專利名稱：：人g-csf的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的高產(chǎn)量生產(chǎn)G-CSF的方法，其通過在生產(chǎn)期期間高鹽誘導(dǎo)增加質(zhì)粒穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞因子粒細(xì)胞集落刺激因子(GranulocyteColonyStimulatingFactor,G-CSF)治療顯著改善了患有嚴(yán)重的慢性中性白細(xì)胞減少患者的生活質(zhì)量[Jones等X4Af^270:1132-1133(1993)。G~CSF是從骨髄儲(chǔ)備釋放粒細(xì)胞以及增強(qiáng)其抗微生物活性的強(qiáng)效的內(nèi)源觸發(fā)劑。G"CSF在急性疾病的多種臨床前模型中被廣泛評估，并且一般都得到了很有希望的結(jié)果[MarshallJ.C.S/^cA:24:120-9(2005)]。由于其在化療周期中得到證實(shí)的功效，G-CSF成為腫瘤學(xué)中重要的生物技術(shù)藥物。G^CSF已被克隆并在多種類型的細(xì)胞中表達(dá)，例如微生物細(xì)胞[SouzaL.M.Sc&w"232:61-65(1986);HuZ.Y.等ZhongguoShenghuaYaowuZazhi(1999),20:55-57、酵母細(xì)胞[LasnikM.A.等5,Wedi朋/.81:768-774(2003);LeeS.M.等韓國專利KR160934Bl19981116、水稻細(xì)胞[Hong等Prate/"五x，在線發(fā)表(2005)1、貓細(xì)胞[Yamamoto等Ge"e274:263-269(2001)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞MonacoGewe.180:145-150(1996)、昆蟲細(xì)胞[Shinkai等10:379-385(1997)，甚至在轉(zhuǎn)基因山羊中表達(dá)[KoJ.H.等T)Ym艱e/ifci^s.9:215-22(2000)。用于藥物用途的G^CSF主要在大腸桿菌(五sc/^Wc/iiVi)中以包涵體的形式生產(chǎn)[JevsevarS.等說W"/i朋/.Prag.21:632-639(2005)1，所述包涵體是非天然構(gòu)象的重組蛋白形成的不溶聚集物BaneyxF.&MujacicM.AWw"5,Vtec/mo/L22:1399-1408(2004)，其通常不具有生物活性BernardezC.E.Cwr.O//".說W"/iwo/.9:157-163(1998)。G-CSF的分泌生產(chǎn)技術(shù)也已報(bào)道[JeongKJ.&LeeS.Y.五x/7r尸"ny:23:311-318(2001);LeeS.Y.等說W.308:31-42(2005)。分泌表iiit常導(dǎo)致正確折疊形式的G"CSF釋放到周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基中，但是產(chǎn)量比通過包涵體形式獲得的要少得多。因此，在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)G-CSF具有商業(yè)優(yōu)勢?？梢砸陨虡I(yè)上可行的方式，在分離和溶解包涵體后采用變性和復(fù)性方法容易地從包涵體獲得正確折疊的、具有生物活性的G-CSF蛋白[RudolphR，在iV他1V1五wgiWmVig:尸nVici]p/esflrfPracft'ce中；Cleland，J.L.，Craik,S.C.，電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)；Wiley-Liss，Inc.:NewYork,1996;283-298頁；RathoreA.S.等J尸/^f7MJ""/.32:1199-1211(2003)。在大腸桿菌中生產(chǎn)重組蛋白最有效的方法之一是補(bǔ)料-分批發(fā)酵，其可以以循環(huán)和非循環(huán)的模式進(jìn)行。非循環(huán)方法較不復(fù)雜，因此更適于工業(yè)生產(chǎn)。事實(shí)上，現(xiàn)有技術(shù)記載了利用非循環(huán)的補(bǔ)料-分批方法生產(chǎn)GCSF的最高產(chǎn)量之一為4.2-4.4g/L[YimSC等所0/wyk^s朋rf5/仍p&附s五"g/"een'"g(2001),24，249-254。為獲得更高的累積量而以循環(huán)模式進(jìn)行補(bǔ)料-分批發(fā)酵造成質(zhì)粒的高不穩(wěn)定性ChoiS.-J.等丄vW/cra6/tf/.fi1W"A110/.10:321-326(2000)，從而限制了該方法的穩(wěn)健性(robustness)。通常，為了使產(chǎn)物高表達(dá)，需要將含有產(chǎn)物基因的染色體外質(zhì)粒以其合適的形式保持在細(xì)胞中。這通常通過向培養(yǎng)基加入合適的抗生素以對重組微生物保持選擇壓力來實(shí)現(xiàn)，已有報(bào)道，通過在發(fā)酵過程中每1-2小時(shí)加入抗生素(氨節(jié)青霉素)以降低重組菌林的"分離不穩(wěn)定性(segregationalnonstability)"來提高G畫CSF的表達(dá)水平(KrivopalovaGN.等俄羅斯專利RU2158303C220001027)。從終產(chǎn)物清除抗生i的調(diào)控需要必然使其應(yīng)用受到限制。越是大量使用抗生素，越是可能對環(huán)境產(chǎn)生不良影響。但是降低抗生素選擇壓力常常導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性和表達(dá)水平的降低，這削弱了該方法的穩(wěn)健性。因此，在限制抗生素使用的同時(shí)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性和產(chǎn)物的表達(dá)水平(特別是在生產(chǎn)期)是一個(gè)技術(shù)上的挑戰(zhàn)。此外，通常在大體積的培養(yǎng)物中，生產(chǎn)期期間的質(zhì)粒低穩(wěn)定性也可由代謝壓力所致[SaraswatV.等F五A/S"Af/cra6/W.Z^汰179:367-373(1999)，并可能造成低表達(dá)水平[ChengC.etal5/W"A/i"56:23-31(1997)。除了保持抗生素的高選擇壓力，還可以在載體構(gòu)建水平上提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性[SchwederT.等Af/cra6/o/說W"/i朋/.38:91-93(1992);PanS.H.和MalcomB.A.丑/otecA附々"仏29:1234-1238(2000)。實(shí)踐中，可以通過調(diào)整培養(yǎng)條件(例如避免營養(yǎng)饑餓)來提高質(zhì)粒穩(wěn)定性[Smith&BidochkaCVi"./A/iVrM,W.44:351-355(1998)。當(dāng)實(shí)施大M^的底物限制性補(bǔ)料-分批方法時(shí)，營養(yǎng)受P艮/饑餓極易發(fā)生，并且在低復(fù)雜度的方法中過于頻繁或大量地加入抗生素以維持高產(chǎn)量和質(zhì)粒高穩(wěn)定性也是不切實(shí)際且昂貴的解決方案。因此，需要開發(fā)一種使用簡單而穩(wěn)定的方法來保持質(zhì)粒高穩(wěn)定性從而制備高體積產(chǎn)量G-CSF的替代方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明描述了一種在大腸桿菌中以高體積產(chǎn)量(volumetricyield)生產(chǎn)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的非循環(huán)式補(bǔ)料-分批方法，其通過在生產(chǎn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)液中高濃度聯(lián)合使用鉀離子與鎂離子或鈉離子來保持培養(yǎng)物中質(zhì)粒高穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)。圖1顯示在生產(chǎn)期中使用高濃度的鉀和鈉陽離子對分批收獲時(shí)BL21(DE3)細(xì)胞中含有G-CSF基因的質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響。在生產(chǎn)期中，在第2批中使用高濃度的鉀鹽和鈉鹽，而在第l批中則不使用高濃度的鉀鹽和鈉鹽。各批在30L發(fā)酵罐中單獨(dú)進(jìn)行。圖2顯示在生產(chǎn)期中使用高濃度的鉀和鈉陽離子對所收獲批次中G-CSF體積產(chǎn)量的影響。在生產(chǎn)期中，在第2批中使用高濃度的鉀鹽和鈉鹽，而在第l批中則不使用高濃度的鉀鹽和鈉鹽。各批在30L發(fā)酵罐中單獨(dú)進(jìn)行。圖3顯示在生產(chǎn)期中使用高濃度的鎂和鉀陽離子對分批收獲時(shí)BL21(DE3)細(xì)胞中含有G-CSF基因的質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響。在生產(chǎn)期中，在第4批中使用高濃度的鎂鹽，而在第3批中則不使用高濃度的鎂鹽。兩批中均使用高濃度的鉀鹽，并在30L發(fā)酵罐中單獨(dú)進(jìn)行。圖4顯示使用高濃度的鎂和鉀陽離子對所收獲批次中G-CSF體積產(chǎn)量的影響。在生產(chǎn)期中，在第4批中使用高濃度的鎂鹽，而在第3批中則不使用高濃度的鎂鹽。兩批中均使用高濃度的鉀鹽，并在30L發(fā)酵罐中單獨(dú)進(jìn)行。圖5顯示在生產(chǎn)期中使用高的比生長速率對所收獲批次中G-CSF體積產(chǎn)量的影響。在生產(chǎn)期期間，第4批的平均比生長速率約為0.041/h，而第5批的平均比生長速率則約為0.07l/h。兩批中均使用高濃度的鉀鹽和鎂鹽，并在30L發(fā)酵罐中單獨(dú)進(jìn)行。圖6顯示在生產(chǎn)期中使用高濃度的硫胺素對所收獲批次中G-CSF體積產(chǎn)量的影響。在生產(chǎn)期期間，第l批的生產(chǎn)培養(yǎng)基中包含7g/L硫胺素，而在第6批中則不使用硫胺素。兩批在30L發(fā)酵罐中單獨(dú)進(jìn)行。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的以提高水平的體積產(chǎn)量生產(chǎn)粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)的發(fā)酵方法。本發(fā)明還公開了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的培養(yǎng)條件，其進(jìn)一步提高G-CSF的體積產(chǎn)量。本發(fā)明的方法包括經(jīng)由多次誘導(dǎo)的非循環(huán)補(bǔ)料-分批方法，其在生產(chǎn)培養(yǎng)基中存在高濃度的鉀以及另外的高濃度無機(jī)鹽(例如鈉、鎂等)下進(jìn)行。出乎意料的是，當(dāng)本發(fā)明的使用鹽的方法(在下文中有詳述)與高的比生長速率聯(lián)合使用時(shí)，仍保持高的質(zhì)粒穩(wěn)定性并導(dǎo)致體積產(chǎn)量進(jìn)一步提高。本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述如下可以應(yīng)用任何粒細(xì)胞集落刺激因子(本文也稱為"G-CSF")多肽。術(shù)語"粒細(xì)胞集落刺激因子"或"G-CSF"是指天然G-CSF、其突變蛋白、片段、融合蛋白、類似物和衍生物，它們表現(xiàn)出天然hG-CSF的至少60%生物活性或受體結(jié)合活性或者保持至少約80%氨基酸一致性。這樣的G-CSF序列包括Genbank序列IDGI:27437048以及美國專利No.4810643中所述的序列。使用本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)化技術(shù)，用合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含G-CSF的編碼序列以及選自f7、toc和類似啟動(dòng)子的合適啟動(dòng)子連同其它載體組分。在下文所述的方法中，所述發(fā)酵是指用于生產(chǎn)G-CSF的微生物、尤指重組大腸桿菌的需氧生長。在該方法中，分批生長期(batchphaseofgrowth)是指在接種后，不提供營養(yǎng)而只在發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液中加入氫氧化銨(如果需要的話)的一段時(shí)期。所述培養(yǎng)液是細(xì)胞、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基和細(xì)胞的衍生物(如果存在的話)的懸浮液。生長期中底物限制性補(bǔ)料-分批是指生長期的一部分，在此期間通過以主要碳源/能源(例如，葡萄糖)濃度受到限制的方式向培養(yǎng)液加入補(bǔ)料分批生長培養(yǎng)基而出現(xiàn)的生物量顯著增加(至少翻2番)。所述培養(yǎng)基的流速?zèng)Q定了培養(yǎng)物的比生長速率。誘導(dǎo)前培養(yǎng)基是指與生長培養(yǎng)基組成不同、在加入誘導(dǎo)劑(如IPTG)之前加入培養(yǎng)液的培養(yǎng)基。誘導(dǎo)是通過加入誘導(dǎo)劑(如IPTG和乳糖)來明顯增加細(xì)胞中G-CSF濃度的方法，所述濃度增加可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的工具進(jìn)行測定。生產(chǎn)培養(yǎng)基與生長培養(yǎng)基的組成不同，在誘導(dǎo)G-CSF基因期間將生產(chǎn)培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中。生產(chǎn)培養(yǎng)基還可以以底物(例如葡萄糖)濃度保持受限的方式加入。生產(chǎn)培養(yǎng)基的流速?zèng)Q定了生產(chǎn)期期間培養(yǎng)物的比生長速率。預(yù)先用編碼G-CSF的合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌宿主細(xì)胞首先在37X:在搖瓶中培養(yǎng)，用以培育發(fā)酵罐用種子培養(yǎng)物。所述種子培養(yǎng)物用于接種到發(fā)酵罐中的無菌生長培養(yǎng)基。一旦重組大腸桿菌培養(yǎng)物開始生長并且培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度下降到0.5g/L或更少，底物限制性補(bǔ)料-分批模式的發(fā)酵生長期便開始了。在生長期期間，以底物限制性補(bǔ)料-分批模式加入的補(bǔ)料-分批生長培養(yǎng)基保持連續(xù)(指數(shù)或恒定速率)或不連續(xù)地加入。在培養(yǎng)液中細(xì)胞密度達(dá)到1-60g/L的干細(xì)胞重量并且葡萄糖濃度低于0.5g/L后，加入生產(chǎn)前培養(yǎng)基，隨后開始加入生產(chǎn)培養(yǎng)基并采用連續(xù)或不連續(xù)的底物限制性方式繼續(xù)添加。使用IPTG對G-CSF基因進(jìn)行多次誘導(dǎo)。平均比生長速率在加入誘導(dǎo)劑期間或之后均不下降。pH值保持在大約5-7。溫度保持在約30-42'C。在加入生產(chǎn)前培養(yǎng)基2-48小時(shí)后，根據(jù)本領(lǐng)域所述技術(shù)取出培養(yǎng)基并進(jìn)行下游加工。生長期培養(yǎng)基包含碳源和能源，其選自葡萄糖、甘油等或其混合物；復(fù)合培養(yǎng)基組分，其選自酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白酶水解物、大豆酪蛋白水解物等或其混合物；合適的鹽/營養(yǎng)物，其選自檸檬酸、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、丁酸鈉、硫胺素、甘氨酸和氯化鋅等。其它發(fā)酵條件例如通氣、攪拌、接種物、接種時(shí)間等均盡可能方便地按照現(xiàn)有技術(shù)已知的進(jìn)行選擇。所述生產(chǎn)前培養(yǎng)基包含復(fù)合培養(yǎng)基組分(選自酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白酶水解物、大豆酪蛋白水解物等)連同營養(yǎng)物(例如硫胺素、甘氨酸等或其混合物)；抗生素，例如卡那霉素和氨千青霉素等。合適的鹽類選自檸檬酸、氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、丁酸鈉和氯化鋅等，從而使培養(yǎng)基中含有高濃度水平的K離子以及或者Na離子或者M(jìn)g離子。所述生產(chǎn)培養(yǎng)基除了包含生產(chǎn)前培養(yǎng)基的成分外還包含碳源。合適的碳源可以選自甘油、葡萄糖、果糖等或其混合物。本發(fā)明優(yōu)選的碳源為葡萄糖。在生產(chǎn)期期間，培養(yǎng)液中保持高水平的K離子以及或者Na離子或者M(jìn)g離子。在培養(yǎng)液中，K離子濃度保持在約60mM至約300mM，Na離子濃度保持在約60mM至約300mM，Mg離子濃度保持在約150mM至約250mM。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)液中的K離子濃度為卯mM至150mM，Na離子濃度為60mM至120mM，Mg離子濃度的范圍為180mM至220mM。在另一實(shí)施方案中，加入高濃度的硫胺素(范圍在5g/L至10g/L)提供產(chǎn)量為5-6g/L的G-CSF。本發(fā)明的方法通過在整個(gè)生長期和生產(chǎn)期中保持質(zhì)粒高穩(wěn)定性(75-90%)來獲得高產(chǎn)量的G畫CSF(5-9.5g/L)。實(shí)施例1高濃度的Na和K離子對質(zhì)粒穩(wěn)定性和體積產(chǎn)量的影響該實(shí)驗(yàn)在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行。將用人G-CSF基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞的種子培養(yǎng)物接種到如下組成的生長培養(yǎng)基中。成分接種前濃度KH2P0413.3g/L(NH4)2HP044.0g/L酵母提取物1.0g/L葡萄糖10.0g/L檸檬酸1.7g/LMgS04.7H201.2g/L痕量元素溶液20.0mL/L卡那霉素50mg/L痕量金屬溶液成分濃度FeCl3.6H200.162g/LZnCl2.4H200.0144g/LCoCl2.6H200.12g/LNa2Mo04.2H200.012g/LCaCl2.2H200.006g/LCuCl21.9g/LH3B030.5g/L以底物限制性補(bǔ)料-分批模式加入以下"補(bǔ)料-分批生長培養(yǎng)基"，生物量得到了顯著增加成分濃度葡萄糖700g/LMgS04.7H2020g/L痕量元素溶液20mL/L卡那霉素500mg/L在生長期用氫氧化銨調(diào)節(jié)pH至6.8-7.0。溫度保持在37'C。當(dāng)?shù)?批中的光密度達(dá)到約50AU(在600nm)后，將由以下成分組成的誘導(dǎo)前培養(yǎng)基加入培養(yǎng)液成分酵母提取物氯化鉀氯化鈉鹽酸疏胺素濃度84.38g/L75.41g/L123.13g/L8.44g/L培養(yǎng)液中鐘和鈉陽離子的終濃度分別約為120mM和250mM。隨后開始加入如下生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)成分濃度葡萄糖270g/LMgS04.7H201g/L酵母提取物214g/L鹽酸硫胺素7g/L氯化鉀8.94g/L(>(51^第2批中)氯化鈉17.5g/L(<51^第2批中)通過向培養(yǎng)液多次加入經(jīng)過濾除菌的IPTG溶液來誘導(dǎo)G-CSF基因的表達(dá)。在生產(chǎn)期，用氫氧化銨作pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在6.8。溫度保持在37'C。將卡那霉素加至培養(yǎng)物以施加選擇壓力。為了探究鹽對質(zhì)粒穩(wěn)定性影響的潛力，在第2批的生產(chǎn)期期間使用的卡那霉素量(37.5mg，一次性加入)約為第l批中使用量(2925mg，分多次加入)的1%。質(zhì)粒穩(wěn)定性通過以下步驟來測定首先將批次末期的樣品無菌收集在無菌管中，并將適當(dāng)稀釋的適量樣品無菌涂布在含有和不含卡那霉素(50mg/L)的Luria-Bertani培養(yǎng)基上。將平板在37。C培養(yǎng)48小時(shí)，并對包含統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將含有卡那霉素平板上獲得的集落數(shù)除以不含卡那霉素平板上獲得的集落數(shù)得到的數(shù)值用于計(jì)算質(zhì)粒的穩(wěn)定性。第2批的質(zhì)粒穩(wěn)定性(96.8%)是第l批的質(zhì)粒穩(wěn)定性(45.0%)的兩倍還多，這表明了鈉和鐘陽離子對于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的重要性(圖1)。在SDS-PAGE電泳后，通過將GCSF條帶的光密度定量與標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定G-CSF的體積產(chǎn)量。第1批的體積產(chǎn)量為5.38g/L，第2批為5.81g/L。第2批的體積產(chǎn)量比第一批大約高出8%(圖2)。實(shí)施例2高濃度Mg和K陽離子對質(zhì)粒穩(wěn)定性和體積產(chǎn)量的影響該實(shí)驗(yàn)在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行。由于兩個(gè)批次(第3批和第4批)的生產(chǎn)期培養(yǎng)基中除了鎂陽離子濃度以外均相同(包括鐘陽離子的濃度)，因此結(jié)果反映的是鉀陽離子和鎂陽離子聯(lián)合使用的影響。將用人G-CSF基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞的種子培養(yǎng)物接種到如下組成的生長培養(yǎng)基中。成分接種前濃度KH2P0413.3g/L(NH4)2HP044.0g/L酵母提取物1.0g/L葡萄糖10.0g/L杼檬酸1.7g/LMgS04.7H201.2g/L痕量元素溶液20.0mL/L卡那霉素50mg/L痕量金屬溶液成分濃度FeCl3.6H200.162g/LZnCl2.4H200.0144g/LCoCl2.6H200.12g/LNa2Mo04.2H200.012g/LCaCl2.2H200.006g/LCuCl21.9g/LH3B030.5g/L以底物限制性補(bǔ)料-分批模式加入以下"補(bǔ)料-分批生長培養(yǎng)基"，生物量得到了顯著增加成分濃度葡萄糖700g/LMgS04.7H2020g/L痕量元素溶液20mL/L卡那霉素500mg/L在生長期，用氫氧化銨作為pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在6.8-7.0的范圍內(nèi)。溫度保持在37'C。當(dāng)光密度達(dá)到約50AU(在600nm)后，將由以下成分組成的誘導(dǎo)前培養(yǎng)基加入培養(yǎng)液成分濃度酵母提取物84.38g/L氯化鉀75.44g/L鹽酸疏胺素8.38g/L硫酸鎂187.06g/L(^M^第4批中)隨后開始加入如下生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng):成分濃度葡萄糖270g/L硫酸鎂lg/L(僅在第3批中)硫酸鎂50.3g/L(僅在第4批中)酵母提取物214g/L鹽酸硫胺素7g/L氯化鉀8.94g/L通過向培養(yǎng)液多次加入經(jīng)過濾除菌的IPTG溶液來誘導(dǎo)G-CSF基因的表達(dá)。在生產(chǎn)期，用氫氧化銨作為pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在6.8.溫度保持在37。C。將卡那霉素加至培養(yǎng)物以施加選擇壓力。在生產(chǎn)期期間使用等量的卡那霉素(37.5mg，一次性加入)。在生產(chǎn)期期間，培養(yǎng)液中鉀和鎂陽離子的濃度分別為約120mM和200mM。如前所述測定質(zhì)粒的穩(wěn)定性。笫4批中的質(zhì)粒穩(wěn)定性(97.3%)比第3批中的質(zhì)粒穩(wěn)定性(91.8%)高出約6%，這表明了鎂和鉀陽離子對于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的有效性(圖3)。鎂和鉀陽離子存在時(shí)得到的質(zhì)粒穩(wěn)定性比第一批(在生產(chǎn)期沒有高濃度的鹽)中的質(zhì)粒穩(wěn)定性高出116.2%。在SDS-PAGE電泳后，通過將GCSF條帶的光密度定量與標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定G-CSF的體積產(chǎn)量。第3批的體積產(chǎn)量為5.48g/L，第4批為8.35g/L(圖4)。第4批的體積產(chǎn)量比第一批大約高出55%。實(shí)施例3生產(chǎn)期期間的高比生長速率對體積產(chǎn)量的影響該實(shí)驗(yàn)在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行。兩個(gè)批次(第4批和第5批)的生產(chǎn)期培養(yǎng)基組成(包括鎂和鉀陽離子的濃度)均相同。第5批的生產(chǎn)期期間平均比生長速率比第4批生產(chǎn)期中的要高。將用人G-CSF基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞的種子培養(yǎng)物接種到如下組成的生長培養(yǎng)基中。成分接種前濃度KH2P0413.3g/L(NH4)2HP044.0g/L酵母提取物1.0g/L葡萄糖10.0g/L檸檬酸1.7g/LMgS04.7H201.2g/L痕量元素溶液20.0mL/L卡那霉素50mg/L痕量金屬溶液成分濃度FeCl3.6H200.162g/LZnCl2.4H200.0144g/LCoCl2.6H200.12g/LNa2Mo04.2H200.012g/LCaCl2.2H200.006g/LCuCl21.9g/LH3B030.5g/L以底物限制性補(bǔ)料-分批模式加入以下"補(bǔ)料-分批生長培養(yǎng)基"，生物量得到了顯著增加成分濃度葡萄糖700g/LMgS04.7H2020g/L痕量元素溶液20mL/L卡那霉素500mg/L在生長期，用氫氧化銨作為pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在6.8-7.0的范圍內(nèi)。溫度保持在37。C。當(dāng)光密度達(dá)到約50AU(在600nm)后，將由以下成分組成的誘導(dǎo)前培養(yǎng)基加入培養(yǎng)液成分濃度酵母提取物84.38g/L氯化鉀75.44g/L鹽酸》i^素8.38g/L硫酸鎂187.06g/L隨后開始加入如下生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng):<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通過向培養(yǎng)液多次加入經(jīng)過濾滅菌的IPTG溶液來誘導(dǎo)G-CSF基因的表達(dá)。在生產(chǎn)期，用氫氧化銨作為pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在6.8。溫度保持在37。C。將卡那霉素加至培養(yǎng)物以施加選擇壓力。在生產(chǎn)期期間使用等量的卡那霉素(37.5mg,—次性加入)。第4批中生產(chǎn)期期間的平均比生長速率約為0.041/h，而第5批中的平均比生長速率約為0.071/h。如前所述測定G-CSF的體積產(chǎn)量，第4批中為8.35g/L，第5批中為9.94g/L。第5批中的體積產(chǎn)量比第4批的約高出19%(圖5)。兩批的批次末樣品的質(zhì)粒穩(wěn)定性均很高(>75%)。實(shí)施例4在生產(chǎn)期使用高濃度硫胺素對體積產(chǎn)量的影響該實(shí)驗(yàn)在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行。將用人G-CSF基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞的種子培養(yǎng)物接種到如下組成的生長培養(yǎng)基中。成分接種前濃度KH2P0413.3g/L(NH4)2HP044.0g/L酵母提取物1.0g/L葡萄糖10.0g/L檸檬酸1.7g/LMgS04.7H201.2g/L痕量元素溶液20.0mL/L卡那霉素50mg/L(在第1批中)氨芐青霉素100mg/L(在第6批中)濃度0.162g/L0.0144g/L0.12g/L0.012g/L0.006g/L痕量金屬溶液成分FeCl3.6H20ZnCl2.4H20CoCl2.6H20Na2Mo04.2H20CaCl2.2H20CuCl21.9g/LH3B030.5g/L以底物限制性補(bǔ)料-分批模式加入下述"補(bǔ)料-分批生長培養(yǎng)基，，，生物量得到了顯著增加成分濃度葡萄糖700g/LMgS04.7H2020g/L痕量元素溶液20mL/L卡那霉素500mg/L(在第1批中)氨芐青霉素僅在第6批中每次加入50mg/L(培養(yǎng)液)。在該批的"補(bǔ)料分批生長，，期共加入6次。在生長期，用氫氧化銨作為pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在約6.8。溫度保持在37。C。當(dāng)光密度達(dá)到約50AU(在600nm時(shí))后，開始加入如下生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)成分濃度葡萄糖270g/LMgS04.7H201g/L酵母^:取物214g/L鹽酸硫胺素7g/L(僅在第1批中)卡那霉素2.925g(在第l批中多次加入)氨芐青霉素2.689g(在第6批中多次加入)通過向培養(yǎng)液多次加入經(jīng)過濾滅菌的IPTG溶液來誘導(dǎo)G-CSF基因的表達(dá)。在生產(chǎn)期，用氫氧化銨作為pH調(diào)節(jié)劑將pH維持在6.8。溫度保持在37'C。如前所述測定GCSF的體積產(chǎn)量。第1批(高石克胺素批次)的批次末樣品的體積產(chǎn)量比第6批(4.86g/L)高出約10.7%，W明了高濃度M素對于提高G-CSF體積產(chǎn)量的有效性(圖6)。本方法的優(yōu)點(diǎn)(1)較高的體積產(chǎn)量使得以較小規(guī)模即可實(shí)現(xiàn)較大產(chǎn)量，因而限制了工藝放大時(shí)的資本支出。(2)使用成本非常低的培養(yǎng)基成分(鎂鹽、鉀鹽和鎂鹽)實(shí)現(xiàn)高體積產(chǎn)量。(3)具有高質(zhì)粒穩(wěn)定性的培養(yǎng)物在代謝壓力條件下(例如在高比生長速率下的G-CSF基因表達(dá))更能夠生產(chǎn)高體積產(chǎn)量的G-CSF。權(quán)利要求1.一種改進(jìn)的在培養(yǎng)液發(fā)酵中獲得高體積產(chǎn)量的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的方法，其中所述培養(yǎng)液包含濃度為60mM至180mM的K離子以及高濃度的選自Na或Mg的無機(jī)陽離子。2.權(quán)利要求l的方法，其中Na離子的濃度為90mM至300mM，Mg離子的濃度為150mM至250mM。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述培養(yǎng)液包含選自酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白酶水解物和大豆酪蛋白水解物的復(fù)合培養(yǎng)基成分。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法為底物限制性補(bǔ)料分批方法。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在生產(chǎn)期期間對基因進(jìn)行多次誘導(dǎo)。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)液還包含選自葡萄糖、甘油和果糖的碳源。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中平均比生長速率在生產(chǎn)期和前生產(chǎn)期保持一致。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中K離子濃度為卯mM至150mM,Na離子濃度為60mM至120mM，Mg離子濃度為180mM至220mM。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中質(zhì)粒穩(wěn)定性至少為75%。10.—種通過在培養(yǎng)液中加入濃度為60mM至180mM的K離子來提高G-CSF質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中生產(chǎn)期中的抗生素濃度低于生長期中使用的抗生素濃度。12.—種生產(chǎn)G-CSF的方法，其包括如下步驟i)將合適的大腸桿菌培養(yǎng)物接種至發(fā)酵罐，所述大腸桿菌培養(yǎng)物預(yù)先已用編碼G-CSF的合適表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化；ii)在生長期采用分批及補(bǔ)料分批模式以提高生物量；iii)加入合適的誘導(dǎo)前培養(yǎng)基；iv)以底物限制性補(bǔ)料分批模式加入合適的生產(chǎn)培養(yǎng)基，其中對基因進(jìn)行多次誘導(dǎo)；v)其中培養(yǎng)液中的K、Na和Mg離子的終濃度如前述權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述。13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中G-CSF的體積產(chǎn)量為5g/L至9.5g/L。14.一種改進(jìn)的在發(fā)酵中獲得高體積產(chǎn)量G-CSF的方法，其中所述培養(yǎng)液包含5g/L至10g/L的硫胺素。全文摘要本發(fā)明公開了一種改進(jìn)的高產(chǎn)量生產(chǎn)G-CSF的方法，其通過在生產(chǎn)期間高鹽誘導(dǎo)增加質(zhì)粒穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)。文檔編號C12N1/20GK101410410SQ200780008077公開日2009年4月15日申請日期2007年3月5日優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日發(fā)明者桑吉夫·庫瑪·門迪拉塔,潘卡伊·R·帕特爾,維伯爾·薩拉斯沃特申請人:卡迪拉保健有限公司