigmacell，Sigmacell在SSF中的殘?zhí)?144小時(shí))。*暫時(shí)鑒定為木糖。圖12(A-C)的柱狀圖顯示100g/LSigmacell(144h)與(A)50SpezymeGC220每克纖維素、(B)50piSpezymeCE每克纖維素和(C)100piSpezymeCE每克纖維素的SSF中的產(chǎn)物形成。圖13(A和B)曲線圖顯示催產(chǎn)克雷伯氏桿菌菌林BW21(■)、BW35pCPP2006O)和BW34(o)在40g/L木糖和45g/LSigmacell與50jxLSpezymeCE每克Sigmacell(A)和50SpezymeGC220每克Sigmacell(B)的SSCF中的乙醇產(chǎn)量(實(shí)線)和木糖消耗(虛線)。圖14(A和B)的柱狀圖顯示催產(chǎn)克雷伯氏桿菌的產(chǎn)乙醇budAB菌株在《吏用(A)50SpezymeCE每克Sigmacell和(B)50(iLSpezymeGC220每克Sigmacell的40g/L木糖和45g/LSigmacell的SSCF(144小時(shí))中的產(chǎn)物形成。圖15(A和B)的柱狀圖顯示用(A)50SpezymeCE每克Sigmacell和(B)50LSpezymeGC220每克Sigmacell的40g/L木糖和45g/LSigmacell的SSCF中的殘?zhí)恰?暫時(shí)鑒定為木糖。圖16的柱狀圖顯示催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW34在SSF(100g/LSigmacell)和SSCF(40g/L木糖和45g/LSigmacell)中每單位酶從纖維素的乙醇產(chǎn)量。在SSCF中，假定為所加入的木糖的理論產(chǎn)率的95%(19.4g/L)。標(biāo)出了酶類型和酶負(fù)荷量。圖17的曲線圖顯示催產(chǎn)克雷伯氏桿菌對(duì)酸水解甘蔗渣的SSF過程中的乙醇產(chǎn)量。圖18(A-C)是三個(gè)示意圖。A和B顯示用于進(jìn)行c^缺失(第1輪)的質(zhì)粒。小圖C是cW缺失(第l輪)的圖解。圖19(A-C)是三個(gè)示意圖。A和B顯示用于進(jìn)行cW缺失(第2和第3輪)的質(zhì)粒。小圖C是c^缺失(第2和第3輪)的圖解。圖20這個(gè)示意圖顯示用于將醇基因整合到大腸桿菌的p乂W位點(diǎn)的質(zhì)粒。圖21這個(gè)示意圖顯示用于將醇基因整合到大腸桿菌的廳/E位點(diǎn)的質(zhì)粒。圖22這個(gè)示意圖顯示用于將醇基因整合到克雷伯氏菌的//7萬位點(diǎn)的質(zhì)粒。圖23這個(gè)示意圖顯示用于將醇基因整合到克雷伯氏菌的庁/五位點(diǎn)的質(zhì)粒。圖24(A和B)圖解顯示醇基因在克雷伯氏菌//W位點(diǎn)的整合。發(fā)明詳述為了清楚地理解本發(fā)明的整個(gè)范圍，提供了以下定義。/.定義術(shù)語"宿主"和"宿主細(xì)菌，，可互用，意指包括擔(dān)當(dāng)據(jù)以產(chǎn)生本發(fā)明重組細(xì)菌的宿主細(xì)胞的細(xì)菌，例如天然細(xì)菌或重組細(xì)菌。因此，本發(fā)明的重組細(xì)菌被說成"衍自"宿主細(xì)菌。在"衍自細(xì)菌的多核苷酸或基因"中的術(shù)語"衍自"意指包括多核苷酸區(qū)段從指定來源(即細(xì)菌)的分離(全部或部分)或者多肽從指定來源(即細(xì)菌)的純化。在這方面，該術(shù)語意指包括例如從或基于與指定的多核芬酸來源有關(guān)的序列進(jìn)行的直接克隆、PCR擴(kuò)增或人工合成。本文所用的術(shù)語"重組細(xì)菌"、"重組宿主細(xì)胞"、"重組微生物"等意指包括適合于或經(jīng)受到遺傳操作的細(xì)胞，或者通過轉(zhuǎn)染摻入異源多核苷酸序列。細(xì)胞可以是孩i生物或高等真核細(xì)胞。該術(shù)語意指包括原先被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的后代。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。革蘭氏陽性細(xì)菌宿主細(xì)胞包括例如芽孢桿菌屬(萬ad〃附)、梭菌屬(C/oWr^wm)、發(fā)酵單月包菌屬(Zymomowoy)、棒狀桿菌屬(Cc^7"e6acten'ww)、土芽孢桿菌屬(Ceo6ac〃fo)、乳桿菌屬(丄acto6ac/〃/51)、ILJ求菌屬(丄flctococcw5)、酒5求菌屬((9e"ococa^)、鏈J求菌屬(5V^ptococciw)和真桿菌屬(五w6a"en'wm)。革蘭氏陰性細(xì)菌宿主細(xì)胞包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)科的所有兼性厭氧革蘭氏陰性細(xì)胞，如埃希氏菌屬C&c/^n'c/n'fl)、志賀氏菌屬(5Tn'ge〃a)、檸檬酸桿菌屬(C"ra&cte。、沙門氏菌屬(5^/mowe〃fl)、克雷伯氏菌屬(A7eZxs7'e〃a)、腸4干菌屬(五""ero6ct"er)、歐文氏菌屬(5WWm'a)、克呂沃爾菌屬vera)、沙雷氏菌屬(Serra"a)、西地西菌屬(Cecfecea)、摩根氏菌屬(Morga"e/Za)、哈夫尼亞菌屬(//a/m'fl)、愛德華氏菌屬(五dwa^^e〃a)、普羅威登斯菌屬(尸ravWew"'a)、變形菌屬(/Vofetw)和耶爾森氏菌屬(l^^w'a)。優(yōu)選的重組宿主是大腸桿菌細(xì)胞和催產(chǎn)克雷伯氏桿菌細(xì)胞。本文所用的術(shù)語"基因"是能指導(dǎo)酶或其他多肽分子的合成的核酸，它例如可包含編碼序列，如編碼多肽的田比鄰(contiguous)開放讀框(ORF),或者它可自己在生物中具有功能。如本文所定義，生物中的基因可簇集(cluster)在操縱子中，其中該操縱子被基因間DNA使之與其他基因和/或操縱子隔開。操縱子當(dāng)中所含的各個(gè)基因可重疊，使得各個(gè)基因之間沒有基因間DNA。另外，術(shù)語"基因"意指包括針對(duì)選定目的的特定基因?；蚩梢允撬拗骷?xì)胞的內(nèi)源基因，或者可被重組導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，例如作為以附加體形式保持的質(zhì)?；虮环€(wěn)定整合到基因組中的質(zhì)粒(或其片段)來導(dǎo)入。異源基因是被導(dǎo)入到細(xì)胞中而非細(xì)胞的天然基因的基因。根據(jù)本發(fā)明，異源基因還包括在這樣的位置導(dǎo)入細(xì)胞中的內(nèi)源基因，該位置并非該內(nèi)源基因在細(xì)胞基因組中的天然位置。術(shù)語"異源產(chǎn)乙醇基因"意指包括這樣的基因或其部分，它衍自任何來源如真核生物、原核生物、古細(xì)菌、病毒或合成核酸片段，能編27碼參與產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的多肽，被摻入到非它的天然宿主細(xì)胞中。術(shù)語"異源產(chǎn)乙醇基因"還指這樣的基因，它編碼參與碳水化合物的發(fā)酵的、例如參與生物中的產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑的多肽，它不在生物中天然出現(xiàn)，例如是被導(dǎo)入到生物中的基因。術(shù)語"異源產(chǎn)乙醇基因"和"異源乙醇發(fā)酵基因"可互用，意指包括參與碳水化合物向乙醇的生物轉(zhuǎn)化中的至少一個(gè)步驟的基因。因此，該術(shù)語已知包括任何編碼多肽的基因，所述多肽例如醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、分泌性蛋白或多糖酶，如葡聚糖酶(如內(nèi)切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶)、纖維二糖水解酶、(3-葡萄糖苷酶、內(nèi)切-l,4-P-木聚糖酶、p-木糖苷酶、ot-葡糖醛酸酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、a-淀粉酶、p-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、P-葡聚糖酶、半纖維素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠水解酶或果膠酸裂合酶。詞語"整套異源產(chǎn)乙醇基因，，意指包括基本上所有的已在產(chǎn)乙醇生物(異源產(chǎn)乙醇基因從中獲得沐f生)中進(jìn)化的、構(gòu)成該生物的天然乙醇生產(chǎn)途徑的基因。整套產(chǎn)乙醇基因包括產(chǎn)乙醇生物的基本上所有的能指導(dǎo)發(fā)酵遠(yuǎn)離這樣的代謝途徑的基因，該代謝途徑涉及不產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的酶("替代代謝途徑")。這種替代代謝途徑包括丙酮酸代謝的替代途徑和NADH氧化的發(fā)酵途徑。例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌這一產(chǎn)乙醇細(xì)菌的整套異源產(chǎn)乙醇基因包括基因、W/l4基因和ac/A5基因。酉良酒酵母(5^cc/wramyc^cereWWae)這一產(chǎn)乙醇酵母的整套異源產(chǎn)乙醇基因包括4個(gè)或5個(gè)不同的aW基因，例如醇脫氫酶I、II、111和1￥(^//-/^)(0^百1^等.1988;Reid等.1994)和2個(gè)不同的;c/c基因。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，重組大腸桿菌KOll(ATCC55124)(Ohta爭(zhēng).1991)可用作宿主細(xì)胞。KOll含有只編碼pA基因和acZ/LS基因的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌盒(cassette)，因此不具有根據(jù)本發(fā)明的整套異源產(chǎn)乙醇基因。與之對(duì)比，本發(fā)明的衍自KOll的新的重組大腸桿菌菌林LY165(NRRLB-30952)和LY168(NRRLB-30953)含有編碼;c/c基因、c^/L4基因和^^5基因的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌盒，因此具有根據(jù)本發(fā)明的整套異源產(chǎn)乙醇基因。詞語"丙酮酸代謝的替代途徑"意指包括NADH氧化的發(fā)酵途徑這一子集(subset)。該詞語意指包括涉及不產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的酶的代謝途徑。這種替代途徑的一個(gè)實(shí)例包括產(chǎn)生乳酸和琥珀酸作為主要代謝產(chǎn)物的途徑。這種途徑的其他實(shí)例是浪費(fèi)性途徑(wastefulpathway)。浪費(fèi)性途徑會(huì)每個(gè)乙醇氧化兩個(gè)HADH分子，而不是本發(fā)明的優(yōu)選途徑中的每個(gè)乙醇氧化一個(gè)NADH分子，因此會(huì)減少最終產(chǎn)率。丙酮酸代謝的浪費(fèi)性替代途徑的實(shí)例包括涉及諸如醇脫氫酶E(ad/LE)和乙酸激酶(ac/b4)的酶的途徑。丙酮酸代謝的替代途徑的又一個(gè)實(shí)例包括由W/l4(乳酸脫氫酶)基因編碼的途徑。U/l4編碼代謝NADH+丙酮酸產(chǎn)生NAD+和乳酸的單酶途徑。丙酮酸代謝的替代途徑的還另一個(gè)實(shí)例包括涉及這樣的基因的途徑，該基因編碼富馬酸還原酶復(fù)合物(FRD操縱子)的四個(gè)亞單位，加上NADH和丙酮酸，這四個(gè)亞單位一起將HADH氧化成NAD+,其中丙酮酸的最終產(chǎn)物是琥珀酸。在某些實(shí)施方案中，丙酮酸代謝的替代途徑這個(gè)術(shù)語涵蓋NADH氧化的發(fā)酵途徑這一子集。術(shù)語"核糖體RNA操縱子(operon)"意指作為一個(gè)團(tuán)體表達(dá)的核糖體RNA基因與它們的相關(guān)啟動(dòng)子和操縱基因(operator)所成的簇(cluster)。有7個(gè)核糖體RNA(rRNA)操縱子，稱〃M、〃/5、廳/C、？r/D、威、〃/(^^//^(1^11池^等.1986;Nomura等.，1984)。按常規(guī)，術(shù)語"/r/f指編碼所有三種核糖體RNA的一組基因，而術(shù)語"皿F，指庁伍基因產(chǎn)物，即23S、16S、5SrrlE核糖體RNA分子。at/S等價(jià)物0r伍equivalent)存在于大多數(shù)的生物中，如果不是存在于所有的生物中的話。示例性的w/五序列是GenelD編號(hào)948509所指的序列。每個(gè)rRNA操縱子含有被多個(gè)tRNA基因所間隔的16SrRNA基因、23SrRNA基因和5SrRNA基因。rrlD操縱子含有兩個(gè)5SrRNA基因。"rrs"基因編碼16SrRNA,"rrl"基因編碼23SrRNA,"rrf，基因編碼5SrRNA。29術(shù)語"被滅活"或"滅活"意指包括任何據(jù)以使基因停止編碼其預(yù)定多肽或停止編碼其預(yù)定多肽的活性形式的手段。因此，該術(shù)語包括例如突變、缺失、插入、復(fù)制、錯(cuò)義、移碼、重復(fù)、無義突變或者其他的改變或修飾，使得基因活性(即轉(zhuǎn)錄)被阻斷。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因通過缺失來滅活。術(shù)語"丙酮酸脫羧酶"(/&)意指包括擔(dān)當(dāng)著指導(dǎo)發(fā)酵過程中丙酮酸流向乙醇的酶。按常規(guī)，術(shù)語》^"指丙酮酸脫羧酶基因，而術(shù)語"PDC"指pdc基因產(chǎn)物，即丙酮酸脫羧酶這種多肽或酶。示例性的pc/c序列是Conway等(J.Bacteriol.169(3),949-954(1987))所描述的、GenBank檢索號(hào)為AAA27696的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌；血。術(shù)語"醇脫氫酶A"(fl說J)和"醇脫氬酶B"("d/^)和"醇脫氫酶E"(aW^)意指包括在發(fā)酵條件下將乙醛轉(zhuǎn)化成乙醇的酶。按常規(guī)，術(shù)語"ad/l4"、"^/ZLS"或"a說F，指醇脫氫酶基因，而術(shù)語"ADHA"、"ADHB"或"ADHE，，分別指"adhA"、"adhB"或"adhE"基因產(chǎn)物，即醇脫氫酶這種多肽或酶。示例性的序列是Keshav等(J.Bacteriol.172(5)，2491-2497(1990))描述的、GenBank檢索號(hào)為AAA27682的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌^//^。示例性的W力J5序列是Conway等(J.Bacteriol.169(6)，2591-2597(1987))描述的、GenBank檢索號(hào)為AAA27683的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌W/lS。示例性的W/le序列是Kessler等(FEBSLett.281(1-2),59-63(1991))描述的、GenBank檢索號(hào)為CAA41955的大腸桿菌W/lE:。術(shù)語"focA-py^基因區(qū)域"(/k^-;y^基因區(qū)域)意指包括參與丙酮酸代謝的/od基因、py7S基因。術(shù)語"丙酮酸甲酸裂解酶"(p力別意指包括在發(fā)酵條件下將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA和曱酸的酶。按常規(guī)，術(shù)語"http://W"指丙酮酸甲酸裂解酶基因，而術(shù)語"PFL"指pyz基因產(chǎn)物，即丙酮酸甲酸裂解酶這種多肽或酶。示例性的；/75#^/是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1),1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—415423的大腸桿菌;/m。術(shù)語"focA"(/bd)意指包括參與曱酸代謝的酶。示例性的/od#^/是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1),1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—415424的大腸桿菌"術(shù)語"乳酸脫氫酶"(W/L4)意指包括在發(fā)酵條件下將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸的酶。按常規(guī)，術(shù)語"W/L4"指乳酸脫氫酶基因，而術(shù)語"LDHA"指W/L4基因產(chǎn)物，即乳酸脫氬酶這種多肽或酶。示例性的W/l4序列是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1),1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—415898的大腸桿菌/2Ml4。術(shù)語"乙酸激酶"(fldb4)意指包括編碼丙酮酸代謝的替代途徑的酶。按常規(guī)，術(shù)語"adb4"指乙酸激酶基因，而術(shù)語"ACKA"指acW基因產(chǎn)物，即乙酸激酶這種多肽或酶。示例性的adb4序列是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1)，1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—416799的大腸桿菌《-72acfc4。術(shù)語"frd操縱子，，意指包括構(gòu)成富馬酸還原酶復(fù)合物的四個(gè)亞單位(A-D)。按常規(guī)，術(shù)語"/n/橫-織f，指編碼該四個(gè)亞單位的基因，而術(shù)語"FRDOPERON"指編碼該四個(gè)亞單位的蛋白質(zhì)。示例性的貧馬凝還乂褒^J序列是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1)，1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—418578的大腸桿菌"貧馬凝還^^丄示例性的貧馬虔還#^5序列是Riley等(NucldcAcidsRes.34(1)，1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NPjU8577的大腸桿菌《-"貧馬磁還^錄5。示例性的,馬^還^雄C序列是Blattner等(NucleicAcidsRes.34(1),1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—418576的大腸桿菌"^4遂還^f齊C。示例性的,^凝i5^廢"序列是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1)，1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—418575的大腸桿菌《-",馬凝還^^D。術(shù)語"casAB"(cosylg)意指包括發(fā)酵纖維二糖的酶II纖維二糖和磷酸-卩-葡糖苷酶。按常規(guī)，術(shù)語"casAB"指casAB基因，而術(shù)語"CASAB"指casAB基因產(chǎn)物，即casAB酶。示例性的caW序列和ca^序列是Lai等(Appl.Environ.Microbiol.63(2),355-363(1997))描述的、GenBank檢索號(hào)為AAB51563的催產(chǎn)克雷伯氏桿菌cflW(纖維二糖特異性PTS通透酶)和Lai等(Appl.Environ.Microbiol.63(2),355-363(1997))描述的、GenBank4企索號(hào)為AAB51564的催產(chǎn)克雷伯氏桿菌(磷酸纖維二糖酶)。在某些實(shí)施方案中，^"5基因來自催產(chǎn)克雷伯氏桿菌。術(shù)語"cdY"(ce/y)意指包括內(nèi)切葡聚糖酶Y這種酶。按常規(guī)，術(shù)語"ce/F"指ce/y基因，而術(shù)語"CELY"指ce/y基因產(chǎn)物，即cdY酶。示例性的ce/y^/y是Guiseppi等(Gene106(1)，109-114(1991))描述的、GenBank檢索號(hào)為M74044的菊歐文菌ce/7(內(nèi)切葡聚糖酶Y)。術(shù)語"曱基乙二醛合酶A"(7WgM)意指包括編碼甲基乙二醛旁路途徑的第一個(gè)步驟中的酶mgsA的酶。按常規(guī)，術(shù)語"wgW指甲基乙二醛合酶基因，而術(shù)語"MGSA，，指mgM基因產(chǎn)物，即曱基乙二醛合酶A這種多肽或酶。示例性的mgs序列是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1)，1-9(2006)描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—415483的大腸桿菌《-"術(shù)語"短鏈酯酶意指包括編碼惡臭假單胞菌(NRRLB-18435)短鏈酯酶的酶。按常規(guī)，術(shù)語"e^Z"指短鏈酯酶基因，而術(shù)語"ESTZ，，指e^Z基因產(chǎn)物，即短鏈酯酶這種多肽或酶。示例性的e^Z^/y是Hasona等(App1.Environ,Microbiol.68(6),2651-2659(2002))描述的、GenBank檢索號(hào)為AAM16269的惡臭假單胞菌e^Z。術(shù)語"lac操縱子"意指包括一個(gè)調(diào)節(jié)基因(即i基因)和三個(gè)結(jié)構(gòu)基因(z、y和a)。按常規(guī)，術(shù)語"/ac橫i^^，指這些基因，而術(shù)語"LAC操縱子"指編碼這四個(gè)基因的蛋白質(zhì)。i基因編碼lac操縱子的阻抑蛋白。z基因編碼P-半乳糖苷酶，y基因編碼通透酶，a基因編碼轉(zhuǎn)乙酰酵。術(shù)語"lacA"(/ad)意指包括半乳糖轉(zhuǎn)乙酰酶，一種參與乳糖代謝的酶。按常規(guī)，術(shù)語"/flc，，指半乳糖轉(zhuǎn)乙酰酶基因，而術(shù)語"LACA"指32基因產(chǎn)物，即半乳糖轉(zhuǎn)乙酰酶這種多肽或酶。示例性的/fld#/〈/是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1)，1-9(2006》描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—414876的大腸桿菌"/flcA術(shù)語"lacY"(/acr)意指包括通透酶，一種參與乳糖代謝的酶。按常規(guī)，術(shù)語"/flc:r指通透酶基因，而術(shù)語"LACY"指/flc;r基因產(chǎn)物，即通透酶這種多肽或酶。示例性的/ac:F^/y是Riley等(NucleicAcidsRes.34(1),1-9(2006))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP一414877的大腸桿菌《-"/acr。術(shù)語"氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶"(cW)意指包括引起對(duì)氯霉素的抗生素抗性的酶。按常規(guī)，術(shù)語"cW，指氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶基因，而術(shù)語"CAT"指cW基因產(chǎn)物，即氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶這種多肽或酶。示例性的cw是Parkhill等(Nature413(6858),848-852(2001))描述的、GenBank檢索號(hào)為NP—569406的腸道沙門氏菌(51.ewten'ca)/"c7。術(shù)語"發(fā)酵(fermentation)"和"發(fā)酵(fermenting)"意指包括復(fù)雜糖的降解或解聚和該糖殘基在厭氧條件下向乙醇、乳酸、乙酸和琥珀酸的生物轉(zhuǎn)化。該術(shù)語意指包括據(jù)以,人碳水化合物產(chǎn)生乙醇(特別是作為發(fā)酵主要產(chǎn)物)的酶促過程(例如細(xì)胞的或非細(xì)胞的，例如裂解物或純化的多肽混合物)。術(shù)語"礦物鹽培養(yǎng)基"意指包括含有極微量的營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基，例如這樣的培養(yǎng)基，它基本上由礦物鹽和其他基本營(yíng)養(yǎng)物組成，但能夠在不需要添加復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物情況下使重組生物(例如本發(fā)明的重組細(xì)菌)在厭氧條件下生長(zhǎng)并產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。例如，本發(fā)明的新的大腸桿菌LY165重組細(xì)菌當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物不存在下生長(zhǎng)時(shí)會(huì)以約44.9g/L的速率產(chǎn)生乙醇，本發(fā)明的大腸桿菌LY168重組細(xì)菌當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物不存在下生長(zhǎng)時(shí)會(huì)以約45.5g/L的速率產(chǎn)生乙醇。相比之下，KOll在礦物鹽培養(yǎng)基中以26.9g/L的速率產(chǎn)生乙醇，在添加復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物后僅以43.2g/L的速率產(chǎn)生乙醇。(參見下文實(shí)施例)。術(shù)語"革蘭氏陰性細(xì)菌"意指包括本領(lǐng)域公認(rèn)的本術(shù)語的定義。示例性的革蘭氏陰性細(xì)菌包括不動(dòng)桿菌屬(^7'"eto6a"e。、葡糖桿菌屬(G7wcowo6acfer)、埃希氏菌屬(^lycAen'cA/a)、地桿菌屬(Geo6acter)、希瓦氏菌屬CSAew朋e〃(2)、沙門氏菌屬(S"/wowe〃")、志賀氏菌屬(SA/ge〃")、腸#干菌屬(五"e/ero^"c/er)、檸檬酸桿菌屬(CV/raZ)flC/er)>歐文氏菌屬(^HWm'a)、沙雷氏菌屬(&rra^r)、變形菌屬(尸ratei^)、哈夫尼亞菌屬(//a/m'a)、耶爾森氏菌屬(l^ra'm'a)、摩根氏菌屬(Mo^朋e〃a)、愛德華氏菌屬(五^vards7'e〃a)和克雷伯氏菌屬(《/efe/e〃a)。術(shù)語"革蘭氏陽性細(xì)菌"意指包括本領(lǐng)域公認(rèn)的本術(shù)語的定義。示例性的革蘭氏陽性細(xì)菌包括芽孢桿菌屬C^cz7/w力、梭菌屬(C7a^nWwm)、棒狀桿菌屬(Co/7"e6acfen'wm)、土芽孢桿菌屬(GeoZwc〃fo)、乳4干菌屬(丄actoZ)ac〃fc)、乳3求菌屬(丄ac/ococci^)、酒^求菌屬(Oe"ococct/s)、《連J求菌屬(5Vr印tococcus)和真一干菌屬(五wZ)(2cten't^)。術(shù)語"產(chǎn)乙醇(的)"意指包括具有從碳水化合物產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的能力的細(xì)胞。該術(shù)語意指包括天然的產(chǎn)乙醇生物、具有天然突變或誘導(dǎo)突變的產(chǎn)乙醇生物和經(jīng)遺傳工程改造以從碳水化合物產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的重組生物。術(shù)語"非產(chǎn)乙醇(的)，，意指包括不能夠從碳水化合物產(chǎn)生乙醇作為主要的非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞；即產(chǎn)生乙醇作為次要發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞。術(shù)語"主要發(fā)酵產(chǎn)物"意指包括占總非氣態(tài)產(chǎn)物的約40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%以上的非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)。主要發(fā)酵產(chǎn)物是最豐富的非氣態(tài)產(chǎn)物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。在更多的實(shí)施方案中，主要發(fā)酵產(chǎn)物由在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的宿主產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語"次要發(fā)酵產(chǎn)物"意指包括占總非氣態(tài)產(chǎn)物的40%以下、例如20%、30%、40%的非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)。34術(shù)語"厭氧條件"意指包括其中所存在的氧比有氧環(huán)境中存在的氧顯著低得多的條件。在具體的實(shí)施方案中，厭氧環(huán)境中的氧比有氧環(huán)境中的氧少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%。術(shù)語"同步糖化和發(fā)酵"或"ssf"意指包括使用一種或多種重組宿主(或其提取物，包括純化或未經(jīng)純化的提取物)同時(shí)進(jìn)行復(fù)雜糖的降解或解聚和該糖殘基通過發(fā)酵向乙醇的生物轉(zhuǎn)化。ssf是公知的方法，它可用來將生物質(zhì)降解成多糖，而多糖可^:細(xì)菌最終轉(zhuǎn)化成乙醇。ssf反映了自然界中發(fā)生的生物質(zhì)降解，它結(jié)合真菌(或者從真菌提取的酶如纖維素酶)的活性與產(chǎn)乙醇細(xì)菌(或者從中衍生的酶)的活性，將糖源如木質(zhì)纖維素降解成能夠最終轉(zhuǎn)化成乙醇的簡(jiǎn)單糖類。ssf反應(yīng)通常在酸性pH下進(jìn)行，以優(yōu)化昂貴的真菌酶的使用。術(shù)語"同源重組"指兩個(gè)同源dna分子之間發(fā)生的dna交換。根據(jù)本發(fā)明，同源重組可在基因之間發(fā)生以恢復(fù)基因功能，即同源重組以恢復(fù);^5功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，同源重組可用來除去抗生素it'l"生才示i己。術(shù)語"糖類""糖源"、"寡糖源"、"寡糖"、"復(fù)雜纖維素"、"復(fù)雜碳水化合物""復(fù)雜糖"、"多糖"、"糖來源"、"可發(fā)酵糖來源"等意指包括任何包含超過一種糖分子的碳水化合物來源。糖包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。本文所用的術(shù)語"糖類"還包括例如二糖、三糖、寡糖和多糖。這些碳水化合物可衍自任何未經(jīng)加工的植物材料或任何經(jīng)加工的植物材料。實(shí)例有木材、紙張、紙漿、植物衍生的纖維，或者包含超過一個(gè)連接的碳水化合物部分(即一個(gè)糖殘基)的合成纖維。一種具體的糖源是"木質(zhì)纖維素"，它占大多數(shù)植物材料的干重的大約90%，含有碳水化合物例如纖維素、半纖維素、果膠和芳族聚合物(例如木質(zhì)素)。纖維素占木質(zhì)纖維素干重的30%-50%,是纖維二糖(葡萄糖的二聚體)的均聚物。類似地，半纖維素占木質(zhì)纖維素干重的20%-50%，是含有戊糖(木糖、阿拉伯糖)和己糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖)的混合物的復(fù)雜聚合物，而該戊糖和己糖含有乙?；推咸侨┧峄鶄?cè)鏈。果膠占木質(zhì)纖維素干重的1%-20%,是葡糖醛酸的甲基化均聚物。其他糖源包括羧甲基纖維素(CMC)、無定形纖維素(例如酸溶脹纖維素)及纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖這些纖維寡糖。纖維素例如無定形纖維素可4汙自紙張或紙漿來源(包括例如它們的廢液)或者例如農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物如玉米秸稈、大豆可溶物或甜菜漿。上述碳水化合物聚合物的任何一個(gè)或它們的組合，是供按照本發(fā)明產(chǎn)品和方法進(jìn)行解聚和隨后通過發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化成乙醇的潛在糖來源。在"獲得重組細(xì)菌"中的術(shù)語"獲得"意指包括購(gòu)買、制備、工程改造或以別的方式獲取重組細(xì)菌。在"提供重組細(xì)菌"中的術(shù)語"提供"意指包括出售、分配重組細(xì)菌或以別的方式使重組細(xì)菌可供得到。在生物名稱之后于括號(hào)中出現(xiàn)在數(shù)字前的"ATCC"指該生物保藏在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection,10S01UniversityBlvd.Manassas,Va.20110-2209)。在生物名稱之后于括號(hào)中出現(xiàn)在數(shù)字前的"NRRL"指該生物寄保藏美國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch,1815NorthUniversityStreet,Peoria，Illinois61604-3999)。如所討論，本發(fā)明提供適合于降解糖類的新的和重組的細(xì)胞，特別是重組細(xì)菌。所述細(xì)胞具有改進(jìn)的乙醇生產(chǎn)能力，特別是在礦物鹽培養(yǎng)基中。所述細(xì)胞包含整套異源產(chǎn)乙醇基因。所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)胞生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還提供擔(dān)當(dāng)著開發(fā)重組細(xì)胞的基礎(chǔ)的宿主細(xì)胞，該重組細(xì)胞被遺傳工程改造成包含整套異源產(chǎn)乙醇基因。因此，宿主細(xì)胞可以36是高等真核生物如線蟲、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。細(xì)胞還可以是單細(xì)胞微生物或多細(xì)胞微生物如真菌、酵母或細(xì)菌的細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞和從中衍生的重組細(xì)胞意指包括適合于或經(jīng)受到遺傳操作的細(xì)胞，或者通過轉(zhuǎn)染摻入異源多核普酸序列。重組宿主細(xì)胞包括原先轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的后代。因此，根據(jù)本發(fā)明的合適宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，例如釀酒酵母。其他根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞包括例如酵母菌屬(&"/wrow少ce力、裂殖酵母屬(iScAz'msflc/^蘭j;cas)、漢遜酵母屬(i/a"""w/a)、管嚢酵母屬(尸ac/o;oTO/ew)、克魯維酵母屬(《/wj;veTOm;;cas)、德巴利酵母屬(Dek70W^ce力、亞羅酵母屬(Yor;ww'a)和畢赤酵母屬CP!'c/n'a)。宿主細(xì)胞可以是非重組的或重組的細(xì)菌宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括革蘭氏陽性細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬(Sad〃M5)、4麥菌屬(C7oWnWwm)、才奉^犬4干菌屬(Coo^eZjacten.wm)、土芽孢桿菌屬(Geo&d/fo)、乳桿菌屬(丄acto6ad/fo)、乳球菌屬(丄actococc—、酒球菌屬((9ewococc一、鏈球菌屬(5V，tococcw力和真桿菌屬(五^ac^n'wm)。在其他實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)菌，包括例如不動(dòng)桿菌屬(JcZweto6flcfer),葡糖桿菌屬(G/wco"oZ)acte"、埃希氏菌屬(EscAenWna)、發(fā)酵單胞菌屬(Zjwowow^)、地桿菌屬(Geo6a"e。、希瓦氏菌屬(幼ew朋e〃a)、沙門氏菌屬(Sa/mo"e〃a)、志賀氏菌屬(57^ge〃力、腸桿菌屬(E"etera6flcfer),檸檬酸桿菌屬(C"ra6acte"、歐文氏菌屬C&"vw'"/")、沙雷氏菌屬(&庁加'")、變形菌屬(尸ratews)、哈夫尼亞菌屬(/^>&)、耶爾森氏菌屬(Fe"/m'fl)、摩根氏菌屬(肘0^^6//")、愛德華氏菌屬(五0^"^^//力和克雷伯氏菌屬(《/eZw'e//a)。示例性的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括非重組細(xì)菌如大腸桿菌B(ATCC11303)和重組細(xì)菌如大腸桿菌KOll(ATCC55124)(Ohta等.1991)。這些細(xì)胞還可以以它們?cè)诘V物鹽培養(yǎng)基中從木糖生產(chǎn)乙醇的速率來表征。例如，大腸桿菌在礦物鹽培養(yǎng)基中在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物存在下產(chǎn)生9.1克/升乙醇，而大腸桿菌菌抹KOll(ATCC11303)在礦物鹽培養(yǎng)基中在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物存在下產(chǎn)生43.2克/升乙醇，在礦物鹽培養(yǎng)基中在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物不存在下產(chǎn)生26.9克/升乙醇。如所討論，本發(fā)明提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)胞，特別是重組細(xì)菌。本發(fā)明的重組細(xì)菌當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。整套異源產(chǎn)乙醇基因包括基本上所有的已在產(chǎn)乙醇生物(這些基因從中衍生)中進(jìn)化的、包含該生物的天然乙醇生產(chǎn)途徑的基因。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是衍自酵母和革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌的異源產(chǎn)乙醇基因。因此，供用于按照本發(fā)明構(gòu)建重組生物的合適異源多核苷酸序列，衍自天然產(chǎn)乙醇生物如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和釀酒酵母以及棕櫚發(fā)酵桿菌(Z少wo^"er;a/附fle)、巴氏醋桿菌(JcetoZwc&r/^xstewn'a"tw)、胃/v疊J求菌(5Vzrc7'm'avew/n'cw/0的at/A基因和/或基因(W02003/025117，通過引用結(jié)合到本文中；Talarico等.2005.)。其菌和大多數(shù)植物。構(gòu)成所述整套的一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)乙醇基因可衍自不同的生物或者衍自同一生物。在有利的實(shí)施方案中，構(gòu)成所述整套的基因衍自同一生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的基因是；^/c、W/L4和ac//^。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，pdc基因、W/l4基因和flW萬基因來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌這一天然的產(chǎn)乙醇細(xì)菌。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是與天然產(chǎn)乙醇基因不同的異源產(chǎn)乙醇基因或基因產(chǎn)物，例如這樣的基因，它們具有一皮突變、插入或缺失的核酸，但編碼與本發(fā)明的天然基因產(chǎn)物基本上相似和功能上等同的多肽，例如具有丙酮酸脫羧酶活性的、擔(dān)當(dāng)著指導(dǎo)發(fā)酵過程中丙酮酸流向乙醇的突變多肽。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，編碼保守氨基酸置換的核酸可進(jìn)行突變(例如通過置換來進(jìn)行突變)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還熟知，天然基因產(chǎn)物中的氨基酸可進(jìn)行置換、添加或缺失到某個(gè)程度，而與天然基因產(chǎn)物相比較又不顯著影響到基因產(chǎn)物的功能(例如不影響作為擔(dān)當(dāng)著指導(dǎo)發(fā)酵過程中丙酮酸流向乙醇的酶的丙酮酸脫羧酶的生物功能)。這些為人熟知的原理包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，雖然在某些實(shí)施方案中，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因可包含例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的天然pdc基因、^//l4基因和^Z/lS基因，但所述整套的一個(gè)或多個(gè)基因可以是天然產(chǎn)乙醇基因(例如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞產(chǎn)乙醇基因)的突變形式。在本發(fā)明的各個(gè)具體的方面，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因被整合到宿主細(xì)胞的核糖體RNA操縱子中。核糖體RNA操縱子為大多數(shù)細(xì)胞所共有，如果不是所有細(xì)胞所共有的話，特別是微生物，尤其是細(xì)菌。如上所述，有七個(gè)核糖體RNA(rRNA)操縱子，稱rrlA、rrnlE、rrlC、rrlD、rrlE、rrlG和rrlH(Lindhal等.1986;Nomura等.，1984)。按常規(guī)，術(shù)語"mz/F，指編碼核糖體RNA(23S、16S和5S)的rrnlE基因，而術(shù)語"皿F，指mz/五基因產(chǎn)物，即核糖體RNA多肽。rm/五等價(jià)物存在于大多數(shù)的生物中，如果不是存在于所有的生物中的話。示例性的庁"近序列是GeneID號(hào)9485094所指的序列。每個(gè)rRNA操縱子含有被多個(gè)tRNA基因所間隔的16SrRNA基因、23SrRNA基因和5SrRNA基因。rrlD操縱子含有兩個(gè)5SrRNA基因。"rrs"基因編碼16SrRNA,"rrl"基因編碼23SrRNA,"nf，基因編碼5SrRNA。在有利的實(shí)施方案中，RNA操縱子包含選自/r/J、w/5、〃/C、〃伍、〃/G和rr/7/的基因。在其他方面，本發(fā)明提供包含前文所迷的整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記^皮去除。一般來說，編碼抗生素標(biāo)記的基因在重組工程技術(shù)中用來鑒定或標(biāo)記特定的基因型/表型的存在。在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的本發(fā)明重組生物可^皮抗生素標(biāo)記的存在所抑制。因此，將這種抗生素標(biāo)記,人重組生物中去除是有利的。在一些實(shí)施方案中，被確定來進(jìn)行去除的抗生素標(biāo)記包括例如選自安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和氯霉素的抗生素標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，安普霉素標(biāo)記和卡那霉素標(biāo)記^皮去除。在還其他的方面，本發(fā)明提供包含前文所述的整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因被滅活。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的基因，都可被靶向滅活。可被耙向滅活的基因包括但不限于包含/oc^p/7萬基因區(qū)域、W/l4、ac/U、"J/^、/W操縱子、cfl"5和mg^的基因。因此，在某些實(shí)施方案中，編碼參與NADH氧化的所有發(fā)酵途徑的多肽的基因被滅活。在具體的實(shí)施方案中，編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的多肽的基因被滅活。這種基因包括例如ac)b4#ac//LE。^cL4和爿說￡一起形成乙醇生產(chǎn)的浪費(fèi)性途徑，這個(gè)途徑在某些實(shí)施方案中可作為浪費(fèi)性的HADH使用途徑加以消除。LDHA通過丙酮酸向乳酸的同時(shí)產(chǎn)生-還原來消除NADH的氧化。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，w5"g^基因通過缺失來滅活。這個(gè)基因編碼參與曱基乙二醛旁路途徑這個(gè)溢出途徑(spilloverpathway)的蛋白質(zhì)，該途徑是大腸桿菌中乳酸的潛在來源，會(huì)減慢糖酵解和大分子合成(Totemeyer等.1998，Zhu爭(zhēng).2001)。在某些實(shí)施方案中，所述基因是宿主細(xì)胞的內(nèi)源基因。內(nèi)源基因包括但不限于M^、adb4、a^l&、包含/n/操縱子的基因、包含/od//^基因區(qū)域的基因和mg"。在其他實(shí)施方案中，所述基因是宿主細(xì)胞的異源基因。異源基因包括但不限于cfl5^8。在其他的方面，本發(fā)明提供包含前文所述的整套異源產(chǎn)乙醇基因、且還包含一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因的重組細(xì)菌。這種基因可以是內(nèi)源基因或異源基因，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)整合到宿主細(xì)胞中。40在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含前文所述的整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，且其中該重組細(xì)菌是通過包括本發(fā)明任何方面所述的方法各步驟的方法來制備。任何編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因，都可被乾向整合到宿主細(xì)胞中。這種基因包括例如編碼以下蛋白質(zhì)和酶的基因分泌性蛋白、多糖酶如葡聚糖酶(如內(nèi)切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶)、纖維二糖水解酶、卩-葡萄糖苷酶、內(nèi)切-l,4-P-木聚糖酶、(3-木糖苷酶、cc-葡糖醛酸酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、a-淀粉酶、(3-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、(3-葡聚糖酶、半纖維素酶、阿拉伯糖苦酶、甘露聚糖酶、果膠水解酶或果膠酸裂合酶。天然基因或衍自天然基因的基因都可進(jìn)行整合。因此，本發(fā)明的這個(gè)方面涵蓋與天然基因不同的基因或基因產(chǎn)物，包括例如具有被突變、插入或缺失的核酸，但編碼與天然基因產(chǎn)物基本上相似和功能上等同的多肽的基因。在某些實(shí)施方案中，基因例如惡臭假單胞菌(NRRLB-18435)的estZ基因編碼酯酶。e^Z基因的整合有助于減少乙酸乙酯這種乙醇生產(chǎn)的次要副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在最終純化步驟中從乙醇分離乙酸乙酯會(huì)增加工藝成本。雖然所產(chǎn)生的乙醇收率的增加可能微不足道，但乙醇的生產(chǎn)得到了促進(jìn)，因?yàn)槿绻宜嵋阴サ漠a(chǎn)生被減少，乙醇純化成本的變化會(huì)更加明顯。其他可加以考慮的另外的基因包括但不限于編碼小的糖類和多糖的水解的酶的基因，例如催產(chǎn)克雷伯氏桿菌的ca"5和菊歐文菌的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的ce/y和ce/Z。在其他實(shí)施方案中，基因例如大腸桿菌的/a"基因和/flcy基因分別編碼半乳糖轉(zhuǎn)乙酰酶和通透酶。在還其他的實(shí)施方案中，示例性的基因包括編碼分泌性蛋白的基因，例如基因和ow基因(WO2000/071729);編碼進(jìn)行小的糖類和多糖的水解的酶的基因，例如催產(chǎn)克雷伯氏桿菌的caWA基因(美國(guó)專利第6,102,690號(hào))；菊歐文菌的編碼內(nèi)切葡聚糖酶的ce/7基因和ce/Z基因(美國(guó)專利第7,026,152號(hào))；和編碼葡萄糖攝取途徑的基因(美國(guó)專利第5，602，030號(hào))。本發(fā)明提供的重組生物通過它們產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的能力來表征。它們進(jìn)一步通過它們當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的能力來表征。如所討論，本發(fā)明的重組生物包含整套異源產(chǎn)乙醇基因，因此是產(chǎn)乙醇的。所謂"產(chǎn)乙醇的"是指所產(chǎn)生的乙醇占總非氣態(tài)產(chǎn)物的40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%以上。主要發(fā)酵產(chǎn)物是在厭氧條件下特別是當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)所產(chǎn)生的最豐富的非氣態(tài)產(chǎn)物。示例性的根據(jù)本發(fā)明的重組生物是新的大腸桿菌菌林LY165(NRRLB-30952)和LY168(NRRLB-30953)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，這些新的大腸桿菌菌抹是從用作宿主細(xì)胞的重組大腸桿菌K011(ATCC55124)(Ohta等.1991)產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，這些新的大腸桿菌菌抹可從大腸桿菌菌抹SZ110(NRRLB-30951)產(chǎn)生。產(chǎn)生這些新的菌林的方法在下文實(shí)施例中描述。根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)菌例如大腸桿菌菌株LY165(NRRLB-30952)和LY168(NRRLB-30953)，當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)能產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。礦物鹽培養(yǎng)基是這樣的培養(yǎng)基，它能夠使本發(fā)明的重組細(xì)菌在根據(jù)本發(fā)明方法的厭氧條件下生長(zhǎng)，而不需要添加復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)物。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的礦物鹽培養(yǎng)基可定義為每升含有3.5gKH2P04、5.0gK2HPO4、3.5g(NH4)2HP04、0.25gMgSO4*7H2O、15mgCaCl2'2H2C)、0.5mg硫胺素和ImL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)加2(w/v)。/。-9(w/v)。/。木糖。痕量金屬儲(chǔ)液可在0.1MHC1中制備(每升1.6gFeCl3*6H20、0.2gCoCl2*6H20、O.lgCuCl2*2H20、0.2gZnCl2、0.2gNa2MoO4'2H2O、0.05gH3BO3)(Causey等.，2003)。在有利的實(shí)施方案中，可將甜菜堿這種公知的細(xì)菌滲透保護(hù)劑加到礦物鹽培養(yǎng)基中。在其他的實(shí)施方案中，礦物鹽培養(yǎng)基可定義為AMI培養(yǎng)基，每升含有2.63g(NH4)2HP04、0.87gNH4H2P04、0.375g/L42MgS04'7H20、0.149gKCl、.0163g甜菜堿HC1(pH7.4)和1.5mL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)加2(w/v)%-14(w/v)Q/o所指定的糖。這一微量鹽培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中被描述為AMI培養(yǎng)基(Martinez等.，2007)。在更多的實(shí)施方案中，痕量金屬儲(chǔ)液可在0.1MHC1中制備(每升1.6gFeCl3*6H20、0.2gCoCl2'6H20、O.lgCuCl2*2H20、0.2gZnCl2、0,2gNa2Mo04'2H20、0,05gH3BO3、0.33gMnCl2'4H20)。///.本發(fā)明提供制備具有前述屬性的重組生物的方法。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌的方法，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。所述方法包括將所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到宿主細(xì)菌中，從而產(chǎn)生能生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的重組細(xì)菌的步驟。制備重組產(chǎn)乙醇微生物的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域公知的。合適的材料和方法及重組宿主生物在例如美國(guó)專利7,026,152、6,849,434、6,333,181、5，821，093、5,482,846、5，424，202、5,028,539、5,000，000、5,487，989、5，554，520和5,162,516及WO2003/025117(這些專利通過引用結(jié)合到本文中)中有描述，它們可用于實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明的細(xì)菌包含整套異源產(chǎn)乙醇基因。所述整套基因包括在生物中被基因間DNA(即天然側(cè)接(flank)生物的染色體DNA中的基因和/或分隔這些基因的間插DNA(interveningDNA)或間隔DNA(spacerDNA》使之與另一基因或其他的基因分隔開來的核酸分子(例如DNA分子或其區(qū)段)，例如編碼多肽或RNA的核酸分子。基因可指導(dǎo)酶或其他多肽分子的合成(例如可包含編碼序列，如編碼多肽的毗鄰開放讀框(ORF)),或者它可自己在生物中具有功能。如本文所定義，生物中的基因可簇集在操縱子中，其中該操縱子被基因間DNA使之與其他基因和/或操縱子隔開。操縱子當(dāng)中所含的各個(gè)基因可重疊，使得各個(gè)基因之間沒有基因間DNA。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是無啟動(dòng)子的操縱子，這是缺乏啟動(dòng)子部分的操縱子(例如yw操縱子)。本文所述的分離基因包括這樣的基因，它基本上沒有天然側(cè)接生物(它從該生物衍生)的染色體DNA中的基因的序列(即沒有編碼第二或不同的多肽或RNA分子的鄰接(adjacent)編碼序列、鄰接結(jié)構(gòu)序列等)，且任選包括5'調(diào)節(jié)序列和3'調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子序列和/或終止子序列。分離基因包括多肽的優(yōu)勢(shì)編碼序列(predominantlycoding序列)(例如編碼PDC多肽的序列)。如上所述，所述整套異源產(chǎn)乙醇基因被摻入的宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌，也稱為"親本菌林"。在一些實(shí)施方案中，親本菌林是非重組細(xì)菌。例如，親本菌抹可以是天然的非產(chǎn)乙醇細(xì)菌，例如大腸桿菌W。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，親本菌林可以是重組生物。在這種實(shí)施方案中，親本菌林可含有編碼能減少該菌抹例如在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的野生型基因和異源基因。野生型基因包括在親本菌林中存在的基因。異源基因包括加入到了親本菌抹中的夕卜生(exogenous)基因。供用于本發(fā)明方法的示例性宿主細(xì)胞包括例如大腸桿菌菌林K04(ATCC55123)、KOll(ATCC55124)和K012(ATCC55125)及催產(chǎn)克雷伯氏桿菌菌抹P2(ATCC55307)(美國(guó)專利5,821,093)。合適的宿主細(xì)胞的其他實(shí)例包括大腸桿菌(ATCC11303)、大腸桿菌DH5a、大腸桿菌K04(ATCC55123)、大腸桿菌LY01(ATCCPTA-3466)、大腸桿菌W(ATCC9637)和催產(chǎn)克雷伯氏桿菌M5A1(ATCC68564)。本發(fā)明還涵蓋本文所述的制備重組生物的方法的各個(gè)實(shí)施方案。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到核糖體RNA操縱子中。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，核糖體RNA操縱子包含選自〃/丄at"C、rWZXat伍、^r/G和r/"7/的基因。在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，核糖體RNA操縱子包含〃/五。44在還另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括去除一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗生素標(biāo)記選自安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨千青霉素和氯霉素。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗生素標(biāo)記是安普霉素和卡那霉素?？股貥?biāo)記可通過用本領(lǐng)域公知的多種方法的任何一種滅活(例如通過缺失來滅活)編碼該標(biāo)記的基因來去除。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，編碼抗生素標(biāo)記如卡那霉素和安普霉素的基因是用重組酶通過同源重組來去除。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括滅活一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因。根據(jù)本發(fā)明，這種基因是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法的任何一種來滅活，由此使得基因停止編碼其目的多肽或者停止編碼其目的多肽的活性形式。因此，這種基因是通過例如突變、缺失、插入、復(fù)制、錯(cuò)義、移碼、重復(fù)、無義突變或者其他的改變或修飾來的多肽。根據(jù)本發(fā)明的有利的實(shí)施方案，基因是通過缺失來滅活。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括整合一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的異源基因。上述的用以整合所述整套產(chǎn)乙醇基因的方法，同樣可用來整合編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，基于前述實(shí)例和基于各細(xì)菌菌林之間的同源性，本發(fā)明的方法并不限于本申請(qǐng)中所教導(dǎo)的菌林。炎^才法-^產(chǎn)乙舉^才法本發(fā)明的重組細(xì)菌能從寡糖來源生產(chǎn)乙醇。因此，本發(fā)明提供從寡糖來源生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括使所述寡糖與本發(fā)明的重組細(xì)菌在適于乙醇生產(chǎn)的條件下進(jìn)行接觸，從而從寡糖來源生產(chǎn)出乙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡糖和重組細(xì)菌是在任選含有甜菜力咸的礦物鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行接觸。在一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，重組細(xì)菌在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并以高濃度產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明方法，本文所述的重組細(xì)菌能將復(fù)雜糖類降解或解聚成單糖。隨后，重組細(xì)菌憑借其所攜帶的所述整套異源產(chǎn)乙醇基因，通過發(fā)酵將更簡(jiǎn)單的糖分解代謝成乙醇。復(fù)雜糖類解聚成更小的糖殘基后同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵的這一過程，稱為同步糖化和發(fā)酵(SSF)。通常，發(fā)酵條件選擇成能提供促進(jìn)生產(chǎn)者即宿主細(xì)胞林的最佳生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的最佳pH和溫度以及培養(yǎng)物所產(chǎn)生的酶的催化條件(Doran等.，(1993)腸/ec/mo/.尸，固.9:533-538)。美國(guó)專利5,487,989和5,554,520中公開了多種示例性的發(fā)酵條件。在某些實(shí)施方案中，最佳條件包括約25至約43。C的溫度和約4.5-8.0的pH。其他的條件在實(shí)施例中討論。此外，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，僅需使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，就可以優(yōu)化本發(fā)明的給定發(fā)酵反應(yīng)。目前，復(fù)雜糖類如木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化是一個(gè)非常繁雜的多步驟過程。例如，木質(zhì)纖維素必須首先用酸水解進(jìn)行降解或解聚。緊接的步驟是進(jìn)行固液分離，所得產(chǎn)物隨后進(jìn)行洗滌和去毒，以產(chǎn)生可進(jìn)一步進(jìn)行解聚的纖維素，最后通過合適的產(chǎn)乙醇宿主細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵。與之對(duì)比，玉米的發(fā)酵要簡(jiǎn)單得多，因?yàn)榭稍诨旧弦粋€(gè)步驟的工藝中，用淀粉酶來降解玉米淀粉，以讓產(chǎn)乙醇宿主直接進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。因此，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的重組宿主和方法提供了使用類似地更簡(jiǎn)單和更有效的工藝來發(fā)酵木質(zhì)纖維素。例如，本發(fā)明方法意在涵蓋完全避免酸水解的方法。此外，本發(fā)明的宿主具有以下優(yōu)點(diǎn)l)能有效進(jìn)行戊糖和己糖共發(fā)酵；2)對(duì)毒素有抗性；3)能產(chǎn)生同步糖化發(fā)酵用的酶；和4)有環(huán)境耐久力。因此，用本發(fā)明的改進(jìn)的生物催化劑，可使木質(zhì)纖維素的解聚復(fù)雜性得到簡(jiǎn)化。的確，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)可在單一反應(yīng)容器中和在酸水解不存在下進(jìn)行，例如作為SSF工藝來進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠使用迄今為止未得到充分利用的糖源。因此，有許多復(fù)雜的糖底物可用作原料，供使用本發(fā)明的重組細(xì)菌和方法進(jìn)行解聚和隨后發(fā)酵。理想地，可將可再循環(huán)的資源用于SSF工藝中?；旌系膹U辦公用紙是優(yōu)選的底物(Brooks等.，(1995)Aofec/mo/.iVogm^.11:619-625;Ingram等.，(1995)U.S.P.N.5,424,202)，比酸預(yù)處理的甘蔗渣(Doran等.，(1994)Ao/ec/.44:240-247)或高度純化的結(jié)晶纖維素(Doran等(1993)說ofedmo/./Vogm^.9:533-538)要容易消化得多。葡聚糖酶(內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶)含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過用離心收獲未消化的纖維素殘余物，可容易地將這些酶再循環(huán)用于隨后的發(fā)酵(Brooks等.，(1995)歷otec/mo/.尸rag^M.11:619-625)。這種方法對(duì)純化的纖維素很適用，盡管對(duì)于木質(zhì)素含量較高的底物，再循環(huán)步驟的次數(shù)可能受限。落入本發(fā)明范圍內(nèi)的其他底物來源，包括任何類型的經(jīng)加工或未經(jīng)加工植物材料，例如草坪草屑、皮殼、玉米穗軸、莖干、葉子、纖維、紙漿、大麻、鋸屑、報(bào)紙等。如上所述，本發(fā)明提供的重組生物能產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物，特別是當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)。在礦物鹽培養(yǎng)基中，本發(fā)明的新的重組大腸桿菌LY168在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物不存在下以45.5g/L的速率產(chǎn)生乙醇，新的重組大腸桿菌LY165在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物不存在下以44.9g/L的速率產(chǎn)生乙醇。與之對(duì)比，大腸桿菌KOll在礦物鹽培養(yǎng)基中在復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物不存在下以26.9g/L的速率產(chǎn)生乙醇，在添加復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物后以43.2g/L的速率產(chǎn)生乙醇。因此，本發(fā)明的新的重組大腸桿菌LY168和LY165在礦物鹽培養(yǎng)基中不需添加昂貴的復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物，就能比大腸桿菌KOll產(chǎn)生更多的乙醇。本發(fā)明通過以下實(shí)施例做進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例47才才泮牛和方法在下文的各實(shí)施例中用到以下材料和方法。1.^參和凝#務(wù)斧菌抹和質(zhì)粒下表1列出了用以構(gòu)建本發(fā)明的重組微生物的生物和質(zhì)粒。表l.大腸桿菌菌林和質(zhì)粒<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>大腸桿菌DH5a、S17-1V^和TOP10F，用作構(gòu)建用宿主，在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。氨芐青霉素(50mg/升)、卡那霉素(50mg/升)、氯霉素(40mg/升)和安普霉素(50mg/升)適當(dāng)時(shí)添加以進(jìn)行選擇。溫度條件性質(zhì)粒在30°C下生長(zhǎng)；所有其他的在37°C下生長(zhǎng)。再工程改造的產(chǎn)乙醇菌林在NBS礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Causey等.,2003)，該培養(yǎng)基每升含有3.5gKH2PO4、5.0gK2HPO4、3.5g(NH4)2HPO4、0.25gMgS04'7H20、15mgCaCl2'2H20、0.5mg硫胺素和lmL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)充以2(w/v)y。-9(w/v)。/o木糖。痕量金屬儲(chǔ)液可在0.1MHC1中制備(每升1.6gFeCl3、0.2gCoCl2'6H20、O.lgCuCl2、0.2gZnCl2'4H20、0,2gNaMoO斗、0.05gH3BO3)。在指定的情況中，按(Underwood等.2004)描述添加甜菜石威(1mM)和MOPS(4-嗎啉丙磺酸)緩沖液(IOOmM,pH7.4)。在開發(fā)了LY168后，使用更為經(jīng)濟(jì)的礦物鹽培養(yǎng)基即AMI培養(yǎng)基(Martinez等.，2007)，該培養(yǎng)基每升含有2.63g(NH4)2HP04、0.87gNH4H2P04、0.375g/LMgS04*7H20、0.149gKC1、.0163g甜菜堿HC1(pH7.4)和1.5mL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)充以2(w/v)%-14(w/v)。/。所指定的糖。痕量金屬儲(chǔ)液可在0.1MHC1中制備(每升1.6gFeCl3'6H20、0.2gCoCl2*6H20、0.1gCuCl2'2H2O、0.2gZnCl2、0.2gNa2Mo04'2H20、0.05gH3B03、0.33gMnCl2*4H2O)。產(chǎn)乙醇菌林按之前的描述(Conway爭(zhēng).1987)在醛指示劑平板上篩選其醇脫氫酶活性。酯酶活性用之前描述的曱基紅測(cè)定法(Hasona等.2002)進(jìn)行;險(xiǎn)查。纖維二糖利用情況用添加2%纖維二糖的MacConkey瓊脂進(jìn)行評(píng)估。內(nèi)切葡聚糖酶活性在CMC瓊脂平板上進(jìn)行評(píng)估(Wood等.，1997)。2.遽傳夢(mèng)才法除另有描述的外，質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、電穿孔、綴合和PCR擴(kuò)增都使用標(biāo)準(zhǔn)的方法(Miller，1992;Sambrook&Russell2001)。51caf-sac5雍#在使用ca"acB盒進(jìn)行的第一次重組中，將靶標(biāo)基因的一部分用含有氯霉素抗性基因(c^)和果聚糖蔗糖酶基因(Mc5)的DNA盒替代。在第二次重組中，通過選擇對(duì)蔗糖的抗性，接著試驗(yàn)對(duì)氯霉素的敏感性，來去除ca""c5盒。含有J"C^基因的細(xì)胞在與嚴(yán)糖溫育過程中積累果聚糖并被殺滅。存活的重組子因?yàn)槭ズ械玫礁叨雀患?。?gòu)建新的盒作為模板以促進(jìn)基因缺失。ca"acS區(qū)域最初用引物對(duì)JMcatsacBNheI(表2)通過PCR從pEL04(Lee等.，2001;Thomason等.，2005)擴(kuò)增，用NheI消化，進(jìn)行修飾并連接到經(jīng)修飾的pUC19載體中，其中Pacl位點(diǎn)側(cè)接所插入的盒，從而產(chǎn)生pLOI4162。c"z-sacB盒可用PacI消化，在后續(xù)的連接中使用。所描述的方法中用到的引物在下表2中列出。表2.引物<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>&包括3<///位點(diǎn)；b包括五coi/位點(diǎn)；e包括&e/位點(diǎn)；d在rm^當(dāng)中；e在；dc當(dāng)中；f包括Mf/位點(diǎn)將7b《PCRMasterMix(QIAGEN,Inc.,Valencia,CA)用來構(gòu)建缺失和用于分析。將Platinum尸ADNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和Easy-AHigh-FidelityPCRCloningEnzyme(Stratagene，LaJolla，CA)用來擴(kuò)增用于染色體整合的功能基因。使用質(zhì)粒pKD46(Datsenko&Wanner2000)來促進(jìn)線性化DNA的整合。將i^r側(cè)接的抗生素基因用于選擇以促進(jìn)隨后用重組酶進(jìn)行的去除(Martinez-Morales等.1999;Posfai等.1997)。通過PCR分析和表型來驗(yàn)證染色體構(gòu)建情況。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抗生素標(biāo)記例如抗生素基因標(biāo)記可通過同源重組來去除。同源重組是用能向靶標(biāo)DNA中引入位點(diǎn)特異性斷裂(site-specificbreak)的重組酶如重組酶來進(jìn)行。3.發(fā)'發(fā)發(fā)酵是按Underwood等.2004的描述,在帶有自動(dòng)pH控制器(37。C:pH6.5和150rpm;350ml工作體積)的500mL發(fā)酵罐中，用NBS礦物鹽培養(yǎng)基(9%木糖和1mM甜菜堿(在指定情況下))或AMI培養(yǎng)基(95或14%木糖(在指定情況下))來進(jìn)行。預(yù)接種物在靜置(standing)螺旋蓋管中的含有9.0(w/v)。/。木糖和lmM甜菜堿的NBS礦物鹽培養(yǎng)基中37。C生長(zhǎng)24-48h,然后轉(zhuǎn)移到小發(fā)酵罐中。溫育24h后，將肉湯用來接種以進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)酵(10-16mgdewl"接種物)。在一些情況中，在24h或48h后將小發(fā)酵連續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，以對(duì)生長(zhǎng)和乙醇生產(chǎn)的改進(jìn)作共選擇(co-select)。對(duì)于種子試驗(yàn)或發(fā)酵試驗(yàn)，都沒有向肉湯添加抗生素。4為、浙才法細(xì)胞密度由Bausch&LombSpectronic70分光光度計(jì)在550nm處測(cè)得的光密度來估計(jì)。乙醇通過氣相色譜(Ohta等.1991)來測(cè)量。有機(jī)酸按(Causey等.2003)的描述通過HPLC來測(cè)定。實(shí)施例1運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇基因的新宿主菌抹的構(gòu)建通過缺失/oc^-;/W區(qū)域(Zhou等.2005)從K011去除編碼產(chǎn)乙醇基因(pcfc、ac/A萬、car)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌盒。編碼丙酮酸代謝的替代途徑的另外的基因，包括"cW和^Z/lE在內(nèi)，也進(jìn)行缺失，只留下D(-)-乳酸脫氫酶(W/L4)。所得的菌林SZ110及其進(jìn)一步的衍生菌株，在含有1mM甜菜堿的礦物鹽培養(yǎng)基中高產(chǎn)率產(chǎn)生乳酸(Zhou等.2005;Zhou等，2006)。參見圖1A，菌抹SZ110是通過首先缺失W/l4,再工程改造為插入來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的新乙醇基因的宿主。使用表2所列的引物克隆到pCR2.1-TOPO中后，將中央的iKfel至片4殳(484bp,Klenow處理)用含有來自pLOI3421(Wood等.2005)的FAr側(cè)接基因的Klenow處理5Vwal至五coRI片段(1，942bp)進(jìn)行替代，產(chǎn)生pL013497。所得的盒(W/L4'-i^r-加c-Fir-W/L4，)作為2.5kb五coRI片段去除，以整合到SZ110中。用重組酶消除aac后，所得的菌林標(biāo)示為L(zhǎng)Y149。LY149菌株缺乏厭氧NADH氧化的所有主要途徑，甚至在豐富培養(yǎng)基中也不能夠以糖進(jìn)行發(fā)酵生長(zhǎng)。由于LY149中fl^五和的缺失使得;^5的缺失不必要，因此這個(gè)區(qū)域用來自pLOI39(U(圖1B)的含有大腸桿菌W的少caA^/o"區(qū)域的9kb片段通過同源重組進(jìn)行恢復(fù)。為構(gòu)建這個(gè)質(zhì)粒，將//L5區(qū)域(yc"(9吵c"W)擴(kuò)增為2個(gè)PCR片段，分三塊裝配到pL013495中1)連4妄到獨(dú)特五coRV位點(diǎn)和賴'mffll位點(diǎn)中的至S/cI(Klenow)片段(ycaiV'-;;cai:;764bp);2)連接到Klenow處理的S;e/位點(diǎn)中的Klenow處理的片段fe/L4-z/75';2，084bp);和3)連接到pL013495的相應(yīng)位點(diǎn)中的至片段(p/7'-_yca6>;4,657bp)。在pLOI3901中，供進(jìn)行選擇的FRT側(cè)接的aac基因位于少c^:和pyL4之間。戶/^的功能通過用至賴'wJin片段(ycaO/ocJ-py^fyM-FRT-awFRT-^r"STl終止子-7c"《吵ca^)進(jìn)行55同源重組來在菌抹LY149中進(jìn)行恢復(fù)，并篩選安普霉素抗性。所得的菌林標(biāo)示為L(zhǎng)Y151;這個(gè)菌抹產(chǎn)生了曱酸，表明有丙酮酸曱酸裂合酶(p/釣活性。實(shí)施例2含有整套運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇基因的轉(zhuǎn)座體(transposome)的構(gòu)建在之前的研究中，將礦物套(mineralset)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因(pc/c、ac//LS、供進(jìn)行選擇)整合在大腸桿菌的啟動(dòng)子后面，構(gòu)建出KOll(Ohta等.1991)。與之對(duì)比，采取了不同的程序，使用新的載體pLOD491(如圖1C所示)，用Tn5轉(zhuǎn)座子將含有整套(fullset)乙醇基因(pdc、和WA5)的無啟動(dòng)子的操縱子與可去除的抗生素標(biāo)記進(jìn)行隨機(jī)整合。質(zhì)粒pL013491是如下構(gòu)建的。將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌aJ/L4基因(含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)和帶側(cè)接^el位點(diǎn)的翻譯終止子的PCR產(chǎn)物；1,157bp;表2)連接到pL01295中；^c和W/l5之間的獨(dú)特位點(diǎn)。所得的無啟動(dòng)子的操縱子(4,352bp)通過用EcoRI和S"wHI消化來去除，并連接到鄰近pL013472中FiJ1側(cè)接的々"w基因的相應(yīng)位點(diǎn)中。這產(chǎn)生出5,587bp的尸acl側(cè)接的盒(^^-^/^-^/^-尸^7^朋-/^7),該盒隨后插入到pL013469的獨(dú)特尸acl位點(diǎn)中(在串聯(lián)的Tn5整合位點(diǎn)之間)，產(chǎn)生出pL013491(圖1C)。這個(gè)綴合的質(zhì)粒還含有Tn5轉(zhuǎn)座酶(/"/)、Wa和與被耙向進(jìn)行整合的區(qū)段反向的條件復(fù)制子(R6K)。實(shí)施例3新的產(chǎn)乙醇大腸桿菌的整合和選擇供體菌抹S17-R;^因?yàn)閷?duì)脯氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型要求，不能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。受體菌抹LY151因?yàn)槿狈ADH氧化的途徑，不能夠以發(fā)酵方式生長(zhǎng)。這兩方面結(jié)合在一起提供了不用抗生素就可進(jìn)行直接功能選擇的獨(dú)特機(jī)會(huì)。由于糖酵解和生長(zhǎng)進(jìn)行的ATP產(chǎn)生與56發(fā)酵途徑的功能表達(dá)專性偶聯(lián)(obligatelycoupled),因此采用對(duì)在NBS礦物鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)的選擇，來從一文庫(kù)的(alibraryof)攜有產(chǎn)乙醇盒的隨機(jī)LY151接合后體共選擇出最佳的產(chǎn)乙醇菌株(插入位點(diǎn)、表達(dá)水平)。使S17-a;&(pLOI3491)和LY151在LB平板(2%葡萄糖)上交配。將集中的接合后體接種到1升瓶子中，用NBS礦物鹽培養(yǎng)基(5。/。木糖,100mMMOPS,pH7.4)充滿瓶，37°C(150rpm)下溫育。溫育3天后生長(zhǎng)明顯可見，此時(shí)開始以48小時(shí)間隔在15ml螺旋蓋培養(yǎng)管中進(jìn)行系列轉(zhuǎn)移(O.lml接種物)，接著在小的pH控制的發(fā)酵罐中進(jìn)行系列轉(zhuǎn)移(省去MOPS)(33mgdew1"接種物)。在這一工作過程中，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加甜菜堿對(duì)于由KOll進(jìn)行的木糖發(fā)酵是有利的，因此在最初IO次轉(zhuǎn)移后將這個(gè)補(bǔ)加包括在內(nèi)作為補(bǔ)充。在有甜菜堿(lmM)的情況下，培養(yǎng)物以24小時(shí)的間隔進(jìn)行轉(zhuǎn)移，因?yàn)樗鼈兩L(zhǎng)更快。在這一富集過程中(包括38次轉(zhuǎn)移)，細(xì)胞產(chǎn)率和乙醇生產(chǎn)都得到穩(wěn)定的改進(jìn)。從最后一次轉(zhuǎn)移分離菌落。所有菌落都對(duì)氨芐青霉素敏感(證明不存在載體)，對(duì)安普霉素有抗性(證明受體中有被間斷的基因)和對(duì)卡那霉素有抗性(存在著乙醇盒)。試^r了六個(gè)克隆在小發(fā)酵中的性能，都非常相似。選擇出兩個(gè)克隆，標(biāo)示為L(zhǎng)Y158和LY159。用重組酶同時(shí)去除兩個(gè)抗生素標(biāo)記。從LY158和LY159所得的克隆有超過99%被卡那霉素和安普霉素兩者抑制。LY158和LY159各取10個(gè)克隆集中在一起，用來接種小發(fā)酵罐，以進(jìn)一步進(jìn)行基于生長(zhǎng)的選擇。在NBS-9。/。木糖培養(yǎng)基(1mM甜菜堿)中以24小時(shí)間隔進(jìn)行了7次系列轉(zhuǎn)移后，分離出12個(gè)克隆，各自在小發(fā)酵中進(jìn)行試驗(yàn)。它們都很相似，選出兩個(gè)，標(biāo)示為L(zhǎng)Y161和LY160。用LY160再進(jìn)行另一組32次系列轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔)，結(jié)果顯示在性能上有持續(xù)的改進(jìn)。從最后一次轉(zhuǎn)移分離出一個(gè)克隆，標(biāo)示為L(zhǎng)Y160im。實(shí)施例4乙醇基因在大腸桿菌菌抹LY160im中的整合位點(diǎn)用來自菌株LY160im的經(jīng)」EboRI消化的DNA在pUC18中構(gòu)建基因文庫(kù)，在醛指示劑平板上篩選紅色菌落，以鑒定含有整合的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因的片段。選出一個(gè)含有10.2kb插入片斷的質(zhì)粒(pLOI3951)進(jìn)行亞克隆和部分測(cè)序。測(cè)序揭示^fc-^Z/L4-a必5-Fir盒整合在高度表達(dá)的/r"萬基因(23S核糖體RNA)當(dāng)中，與轉(zhuǎn)錄的方向一致(如圖1D所示)。設(shè)計(jì)出了驗(yàn)證插入位點(diǎn)的引物(如表2所示)。實(shí)施例5casAB的缺失在木糖-NBS礦物鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇及構(gòu)建LY160和LY161的過程中，盡管催產(chǎn)克雷伯氏桿菌^wJ5基因保持整合在/ac操縱子中，但纖維二糖利用能力下降(Zhou等.2005)。如圖1E所示，構(gòu)建了質(zhì)粒pL013924以通過同源重組來缺失這些功能不良的基因。用表2所示的引物和用KOllDNA作為才莫板，將/flc^和/ac;r分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆到pCR2.1-TOPO中。質(zhì)粒pLOD924以三個(gè)連續(xù)的步驟進(jìn)行構(gòu)建l)將克隆的/"o4片段(5amHI至iVort;644bp)連接到pLOI3470中的相應(yīng)位點(diǎn)；2)將/acY至Klenow處理5awHI;1,292bp)連接到WoI位點(diǎn)和Klenow處理&o0109I位點(diǎn)；和3)將5Vwal片段(F7r-A:fl"-Fir;1，228bp)從pLOI25U插入到Klenow處理5awHI位點(diǎn)和MM(/flcy當(dāng)中)位點(diǎn)中。所得的質(zhì)粒含有尸flcl側(cè)接的/acnir-fem-Fir-/ac^盒(2,984bp)，該盒用來通過同源重組替代LY160im中的caM5基因。用重組酶缺失掉fem后，所得的菌林標(biāo)示為L(zhǎng)Y163。實(shí)施例6酯酶的添加之前的研究已證明在來自KOll的蒸餾物中有低水平的乙酸乙酯；這個(gè)問題通過功能上整合來自惡臭假單胞菌NRRLB-18435的編碼短鏈酯酶的eWZ基因來進(jìn)行矯正(Hasona等.2002)。為使對(duì)LY163的潛在損害減至最低，我們構(gòu)建了新的質(zhì)粒來促進(jìn)啟動(dòng)子選擇和讓eWZ整合到部分缺失的a^五基因中。用表2所示的引物和分別用NC3DNA和pAH181作為模板，擴(kuò)增無啟動(dòng)子的a必五(2,715bp)基因和(1,083bp)基因，并克隆到pCR2.1-TOPO中。用含有e^Z(核糖體結(jié)合位點(diǎn)、編碼區(qū)域和終止子區(qū)域)的5g/H至Klenow處理五coRI片段(l,083bp)，替代^/^的中央?yún)^(qū)域0^///至幻6110\￥處理&/1;1,408bp)。將所得的WM:，-as/Z-afif/L&，盒(Klenow處理iVort至J5amHI片段；2，471bp)連接到pLOI3470的幻enow處理歷"Jin(平端)至S"wHI區(qū)域(204bp)。將來自pLOI3421的含有FWr側(cè)接的"ac基因的片段(1,956bp)插入到Klenow處理位點(diǎn)中。用尸acl消化后，將W/LE:，-eWZ-F7r-aac-i^r-W/z五'盒(4,484bp)移到pLOI3918的尸acl位點(diǎn)中。所得的質(zhì)粒pLOI3920(圖1F)含有供在eWZ核糖體結(jié)合位點(diǎn)上游插入啟動(dòng)子片段的獨(dú)特5gffl位點(diǎn)和溫度敏感性pSC101復(fù)制子。將來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的經(jīng)Saw3A消化的染色體DNA連接到pLOI3920的5g/II位點(diǎn)中，在菌抹NC3中篩選啟動(dòng)子(酉旨酶)活性。從300個(gè)陽性克隆選出兩個(gè)質(zhì)粒，標(biāo)示為pLOI3925A和pLOI3925C。將含有功能酯酶盒(a^LE，-Zw啟動(dòng)子-eWZ-FRT-aac-FRT-W/LE')的片段整合到LY163中，并篩選安普霉素抗性。用重組酶缺失掉aac后，所得的菌林分別標(biāo)示為L(zhǎng)Y165A和LY165C。實(shí)施例7mgsA的缺失曱基乙二醛旁路是大腸桿菌中乳酸的潛在來源(Zhu爭(zhēng).2001)。為消除這一不需要的產(chǎn)物，將編碼甲基乙二酪合酶的mg^這個(gè)第一關(guān)鍵步驟進(jìn)行缺失。用表2所示的引物(SEQIDNO:9和SEQIDNO:10),用NC3基因組DNA作為模板，擴(kuò)增mg^基因，然后克隆到pCR2.1-TOPO中。中央的SWEII至^gel(Klenow處理)片段(66bp)用來自pL013421的攜帶FRT側(cè)接的aac基因的平端Smal至五coRI(Klenow處理)片段(1,942bp)進(jìn)行替代，產(chǎn)生pLOI3940。用克隆用的引物擴(kuò)增wgW-FRT-加c-FRT-mgW盒(2,456bp)(圖1G)，并整合到LY165C中。用重組酶去除aac后，所得的菌^f朱標(biāo)示為L(zhǎng)Y168。實(shí)施例8在礦物鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵木糖如圖2和3所示的曲線圖顯示，含有整套運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇基因的菌抹LY161和LY165C，在NBS礦物鹽培養(yǎng)基中在添加和不添加1mM甜菜堿下發(fā)酵9%木糖比KOll遠(yuǎn)為有效。但是，如圖4所示，仍有低水平的乳酸和乙酸作為副產(chǎn)物。這一乳酸的來源是曱基乙二醛旁路，以下發(fā)現(xiàn)證明了這一點(diǎn)這個(gè)問題通過缺失曱基乙二醛合酶OgM)得到矯正。在菌抹LY168中，乳酸水平低于檢測(cè)限。以加到發(fā)酵中的總木糖計(jì)，乙醇產(chǎn)率為0.5g乙醇g"木糖，這接近理論最大值。曱基乙二醛合酶的消除還改進(jìn)了生長(zhǎng)和細(xì)胞產(chǎn)率，減少了完成木糖發(fā)酵所需的時(shí)間(圖4)。在低的起始接種物下，在發(fā)酵的第二個(gè)24小時(shí)對(duì)于LY165和LY168來說乙醇的體積產(chǎn)率最高(大約1.3g"h")。24小時(shí)后，用NBS礦物鹽培養(yǎng)基(mM甜菜堿)進(jìn)行的發(fā)酵與Luria肉湯中的發(fā)酵相當(dāng)。實(shí)施例9AMI培養(yǎng)基中的發(fā)酵用LY168在AMI培養(yǎng)基加9。/。木糖(Martinez等.，2007)這一新的培養(yǎng)基中，進(jìn)行了另一組29系列Fleaker轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔)(圖5A和B)。大約在第21次轉(zhuǎn)移，琥珀酸開始出現(xiàn)在發(fā)酵液中，表明frd操縱子已被修復(fù)。從最后一次轉(zhuǎn)移分離一個(gè)克隆，標(biāo)示為L(zhǎng)Y168im(在AMI培養(yǎng)基中生長(zhǎng)有改進(jìn))，備用于進(jìn)行進(jìn)一步的修飾。實(shí)施例10Lac區(qū)域的修復(fù)當(dāng)cw^S基因被缺失時(shí)，一部分的/acy基因也被缺失，這消除了菌林發(fā)酵乳糖的能力。為了修復(fù)這個(gè)區(qū)域，使用引物對(duì)/acZ-qy"X(上表2)，用PCR克隆橫跨/acZ至c戸Z的區(qū)域(4,082bp)的大腸桿菌W基因組DNA片段(圖1H)。將這個(gè)/acZ-c，Z區(qū)域整合到菌株LY168im中。在含有AMI培養(yǎng)基和5%乳糖的靜置螺旋蓋管中，進(jìn)行對(duì)該盒向該區(qū)域中的同源重組的選擇。用針對(duì)/ac75的引物對(duì)(表2)以PCR篩選菌落，以驗(yàn)證lac操縱子的修復(fù)。對(duì)22個(gè)在MacConkey瓊脂平板(含有2%乳糖)上乳糖發(fā)酵陽性的菌落的PCR篩選，顯示有20個(gè)菌落已修復(fù)了該區(qū)域。選出一個(gè)菌落，標(biāo)示為菌林LY169。實(shí)施例11frd操縱子的缺失和ceIY的再整合在將菌抹LY168im在含有AMI培養(yǎng)基加9%木糖的Fleakers中進(jìn)行系列轉(zhuǎn)移過程中，碰到了一個(gè)問題。發(fā)酵液開始積累琥珀酸，這導(dǎo)致了這個(gè)判斷，即該菌4^能夠修復(fù)原先在/n^C區(qū)域產(chǎn)生的點(diǎn)突變。之前已將菊歐文菌3937的ce/7基因整合在frdA基因前面(Zhou等.，2005)。有一種程序是將yh詔基因完全缺失，將/WC基因部分缺失，保持ce/F基因在的前面。用引物對(duì)frdB，-frdC，(表2)從基因組大腸桿菌W克隆frdB，-frdC，片段(948bp)，并連接到pCR2.1-TOPO中，產(chǎn)生pL013958。下一步是用PCR將ca"ac5盒移到基因的中部，產(chǎn)生氯霉素標(biāo)記。使用pEL04(Lee等.，2001;Thomason等.，2005;圖ll)作為模板和引物對(duì)JmcatsacBNheI(表2),克隆c^-sacB片段(3,247bp),側(cè)接有滿e/61位點(diǎn)。用引物對(duì)NhefrdB-C(表2)和pLOI3958作為模板，將該片段連接到pL013958的PCR產(chǎn)物的A7e/位點(diǎn)中，產(chǎn)生pL013959(frdB，-ca/-sacB-frdC，)。用克隆原始片|殳所用的引物擴(kuò)增'frdB，-c^-sacB-frdC，盒(3,601bp)，并整合到LY169中，用氯霉素進(jìn)行選擇。選擇了39個(gè)菌落進(jìn)行PCR篩選，以驗(yàn)證向正確區(qū)域中的整合情況，其中有20個(gè)菌落正確。選出一個(gè)菌落，標(biāo)示為L(zhǎng)Y170。接著，需要含有frdA，-運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌片段-celY-frdC，的質(zhì)粒。將質(zhì)粒pL013959用Nhel和Xhol消化，連接到經(jīng)類似消化的來自pL012726的PCR產(chǎn)物(XhofrdA-NhecelY引物對(duì)，表2),以frdA，-Zmfrg-celY盒為模板(Zhou等.，2005),產(chǎn)生質(zhì)粒pL013961(frdA，-Zmfrg-celY-frdC，；圖1J)。在CMC瓊脂平板上驗(yàn)證ce/7基因的活性。用引物XhofrdA和frdC，(表2)擴(kuò)增frdA，-Zmfrg-celY-'frdC，盒(3,157bp)，并整合到LY170中。對(duì)于在CMC平板上進(jìn)行活性的篩選和在LB加氯霉素上進(jìn)行標(biāo)記的失去情況的篩選的225個(gè)菌落，選擇了11個(gè)菌落進(jìn)行PCR篩選以驗(yàn)證向該區(qū)域的整合情況。所有11個(gè)菌落都正確，取l個(gè)標(biāo)示為菌抹LY172。用LY172在AMI培養(yǎng)基加9%木糖中進(jìn)行另一組15次系列Fleaker轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔)(圖6A和B)。從最后一次轉(zhuǎn)移分離一個(gè)克隆，標(biāo)示為L(zhǎng)Y172im。實(shí)施例12催產(chǎn)克雷伯氏桿菌casAB基因的整合還需要將催產(chǎn)克雷伯氏桿菌M5A1cfl^c^5基因整合到菌抹中，因此決定將這些基因整合到已經(jīng)被部分缺失的ldhA基因中而不是lac操縱子中(保持發(fā)酵乳糖的能力完整無缺)。用表2所列的引物將無啟動(dòng)子的W/l4基因克隆到pCR2.1-TOPO中后，用BamHI-XhoI將基因移動(dòng)到pLOI3470的相同位點(diǎn)中，產(chǎn)生pL013971(Pacl位點(diǎn)側(cè)接該基因)。將具有pL011910(Moniruzzaman等.，1997)的天然核糖體結(jié)合位點(diǎn)的c"Mm^基因在AMI培養(yǎng)基加5。/。纖維二糖中攜帶(carry)1%星期，每日在螺旋蓋管中轉(zhuǎn)移。用PCR以^1物對(duì)Sg/ZAmJ-Tl^e/ca^克隆cflW5基因(3,406bp),并克隆到載體pL013971用丑g/7/和A^/(W/l4中的天然辦kM立點(diǎn))消化后用引物對(duì)5g///W/L4-W/L4(表2)所得的PCR產(chǎn)物中，產(chǎn)生pLOI3972(ldhA，-casA-casB-ldhA，)。在MacConkey瓊脂加2%纖維二糖上試驗(yàn)菌落，以驗(yàn)證纖維二糖的發(fā)酵。下一步是將c^-sacB基因盒插入在cm^基因后面，導(dǎo)致氯霉素和在蔗糖上的不能生長(zhǎng)作為可選擇標(biāo)記。使用質(zhì)粒pL014162,將尸ac/片段(pUC19中用Pacl位點(diǎn)側(cè)接盒修飾的c^-sacB盒；2,960bp;圖1K)連接到pLOI3972BglII位點(diǎn)中，產(chǎn)生pLOI3973(ldhA，-caf-sacB-casA-casB-ldhA，-側(cè)接有Notl位點(diǎn))。將攜帶來自pLOI3973的盒的Notl片段(7,077bp)整合到LY172im中，用氯霉素進(jìn)行選擇。用PCR驗(yàn)證整合情況。新菌抹標(biāo)示為L(zhǎng)Y173。使用質(zhì)粒pLOI3972，將ldhA-casA-casB-ldhA盒(4,161bp)作為Pad片段連接到pLOI3918Pad位點(diǎn)中，產(chǎn)生pLOI3975。在pLOI3975中正好在其中連接了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4Sau3A基因組DNA片段的核糖體結(jié)合位點(diǎn)后面，有獨(dú)特的BglII位點(diǎn)。菌落在MacConkey瓊脂加2%纖維二糖上經(jīng)篩選有不同程度的紅色，這表明casAB基因得到表達(dá)。從15個(gè)在平板上呈陽性的菌落分離質(zhì)粒，標(biāo)示為pLOI3976A-K(ldhA，-Zmfrg-casA-casB畫ldhA),比較它們?cè)贚Y173中的活性。選擇質(zhì)粒pLOI3976A、C、D、E和F(如圖IL所示)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。將4個(gè)ldhA，-Zmfrg-casA，片段(casA中Notl/NcoI-內(nèi)部位點(diǎn))整合到LY173中，在AMI培養(yǎng)基加5%纖維二糖靜置液體培養(yǎng)物中選擇，37。C下系列轉(zhuǎn)移5天。將所得的菌林LY178A、C、D、E和F(分別)在10mL靜置液體培養(yǎng)中，比較它們?cè)诤?%木糖或纖維二糖的AMI培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量。菌林LY178E產(chǎn)生最多的乙醇，生長(zhǎng)至最高O.D.550,在MacConkey瓊脂加2%纖維二糖上進(jìn)行比較時(shí)顯得最好。63用LY178E在AMI培養(yǎng)基加10%木糖中進(jìn)行另一組12次系列Fleaker轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔)。在Fleakers中的系列轉(zhuǎn)移連續(xù)進(jìn)行4天，接著在補(bǔ)加5%纖維二糖的AMI培養(yǎng)基中在10mL液體培養(yǎng)中進(jìn)行3天的轉(zhuǎn)移，以改進(jìn)對(duì)穩(wěn)定的casAB基因的選擇(圖7A和B,僅顯示Fleakers)。從最后一次轉(zhuǎn)移分離出一個(gè)克隆，標(biāo)示為L(zhǎng)Y180。用LY180在AMI培養(yǎng)基加10%木糖中進(jìn)行另一組25次系列Fleaker轉(zhuǎn)移(24小時(shí)間隔)。在Fleakers中的系列轉(zhuǎn)移連續(xù)進(jìn)行4天，接著在補(bǔ)加10%纖維二糖的AMI培養(yǎng)基中在10mL液體培養(yǎng)中進(jìn)行3天的轉(zhuǎn)移(圖8A和B，僅顯示Fleakers)。從最后一次轉(zhuǎn)移分離一個(gè)克隆，標(biāo)示為L(zhǎng)Y186。實(shí)施例13改進(jìn)的產(chǎn)乙醇重組細(xì)菌前面的研究證明，重組大腸桿菌在礦物鹽培養(yǎng)基中快速和有效發(fā)酵木糖沒有內(nèi)在的障礙。所觀察到的相對(duì)于之前工程改造的菌林的改進(jìn)是由幾個(gè)因素的組合所產(chǎn)生，其中之一是隨機(jī)整合加基于生長(zhǎng)的選擇來確定運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇基因的最佳染色體整合位點(diǎn)。另一個(gè)因素是可能會(huì)妨礙性能的抗生素基因的缺失。最后一個(gè)因素是曱基乙二醛旁路的消除，甲基乙二醛旁路是會(huì)減慢糖酵解和大分子合成的溢出途徑(Zhu等.2001)。觀察到甜菜堿的添加增加了生長(zhǎng)和改進(jìn)了性能，但并不是必要的。甜菜石威是一種保護(hù)性滲壓劑，能改進(jìn)在初始高糖濃度存在下的生長(zhǎng)，減少對(duì)谷氨酸和海藻糖的生物合成需求(Underwood等.2004;Zhou等.2006a和2006b)。實(shí)施例14BW34的工程改造之前已經(jīng)證明了細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的共產(chǎn)生在降低對(duì)商業(yè)纖維素酶的需求方面的有用性(Wood和Ingram,1992;Wood,1997;Wood等.1997b)。這些內(nèi)切葡聚糖酶中最有效的據(jù)發(fā)現(xiàn)是來自菊歐文菌(Wood等.1997b,Zhou等.2001)。Ce/r和Ce/Z的組合，協(xié)同作用，使得可以直接將無定形纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇(Zhou和Ingram,2001)。單獨(dú)的Ce/r被證明當(dāng)在結(jié)晶纖維素的同步糖化和發(fā)酵(SSF)中與商業(yè)纖維素制品結(jié)合使用時(shí)能提供最大的好處。用于本文所述的研究的菌抹和質(zhì)粒在下表3中列出。表3菌林/質(zhì)粒相關(guān)性狀來源/參考文獻(xiàn)大腸桿菌DHaBathesdaResearchLabs大腸桿菌S17XpirLabStocks催產(chǎn)克雷伯氏桿菌SZ21Zhou等.2001催產(chǎn)克雷伯氏桿菌SZ22SZ21Ace/Zaac;Zhou等.2001催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW15催產(chǎn)克雷伯氏桿菌M5al.6McMS::FRT-te"FRT本研究(第2章)催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW21本研究(第2章)催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW32BW21.ce,n加本研究催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW33SZ21本研究催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW34BW21.ce/K催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW35SZ21Ak(雄pCPP2006平w.40kbp片段，含有菊歐文菌的out基因Heet.al.1991pFT-AWa.FLP重組酶Posafiet.al.1997pFT-Ktow.FLP重組酶Posafietal.1997pLOI2224R6KoW.Kcm.FRT側(cè)接的MC5(Ac7)Martinez-Morales等.1999pLOI2348菊歐文菌的ce/r;3kbpM5al染色體片段Zhou等.2001pLOI342t)X紅色重組酶，R印Ao"'.aac本研究(第2章)pLOI3421FRT-。ac陽FRT本研究(第3章)pLOI3290Dra/aac片段，來自pL013421pFT-AC7。/中本研究pL013293ce/KM5alg/gP片段(Acl)來自PLOI2224Acl中本研究各菌抹保持在不添加糖的Luria瓊脂平板上。如下添加抗生素進(jìn)行選擇氨千青霉素，50mg/L;安普霉素，50mg/L;卡那霉素，50mg/L;四環(huán)素12.5mg/L;和大觀霉素，50mg/L。將產(chǎn)乙醇菌4朱保持在還含有2%葡萄糖和40或600mg/L氯霉素的Luria瓊脂平板上(每日輪換，在氬氣下)。用于內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生方面的篩選的瓊脂平板還含有3g/L低粘度羧曱基纖維素(CMC)。CMC平板在37°C下生長(zhǎng)過夜后用剛果紅染色(Wood等.1988)。將含有pLOI3420的菌林在30。C下溫育，所有其他的菌林在37°C下保持。用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行基于PCR的基因克隆、質(zhì)粒構(gòu)建和遺傳分析。整合、染色體缺失、整合和使用可去除的抗生素抗性基因的方法，之前已有描述(Datsenko和Wanner,2000;Martinez-Morales等.1999;Zhou等.2003;Causey等.2004)。大腸桿菌DH5"用于大多數(shù)的構(gòu)建。大腸桿菌S17用于構(gòu)建含有R6K復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒。噬菌體PI用于按Silhavay等(1984)描述的方法進(jìn)行普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。用于菊歐文菌的編碼內(nèi)切葡聚糖酶Ce/r的基因ce/r的直接整合的質(zhì)粒是這樣構(gòu)建從含有的pLOI2348去除位于替代啟動(dòng)子(surrogatepromoter)后面的5.7kbpAscl片段，將來自催產(chǎn)克雷伯氏桿菌M5al的染色體片段進(jìn)行靶向整合(之前經(jīng)確定含有g(shù)ZgP，糖原合成途徑中的一個(gè)基因)(Zhou等.2001),然后連接在pLOI2224的Ac/位點(diǎn)(Martinez-Morales等.1999),產(chǎn)生pLOI3293。pLOI3293在Zwd45菌株催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW21中的整合被pL013420的X紅色重組酶的表達(dá)所促進(jìn)。所產(chǎn)生的整合子通過在39。C下長(zhǎng)出而去除pL013420,進(jìn)行卡那霉素抗性的選擇，隨后進(jìn)行內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)生和高水平氯霉素抗性(600mg/L)的保持方面的篩選。將幾個(gè)分離物進(jìn)一步在含有90g/L葡萄糖的0UM1(未顯示，Wood2005)中在pH控制的發(fā)酵中試驗(yàn)乙醇產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)全部都相似。選出一個(gè)作進(jìn)一步的研究，并標(biāo)示為菌4朱BW32。含有菊歐文菌的兩個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶基因ce/7ce/Z和6wfiL4萬的菌株如下構(gòu)建。筒單的說，將催產(chǎn)克雷伯氏桿菌菌株BW15用作供體菌抹，以進(jìn)行丁二醇操縱子(budA，-FRT-tet-FRT-'budB，)中的缺失向菌抹SZ21(Zhou等.2001)的Pl噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)子的分離和篩選與以上所用的相同，例外的是用四環(huán)素進(jìn)行選擇。將菌林BW33繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。66為促進(jìn)々""從菌株BW32的去除，將pFT-A(FLP重組酶)通過添加安普霉素抗性基因a"c來進(jìn)行修飾。用C7a/進(jìn)行限制性消化使質(zhì)粒pFT-A線性化，然后用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段處理。將來自pL013420的含有wc的1.6kbp片段連接到線性化的pFT-A，產(chǎn)生pLOI3290。tet從菌抹BW33的除去是使用之前描述的pFT-K(Posafi等.1997)進(jìn)行。Kans菌抹和Tets菌抹如上所述進(jìn)行內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生、氯霉素抗性和乙醇產(chǎn)生方面的再篩選，所得的菌抹分別標(biāo)示為BW34和BW35。還用PCR證實(shí)整合。將種子培養(yǎng)物(150ml于250ml燒瓶)在這樣的培養(yǎng)基中35°C(120rpm)下生長(zhǎng)16h，該培養(yǎng)基與pH控制的發(fā)酵所用的培養(yǎng)基相同，但含有50g/L葡萄糖。離心(5000xg，5min)收獲細(xì)胞用作接種物，以提供33mg/L細(xì)胞干重(OD550nm-0.1)的初始濃度。發(fā)酵罐為之前所描述(Beall等.1991)，含有350ml的初始體積。葡萄糖發(fā)酵含有90g/L糖，在OUMl(Wood2005)中。SSFs在Luria肉湯中含有100g/LSigmacdl50，SSCFs在0UM1中含有45g/LSigmacdl50加40g/L木糖。培養(yǎng)物在35。C(150rpm)下進(jìn)行溫育。在用菌抹BW35pCPP2006發(fā)酵的情況下，加入大觀霉素以維持質(zhì)粒。所有其他的發(fā)酵不含加入的抗生素。葡萄糖發(fā)酵和SSFs的肉湯通過自動(dòng)加入2NKOH維持在pH5.2。對(duì)于改進(jìn)的木糖發(fā)酵，將SSCFs維持在pH5.8。為比較表達(dá)重組內(nèi)切葡聚糖酶的菌林的發(fā)酵性能，將最終菌林用于在OUM1中90g/L葡萄糖的發(fā)酵。產(chǎn)CelY菌抹BW34在生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)生方面都與菌抹BW21相當(dāng)(圖9)。表達(dá)CeJ和CeZZ的菌林BW35包括了來自pCPP2006的菊歐文菌ow/基因的共表達(dá)，以改進(jìn)生長(zhǎng)。菌株BW35pCPP2006最初具有與BW21和BW34兩者相似的乙醇生產(chǎn)力。在菌林BW35中最終乙醇濃度降低，可能是因?yàn)閜CPP2006的不穩(wěn)定性。從90g/L葡萄糖得到的最大乙醇產(chǎn)率，分別為菌抹BW21、BW34和BW35pCPP2006的理論值的92.7、91.4和80.5%。當(dāng)分析副67產(chǎn)物(下表4)時(shí)，菌林BW21和BW34再次近似，而菌林BW35在乳酸產(chǎn)生方面稍高。表4顯示催產(chǎn)克雷伯氏桿菌的Z^W萬菌林、產(chǎn)乙醇菌株和產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌抹在0UM1中90g/L葡萄糖72h后的產(chǎn)物形成和碳平衡。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>BW35pCPP2006保持著乳酸產(chǎn)生方面的增加。乙酸的產(chǎn)生在表達(dá)高水平的重組蛋白質(zhì)的菌株中是共同的(Aristidou等.1995;Farmer和Liao,1997)。對(duì)兩個(gè)商業(yè)纖維素酶制品做了與Ce/r(和Ce/2)組合使用方面的評(píng)估。SpezymeCE(GENECORINT,不再市售供應(yīng))和GC220都基于它們對(duì)羧曱基纖維素的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，據(jù)報(bào)道是水解酶活性的摻合物(blend)。為消除培養(yǎng)基的任何潛在影響，將Luria肉湯用于評(píng)估每個(gè)酶摻合物(enzymeblend)。在最高濃度的SpezymeCE(100^L/gSigmacell)下，獲得38g/L的最高乙醇濃度(圖IOC)。這相當(dāng)于乙醇產(chǎn)率為理論值的67%。與之前用Sigmacell和SpezymeCE進(jìn)行的研究形成對(duì)比的是，Ce/7(BW34vs.BW21)或Ce/Z(BW35pCPP2006vs.BW21)與SpezymeCE進(jìn)行組合沒有明顯的好處(Zhou等.2001)。在較低的酶負(fù)荷量下，結(jié)果清楚表明SpezymeGC220優(yōu)于SpezymeCE(圖10A和IOC)。在等價(jià)的酶濃度(50pL/g纖維素)下，與SpezymeCE相比，使用SpezymeGC220時(shí)初始速率和最終乙醇濃度分別增加26%和21%(用菌株BW34)。用SpezymeGC220在50pL/gSigmacdl的酶負(fù)荷量下的乙醇產(chǎn)量，幾乎與SpezymeCE在100pL/gSigmacell下的乙醇產(chǎn)量相等。使用SpezymeGC220(50/g),CelY的表達(dá)(在菌林BW34中)似乎具有最大的好處。SSFs(用菌株BW34)產(chǎn)生的最終乙醇濃度比菌林BW21高15%，比菌林P2高70%。由于商業(yè)酶是幾種活性的摻合物，很可能它們被定期重新配制以滿足特定的客戶要求，因此不會(huì)在幾年時(shí)間里恒定。與SpezymeCE的配方的變化一致的是之前開發(fā)的菌抹P2的相對(duì)較差性能(Doran和Ingram,1993)。還包括了之前開發(fā)的表達(dá)的菌抹SZ22(Zhou等.2001)以作比較。使用任一種酶(在任何負(fù)荷量下)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)所存在的纖維素降解產(chǎn)物(糖)的量似乎與乙醇的產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)，可反映相對(duì)于所用纖維素酶的有效性的生物的代謝活性。雖然Sigmacell據(jù)報(bào)道是純化的纖維素產(chǎn)物，但木糖的檢出提示有小的木聚糖成分。或者，被鑒定為木糖的HPLC峰可能是來自商業(yè)纖維素酶中存在的成分(防腐劑、穩(wěn)定劑等)的另一代謝產(chǎn)物。由于這個(gè)不確定性，不將殘余的木糖包括在產(chǎn)率計(jì)算中。在水解更為快速的SSFs(每g纖維素50^SpezymeGC220和100piSpezymeCE)中，pCPP2006在菌林BW35中的穩(wěn)定性再次可造成最終乙醇濃度的下降。一般來說，缺乏2,3-丁二醇發(fā)酵途徑(budAB)的基因的菌株其性能優(yōu)于保持這些基因的菌林。^cM萬的消除也導(dǎo)致其他副產(chǎn)物的減少(圖12)。例外出現(xiàn)在菌株BW35pCPP2006中，這由其中乙酸和乳酸產(chǎn)量都升高的葡萄糖發(fā)酵(上表4中顯示)可見。菌林P2和SZ22中的2，3-丁二醇發(fā)酵途徑的產(chǎn)物似乎與纖維素水解的速率相關(guān)，即葡萄糖限制(50pilCE>50^GC220>100plCE每g纖維素)，這與用產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Iaerage"^)在葡萄糖限制性恒化培養(yǎng)中進(jìn)行的研究相反(TeixeimdeMattos和Tempest,1983)。除了表現(xiàn)相對(duì)較差的菌林P2外，不管酶類型或濃度如何，琥珀酸水平在所有菌林都一致。大量的液-固分離的需要的消除，能簡(jiǎn)化木質(zhì)纖維素向乙醇的加工(Wright等.1988)。對(duì)上述用于SSF的相同的酶(SpezymeCE和SpezymeGC220)再次評(píng)估它們?cè)诤?5g/LSigmacell和40g/L木糖的SSCFs中的使用情況。每種酶使用50pl/g纖維素的酶負(fù)荷量。為充分地評(píng)估商業(yè)應(yīng)用潛力，所有的SSCFs都使用OUMl(Wood2005),只試驗(yàn)Zn/cL45菌林BW21、BW34和BW35pCPP2006。在SSCF中，似乎SpezymeCE造成的減低的水解速率實(shí)際上有利于木糖的快速和完全的使用(圖13)。對(duì)于SpezymeGC220,葡萄糖水平盡管低(在24h時(shí)lmM)，但最初可能超過一個(gè)限度，在該限度下木糖代謝變得被阻遏。這一點(diǎn)的進(jìn)一步證據(jù)見于產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶菌抹BW34和BW35pCPP2006中木糖消耗速率的減低，這大概是用SpezymeGC220進(jìn)行的SSFs中所見的水解的改進(jìn)的結(jié)果。之前證實(shí)了為改進(jìn)木糖消耗需要增加PFL(或ACK)活性(高pH)(Wood2005)。在pH6.0下的OUMl中，菌抹BW21從90g/L木糖產(chǎn)生44.3g/L乙醇，為理論產(chǎn)率的96.4%。在pH5.8下的SSCF中，在纖維素產(chǎn)率計(jì)算中，給木糖轉(zhuǎn)化率假定更保守些的95%(下表5)。表5酶菌林SSCF產(chǎn)率(。/。)abSSF產(chǎn)率(。/。)ad木糖+纖維素纖維素eBW2181.871.245.8SpezymeCEBW35pCPP200682.572.443.6BW3486.679.847.0BW2175.058.951.8SpezymeBW35pCPP200675.359.537.9GC220BW3480.970.158.83基于0.51g乙醇每克木糖和/或0.568g乙醇每克纖維素的理論值的％bSSCFs在OUMl培養(yǎng)基,pH5.8中進(jìn)行，產(chǎn)率忽略殘余木糖c假定為所加入的木糖的理論產(chǎn)率的95%(19.4g/L)dSSFs在Luria肉湯，pH5.2中進(jìn)行70如同在SSF中，在SSCF中各菌抹之間在所形成的副產(chǎn)物方面相似(圖14)，與在SSF中所見的大部分一致。相比于在葡萄糖中或在SSF中所見的，在pH5.8下ACK(PFL)活性的增加的確導(dǎo)致乙酸產(chǎn)量的增加。在SSCF中包括木糖導(dǎo)致了纖維素轉(zhuǎn)化率的改進(jìn)。表5比較budAB各菌林從SSF和SSCF(在50pL/gSigmacell的酶負(fù)荷量下)的乙醇產(chǎn)率。最顯著的增加見于SpezymeCE,估計(jì)的纖維素轉(zhuǎn)化率在SSCF中比在單獨(dú)SSF中高55%以上。在SSCF中使用SpezymeGC220還導(dǎo)致從纖維素產(chǎn)生乙醇的產(chǎn)率增加(14-19%)。對(duì)于兩種酶，最大的增加見于SSF或SSCF中的BW34中。在SSCF中纖維素降解產(chǎn)物的代謝的改進(jìn)，由發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢出的低水平的糖得到反映(圖15)。當(dāng)使用SpezymeGC220時(shí)，菌抹BW34和BW35pCPP2006的木糖使用速率和總體乙醇產(chǎn)率的下降，轉(zhuǎn)變成了所檢出的殘?zhí)堑脑黾印ｏ@然，商業(yè)纖維素酶的選擇可對(duì)纖維素水解的程度具有影響。木糖或者可能的其他游離糖類的加入，增加了用于SSCF的纖維素酶的有效性。這很可能是因?yàn)樯锎呋瘎舛鹊脑黾?，這一增加更能夠保持纖維二糖和葡萄糖的亞抑制濃度(sub-inhibitoryconcentrations)。當(dāng)生物催化劑濃度的增加與另外的內(nèi)切葡聚糖酶活性的產(chǎn)生相結(jié)合時(shí)，甚至在比真菌纖維素酶活性的最佳發(fā)酵條件差的發(fā)酵條件下，纖維素轉(zhuǎn)化率也還要更大。圖16顯示了從纖維素產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量的遞增式改進(jìn)。每單位酶的乙醇量直接影響用纖維素酶從纖維素生產(chǎn)乙醇的成本。在SSF中，隨著SpezymeCE荷載量降低50%,每克乙醇的酶成本會(huì)同樣降低50%。假設(shè)SpezymeGC220成本相當(dāng)于SpezymeCE，SpezymeGC220的使用會(huì)再降低酶成本21%。在SSCF中，使用SpezymeGC220(14%)或SpezymeCE(60%),在酶荷載量與SSF中所用相當(dāng)?shù)那闆r下(50pL/gSigmacell),從纖維素生產(chǎn)乙醇的酶成本會(huì)進(jìn)一步降低。實(shí)施例15產(chǎn)乙醇KOll-RDl和BW34中氯霉素抗性的消除,#、者在、潛#^#^六務(wù)伴本研究所用的菌株和質(zhì)粒在下表6中列出。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>KOll-RDl和BW34是原始的產(chǎn)乙醇菌林，對(duì)600mgl-l氯霉素有抗性。本研究所用的引物在下表7中列出。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>在菌林構(gòu)建過程中，將培養(yǎng)物在含有2%(w/v)葡萄糖或阿拉伯糖的Luria肉湯(IOg1-1Difco胰蛋白胨，5g1-1Difco酵母膏和5g1-1NaCl)中于30、37或39。C下進(jìn)行有氧生長(zhǎng)。按需加入氨千青霉素(50mgl隱l)、安普霉素(50mgl-l)、四環(huán)素(12.5mgl-l)或卡那霉素(50mg1-1)。對(duì)于乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，將各菌林在含有10%(w/v)木糖的Luria肉湯或AMI礦物鹽培養(yǎng)基(Alfredo等.，2007)中不加抗生素在37°C下進(jìn)行生長(zhǎng)。遽傳夢(mèng)才法使用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行基因組DNA提取(Qiagen)、PCR擴(kuò)增(Stratagene和Invitrogen)、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取(Qiagen)和限制性內(nèi)切核酸酶消化(NewEnglandBiolabs)。—^^^在遽/,c^基因7發(fā)」缺失氯霉素抗性基因(cw)的方法根據(jù)同源重組的兩個(gè)步驟(Thomason等.，2005)進(jìn)行了改進(jìn)，這會(huì)使得在基因缺失后不留下抗生素基因和外來基因疤痕。在第l次重組后，將位于cW基因中部的200bpDNA片段用含有卡那霉素抗性基因(Kan)和果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的DNA盒替代(圖18C)。在第2次重組，將第一200bp片段外部的DNA片段用作重組靶標(biāo)(圖18C)，根據(jù)蔗糖敏感性去除《aw-^c^盒。由于具有^c^基因的菌落會(huì)用蔗糖積累果聚糖蔗糖酶，而這會(huì)殺滅細(xì)胞，因此只有去除^m-5flcS盒的重組子能存活。用引物組Kan-up/Kan-down(上表7)從pCR2.1-TOPO擴(kuò)增Kan基因，然后用Wo/和爿cc/消化，克隆到pLOI4162(1o/和爿cc7)中，以替代cw基因和獲得pL014292。Kan-sacB盒(2899bp)通過用尸ac/消化pL014292然后進(jìn)行T4處理來獲得，用于下一步的連接。一開始認(rèn)為，在K011-RD1和BW34的染色體中只有一個(gè)ca/基因，進(jìn)行一輪的cW基因缺失就會(huì)消除抗性。用引物組JMcatUP/JMcatDOWN(表7)從K011-RD1擴(kuò)增位于基因中部的400bpDNA片段(圖18C)，并克隆到pCR2.1-TOPO中，獲得pL014657。然后將這個(gè)質(zhì)粒用^To/消化并自身連接，以滅活卡那霉素抗性，獲得pL014658。將pL014658的質(zhì)粒DNA稀釋1000倍，用作PCR模板(使用引物組c^-l/o^-2，向外擴(kuò)增(outwardamplification)),用擴(kuò)增的DNA片段(cW-cW-TOPO,3868bp)與^w-McS盒(2899bp)連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pL014659(圖18A，6767bp)。還將ca"/ca"的PCR產(chǎn)物用T4多核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs)進(jìn)行處理以在片段的末端加上磷酸，并進(jìn)行自身連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pLOI4660(圖18B，4958bp)。將質(zhì)粒pLOI4659和pLOI4660用Wfl/消化并稀釋1000倍，用作模板擴(kuò)增DNA片段I(cW-^m-Mc5-ca廣)用于同源重組(使用引物組JMcatUP/JMcatDOWN)的第一步驟，擴(kuò)增片段II(cW-ca廣)用于第二步驟(圖18C)。V々^^^在遽/,c^基因凝關(guān)(^"2發(fā)和#3幾)缺失了c"/基因后，所得的菌抹仍對(duì)高氯霉素濃度有抗性。據(jù)認(rèn)為原始菌林的染色體中會(huì)有超過一個(gè)c^基因拷貝。如果使用前面的來自pLOI4659的DNA片段I(c^'-《朋-^c5-c^'〕進(jìn)行進(jìn)一步的重組，76它在新的CW基因位點(diǎn)或缺失的CW基因位點(diǎn)處整合的機(jī)會(huì)相同。為了使進(jìn)一步的CW基因缺失出現(xiàn)在新的位點(diǎn)，構(gòu)建了新的質(zhì)粒。用引物的200bpDNA片段，用/^//消化并克隆到pBR322中的尸W/在乂，獲得pL014661。將這個(gè)質(zhì)粒DNA稀釋1000倍，用作PCR模板(使用引物組cat2-3/cat2-4，向外擴(kuò)增)。用擴(kuò)增的DNA片段(cW，，陽C"-TOPO，4521bp)與Kan-sacB盒(2899bp)連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pL014662(圖19A,7420bp)。將這個(gè)質(zhì)粒DNA用Xbal消化并稀釋1000倍，用作模板擴(kuò)增DNA片段III(cW"-Kan-sacB-cW，)用于第一步同源重組Cf吏用引物組cat2-up/cat2-down)。來自pLOI4660的DNA片段II仍用于第二步重組(圖19C)。在cW基因缺失的第一次重組，將DNA片段I(cW-Kan-sacB-ca廣)電穿孔到具有紅色重組酶表達(dá)質(zhì)粒pKD46(Datsenko和Wanner2000)或pLOI3420(Brent等.，2005)的KOI1-RD1或BW34中，然后在30°C下溫育2h進(jìn)行長(zhǎng)出，然后涂布在具有氨卡青霉素和卡那霉素(對(duì)于KOll-RDl)或安普霉素和卡那霉素(對(duì)于BW34)的LB平板中?？敲顾厥怯脕磉x擇正確的重組子，氨芐青霉素或安普霉素是用來保持pKD46或pLOI3420進(jìn)行第二步重組。在30。C下溫育約18h后，挑取三個(gè)菌落用來制備感受態(tài)細(xì)胞，將DNA片段II(cW-ca廣)電穿孔到細(xì)胞中。然后，將培養(yǎng)物在30。C下溫育進(jìn)行4h長(zhǎng)出，接著轉(zhuǎn)移到含有100mlLB培養(yǎng)基(無氯化鈉)和10%蔗糖的250ml燒瓶中。將培養(yǎng)物在30°C下溫育過夜，然后在含有6%蔗糖的LB平板(無氯化鈉)中劃線，在30或39。C下溫育16h。在30。C下溫育是為了保持紅色重組酶質(zhì)粒以進(jìn)行進(jìn)一步的cW基因缺失。從平板挑取菌落，試驗(yàn)它們的氨芐青霉素或安普霉素及卡那霉素敏感性。還試驗(yàn)它們對(duì)不同氯霉素濃度和用不同引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增的抗性。舉基因^存,合在缺失了所有的cw基因后，所得的菌株也失去了產(chǎn)乙醇能力。/^c基因不能通過PCR檢測(cè)。為了生產(chǎn)乙醇，將醇基因再整合在//^或at/五K用于將醇基因整合在克雷伯氏菌j!^5位點(diǎn)的質(zhì)粒如下構(gòu)建。用引物組/^5-up2-M5Al/z/W-down2-M5Al從催產(chǎn)克雷伯氏桿菌M5A1擴(kuò)增戶/W基因，然后克隆到pCR2.1-TOPO中，獲得pL014637。將//W基因從pL014637(KpnI-XbaI,用T4DNA聚合酶切成平端)亞克隆到pL012394中的EcoRI位點(diǎn)(用Klenow切成平端)，獲得pL014645。將這個(gè)質(zhì)粒DNA稀釋1000倍，用作PCR模板(使用引物組p/^-2-M5Al/;/75-3-M5Al，向外擴(kuò)增)。用擴(kuò)增的DNA片段與pdc-adhA-adhB-FRT-Kan-FRT盒(通過Pacl消化從pL013491獲得，用T4聚合酶切成平端)連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pL014646。然后將K.//75，-pdc-adhA-adhB-FRT-Kan-FRT-K.//^"盒從pL014646(Ascl消化)亞克隆到pL012225中的Ascl位點(diǎn)，獲得pL014649(圖5),它具有R6K復(fù)制起點(diǎn)。用Ascl消化質(zhì)粒pL014649,將含有醇基因(K.//L5，-pdc-adhA-adhB-FRT-Kan-FRT-K.;/m")的大DNA片段進(jìn)行凝膠純化，然后電穿孔到BW34-XZ106(具有紅色重組酶pLOI3421)中，涂布在LBkan平板上，以選擇整合子。從LBkan平板挑取菌落，點(diǎn)綴(patch)在不同的平板上，其中包括LB2%葡萄糖(LBG)、LB安普霉素(LBAac)、LB卡那霉素(LBKan)和LBcat40。用于將醇基因整合在克雷伯氏菌庁/五設(shè),《的質(zhì)粒的構(gòu)建稍有不同。用引物組K.玎/E-up-EcoRI/K./r/￡-down-EcoRI從催產(chǎn)克雷伯氏桿菌M5A1擴(kuò)增〃/五基因，然后用EcoRI消化，克隆到pL012394中的EcoRI位點(diǎn)，得到pL014673。下面的步驟與；/W中的相同，所構(gòu)建的質(zhì)粒在表6中顯示。構(gòu)建用于將醇基因整合在大腸桿菌庁伍位點(diǎn)和/7/LB位點(diǎn)的質(zhì)粒的方法，與將醇基因整合在克雷伯氏菌幻eZwW/a;r/五位點(diǎn)的相同。每個(gè)步驟所構(gòu)建的質(zhì)粒在表6中顯示。^癡//關(guān)滲^餘^基因?qū)⒕諶D1-XZ027首先用具有翻轉(zhuǎn)酶基因的pFT-A轉(zhuǎn)化，然后涂布在LBAmp平板上。挑取幾個(gè)菌落，接種在含有10mlLB培養(yǎng)基加氨芐青霉素的250ml燒瓶中。OD增加到0.1后，加入1ml氯四環(huán)素儲(chǔ)液(20mg/100mlLB)以誘導(dǎo)翻轉(zhuǎn)酶基因表達(dá)。30。C下生長(zhǎng)6h后，將培養(yǎng)基在LBG平板上劃線，在39。C下溫育過夜。挑取菌落，點(diǎn)綴在不同的平板上，其中包括LBG、LBKan、LBAmp和LBcat40。fem基因按在克雷伯氏菌菌抹BW34-XZ118中的同樣方法去除，例外的是使用具有翻轉(zhuǎn)酶基因和對(duì)安普霉素有抗性的質(zhì)粒pL013409。發(fā)#在盛有50mlLB培養(yǎng)基加10%木糖的125ml燒瓶中，在37°C和100rpm(沒有pH調(diào)節(jié))下，試驗(yàn)所有菌株的乙醇生產(chǎn)情況。還將最終的產(chǎn)乙醇菌株在含有10%木糖或葡萄糖的AMI培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)。pH通過自動(dòng)加入2N氫氧化鉀調(diào)節(jié)在7.0。為、浙細(xì)胞質(zhì)量通過在550nm處測(cè)量光密度(OD550)來估計(jì)。乙醇濃度通過GC來測(cè)量。有機(jī)酸和糖濃度通過HPLC(Underwood等.，2002)來測(cè)量。《a^-7Z)7^專7一合cW基因^關(guān)用兩步驟同源重組方法在K011-RD1中進(jìn)行ca,基因缺失。第二次重組后，當(dāng)在LB6%蔗糖平板上劃線時(shí)使用30。C和39°C兩個(gè)溫度點(diǎn)。30。C溫度用于保持紅色重組酶質(zhì)粒pKD46，它可用于進(jìn)一步的79CW基因缺失。在該兩個(gè)條件下挑取幾個(gè)菌落，點(diǎn)綴在不同的平板上，其中包括不同濃度(40、100、200、400、600mgl-l)的LBG、LBKan、LBAm和LBCat。對(duì)于來自30°C條件的菌落，它們生長(zhǎng)得較慢，還對(duì)氨千青霉素敏感。挑取了兩個(gè)菌落，命名為RD1-XZ001和RD-XZ002。它們都對(duì)cat400敏感，而對(duì)cat200有抗性(如表8中所示)。來自39。C條件的菌落長(zhǎng)得較快。挑取了兩個(gè)菌落，命名為RD1-XZ003和RD-XZ004。它們都對(duì)cat600敏感，而對(duì)cat400有抗性(下表8)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>在表8中，引物組catU/D(cat-up/cat-down)應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增天然cat基因中的635bpDNA片段，這個(gè)片段接近完整的cat基因(660bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為N(天然)。如果cat基因的中間部分被缺失，則應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增較短的DNA片段(462bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為D(缺失)。用cat-l/cat-2和pflB-2/pflB-5的引物組來檢測(cè)pdc-adhB-cat盒的串聯(lián)重復(fù)。所有的菌落仍對(duì)高氯霉素濃度有抗性，這提示仍有其他的cw基因拷貝保持在染色體中。這是合理的，因?yàn)橥ㄟ^選擇對(duì)增加的氯霉素濃度的抗性，原始菌抹K011-RD1已被優(yōu)化了很長(zhǎng)時(shí)間以提高乙醇產(chǎn)率。據(jù)認(rèn)為^,基因和醇基因(/^。^//^)都在染色體中被重復(fù)。通過PCR在這四個(gè)菌抹中試驗(yàn)了cW基因。引物組ca"up/c^-down應(yīng)擴(kuò)增天然c^基因中的635bpDNA片段，這個(gè)片段接近完整的《^基因(660bp)。如果cw基因的中間部分#:缺失，則應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增較短的DNA片段(462bp)。但是在所有四個(gè)菌抹中，只有630bpDNA片段被擴(kuò)增，而短的462bp片段沒有獲得?？赡苁且?yàn)榈诙襟E重組沒有在c^和cW位點(diǎn)發(fā)生。由于染色體中可能有多個(gè)醇基因，第二步驟重組有極大的機(jī)會(huì)在比c^基因大得多的pdc和adhB位點(diǎn)發(fā)生。這會(huì)去除它們之間的所有DNA片段，包括cW-Kan-sacB-cW盒在內(nèi)，而這會(huì)導(dǎo)致短的462bp片段不被擴(kuò)增。用引物組；/IS-2/;/7萬-5來驗(yàn)證pdc-adhB-ca/盒的串聯(lián)重復(fù)。在原始菌林K011-RD1和RD1-XZ004中都獲得了PCR產(chǎn)物。將擴(kuò)增的2.5kbDNA片段測(cè)序，以獲得重復(fù)之間的序列信息。還用引物組caH/c^-2來檢測(cè)pdc-adhB-cW盒的串聯(lián)重復(fù)。但是，沒有DNA片段被擴(kuò)增。這可能是因?yàn)橐颿^-l和c^-2之間的DNA片段太大，以致于當(dāng)前的PCR試劑盒不能足夠有效地獲得任何擴(kuò)增。對(duì)所有四個(gè)菌林試驗(yàn)它們?cè)诰哂蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中的乙醇生產(chǎn)情況。菌抹RD1-XZ001和RD1-XZ002的生長(zhǎng)要慢得多，失去了幾乎全部的產(chǎn)乙醇能力。在菌抹RD1-XZ003和RD1-XZ004中，2天后細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量稍有下降，從原始菌林K011-RD1的40g/l下降到接近30g/1(表8)。選擇菌林RD1-XZ004進(jìn)行進(jìn)一步的基因缺失。發(fā)c^基因^關(guān)據(jù)認(rèn)為在第1輪的cw基因缺失的第二次重組過程中，所有的cW-Kan-sacB-cW盒都被去除，因?yàn)橐锝Mcfl/-up/cW-down沒有擴(kuò)增到短的片段(462bp)。但是，仍有可能兩交換重組(two-crossoverrecombination)在cW位點(diǎn)和cW位點(diǎn)發(fā)生，因?yàn)殛幮訮CR結(jié)果總是不夠強(qiáng)烈。如果這樣的話，cfl,，和ca廣會(huì)留在染色體中。對(duì)于進(jìn)一步81的cw基因缺失，如果在第一重組步驟仍使用DNA片段I(c",，-Kan-sacB-c",")，則兩交換重組有相同的機(jī)會(huì)來靶向于新的未被觸及的cW位點(diǎn)或靶向于已經(jīng)被缺失的ca,位點(diǎn)。為了避免重組發(fā)生在已經(jīng)被缺失的cW位點(diǎn)，構(gòu)建了新的DNA片段III(圖19C)。在這個(gè)片段中，^w-^cS盒被插入在ca廣，片段和ca廣，，片段之間，這在caf基因的ca，和c"f'片段的內(nèi)部。它們?cè)谶M(jìn)行一輪c^基因缺失后被去除。當(dāng)將DNA片段m用于第一步驟重組時(shí)，兩交換重組只會(huì)發(fā)生在新的未被觸及的cw基因。對(duì)于第二步驟重組，使用DNA片段II,使得ca廣，和ca廣"片段能被去除(圖19C)，這會(huì)幫助在后面的各輪中檢測(cè)新的未被觸及的c"/基因。這個(gè)策略能一個(gè)接一個(gè)地缺失所有的cw基因，不管在染色體中有多少個(gè)c^基因重復(fù)。在第二次重組，當(dāng)在LB6。/。蔗糖平板上劃線時(shí)，使用30。C和39。C。在該兩個(gè)條件下挑取幾個(gè)菌落，點(diǎn)綴在不同的平板上，包括不同濃度(40、100、200、400、600mgl-l)的LBG、LBKan、LBAm和LBCat。如同在第l輪的c^基因缺失的過程中，來自30。C條件的那些菌落生長(zhǎng)得較慢，仍對(duì)氨千青霉素敏感。挑取了兩個(gè)菌落，命名為RD1-XZ009和RD-XZOIO。它們都對(duì)cat40敏感(下表9顯示)。來自39。C條件的菌落長(zhǎng)得較快。挑取了兩個(gè)菌落，命名為RD1-XZ011和RD-XZ012。它們都對(duì)cat200敏感，而對(duì)cat100有抗性(表9)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>在表9中，引物組catU/D(cat-up/cat-down)應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增天然cat基因中的635bpDNA片段，該片段接近完整cat基因(660bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為N(天然)。如果cat基因的中間部分被缺失，則應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增較短的DNA片段(462bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為D(缺失)。用引物組cat2U/D(cat2-up/cat2-down)來擴(kuò)增cat基因的中部。對(duì)于天然cat基因，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為200bp。對(duì)于那些被缺失的cat,不應(yīng)當(dāng)有DNA片段被擴(kuò)增；用引物組pdcup/1(pdc-up/pdc-l)來檢測(cè)pdc基因；用引物組cat-up/pdc-l來檢測(cè)pdc-adhB-cat盒的串聯(lián)重復(fù)。通過PCR試驗(yàn)了這四個(gè)菌株的cw基因。當(dāng)使用引物組caMip/cflKiown時(shí)，仍從RD1-XZ009和RD1-XZ010擴(kuò)增到天然的635bpDNA片段，這提示有至少一個(gè)基因保持在染色體中。但是，這兩個(gè)菌抹都對(duì)cat40敏感。這可能是因?yàn)榧t色重組酶pKD46在30°C下長(zhǎng)時(shí)間保持而在染色體中出現(xiàn)重組，這個(gè)重組可能去除了一些細(xì)胞生長(zhǎng)和抗生素抗性所必需的基因。因此，只使用來自39。C溫育條件的菌抹。在第1輪的c^基因缺失過程中，對(duì)于菌林RD1-XZ011和RD1-XZ012,用引物組cflMip/ca"down只有天然的635bpDNA片段得到擴(kuò)增，而短的462bpDNA片段不被擴(kuò)增。還試驗(yàn)了引物組cat2-up/cat2-down,它應(yīng)當(dāng)會(huì)擴(kuò)增天然基因中的190bpDNA片段。在一輪ca/基因缺失后，應(yīng)當(dāng)沒有DNA片段被擴(kuò)增。從所有四個(gè)菌抹擴(kuò)增190bpDNA片段。用引物組pdc-up/pdc-1來試驗(yàn)pdc基因，它也從所有四個(gè)菌林?jǐn)U增。用引物組ca"up/pdc-l來驗(yàn)證pdc-adhB-c^盒的串聯(lián)重復(fù)。PCR產(chǎn)物獲自原始菌抹K011-RD1、獲自親本菌抹RD1-XZ004和獲自菌抹RDl-XZOll。但是，它不從RD1-XZ012擴(kuò)增。這提示在菌抹RD1-XZ012中，在第283輪至少有兩個(gè)毗鄰的ca/基因一起被去除，導(dǎo)致引物組caMip/pdc-1沒有擴(kuò)增DNA片段。所有四個(gè)菌林都在含有LB和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中試驗(yàn)乙醇生產(chǎn)情況。所有的菌株都長(zhǎng)得非常慢，并意想不到地失去幾乎所有的產(chǎn)乙醇能力(表9)，盡管基因仍檢測(cè)到。如7-忍0"^,3齊c"/基因^關(guān)使用與第2輪相同的策略，在菌林RD1-XZ012中再次缺失cW基因。在第二次重組，當(dāng)在LB6%蔗糖平板上劃線時(shí)，只使用39。C溫度點(diǎn)。挑取幾個(gè)菌落，點(diǎn)綴在不同的平板上，包括具有不同濃度(40、100、200、400、600mgl-l)的LBG、LBKan、LBAmp和LBCat。所有菌抹都對(duì)kan、amp和cat40敏感。通過PCR試驗(yàn)基因。當(dāng)使用引物組cat2-up/cat2-down時(shí)，從所有菌落都沒有擴(kuò)增到DNA片段，這表明沒有活性ca,基因保留在染色體中(表10,見下)。當(dāng)使用引物組c^-up/pdc-l時(shí)，從所有的菌落也沒有擴(kuò)增到DNA片段。當(dāng)使用引物組caHjp/ca,-down時(shí)，從一些菌落擴(kuò)增到短的462bpDNA片段，而從其他的菌落沒有擴(kuò)增到DNA片段(表IO)。表10菌抹Cat抗性PCRaOD550E認(rèn)(g/L)CatU/DCat2U/DPdcUp/1Cat-UPdc-1DlD2「DlD2K011-RD1600RN+++14.21828.240.8RD1-XZ004600S400RN+++11.212.412.130.2RD1-XZ012100R200SN++3.23.20.80.5RD1-XZ01640SD-+-2,82.60.90.6RD1-XZ01740SD-+-2.92.70.80.5RD1-XZ01840S----2.42.300<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>在表10中，引物組catU/D(cat-up/cat-down)應(yīng)當(dāng)會(huì)擴(kuò)增天然cat基因中的635bpDNA片段，這個(gè)片段接近完整的cat基因(660bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為N(天然)。如果cat基因的中間部分被缺失，則應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增較短的DNA片段(462bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為D(缺失)。用引物組cat2U/D(cat2-up/cat2-down)來擴(kuò)增cat基因的中部。對(duì)于天然cat基因，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為200bp。對(duì)于那些被缺失的cat，不應(yīng)當(dāng)有DNA片段被擴(kuò)增。用引物組pdcup/1(pdc-up/pdc-l)來檢測(cè)pdc基因。從每個(gè)類型挑取兩個(gè)菌落，用引物組pdc-up/pdc-l進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于RD1-XZ016和RD1-XZ017，pdc基因片段被擴(kuò)增。但是，對(duì)于RD1-XZ018和RD1-XZ019,沒有DNA片段被擴(kuò)增。據(jù)認(rèn)為，對(duì)于RD1-XZ018和RD1-XZ019,在第二步驟重組過程中，兩交換重組不發(fā)生在cW，和ca,"位點(diǎn)，而是在pdc-adhB-cW盒外部的位點(diǎn)，這去除了內(nèi)部的所有DNA片段。所有四個(gè)菌林都在含有LB和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中試驗(yàn)乙醇生產(chǎn)情況。所有的菌抹都生長(zhǎng)緩慢。菌林RD1-XZ016和RD1-XZ017產(chǎn)生極少的乙醇(lg/1以下)，盡管pdc基因仍被檢測(cè)到。菌抹RD1-XZ018和RD1-XZ019不產(chǎn)生乙醇(表10)。^寧差西存,合到/^D7-忍WS哞為了獲得產(chǎn)乙醇能力，將醇盒(pdc-adhA-adhB)再整合到菌抹RD1-XZ018中。；/75基因和/T/五基因都選擇作為整合位點(diǎn)。在將//W-pdc-adhA-adhB-FRT-kan-FRT-^/W，，盒(圖20)電穿孔到菌株RD1-XZ018中并涂布LBKan平板后，沒有菌落生長(zhǎng)。但是，當(dāng)使用AT仏，-pdc-adhA-adhB-FRT-kan-FRT-Ar店"盒(圖21)時(shí)，在8小時(shí)后就有菌落在LBKan平板長(zhǎng)出。有兩種類型的菌落。一種類型厚且隆起。這個(gè)類型挑取了六個(gè)菌落，命名為RD1-XZ020、RD1-XZ021、RD1-XZ022,、RD1-XZ023、RD1-XZ026和RD1-XZ027。另一種類型薄且平坦。這個(gè)類型挑取了兩個(gè)菌落，命名為RD1-XZ024和RD1-XZ025。所有八個(gè)菌抹都用引物組〃/五-up/pdc-l進(jìn)行PCR試驗(yàn)，結(jié)果均為陽性。將這八個(gè)菌抹在含有LB和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中試驗(yàn)乙醇生產(chǎn)情況。具有薄且平坦的菌落的RD1-XZ024和RD1-XZ025比其他的菌株生長(zhǎng)得慢得多，產(chǎn)生的乙醇極少。具有厚且隆起的其他菌抹比原始菌林K011-RD1還要長(zhǎng)得快。它們也產(chǎn)生與K011-RD1接近的乙醇量，在48小時(shí)后為約40g/l(表11,見下)。RD1-XZ027在M小時(shí)后產(chǎn)生最多的乙醇(34.6g/1),這提示它具有最大的乙醇生產(chǎn)力。這個(gè)菌林用于通過翻轉(zhuǎn)酶處理進(jìn)一步去除kan基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>厚且隆起181832.839.2RD1-XZ027厚且隆起1818.834.638.4RD1-XZ02817.216.233.843.6RD1-XZ02917.617.233.741.3RD1-XZ03017.41732.641.3RD1-XZ0311716.233.340.8通過翻轉(zhuǎn)酶處理從RD1-XZ027去除fern基因后，挑取了四個(gè)菌落，命名為RD1-XZ028、RD1-XZ029、RD1-XZ030和RD1-XZ031。將它們?cè)诤蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中試驗(yàn)乙醇生產(chǎn)情況。在這四個(gè)菌4朱中，細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量都相似。RD1-XZ028產(chǎn)生最多的乙醇(48h后43.6g/1),比原始菌4朱KOI1-RD1稍高。KOll-RDl中ca,基因缺失和醇基因再整合的整個(gè)過程總結(jié)于表16中。哞的cW基因^關(guān)還通過兩步同源重組方法，在催產(chǎn)克雷伯氏桿菌BW34中缺失cW基因。在第二次重組，當(dāng)在LB6%蔗糖平板上劃線時(shí)，使用30。C和39°C。在兩個(gè)條件都挑取幾個(gè)菌落，點(diǎn)綴在不同的平板上，包括不同濃度(40、100、200、400、600mgl-l)的LBG、LBKan、LBAac和LBC",。對(duì)于來自30。C條件的菌落，它們生長(zhǎng)較慢，而且出乎意料地對(duì)安普霉素每丈感。選擇了兩個(gè)菌落，命名為BW34-XZ101和BW34-XZ102。它們都對(duì)cat400敏感，而對(duì)cat200有抗性(表12)。來自39。C條件的菌落長(zhǎng)得更快。大多數(shù)的39。C菌落都對(duì)cat400敏感，對(duì)cat200有抗性。選擇了兩個(gè)菌落，命名為BW34-XZ103和BW34-XZ104。但是，一個(gè)菌落仍對(duì)cat600有抗性，命名為BW34-XZ105,—個(gè)菌落對(duì)cat40敏感，命名為BW34-XZ106。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>在表12中，引物組catU/D(cat-up/cat-down)應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增天然cat基因中的635bpDNA片段，這個(gè)片段接近完整的cat基因(660bp)。在這個(gè)情況中，PCR結(jié)果標(biāo)為N(天然)。如果cat基因的中間部分被缺失，則應(yīng)當(dāng)擴(kuò)增較短的DNA片段(462bp)。用引物組cat-l/cat-2來檢測(cè)cat基因的串聯(lián)重復(fù)。通過PCR試驗(yàn)所有六個(gè)菌抹的c",基因。用引物組c"/-l/cW-2來檢測(cè)ca/基因的重復(fù)情況。從原始菌抹BW34擴(kuò)增到接近1.8kb的DNA片段，這提示對(duì)于完整的K.^/^，-pdc-adhB-cW-K./7yZ5"盒，串聯(lián)重復(fù)并不如同在K011-RD1中那樣發(fā)生。相反，只有c^基因被重復(fù)。將擴(kuò)增的1.8kbDNA片段送去測(cè)序，以獲得重復(fù)之間的序列信息。在cw基因缺失后，1.8kbDNA片段只能從菌抹BW34-XZ105擴(kuò)增。它沒有從所有的其他5個(gè)菌抹擴(kuò)增，這提示兩個(gè)c",基因一起被缺失。當(dāng)使用引物組caZ-up/o^-down時(shí)，635bpDNA片段(天然)在除BW34-XZ106之外的所有菌抹中擴(kuò)增。短的462bp片段之所以沒有獲得，其原因據(jù)認(rèn)為與KOll-RDl相同。由于cfl,-l/ca"PCR結(jié)果證明有兩個(gè)cW基因被一起缺失，因此認(rèn)為在BW34的染色體中有至少三個(gè)c^基因拷貝。令人驚訝的是，從BW34-XZ106沒有擴(kuò)增到DNA片段，且這個(gè)菌抹對(duì)cat40敏感。這可能是因?yàn)榈诙襟E的兩交換重組發(fā)生在所有的c"/基因的外部，這導(dǎo)致了基因被一起去除。對(duì)所有六個(gè)菌林試驗(yàn)它們?cè)诤蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中的乙醇生產(chǎn)情況。BW34-XZ105的細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量與原始菌抹BW34類似。但是，所有其他5個(gè)菌抹生長(zhǎng)得非常慢，且失去所有的產(chǎn)乙醇能力(表7)。摔寧差^存婆合到S『3^AZ/06詐^//W在^為了獲得產(chǎn)乙醇能力，將醇盒(pdc-adhA-adhB)再整合到菌抹BW34-XZ106中。選擇p/^基因和rW五基因作為整合位點(diǎn)。將K.//^，-pdc-adhA-adhB-FRT-kan-FRT-K.;/7F，盒(圖22)電穿孔到菌抹BW34-XZ106中并在LBKan平板上劃線后，出現(xiàn)兩種類型的菌落。一種類型薄且平坦，占據(jù)平板的99%。挑取了兩個(gè)菌落，命名為BW34-XZ107和BW34-XZ108。另一個(gè)類型厚且隆起，只占平板的1%。挑取了兩個(gè)菌落，命名為BW34-XZ109和BW34-XZ110。用引物組K.focA-up/pdc-1來驗(yàn)證重組情況。正向引物(K.focA-up)在染色體中的；yZS基因的上游。對(duì)于菌株BW34-XZ109和BW34-XZ110,它能擴(kuò)增接近1.5kb的產(chǎn)物。但是對(duì)于BW34-XZ107和BW34-XZ108，沒有擴(kuò)增到DNA片段。據(jù)認(rèn)為天然戶/53，-末端在之前在菌抹BW34-XZ106中進(jìn)行的c^基因缺失的過程中被缺失。對(duì)于BW34-XZ109和BW34-XZ110，兩交換重組發(fā)生在克雷伯氏菌染色體中的天然；/W5，-末端位點(diǎn)中，重復(fù)的p乂Z53，-末端在其他位點(diǎn)(圖24A)。但是對(duì)于BW34-XZ107和BW34-XZ108，兩交換重組都發(fā)生在//m位點(diǎn)，之后在染色體的其他位點(diǎn)中重復(fù)(圖24B)。它以后一方式發(fā)生的機(jī)會(huì)要高得多，這可解釋為什么99%菌落是這個(gè)類型。對(duì)所有四個(gè)菌林試驗(yàn)它們?cè)诰哂蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中的乙醇生產(chǎn)情況。BW34-XZ109和BW34-XZ110在48小時(shí)后的乙醇產(chǎn)量比BW34-XZ107和BW34-XZ108稍高，它們都比原始菌林BW34好(表13，見下)。由于BW34-XZ1IO產(chǎn)生最多的(48h后22.4g/1),因此將它用于進(jìn)一步的kan基因去除。表13菌林菌落生理PCRaOD550EtOH(g/L)pdcup/1pflBU/DfocA/pdclDlD2DlD2BW34-+-8.27.611.218.4BW34-XZ106-+-2.3〗.80.20BW34-XZ107薄且平坦++-8.07.69.719.9BW34-XZ108薄且平坦++-7.57.69.619.4BW34-XZ109厚且致密+-+8.06.612.720.9BW34-XZ110厚且致密+-+9.57.412.822.4BW34-XZ1137.39.512.622.2BW34-XZ1147.49.81322.1BW34-XZ1157.77.01321.9BW34-XZ1167.37.613.121.2在表13中，用引物組pdc-up/pdc-l來檢查pdc基因。用引物組K.focA-up/pdc-l來驗(yàn)證兩交換重組位點(diǎn)。通過翻轉(zhuǎn)酶處理從BW34-XZ110去除基因后，挑取四個(gè)菌落，命名為BW34-XZ113、BW34-XZ114、BW34-XZ115和BW34-XZ116。還試驗(yàn)它們?cè)诰哂蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中的乙醇生產(chǎn)情況。這四個(gè)菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量都相似。BW34-XZ113產(chǎn)生最多的乙醇(48h后22.2g/l)。還試驗(yàn)了這個(gè)菌林在含有10%葡萄糖或10%木糖的AMI培養(yǎng)基中的乙醇生產(chǎn)情況。在木糖發(fā)酵中48小時(shí)后的乙醇產(chǎn)量(36.4g/l)比在葡萄糖(28.7g/l)中高得多，而這兩種情況都比在LB培養(yǎng)基(22.2g/l)中好(表14,見下)。還形成了一些其他的聯(lián)產(chǎn)物，如乳酸、琥珀酸和乙酸(表14)。特別是在葡萄糖發(fā)酵中，產(chǎn)生了294mM乳酸。這些聯(lián)產(chǎn)物是因?yàn)榕c丙酮酸脫羧酶竟?fàn)幈岬钠渌l(fā)酵酶(乳酸脫氫酶、富馬酸還原酶和乙酸激酶)的活性所致。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>摔攀差^存整合到5『M-忍/M"^w〃伍在^在將K"仏，-pdc-adhA-adhB-FRT-kan-FRT-K.〃伍"盒(圖23)電穿孔到菌抹BW34-XZ106中并涂布LBKan平板后，出現(xiàn)兩種類型的菌落。一種類型厚且隆起。挑取了兩個(gè)菌落，命名為BW34-XZ117和BW34-XZ118。另一種類型薄且平坦。挑取了兩個(gè)菌落，命名為BW34-XZ119和BW34-XZ120。對(duì)所有四個(gè)菌抹試驗(yàn)它們?cè)诰哂蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中的乙醇生產(chǎn)情況。BW34-XZ117和BW34-XZ118在48小時(shí)后的乙醇產(chǎn)量與醇基因整合在位點(diǎn)的BW34-XZ110類似。與之對(duì)比，BW34-XZ119和BW34-XZ120的乙醇產(chǎn)量低得多(表15,見下)。由于BW34-XZ118產(chǎn)生最多的乙醇(48h后22.5g/l)，將它用于進(jìn)一步的A朋基因去除。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>通過翻轉(zhuǎn)酶處理從BW34-XZ118去除few基因后，挑取四個(gè)菌落，命名為BW34-XZ121、BW34-XZ122、BW34-XZ123和BW34-XZ124。還試驗(yàn)它們?cè)诰哂蠰B和10%木糖的125ml燒瓶發(fā)酵中的乙醇生產(chǎn)情況。這四個(gè)菌抹的細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量都相似。BW34-XZ123產(chǎn)生最多的乙醇(48h后23.2g/1),比醇基因整合在位點(diǎn)的BW34-XZ113(22.2g/l)稍高。下表16總結(jié)了K011-RD1中的cW基因缺失和醇基因的再整合，下表17總結(jié)了BW34中的cW基因缺失和醇基因的再整合。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>化率。渣餅#070207T150-BW-CAKE-ROLL用VOP#28-BiomassFiberWashing(生物質(zhì)纖維洗滌)洗滌至pH4.96。如圖17所示，相對(duì)于原始BW34菌抹(72%轉(zhuǎn)化率，72小時(shí))，在新的無臂(armless)菌林當(dāng)中，XZ112和XZ113(76%轉(zhuǎn)化率，72小時(shí))表現(xiàn)最好。XZ115和對(duì)照BW34在發(fā)酵餅070207T150上都有困難，可能是因?yàn)樵摰孜飳?duì)酶攻擊的易感性或其抑制劑濃度。一種可能是，需要更徹底的洗滌，因?yàn)橄礈靝H(4.96)與SP5C—C2(6.46)相比偏低。為達(dá)到70%轉(zhuǎn)化率，這個(gè)餅再發(fā)酵24小時(shí)是有利的，這提示了后一可能性抑制性化合物的速率降低性存在(aratedecreasingpresenceofinhibitorycompounds)。雖然按總體轉(zhuǎn)化率測(cè)量XZ115的表現(xiàn)效率差大約10%，但并不能下定論認(rèn)為這個(gè)菌林是或者不是與原始BW34持平，因?yàn)橐种菩曰衔锟赡軟]有均勻地分布在整個(gè)餅當(dāng)中。下表20總結(jié)了關(guān)于用重組生物催化劑從木糖生產(chǎn)乙醇的新近文獻(xiàn)。許多這些生物催化劑已知需要復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)物。無論是在復(fù)雜培養(yǎng)基還是礦物鹽培養(yǎng)基中比較，它們將木糖發(fā)酵成乙醇的產(chǎn)率或濃度都不高過本文所述的大腸桿菌新重組菌林。表20.重組生物從木糖的乙醇產(chǎn)量菌林木糖(gL")營(yíng)養(yǎng)物乙醇(gL")產(chǎn)率(gg")參考文獻(xiàn)礦物鹽培養(yǎng)基2.80.03大腸桿菌B(ATCC11303)90LB9.10.1本研究中所用EcKOll卯LB43.20.48本研究EcLY16890LJB45.30.50本研究EcKOll90Min26.90.30本研究EcLY165卯Min44,90,50本研究EcLY16890Min45.50.51本研究￡cFBR5(pL01297)95LB41.50.44Dien等.2000100LB46.00.46Ohta等.199195<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>縮寫LB，酵母膏+胰蛋白胨；Min，礦物鹽+lmM甜菜石威；YE，酵母膏補(bǔ)加碌酸鹽；YEP,補(bǔ)加酵母膏和胰蛋白胨；Synth,礦物鹽補(bǔ)加維生素混合物；8G，每升添加8g葡萄糖。參考文獻(xiàn)AlterthumF&IngramLO(1989)Efficientethanolproductionfromglucose,lactose,andxylosebyrecombinant￡^cAen.c/'aco/z'(重組大腸桿菌從葡萄糖、乳糖和木糖的有效乙醇生產(chǎn)).々少/.M/cra嵐55:1943-1948.ArntzenC.E.&DaleBE(1999)^d"Wn.a//roc/wcf,msearcAawdcommera'afea"ow(^:參差工j^/^品，研冤^7眾j^似械^資《」.NationalAcademyPress,WashingtonD.C.AsghariA,BothastRJ,DoranJB,andIngramLO(1996)Ethanolproductionfromhemicellulosehydrolysatesofagriculturalresiduesusinggeneticallyengineered^c^en'cA/aco/z.(用遺傳工程改造的大腸軒菌從農(nóng)業(yè)殘余物的半纖維素水解物生產(chǎn)乙醇)./"cf肌Mz'cra&o/.16:42-47.Aristidou，A.A.,K.San,andG.N.Bennett.1995.Metabolicengineeringthroughacetatereduction(對(duì)大腸桿菌進(jìn)行代謝工程改造以通過降低乙酸提高重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)).Biotechnol.Prog.11:475-478.Ausubel，F(xiàn)M,BrentR,KingstonRE，MooreDD，DeidmanJG,SmithJA，andStruhlK(ed.)(1987)Cwrrew//rotoco/swo/ecw/a/-Zz.o/ogy(^、fi參夢(mèng)W遞^才,人JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork，NY.Beall，D.S.，K.Ohta,andL.O.Ingram(1991)ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli(重組大腸桿菌從木糖和其他糖類生產(chǎn)乙醇的參量研究).Biotechnol.Bioeng.38:296-303.CauseyTB，ZhouS,ShanmugamKT,andIngramLO(2003)EngineeringthemetabolismofEscAe"'c/'aco/ZW3110fortheconversionofsugartoredox-neutralandoxidizedproduct:homoacetateproduction(對(duì)大腸桿菌W3110的代謝進(jìn)行工程改造以將糖轉(zhuǎn)化成氧化還原中性的和氧化的產(chǎn)物同型乙酸生產(chǎn)).尸toc.Wa//.v4cW.Sd.100:825-832.CebollaA，RoyoJL,deLorenzoV,andSanteroE(2002)Improvementofrecombinantproteinyieldbyacombinationoftranscriptionalactivationandstabilizationofgeneexpression(通過轉(zhuǎn)錄激活與基因表達(dá)穩(wěn)定化的組合改進(jìn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率).J/^/.￡""w>o".M/cra嵐68:5034-5041.Conway,T,SewellGW，OsmanYA，Ingram,LO(1987)CloningandsequencingofthealcoholdehydrogenaseIIgenefromZ戸函o加/膨Z版(運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的醇脫氫酶II基因的克隆和測(cè)序).Bacfen'o/.169:2591-2597.DatsenkoKA&WannerBL(2000)One-stepinactivationofchromosomalgenesin^c/en'c/n'aco/z'K-12usingPCRproduct(用PCR產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌K-12中的染色體基因進(jìn)行一步失活).尸rac.A^/.顛乂腺97:6640-6645.deLorenzo,V.,M.Herrero，U.Jakubzik，andK.N.Timmis.1990.Mini-Tn5transposonderivativesforinsertionmutagenesis,promoterofclonedDNAingram-negativeeubacteria(用于插入誘變、啟動(dòng)子探測(cè)和克隆的DNA在革蘭氏陰性真細(xì)菌中的染色體插入的小Tn5轉(zhuǎn)座子衍生物).J.Bacteriol.172:6568-6572.Dien，BS，NicholsNN,O，BryanPJandBothastRJ(2000)Developmentofnewethanologenic_EscAe"'c/n'aco/z'strainforfermentationoflignocellulosicbiomass(用于發(fā)酵木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的新的產(chǎn)乙醇大腸桿菌的開發(fā))，84-6:181-196.Doran，J.B.,andL.O.Ingram.1993.FermentationofcrystallinecellulosetoethanolbyA7血Ze〃ao:^ocacontainingchromosomallyintegratedZymomonasmobilisgenes(通過含有染色體上整合的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因的催產(chǎn)克雷伯氏桿菌將結(jié)晶纖維素發(fā)酵成乙醇).Biotechnol.Prog.9:533-538.DrewkeCandCiriacyM(1988)Overexpression，purificationandpropertiesofalcoholdehydrogenaseIVfromSacc/wrawycascer譜'w'ae(酉良酒酵母的醇脫氬酶IV的過量表達(dá)、純化和特性).說oc/n'm所o;/y^950(1):54-60.Farmer,W.R.,andJ.C.Liao.1997.ReductionofaerobicacetateproductionbyEscherichiacoli(大腸桿菌的好氧乙酸生產(chǎn)的降低).Appl.Environ.Microbiol.63:3205-3210.HasonaA,YorkSW,YomanoLP，IngramLO,andShanmugamKT(2002)Decreasingthelevelofethylacetateinethanologenicbrothsof￡^c/m'c/n'aco/z.KOllbyexpressionofi^et^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hnol.Lett.23:1455-1462.Zhou,S.,T.B.Causey,A.Hasona,K.T.Shanmugam,andL.O.Ingram.2003.ProductionofopticallypureD-lacticacidinmineralsaltmediumbymetabolicallyengineeredEscherichiacoliW3110(代謝工程改造的大腸桿菌W3110在礦物鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行的旋光純D-乳酸的產(chǎn)生).ApplEnvironMicrobiol.69:399-407.ZhouS,GrabarTB,ShanmugamKT，andIngramLO(2006a)BetainetripledthevolumetricproductivityofD(-)-lactatebyEscherichiacolistrainSZ132inmineralsaltsmedium(甜菜石iU吏大腸桿菌菌株SZ132在礦物鹽培養(yǎng)基中的D(-)-乳酸的體積產(chǎn)率提高三倍).所otec/mo/ow28(9):671-676.ZhouS,ShanmugamKT,YomanoLP,GrabarTB,andIngramLO(2006b)Fermentationof12%glucoseto1.2Mlactateby五scAm'c/n'aco/ZstrainSZ194(大腸桿菌菌林SZ194將12%葡萄糖向1.2M乳酸的發(fā)酵).歷她cAwo/ow28(9):663-670.ZhouS，YomanoLP,ShanmugamKT,andIngramLO(2005)Fermentationof10%sugartoD(-)-lactatebyengineered5sc/ie〃'c/u'aco〃萬(工程改造的大腸桿菌B將10%糖向D(-)-乳酸的發(fā)酵).Aofec/wo/.27:1891-1896.ZhuMM,SkralyFA，andCameronDC(2001)Accumulationofmethylglyoxalinanaerobicallygrown五scAm'c力勿co//anditsdetoxificationbyexpressionofthei^ewdomowas/wdt/aglyoxylaseIgene(曱基乙二醛在厭氧生長(zhǎng)的大腸桿菌中的積累及其通過惡臭假單胞菌乙二醛酶I基因的表達(dá)進(jìn)行的解毒).Me/fl6.3:218-225.通過引用結(jié)合到本文中本文公開的所有專利、公布的專利申請(qǐng)和其他參考文獻(xiàn)，都明確地通過引用整體結(jié)合到本文中。等同方案本文所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同方案。這些等同方案意在被所附的權(quán)利要求書所涵蓋。權(quán)利要求1.包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌。2.包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到核糖體RNA操縱子中。3.包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中所述重組細(xì)菌不含有4元生素纟示{己。4.包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因被去除或滅活。5.包含整套異源產(chǎn)乙醇基因和一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因的重組細(xì)菌。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。7.重組細(xì)菌，其包含(a)整合到核糖體RNA操縱子中的整套異源產(chǎn)乙醇基因，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物；和(b)—個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因；且其中(i)一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記^:去除；和(ii)一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因被失活。8.權(quán)利要求2或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述核糖體RNA4喿纟從子包含選自htl4、〃"C、rmZ)、/7TiE、n7G牙口n^/f的基因。9.權(quán)利要求2或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述核糖體RNA操縱子包含廳伍基因。10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因包含pt/c、a^/L4和ad/^。11.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因衍自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。12.權(quán)利要求3或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述抗生素標(biāo)記選自安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨節(jié)青霉素和氯霉素。13.權(quán)利要求4或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因編碼參與NADH氧化的發(fā)酵途徑的蛋白質(zhì)。14.權(quán)利要求4或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)。15.權(quán)利要求4或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因是細(xì)菌的內(nèi)源基因。16.權(quán)利要求4或權(quán)利要求7的重組細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因是細(xì)菌的異源基因。17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)被失活的基因選自包含/od/y75基因區(qū)域、W/l4、flc^、"W五、/rd操縱子、caW5和的基因。18.權(quán)利要求17的重組細(xì)菌，其中所述adb4基因、a^五基因、基因和/W操縱子編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)。19.權(quán)利要求17的重組細(xì)菌，其中所述/0"-/^5基因區(qū)域、W/l4、flc/U、aW五、包含/W操縱子的基因和wgW是內(nèi)源基因。20.權(quán)利要求17的重組細(xì)菌，其中所述ca"5基因是異源基因。21.權(quán)利要求17的重組細(xì)菌，其中W/^4基因被缺失。22.權(quán)利要求21的重組細(xì)菌，其中所述W/l4基因是內(nèi)源基因。23.權(quán)利要求1-5中的重組細(xì)菌，所述重組細(xì)菌還包含/oc^-pyZ萬基因區(qū)域。24.權(quán)利要求23的重組細(xì)菌，其中所述/od-z/^基因區(qū)域是內(nèi)源基因區(qū)域。25.權(quán)利要求1-5中的重組細(xì)菌，其中所述/od-z/^基因區(qū)域來自大腸桿菌。26.權(quán)利要求6的重組細(xì)菌，其中所述一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因，是編碼以下蛋白質(zhì)的基因分泌性蛋白、多糖酶、葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、p-葡萄糖苷酶、內(nèi)切-l,4-P-木聚糖酶、p-木糖苷酶、a-葡糖醛酸酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、a-淀粉酶、p-淀;盼酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、(3-葡聚糖酶、半纖維素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果膠水解酶或果膠酸裂合酶。27.權(quán)利要求26的重組細(xì)菌，其中所述基因是e^Z基因。28.權(quán)利要求27的重組細(xì)菌，其中所述e^Z基因是異源基因。29.權(quán)利要求28的重組細(xì)菌，其中所述e^Z基因來自惡臭假單胞菌。30.權(quán)利要求26的重組細(xì)菌，其中所述編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因包含/ad基因和/"cy基因。31.權(quán)利要求30的重組細(xì)菌，其中所述/ad基因和/acy基因是內(nèi)源基因。32.權(quán)利要求31的重組細(xì)菌，其中所述/ad基因和/acy基因來自大腸桿菌。33.權(quán)利要求26的重組細(xì)菌，其中所述編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加所述整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因包含ce/y基因。34.權(quán)利要求33的重組細(xì)菌，其中所述ce/y基因是異源基因。35.權(quán)利要求34的重組細(xì)菌，其中所述ce/F基因來自菊歐文菌。36.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中mg"基因被缺失。37.權(quán)利要求36的重組細(xì)菌，其中所述mg^基因是內(nèi)源基因。38.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌在厭氧條件下產(chǎn)生乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。39.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述重組細(xì)菌能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。40.權(quán)利要求39的重組細(xì)菌，其中所述礦物鹽培養(yǎng)基含有木糖。41.權(quán)利要求40的重組細(xì)菌，其中所述AMI培養(yǎng)基包含至少約7%木糖。42.權(quán)利要求40的重組細(xì)菌，其中所述AM1培養(yǎng)基含有甜菜堿。43.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述重組細(xì)菌能夠在AM1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。44.權(quán)利要求43的重組細(xì)菌，其中所述礦物鹽培養(yǎng)基含有木糖。45.權(quán)利要求44的重組細(xì)菌，其中所述礦物鹽培養(yǎng)基包含至少約9%木糖。46.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所產(chǎn)生的乙醇占厭氧條件下礦物鹽培養(yǎng)基中總非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的40%以上。47.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。48.權(quán)利要求47的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是選自以下屬的革蘭氏陰性細(xì)菌不動(dòng)桿菌屬(^4"'""o^cte。、葡糖桿菌屬(G/wcowo6a"e。、埃希氏菌屬(&c力^7'cA/fl)、發(fā)酵單胞菌屬(Z少wowo"a力、地桿菌屬(Geo6flc—、希瓦氏菌屬(57ie雇we〃a)、沙門氏菌屬(5"a/wowe〃a)、志賀氏菌屬(幼z'ge〃a)、腸桿菌屬(￡""eraZwcfer)、檸檬酸桿菌屬(Cz'/ro6flcter)、歐文氏菌屬(五nWm'a)、沙雷氏菌屬(Serra"a)、變形菌屬(Pratew力、哈夫尼亞菌屬(/Z"a/"/a)、耶爾森氏菌屬(Jera'm'a)、摩根氏菌屬(Morga"e〃a)、愛德華氏菌屬Cfi^wara^e〃a)和克雷伯氏菌屬49.權(quán)利要求48的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。50.權(quán)利要求47的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是選自以下屬的革蘭氏陽性細(xì)菌芽孢桿菌屬(5ac說w力、梭菌屬(aoWn^wn)、棒狀桿菌屬(Co^"eZ""enY,w)、土芽孢桿菌屬(GeoZ^"7fo)、乳桿菌屬(丄actoZa"7fo)、乳球菌屬(丄actococcw力、酒J求菌屬(Oewococcw力、4連球菌屬(5Vr印,ococc^)和真桿菌屬(五t/Z^cten'i/m)。51.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌衍自大腸桿菌菌才朱KOll(ATCC55124)。52.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌衍自大腸桿菌菌林SZ110(NRRLB-30951)。53.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌菌林LY165(NRRLB-30952)。54.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌菌抹LY168(NRRLB-30953)。55.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是以下任何一個(gè)菌抹LY149、LY151、LY158、LY159、LY160、LY160im、LY161、LY163、LY168im、LY169、LY170、LY172、LY172im、LY173、LY178、LY180、LY186、BW34-XZ106、BW34-XZ107、BW34-XZ108、BW34-XZ109、BW34-XZ110、BW34-XZ111、BW34-XZ112、BW34-XZ113、BW34-XZ114、BW34-XZ115、BW34-XZ116、BW34-XZ117、BW34-XZ118、BW34-XZ119、BW34-XZ120、BW34-XZ121、BW34-XZ122、BW34-XZ123和BW34-XZ124。56.—種產(chǎn)生包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌的方法，所述方法包括將整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到宿主細(xì)菌中從而產(chǎn)生包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌的步驟。57.權(quán)利要求56的方法，所述方法還包括將所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合到核糖體RNA操縱子中。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述核糖體RNA操縱子包含選自rr"丄rr/五、mtC、miZ)、rmfi"、mz(7和rmf/"的基因。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述核糖體RNA操縱子包含廳伍基因。60.權(quán)利要求56的方法，所述方法還包括去除一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記。61.權(quán)利要求56的方法，所述方法還包括失活掉一個(gè)或多個(gè)編碼干擾或以別的方式減少該整套產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因。62.權(quán)利要求56的方法，所述方法還包括整合一個(gè)或多個(gè)編碼促進(jìn)乙醇的生產(chǎn)或以別的方式增加該整套異源產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的異源基因。63.權(quán)利要求56的方法，所述方法還包括以下步驟將所述整套異源產(chǎn)乙醇基因整合在宿主細(xì)菌的廳/五基因當(dāng)中；去除一個(gè)或多個(gè)抗生素標(biāo)記；和失活掉一個(gè)或多個(gè)乙醇生產(chǎn)所不需要的編碼干擾或以別的方式減少該整套產(chǎn)乙醇基因所產(chǎn)生的乙醇量的多肽的基因。64.權(quán)利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因包含pcfc、"^^4和c^/l5。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述pcfc基因、a^L4基因和fld/^基因衍自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。66.權(quán)利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，其中所述整套產(chǎn)乙醇基因包含在無啟動(dòng)子的操縱子中。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述無啟動(dòng)子的操縱子含有連接到和^Z/5之間的5^e/位點(diǎn)中的W/l4基因。68.權(quán)利要求66的方法，其中所述無啟動(dòng)子的操縱子含有可去除的抗生素標(biāo)記。69.權(quán)利要求66的方法，其中所述無啟動(dòng)子的操縱子用Tn5轉(zhuǎn)座子來整合。70.權(quán)利要求56、63或68的方法，其中所述抗生素標(biāo)記用重組酶來去除。71.權(quán)利要求70的方法，其中所述抗生素標(biāo)記選自安普霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氨千青霉素和氯霉素。72.權(quán)利要求61或權(quán)利要求63的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)基因通過缺失或突變來滅活。73.權(quán)利要求72的方法，其中一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)乙醇基因通過缺失來滅活。74.權(quán)利要求72的方法，其中編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)的基因被滅活。75.權(quán)利要求72的方法，其中權(quán)利要求73-74中任一項(xiàng)所述的基因在所述整套異源產(chǎn)乙醇基因被整合前先被滅活。76.權(quán)利要求72的方法，其中所述宿主細(xì)菌是大腸桿菌菌抹KOU(ATCC55124)。77.權(quán)利要求76的方法，其中包含/o"-z/^基因區(qū)域的產(chǎn)乙醇基因通過缺失來滅活。78.權(quán)利要求76的方法，其中編碼參與丙酮酸代謝的替代途徑的蛋白質(zhì)的基因被滅活。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述基因包括adb4、a^五、W/l4和mgs丄80.權(quán)利要求77-79中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組細(xì)菌衍自SZ110(NRRLB-30951)。81.權(quán)利要求75的方法，其中所述內(nèi)源W/l4基因通過缺失來滅活。82.權(quán)利要求81的方法，其中所述W/L4基因在所述整套異源產(chǎn)乙醇基因被整合前先被缺失。83.權(quán)利要求75的方法，其中異源cwylS基因通過缺失來滅活。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述ca^5基因來自催產(chǎn)克雷伯氏桿菌。85.權(quán)利要求83的方法，所述方法還包括用/a"基因和/acy基因替代ca^萬基因的步驟。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述/"d基因和/acy基因來自大腸桿菌。87.一又利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括整合e^Z基因的步驟。88.權(quán)利要求87的方法，其中所述e^Z基因來自惡臭假單胞菌。89.權(quán)利要求87的方法，其中所述e^Z基因在所述整套產(chǎn)乙醇基因整合后再被整合。90.權(quán)利要求72的方法，其中內(nèi)源基因通過缺失來滅活。91.權(quán)利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括去除或滅活lac操縱子的步驟。92.權(quán)利要求91的方法，所述方法還包括恢復(fù)lac操縱子的步驟。93.權(quán)利要求92的方法，其中所述從lac操縱子恢復(fù)的基因包含94.權(quán)利要求93的方法，其中所述包含/"c操縱子的基因來自大腸桿菌。95.權(quán)利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括缺失/W萬基因的步驟。96.權(quán)利要求92的方法，所述方法還包括部分缺失/WC基因的步驟。97.權(quán)利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括整合ceJ基因的步驟。98.權(quán)利要求97的方法，其中所述ce/r基因整合在/WA基因的下游。99.權(quán)利要求98的方法，其中所述ce/r基因來自菊歐文菌。100.權(quán)利要求55-62中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括整合cos^B基因的步驟。101.權(quán)利要求100的方法，其中所述cos^B基因整合到W/l4基因中。102.權(quán)利要求101的方法，其中所述cwv^基因來自催產(chǎn)克雷伯氏桿菌。103.權(quán)利要求56-63中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括恢復(fù)/004-/7/^基因區(qū)域的功肯巨。104.權(quán)利要求103的方法，其中所述/od//W基因區(qū)域的功能通過/oo4-j^萬基因區(qū)域的同源重組來恢復(fù)。105.權(quán)利要求103的方法，其中所述/oc^p/75基因區(qū)域的功能在所述整套產(chǎn)乙醇基因整合前先被恢復(fù)。106.權(quán)利要求56-105中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)菌是大腸桿菌菌抹SZ110(NRRLB-30951)。107.權(quán)利要求56-105中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組細(xì)菌是大腸桿菌菌抹LY165(NRRLB-30952)。108.權(quán)利要求56-105中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組細(xì)菌是大腸桿菌菌抹LY168(NRRLB-30953)。109.權(quán)利要求56-105中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組細(xì)菌能夠在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。110.權(quán)利要求109的方法，其中所述礦物鹽培養(yǎng)基包含木糖。111.權(quán)利要求49-110中任一項(xiàng)的方法，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。112.—種從寡糖來源生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括使所述寡糖與權(quán)利要求1-55任一項(xiàng)的重組細(xì)菌在適于乙醇生產(chǎn)的條件下進(jìn)行接觸，從而從寡糖來源生產(chǎn)出乙醇。113.權(quán)利要求U2的方法，其中所述寡糖選自木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素和果膠或者它們的組合。114.權(quán)利要求112或權(quán)利要求113的方法，其中所產(chǎn)生的乙醇占總非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的40%以上。115.權(quán)利要求111-114中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括提供重組細(xì)菌。116.權(quán)利要求111-115中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括獲得重組細(xì)菌。117.權(quán)利要求111-116中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括使所述寡糖與所述重組細(xì)菌在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接觸。118.權(quán)利要求117的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基選自礦物鹽培養(yǎng)基或AMI培養(yǎng)基。119.權(quán)利要求117的方法，其中所述礦物鹽培養(yǎng)基每升包含3.5gKH2PO4、5.OgK2HPO4、3.5g(NH4)2HPO4、0.25gMgS04'7H2。、15mgCaCl2.2H20、0.5mg硫胺素和lmL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)加有2(w/v)。/。-9(w/v)。/。木并唐。120.權(quán)利要求119的方法，所述方法還包括將甜菜堿添加到礦物鹽培養(yǎng)基中。121.權(quán)利要求119的方法，所述方法還包括將MOPS添加到礦物鹽培養(yǎng)基中。122.權(quán)利要求118的方法，其中所述AM1培養(yǎng)基每升包含2.63g(NH4)2HP04、0.87gNH4H2P04、0.375g/LMgS04'7H20、0.149gKC1、.0163g甜菜堿HC1(pH7.4)和1.5mL痕量金屬儲(chǔ)液，補(bǔ)加有2(w/v)%-14(w/v)。/。所指定的糖。123.權(quán)利要求122的方法，其中所述痕量金屬儲(chǔ)液可在0.1MHC1中制備(每升1.6gFeCl3'6H20、0.2gCoCl2'6H20、O.lgCuCl2'2H20、0.2gZnCl2、0.2gNa2MoO4'2H2O、0.05gH3BO3、0.33gMnCl2'4H20)。124.權(quán)利要求112-123中任一項(xiàng)的方法，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。125.權(quán)利要求112的生產(chǎn)乙醇的方法，其中所述方法使用權(quán)利要求1-55中《壬一項(xiàng)的重組細(xì)菌。126.—種包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌，其中所述重組細(xì)菌通過包含權(quán)利要求55-110中任一項(xiàng)的方法的步驟的方法來制備。127.權(quán)利要求126的重組細(xì)菌，其中所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。128.—種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1-55中任一項(xiàng)的重組細(xì)菌和使用說明書。129.權(quán)利要求127的試劑盒，其中所述使用說明書與權(quán)利要求95-125中任一項(xiàng)的方法相一致。130.權(quán)利要求128的試劑盒，所述試劑盒還包含糖源。131.大腸桿菌菌抹SZ110(NRRLB-30951)。132.大腸桿菌菌林LY165(NRRLB-30952)。133.大腸桿菌菌抹LY168(NRRLB-30953)。全文摘要本發(fā)明提供包含整套異源產(chǎn)乙醇基因的重組細(xì)菌。所述整套異源產(chǎn)乙醇基因的表達(dá)促使重組細(xì)菌當(dāng)在礦物鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)不用添加復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)物就生產(chǎn)乙醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還公開了產(chǎn)生重組細(xì)菌的方法和用重組細(xì)菌生產(chǎn)乙醇的方法。文檔編號(hào)C12N1/21GK101679939SQ200780037561公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2007年8月8日優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日發(fā)明者K·尚馬加姆,L·O·因格拉姆,L·P·約馬諾,S·W·約克,S·周申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)