專利名稱：一種無選擇標記載體及應用該載體培育高含類黃酮和咖啡酰奎尼酸的馬鈴薯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域，提供了一種以馬鈴薯塊莖特異表達基因patatin的啟動子、擬南芥AtMYB12基因和Cre/lox位點特異性重組系統構建pX6-patatin: :AtMYB12無選擇標記載體，同時利用ー個相對于前人更簡單有效的農桿菌轉化法將目的基因轉入馬鈴薯品種Desiree中，獲得無選擇標記的高含類黃酮和咖啡酰奎尼 酸的馬鈴薯。
背景技術：
擬南芥R2R3-MYB類轉錄因子AtMYB12為類黃酮生物合成的特異激活子，在擬南芥中可以增加類黃酮含量的積累。Luo等將該基因轉化到番茄中，發(fā)現蘆丁和山奈酚-蕓香糖苷含量比對照增加了 65倍，總的黃酮醇，積累量達到了 72mg/g DW。類黃酮(Flavonoid)又稱黃酮類化合物，是ー類具有“黃烷核”基本骨架的低分子量多酚類物質的總稱。黃烷核由2個芳香環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過I個中央三碳鏈(可能形成雜環(huán)C環(huán))連接而成。根據B環(huán)的連接位置、中央三碳鏈的氧化程度以及中央三碳鏈是否構成環(huán)狀等特點，可以把黃酮類化合物分為6大類黃酮類、黃酮醇類、黃酮酮類、兒茶精類、異黃酮類、花青素類。類黃酮廣泛存在于各種植物中，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗骨質疏松、抗腫瘤等功能。在農業(yè)、醫(yī)藥、飼料、化工等領域有著重要的應用價值。除了植物中普遍存在的花色苷外，黃烷酮，黃酮醇，黃酮等其他類黃酮物質在馬鈴薯塊莖，花，葉，種子中也均被發(fā)現，但是含量極低。Lewis等運用HPLC法對26種有色馬鈴薯栽培品種的塊莖，花，葉中主要的酚類化合物的含量進行了測定?；ㄖ蓄慄S酮含量最高，達到1000-3000 μ g/g，其次為葉，為500-2000 μ g/g，塊莖中最低，為200-400 μ g/g，且塊莖肉中僅有0-30 μ g/g。塊莖中的類黃酮種類主要為黃烷酮、柚皮素、圣草酚、兒茶酸和表兒茶酸。最常見的槲皮素、蘆丁、山奈酚和山奈酚蕓香苷等黃酮醇在塊莖中痕量存在。綠原酸(Chlorogenicacid),是由咖卩非酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinicacid, I-羥基六氫沒食子酸)生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的ー種苯丙素類化合物。根據咖啡酰在奎尼酸上的結合部位和數目不同，從理論上講，單咖啡?？崴岷庭丝Х弱？崴崴M成的綠原酸異構體共有10種，分別為1_咖啡?？崴?、3-咖啡?？崴?、4-咖啡?？崴?、5-咖啡?？崴?、I，3- ニ咖啡?？崴?、I，5- ニ咖啡?？崴帷?，6- ニ咖啡酰奎尼酸、3，4- ニ咖啡?？崴?、3，5- ニ咖啡?？崴帷?，5- ニ咖啡酰奎尼酸。到目前為止，從植物中發(fā)現的綠原酸異構體有如下綠原酸(3-咖啡?？崴?、隱綠原酸(Band510 (4-咖啡?？崴?、新綠原酸(5-咖啡?？崴?、異綠原酸A (4，5- ニ咖啡?？崴?、異綠原酸B (3，4- ニ咖啡?？崴?、異綠原酸C (3，5- ニ咖啡?？崴?、萊薊素(1，3-ニ咖啡酰奎尼酸)。本研究中涉及的5-咖啡?？崴峋Q為綠原酸。綠原酸的生物活性綠原酸被認為是眾多藥材和中成藥抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，通常被作為定性甚至定量的指標。據報道，綠原酸的主要生物活性有(I)對透明質酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；(2)對自由基的清除及抗脂質過氧化作用；(3)抗誘變作用；(4)保肝利膽作用；(5)抗菌、抗病毒及解痙等作用。馬鈴薯是重要的糧食作物之一，屬于茄科，同源四倍體，應用雜交育種的方法改良品種比較困難，同時馬鈴薯塊莖中多酚類化合物含量非常低。在培育馬鈴薯品種的研究中，營養(yǎng)品質是馬鈴薯品種改良的ー個主要目標，利用基因工程技術有較大的優(yōu)勢，因其可以通過塊莖無性繁殖，將轉基因特性傳遞給后代而無需經花培純化或多代選育。隨著分子生物學研究的不斷深入，馬鈴薯遺傳轉化體系也日趨成熟，但仍存在基因性限制、轉化率較低的問題。轉基因育種技術是常規(guī)育種的有益補充，轉基因植物中篩選標記的存在是轉基因安全上爭論的焦點之一，標記基因的去除已經成為近年來轉基因研究的熱點。目前篩選標記的去除方法主要有轉座子系統、共轉化系統、同源重組以及Cre/lox，FLP/f rt和R/Rs 逐漸成為篩選標記去除的首選工具。其中Cre/lox系統是應用最廣泛、研究最深入的位點特異性重組系統。此系統于1981年在Pl噬菌體中被發(fā)現，最早應用于動物轉基因研究中。1990年，Dale等首次將Cre/lox系統應用于轉基因煙草中，實現了分子內特異性重組。Zuo等(2000)成功地開發(fā)了ー個化學誘導型的Cre/lox系統，此系統中，編碼重組酶的ere基因在雌ニ醇的誘導下表達，將2個Ioxp位點之間的區(qū)間包括篩選標記的部分成功剪切棹，從而達到去除NPT II基因的目的。目前此系統已經成功的應用于煙草、擬南芥、番茄等多種植物的無選擇標記品種培育中，但是在馬鈴薯的無選擇標記培育中還沒有被廣泛的推廣和應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現有技術的情況，提供了一種以馬鈴薯塊莖特異表達基因patat in的啟動子、擬南芥AtMYB 12基因和Cr e/1 ox位點特異性重組系統構建pX6-patatin: :AtMYB12無選擇標記載體，同時利用一個相對于現有技術更簡單有效的農桿菌轉化法將目的基因轉入馬鈴薯品種Desiree中，獲得無選擇標記的高含類黃酮和咖啡?？崴岬鸟R鈴薯。通過轉基因技術在馬鈴薯塊莖中特異表達AtMYB12基因，大大提高了馬鈴薯塊莖中類黃酮和咖啡酰奎尼酸的含量。發(fā)明人首先獲得了ー種包含AtMYB12基因的cDNA片段以及調控這個基因在馬鈴薯塊莖特異表達的patatin基因的啟動子序列。其中，所述包含AtMYB12基因的cDNA片段其基因序列如序列表SEQ ID NO :I所示，或者基本上相當于SEQ ID NO :1所示的DNA序列，也就是說包含如如序列表SEQ ID NO :1所示全序列但是還帶有其他功能序列的DNA序列，其中，所述patatin基因的啟動子序列如序列表SEQ ID NO :2所示,或者基本上相當于SEQID NO :2所示的DNA序列，也就是說包含如如序列表SEQ ID NO :2所示全序列但是還帶有其他功能序列的DNA序列。之后，發(fā)明人利用Cre/lox特異位點重組系統載體PX6-GFP，采用高保真PCR技術，通過分步克隆的策略，構建了載體pX6_patatin: :AtMYB12，并導入農桿菌工程菌AGL I中；采用本發(fā)明中改進的莖段轉化法將該載體轉化栽培種Desiree。用雌ニ醇誘導轉基因馬鈴薯植株，標記基因NPT II去除效率達到8. 8%，從而獲得無選擇標記的馬鈴薯植株。其中，發(fā)明人綜合前人馬鈴薯轉基因的方法，總結出了一套更簡單有效的馬鈴薯轉化體系。在農桿菌侵染步驟去掉了預培養(yǎng)環(huán)節(jié)，同時將農桿菌離心沉淀后重新懸浮進行莖段侵染的方法改為直接將100 μ L OD600為O. 8的農桿菌菌液加入到20ml MSO培養(yǎng)基中侵染莖段的方法，在愈傷培養(yǎng)環(huán)節(jié)，不再加入篩選抗生素卡那霉素，而是在培養(yǎng)12天后轉到加有抗生素卡那霉素的分化培養(yǎng)基M2上選擇培養(yǎng)，而上述的這些措施綜合在一起大大的増加了馬鈴薯的再生效率。綜合上述的方法，發(fā)明人在國際上首次獲得了高含類黃酮和咖啡?？崴岬鸟R鈴薯培育方法。這種方法是通過轉基因技術在馬鈴薯塊莖中特異表達AtMYB12基因，大大提高了馬鈴薯塊莖中類黃酮和咖啡?？崴岬暮浚D基因馬鈴薯塊莖中蘆丁的含量高達3. 091mg/g Dff,山奈酚蕓香苷含量達到O. 951mg/g Dff,而5-咖啡?？崴?綠原酸)的含量高達4. 846mg/gDW，另外I-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡?？崴?、4-咖啡?？崴帷uercetin glucosylglucosiae rhamnoside、Quercetin diglucoside 和 Kaempfero丄 glucosylglucoside rhamnoside在轉基因馬鈴薯塊莖中也積累了相當高的含量，而對照馬鈴薯品種Desiree中蘆丁和山奈酚蕓香苷等類黃酮及咖啡酰奎尼酸的含量均低于高效液相色譜檢測限值，因此均檢測不出其具體含量。采用這類轉基因技術創(chuàng)造高含類黃酮和咖啡?？崴岬鸟R鈴薯是傳統育種技術所不能達到的，總之，本發(fā)明通過轉基因技術在馬鈴薯塊莖中特異表達AtMYB12基因，大大提高了馬鈴薯塊莖中類黃酮和咖啡酰奎尼酸的含量。


圖I為pX6_patatin: : AtMYB12表達載體構建示意圖；圖2為？乂6- &セ&^11:^セ1^812表達載體重組質粒乂110 I/Spe I雙酶切鑒定電泳圖，圖中M為Trans2K Plus II DNA標準；1_3為經Xho I/Spe I降解的重組質粒；圖3為莖段轉化法轉化馬鈴薯品種Desiree過程灰度示意圖，圖中A為莖段兩端愈傷，B為即將出芽的愈傷，C為再生芽，D和E為再生馬鈴薯苗，F為通過D和E獲得的馬鈴薯苗種植的馬鈴薯植株；圖4為轉基因植株中目的基因AtMYB12的PCR檢測結果示意圖，圖中M 為 DNA marker (λ -EcoRTH I digest) ; 1-14 分別為轉 AtMYB12 基因植株；N為陰性對照；P為陽性對照(即質粒pX6-patatin: :AtMYB12)可見待測植株中除11和14夕卜，其他均獲得的目的基因；檢測出的目的基因位于1178bp處；圖5為雌ニ醇誘導后轉基因再生植株AtMYB12基因的PCR擴增檢測結果示意圖，圖中M為DL 2000 DNA marker ;1_14分別為雌ニ醇誘導后的馬鈴薯再生苗；N為陰性對照(Desiree) ;P1 為陽性對照(pX6_patatin: :AtMYB12 質粒)；圖6為雌ニ醇誘導后轉基因再生植株NPTII基因的PCR擴增檢測結果示意圖，圖中M為DL 2000 DNA marker ;1_14分別為雌ニ醇誘導后的馬鈴薯再生苗；N為陰性對照(Desiree) ;P2為陽性對照(轉pX6_patatin: :AtMYB12基因馬鈴薯)；圖5和圖6是用不同的引物擴增的是同一批樣品，通過圖5和圖6可以看到轉入到馬鈴薯的片段同時包含AtMYB 12基因和NPTII基因，本發(fā)明的發(fā)明人利用Cr e/1 ox位點特異性重組系統剔除選擇標記基因NPTII基因，使得轉基因植株中只含有AtMYB12基因，而不含NPTII基因，通過圖5和6的對比可知，編號為6、8和14的轉基因植株中含有AtMYB12基因，而NPTII基因已經被剔除，這些植株即是我們需要的無選擇標記的轉基因馬鈴薯；圖7為轉基因馬鈴薯與野生型馬鈴薯塊莖提取物的液相色譜檢測疊加譜圖；圖中譜線a為轉入AtMYB12基因的馬鈴薯塊莖提取物，譜線b為未轉基因馬鈴薯塊莖提取物，如圖所示轉基因馬鈴薯薯塊的提取物與對照非轉基因馬鈴薯塊莖提取物相比多種次生代謝物質的含量都有明顯的提高。
具體實施例方式以下實施例中進ー步定義本發(fā)明，根據以上的描述和這些實施例，本領域技術人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領域現有技術；本發(fā)明中所涉及的多種培養(yǎng)基具體如下MS培養(yǎng)基MS大量元素，MS微量元素，MS維生素，鐵鹽瓊脂8g/L(MS培養(yǎng)液不加)，PH5. 7-5. 8。馬鈴薯莖段侵染用液體培養(yǎng)基MSO : I XMurashige and Skoog (MS)，蔗糖20g/L, NAAO. 2mg/L, GA3 O. 02 mg/L, zeatin riboside 2. 5mg/L, pH5.7-5. 8。共培養(yǎng)培養(yǎng)基MO : I XMurashige and Skoog (MS),鹿糖 20g/L, NAA O. 2mg/L, GA3
0.02mg/L, zeatin riboside 2. 5mg/L,瓊脂粉 8g/L, pH5. 7-5. 8。愈傷誘導培養(yǎng)基Ml :MO+cefotaxime 500mg/L。分化培養(yǎng)基M2 MS+NAA 0. 02mg/L, GA30. 02mg/, zeatin riboside 2mg/L,cefotaxime500mg/L, kanamycin 50mg/Lo生根培養(yǎng)基MR MS+cefotaxime 500mg/L, kanamycin 25mg/L,瓊脂粉 8g/L,pH5. 7-5. 8。實施例lpX6_patatin: : AtMYB12重組載體構建目的及策略為達到在薯塊中特異表達類黃酮調控基因AtMYB12的目的，發(fā)明人在研究中將馬鈴薯中薯4號塊莖中特異表達淀粉的基因patatin啟動子序列和擬南芥中調控類黃酮合成的AtMYB12基因編碼區(qū)連接在一起，替換掉植物表達載體PX6-GFP中的GFP基因，完成pX6-patatin: :AtMYB12重組載體的構建。該載體轉入到馬鈴薯后，ere基因編碼的重組酶在誘導劑β -estradiol作用下誘導表達,將2個Ioxp位點之間的區(qū)間包括篩選標記的部分成功剪切棹，從而達到去除NPT II基因的目的。實施例2pX6_patatin: : AtMYB12 重組載體構建I.目的片段的PCR擴增馬鈴薯中薯4號葉片DNA提取采用CTAB法，取O. 5g左右幼嫩的植物葉片，加入300μ IDNA 提取緩沖液(50mmol/L Tris. HCL,25mmol/L EDTA, 300mmol/L NaCl, I % SDS)研磨，加入等體積氯仿混勻離心后采用こ醇沉淀，最終溶解于50 μ I TE溶液用于后續(xù)PCR或-20°C暫時保存。
植物組織RNA的提取采用TRI reagent (Sigma,美國)法,按照試劑盒說明書操作。起始材料為IOOmg擬南芥新鮮幼苗，提取的RNA溶解在50 μ I無RNase去離子水中，-80°C保存?zhèn)溆谩］d體構建中涉及Patatin啟動子、AtMYB12基因的擴增采用高保真PCR，按照Phusion超保真DNA聚合酶(FINNZYMES，芬蘭)操作指導進行。50 μ I PCR反應體系(終濃度包含 I XPhusion HF buffer, 200 μ mol/L dNTP, O. 5 μ mol/L Primer each, 0. 02U/ μ IPhusion DNA Polymerase, 2ng/μ I DNA)在 ABI9700 型 PCR 儀上反應條件為98°C預變性Imin ;98°C變性10s，58°C退火10s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)；72°C終延伸lOmin。載體構建過程中涉及的細菌陽性檢測和轉基因植株陽性檢測均采用常規(guī)PCR，試劑采用TaKaRarTaq DNA Polymerase, 20 μ I PCR反應體系(終濃度包含 I XPCR buffer, 50 μ mol/L dNTP,O. 2 μ mol/L Primer each, 0. 05U/ μ I rTaq DNA Polymerase, 2ng/ μ I DNA)反應條件為94°C預變性3min ;94°C變性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35個循環(huán)；72°C終延伸IOmin0試驗中用到的引物序列及說明見下表I。
權利要求
1.一種無選擇標記載體，其特征在于該載體是以馬鈴薯塊莖特異表達基因patatin 的啟動子、擬南芥AtMYB 12基因和Cr e/1 ox位點特異性重組系統載體pX6_GFP構建的 pX6-patatin: : AtMYB12無選擇標記載體。
2.根據權利要求I所述的無選擇標記載體，其特征在于其中所述的擬南芥AtMYB12 基因為AtMYB12基因的cDNA片段，其基因序列如序列表SEQ ID NO I所不，所述patatin 基因的啟動子序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
3.如權利要求I所述無選擇標記載體在培育高含類黃酮和咖啡?？崴岬鸟R鈴薯上的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域，提供了一種以馬鈴薯塊莖特異表達基因patatin的啟動子、擬南芥AtMYB12基因和Cre/lox位點特異性重組系統構建pX6-patatin::AtMYB12無選擇標記載體，同時利用一個相對于現有技術更簡單有效的農桿菌轉化法將目的基因轉入馬鈴薯品種Desiree中，獲得無選擇標記的高含類黃酮和咖啡酰奎尼酸的馬鈴薯。通過轉基因技術在馬鈴薯塊莖中特異表達AtMYB12基因，大大提高了馬鈴薯塊莖中類黃酮和咖啡酰奎尼酸的含量。
文檔編號C12N15/84GK102690840SQ20121019287
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權日2012年6月13日
發(fā)明者丁新華, 代麗麗, 儲昭輝, 馬連杰 申請人:山東農業(yè)大學