專(zhuān)利名稱：丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)性融合蛋白的制作方法
丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)性融合蛋白HCV屬于黃病毒科(F/m^WnW^)，是導(dǎo)致急性肝炎和慢性肝臟疾病的主 要因素。HCV病毒感染與高比率(54-86。/。)的慢性感染相關(guān)，在5—24%的病 例中在20 — 30年間可進(jìn)展為肝硬化，且隨后進(jìn)展為肝細(xì)胞癌(McHutchinson， 2004, 772e ^醇Z謹(jǐn)Jo固a/ 。/Af麵—Cwe 10， S21-29)。目前在歐洲和美 國(guó)，20-30n/。的肝臟移植和15-33。/。的肝癌患者可歸因于HCV感染。世界衛(wèi)生 組織在1999年估計(jì)全世界有大約1億7千萬(wàn)人處于慢性HCV感染狀態(tài)，且每 年新增感染病例3—4百萬(wàn)人。HCV是具有大約9,600個(gè)核苷酸的陽(yáng)性單鏈核糖核酸(RNA)基因組的包 膜病毒，其組構(gòu)對(duì)于所有HCV毒株和分離株均相同。HCV基因組在O期的翻 譯產(chǎn)生3010-3030個(gè)氨基酸的一個(gè)大的多蛋白，根據(jù)基因型其被病毒和細(xì)胞 蛋白酶進(jìn)行蛋白酶解，產(chǎn)生10個(gè)病毒蛋白。三分之一的多蛋白的氨基末端 編碼病毒體結(jié)構(gòu)蛋白核心(C)蛋白、包膜糖蛋白E1和E2。在結(jié)構(gòu)區(qū)之后是 一個(gè)小的完整膜蛋白p7，看起來(lái)其作為離子通道起作用。所述基因組的剩 余部分編碼非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B,它 們介導(dǎo)病毒生活周期的胞內(nèi)過(guò)程(Penin, 2004， Hepatology 39, 5-19)。 HCV也 編碼稱作F (移碼)或ARFP(可變讀框蛋白(alternative reading frame protein)) 的小蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)核糖體移碼或者內(nèi)部起始進(jìn)入核心基因的可變 (altemative)+l讀框中而產(chǎn)生(見(jiàn)Branch et al" 2005， Semin. Liver Dis. 25:105-117;和WO2004/069864所述)。所述多蛋白編碼序列的兩端是兩個(gè)高 度保守的非翻譯區(qū)(UTR)，分別為5'UTR和3，UTR。位于5'UTR中的內(nèi)部核 糖體進(jìn)入位點(diǎn)容許核糖體固定以進(jìn)行翻譯起始，而3'UTR被認(rèn)為在起始病 毒復(fù)制中起重要作用。目前對(duì)于慢性感染的HCV患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是組合使用聚乙二醇化 干擾素-a(PEG-IFN-a)和三氮唑核苷(ribavirin) (Fried et al., 2002, N. Engl. J. Med. 347， 975-982)。然而，這種治療方法很昂貴，且具有明顯的副作用， 導(dǎo)致10%的病例過(guò)早結(jié)束治療及對(duì)很多患者不適用(例如代謝失調(diào)的肝硬化、自身免疫性疾病、抑郁史和妊娠患者)。更重要的是，治療的患者中僅500/o對(duì)治療有反應(yīng)(Falck-Ytter， et al" 2002， Ann. Intern. Med. 136, 288-292)， 且基因型1感染的患者對(duì)治療的反應(yīng)率更低(27%-35%)?？傊?，積累了許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明T細(xì)胞免疫在控制HCV感染中的關(guān)鍵作 用，特別是004+和008+ T-細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)于非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白的直接應(yīng)答(例 如Fmncavilla et al" 2004, Eur. J. Immunol. 34, 427-37; Grakoui et al., 2003, Science 302， 659-662; Sho勿et al.， 2003, J. Exp. Med. 197， 1645-1655; Thimme et al., 2001, J. Exp. Med. 194， 1395-1406; Lechner et al" 2000, J. Exp. Med. 191， 1499-1512; Gerlach， 1999, Gastroenterology 117， 933-941; Folgori etal.， 2006, Nat Med. 12, 190-197)。實(shí)際上，在從急性自限性丙型肝炎中自 然康復(fù)的患者中典型觀測(cè)到強(qiáng)HCV特異性T細(xì)胞應(yīng)答，而在長(zhǎng)期感染的患者 中T細(xì)胞應(yīng)答較弱且很少關(guān)注。另一方面，中和抗體所起的作用(B細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫)更不清楚(Logvinoff, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 10149-54)。由于HCV病毒的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過(guò)15年，但是由于難以實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞培 養(yǎng)物中的有效生長(zhǎng)，且缺少易于獲得的病毒感染的實(shí)驗(yàn)室模型，因此目前 仍未有HCV的疫苗。然而，目前已經(jīng)出現(xiàn)了許多疫苗候選物(Barth and Baumert， 2004， Novel vaccine strategies, p. 214-227， In State of the Art of Hepatology: Molecular and Cell Biology eds Kluwer Academic Publishers; Inchauspe and Feinstone, 2003, Clin. Liver Dis. 7， 243-259)，例如基于HCV-衍生的肽(Cerny et al.， 1995, J. Clin. Invest. 95， 521-30)、重組產(chǎn)生的HCV抗 原、基于DNA和病毒的疫苗(Brinsteretal.,2001，Hepatology34， 1206-1217; Foms et al.， 2000, Hepatology 32， 618-625)和HCV病毒樣顆粒(Baumert et al.， 1999, Gastroenterology 117， 1397-1407; Jeong et al., 2004, J. Virol. 78， 6995-7003)。目前在臨床前模型中評(píng)價(jià)了一些候選物，第一波正在進(jìn)入臨床 實(shí)驗(yàn)階段。目前在II期的最先進(jìn)的疫苗使用輔助的E 1包膜蛋白(Innogenetics) 及輔助的004+和008+ T細(xì)胞表位(Intercell)。最近十年期間積極探索的一種方法是使用多蛋白相關(guān)的各種抗原性結(jié)
構(gòu)域作為免疫原。絕大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)多蛋白得自源自各種NSHCV蛋白的抗 原性多肽、片段或者表位的彼此融合，以形成單一且有希望的免疫原性多 肽。例如，WO01/30812和WO03/031588揭示了NS3至NS5B的HCV多肽的融 合，形成包含主要NS蛋白的單一多肽。WO03/097677描述了源自NS3 、 NS4B 和NS5B多肽的30-70個(gè)氨基酸的抗原性片段的融合。WO2004/046176揭示了 包含Core、 NS3、 NS4B和NS5B的多蛋白。WO2004/111082描述了共表達(dá) NS3、 NS4和NS5B的腺病毒和MVA載體，其中NS3和NS4作為融合蛋白被 表達(dá)，NS5B單獨(dú)表達(dá)。已經(jīng)注意到現(xiàn)有技術(shù)多蛋白的構(gòu)型是天然構(gòu)型，各種成分以其在HCV 前體中存在的順序出現(xiàn)。特別地，NS3后面是NS4，其后是NS5。然而，"天 然"構(gòu)型對(duì)于所得多蛋白的表達(dá)和免疫原性不是最佳的。由于HCV感染的慢性和持續(xù)性、高流行性和顯著的相關(guān)疾病發(fā)病率， 因此預(yù)期HCV在多年內(nèi)將持續(xù)是一種嚴(yán)重的全球性健康威脅因素。因此， 非常需要研發(fā)更具免疫原性的多肽、表達(dá)載體、制備其的方法及其應(yīng)用， 以改善預(yù)防和治療HCV感染或者HCV相關(guān)疾病或病變。本發(fā)明涉及包含以非天然構(gòu)型排列的非結(jié)構(gòu)性(NS)多肽的融合蛋白。 HCVNS多肽(例如NS3、 NS4A、 NS5B及任選地NS4B)的特異性片段被選擇， 并進(jìn)行特異性構(gòu)建以優(yōu)化所得融合蛋白的免疫原性和/或重組產(chǎn)生過(guò)程。與 天然NS多肽對(duì)比，本發(fā)明提供的新HCV融合蛋白或者其編碼核苷酸序列在 導(dǎo)入宿主生物體中時(shí)可以改善抗HCV免疫應(yīng)答和/或改善總體細(xì)胞毒性應(yīng) 答，和/或改善臨床批次(clinical lots)的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明代表了在目前 HCV感染或者HCV相關(guān)疾病或病變的治療和預(yù)防中的顯著進(jìn)展。特別地， 其可用于加強(qiáng)現(xiàn)有的治療方法或者為慢性感染患者、特別是對(duì)于常規(guī)治療 無(wú)反應(yīng)的那些患者提供另一種治療方法。這個(gè)技術(shù)問(wèn)題通過(guò)權(quán)利要求書(shū)中定義的實(shí)施方案得以解決。通過(guò)如下對(duì)于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的描述，將顯而易見(jiàn)本發(fā)明的其 它和進(jìn)一步的方面、特征和優(yōu)勢(shì)。這些實(shí)施方案例證了本發(fā)明。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的融合蛋白，其包含源 自丙型肝炎病毒(HCV)的至少三個(gè)NS多肽，其中所述NS多肽在所述融合蛋 白中的順序構(gòu)建為不同于它們?cè)谔烊粯?gòu)型中呈現(xiàn)的順序。如本文所用，除非另外特別指出，在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"等是 指"至少一個(gè)"、"一或多個(gè)"或者"多個(gè)"所描述的化合物或步驟。例 如，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞及其混合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"和/或"是指具有"和"、"或"以及"該術(shù)語(yǔ)涉 及的元件的所有或者任何其它組合"的含義。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"大約"或者"近似"是指在給定值或范圍的20% 以內(nèi)、優(yōu)選地在10%、更優(yōu)選在5%以內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"氨基酸"和"殘基"是同義詞，包括天然氨基酸以及氨基酸類(lèi) 似物(例如非天然、合成和修飾的氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體)。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文可互換使用，是指氨基酸 殘基的聚合物，其包含通過(guò)肽鍵結(jié)合的十或多個(gè)氨基酸。所述聚合物可以 是線性的、分支的或者環(huán)狀的，可包含天然存在的和/或氨基酸類(lèi)似物，且 可以由非氨基酸中斷。 一般而言，如果氨基酸聚合物較長(zhǎng)(例如超過(guò)50個(gè)氨 基酸)，則優(yōu)選稱作多肽或蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"核酸"、"核酸分子"、"多核苷酸"和"核苷 酸序列"可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的多脫氧核糖核苷酸(DNA)(例如 cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒、載體、病毒基因組、分離的DNA、探針、引 物及其任何組合)或者多核糖核酸(RNA)分子(例如mRNA、反義RNA)的聚合 物或者混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸。其可包含單鏈或雙鏈、線性或環(huán) 狀、天然或合成的多核苷酸。另外，多核苷酸可包含非天然存在的核苷酸， 如甲基化核苷酸和核苷酸類(lèi)似物(見(jiàn)US 5,525,711、 US 4,711,955或EPA 302 175所述修飾的實(shí)施例)，且可以由非核苷酸成分中斷。如果存在，在聚合 之前或之后可以對(duì)核苷酸進(jìn)行修飾。如本文所用，當(dāng)用于描述產(chǎn)物、組合物和方法時(shí)，術(shù)語(yǔ)"包含"是指 所述產(chǎn)物、組合物和方法包括提及的成分或步驟，但不排除其它成分或步 驟。"基本上由…組成"是指排除任何顯著意義的其它成分或步驟。因此，
基本上由列出的成分組成的組合物不排除微量的污染物和藥物可接受的載 體。"由…組成"是指排除超過(guò)痕量元素的其它成分或步驟。例如，當(dāng)一 個(gè)多肽不含有列出的氨基酸序列之外的任何氨基酸時(shí)，則稱該多肽"由所 列出的氨基酸序列組成"。當(dāng)一個(gè)氨基酸序列與少量其它氨基酸殘基(典型為大約l-50個(gè)其它殘基)一起存在時(shí)，則稱多肽"基本上由所述氨基酸序列 組成"。當(dāng)一個(gè)氨基酸序列是一個(gè)多肽最終氨基酸序列的至少一部分時(shí)， 則稱該多肽"包含"所述氨基酸序列。這個(gè)多肽可具有幾個(gè)直至幾百個(gè)其 它氨基酸殘基。這種其它氨基酸殘基可以在多肽運(yùn)輸(tmfficking)、促進(jìn)多 肽產(chǎn)生或純化、延長(zhǎng)半衰期等方面起作用。這個(gè)術(shù)語(yǔ)可同樣用于描述核苷 酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分離的"是指蛋白質(zhì)、多肽、肽或核酸從其天然 環(huán)境中純化或移出。術(shù)語(yǔ)"純化的"是指蛋白質(zhì)、多肽、肽或核酸從其天 然相關(guān)眹的至少一種其它成分中分離。"HCV"是指"丙型肝炎病毒"。大量的系統(tǒng)發(fā)生分析已經(jīng)將HCV分 離株分為含有不同亞型(a、 b、 c等)的6個(gè)主要基因型(l-6) (Simmons et al.， 2005,Hepatology42， 962-973)?；蛐蚻a的HCV分離株的例子包括但非限于 HCV-1 (Choo et al.， 1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 2451-2455)、 -Jl (Okamoto et al.， 1992， Nucleic Acids Res. 20， 6410-6410)和-H (Inchausp6 et al., 1991, Proc.Natl. Acad. Sci. 88， 10292-10296)?；蛐蚻b的HCV分離株的例子 包括但非限于HCV-JA (Kato et al., 1990， Proc. Natl. Acad.， Sci. 87, 9524-9528) 和BK (Takamizawa et al., 1991, J. Virol. 65, 1105-1113)。基因型lc的HCV分 離株的例子包括但非限于HCV-G9 (Okamoto et al., 1994, J. Gen. Virol. 45， 629-635)。基因型2a的HCV分離株的例子包括但非限于HCV-J6 (Okamoto et al.， 1991， J. Gen. Virol. 72， 2697-2704)?；蛐?b的HCV分離株的例子包括 但非限于HCV-J8 (Okamoto et al., 1992, Virology 188， 331-341)?；蛐?c的 HCV分離株的例子包括但非限于HCV-BEBEl (Nako et al.， 1996, J. Gen. Virol. 141， 701-704)?；蛐?a的HCV分離株的例子包括但非限于 HCV-NZLl (Sakamoto et al.， 1994, J. Gen. Virol. 75， 1761- 1768)?；蛐?b
的HCV分離株的例子包括但非限于HCV-Tr (Chayama et al., 1994， J. Gen. Virol. 75， 3623-3628)?；蛐?a的HCV分離株的例子包括但非限于 HCV-ED43 (Chamberlain et al., 1997, J. Gen. Virol. 78， 1341-1347)?；蛐?a 的HCV分離株的例子包括但非限于HCV-EUH1480 (Chamberlain et al., 1997， Biochem. Biophys. Res. Commun. 236， 44-49)?；蛐?a的HCV分離株的例 子包括但非限于HCV-EUHK2 (Adams et al., 1997, Biochem. Bi叩hys. Res. Commun. 234， 393-396)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"融合"或者"融合蛋白"是指至少三個(gè)NS多肽(或 其片段或變體)彼此組合在一個(gè)多肽鏈中。優(yōu)選地，多個(gè)NS多肽之間的融 合是通過(guò)遺傳方式進(jìn)行的，即框內(nèi)(in frame)融合編碼每個(gè)NS多肽的核苷酸 序列。"框內(nèi)融合"是指融合的編碼序列的表達(dá)產(chǎn)生在每個(gè)NS多肽之間無(wú) 任何翻譯終止子的單一蛋白質(zhì)。每個(gè)NS多肽之間的融合可以是直接融合或者通過(guò)接頭融合。如本文所 用，"直接融合"是指兩個(gè)NS多肽之間無(wú)任何附加的氨基酸殘基的融合(例 如編碼一個(gè)NS多肽的密碼子與編碼隨后的NS多肽的密碼子連接)?；蛘?， 可以在至少兩個(gè)NS多肽的交界處使用一個(gè)接頭肽。接頭的存在可以促進(jìn)融 合蛋白的正確形成、折疊和/或起作用。本發(fā)明不受應(yīng)用的接頭序列的形式、 大小或數(shù)目的限制，且在兩個(gè)NS多肽的交界處可以插入一個(gè)接頭序列的多 個(gè)拷貝。適于本發(fā)明的接頭的長(zhǎng)度為3-30個(gè)氨基酸，由氨基酸殘基如甘氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和/或脯氨酸的重復(fù)組成(見(jiàn)例如 Wiederrecht et al,， 1988， Cell 54， 841; Aumailly et al.， 1990 FEBSLett. 262, 82; 和Dekker et al., 1993， Nature 362， 852)。合適的接頭的代表性例子包括 Ser-Gly-Ser接頭，其將NS多肽的N末端與第二個(gè)NS多肽連接在一起；及 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly接頭，其將第二個(gè)NS多肽與第三個(gè)多肽連接在一起。或 者，也可以使用HCV衍生的序列，其將兩個(gè)NS多肽彼此連接在一起(例如天 然NS4A多肽的C末端部分從相應(yīng)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約第1691位延伸 至大約第1711位)。"至少三個(gè)"是指三個(gè)或多于三個(gè)，優(yōu)選三或四個(gè)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"NS多肽"是指本領(lǐng)域認(rèn)可的非結(jié)構(gòu)蛋白，優(yōu)選選 自NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B和NS5B多肽。但是優(yōu)選所述融合蛋白不含有 NS5A多肽。在本發(fā)明中，本發(fā)明融合蛋白中包括的NS多肽可以單獨(dú)源自目 前鑒別的任何HCV毒株或者分離株，如上文關(guān)于術(shù)語(yǔ)"HCV"所描述的那 些。術(shù)語(yǔ)"來(lái)源"是指分離、克隆、衍生或相關(guān)的來(lái)源。因此，根據(jù)本發(fā) 明，融合蛋白中包括的每個(gè)NS多肽可以源自天然NS多肽或者源自修飾的 NS多肽，如下文進(jìn)一步闡述。"天然"的NS多肽是指可以在天然來(lái)源中發(fā)現(xiàn)或者分離自其中的NS蛋 白質(zhì)、多肽或者肽，不同于在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)人工修飾的或者人為改變的多肽。 因此，術(shù)語(yǔ)"天然NS多肽"包括天然存在的NS多肽及其片段。這種天然來(lái) 源包括生物學(xué)樣品(例如HCV感染的患者或者過(guò)去感染過(guò)HCV的患者的血 液、血漿或者血清)、培養(yǎng)的細(xì)胞以及重組材料(例如HCV病毒或基因組，基 因組或cDNA文庫(kù)，含有HCV基因組片段的質(zhì)粒，重組的加工前的前體或者 成熟加工的NS多肽等)。許多天然NS多肽/基因的核苷酸和氨基酸序列已經(jīng) 在文獻(xiàn)中描述，且可得自專(zhuān)門(mén)的數(shù)據(jù)庫(kù)。天然NS多肽的代表性例子是如SEQ ID NO: 1-4所示序列(SEQ ID NO: l-4提供了基因型lb HCV JA毒株的天然 NS3、 NS4A、 NS4B和NS5B多肽的氨基酸序列)。然而，天然NS多肽非限于 這些序列。事實(shí)上，所述氨基酸序列在不同的HCV基因型、亞型和分離株 之間可以有所不同，這種遺傳變異包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的融合蛋白的一或多個(gè)NS多肽可彼此獨(dú)立，與例證的序列或者 其它天然NS多肽相比包括一或多個(gè)氨基酸修飾。修飾可以通過(guò)突變和減添 加化學(xué)部分(例如烷基化、乙?；?、酰胺化、磷酸化等)或者標(biāo)記部分而產(chǎn)生。 突變包括缺失、取代或添加一或多個(gè)氨基酸殘基或者任意組合這些突變。 當(dāng)計(jì)劃進(jìn)行一些突變時(shí)，它們可以涉及連續(xù)的殘基和/或不連續(xù)的殘基?？?以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式進(jìn)行修飾。例如，可以使用常規(guī)的 重組技術(shù)修飾編碼NS多肽的核苷酸序列，如酶裂解后修飾和連接指定的片 段、定向誘變(例如使用法國(guó)Amersham， Les Ullis的Sculptor 體外誘變系 統(tǒng))、PCR誘變或者DNA改組(shuffling)。 優(yōu)選的修飾的NS多肽保留與相應(yīng)天然NS多肽高度的氨基酸序列相同 性，例如與全長(zhǎng)氨基酸序列或者其較短的片段(例如長(zhǎng)度為至少I(mǎi)O、 15、 20、 25、 30、 40、 50、 100個(gè)氨基酸)具有至少75%相同性的氨基酸殘基。更特別 地，在本發(fā)明中使用的修飾的NS多肽與相應(yīng)的天然NS多肽的相同性程度高 于75%，優(yōu)選高于80%、 85%、 90%、 95%，，更優(yōu)選高于97%。兩個(gè)多肽之 間的相同性百分比是由這兩個(gè)序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，這也考慮了 針對(duì)最佳序列排列而需要導(dǎo)入的缺口數(shù)以及每個(gè)缺口的長(zhǎng)度。可以利用本 領(lǐng)域已知的多種計(jì)算機(jī)程序和數(shù)學(xué)算法確定氨基酸序列之間的相同性百分 比，例如可在NCBI獲得的BIast程序(例如Altschul et al., 1997， Nucleic Acids Res. 25， 3389-3402; Altschul et al.， 2005， FEBS J. 272, 5101-5109)。例如，本發(fā)明的融合蛋白中包括的任一或全部NS多肽可以被修飾，從 而代表特定基因型或亞型，并因此包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序 列對(duì)應(yīng)于在特定基因型或亞型的各種NS序列對(duì)比后典型確定的共有或近共 有序列。也可以對(duì)任何或者所有NS多肽進(jìn)行修飾，以提供具有修飾的性質(zhì) 的NS多肽，如降低的酶功能，和/或降低的錨定細(xì)胞膜的能力和/或降低的 翻譯后加工的能力，如下文所述。對(duì)于這種功能性質(zhì)是關(guān)鍵的氨基酸可以 通過(guò)常規(guī)方法鑒別，例如通過(guò)結(jié)構(gòu)和功能分析進(jìn)行鑒別。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可易于確定能降低或破壞指定的酶活性的修飾類(lèi)型。例如，可以通過(guò)定向 誘變或者PCR技術(shù)缺失或取代酶活性功能區(qū)(例如催化位點(diǎn))中的一或多個(gè) 氨基酸，由此天然酶活性被顯著降低或消除。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法在適當(dāng)?shù)拿富钚苑治鲋写_定生物學(xué)活性的降低或缺乏。膜錨定結(jié) 構(gòu)域通常基于其疏水性而被預(yù)測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明融合蛋白中包含的至少三個(gè)多肽的順序構(gòu)建為不 同于其在天然構(gòu)型中的順序。本領(lǐng)域已知所述天然構(gòu)型(見(jiàn)本申請(qǐng)介紹部分 所述)，其中所述NS多肽呈現(xiàn)的順序與在HCV多蛋白前體中發(fā)現(xiàn)的順序相 同，即從N末端至C末端為NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。根據(jù)所述天 然構(gòu)型 NS2多肽總是在NS3多肽或NS4 A多肽或NS4B多肽或NS5 A多肽或 NS5B多肽之前；及 NS3多肽總是在NS4A多肽或NS4B多肽或NS5A多肽或NS5B多肽之前；及 NS4A多肽總是在NS4B多肽或NS5A多肽或NS5B多肽之前；及 NS4B多肽總是在NS5A多肽或NS5B多肽之前；及 NS5A多肽總是在NS5B多肽之前。在本發(fā)明的融合蛋白中，所述構(gòu)型不是天然的，即至少一個(gè)NS多肽呈 現(xiàn)與其天然構(gòu)型不同的順序。因此，如果所述融合蛋白包含一個(gè)NS3多肽、 一個(gè)NS4A多肽及一個(gè)NS5B多肽，則天然構(gòu)型是NS3-NS4A-NS5B ， NS3 在N末端，NS5B在C末端。相反，非天然構(gòu)型可以是NS5B-NS3-NS4A、 NS5B-NS4A-NS3 、 NS4A-NS3-NS5B 、 NS4A-NS5B-NS3 或者 NS3-NS5B-NS4A。特別地，本發(fā)明的融合蛋白包含至少如下一種情況 NS4A多肽與NS3多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合； NS3多肽與NS5B多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合； NS4B多肽與NS5B多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合； .NS4A多肽與NS3多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合，所述NS3多肽與NS4B多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合；和/或 NS3多肽與NS4B多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合，所述 NS4B多肽與NS5B多肽的N末端直接融合或者通過(guò)接頭融合。在本發(fā)明的融合蛋白的這種特定部分中，每個(gè)NS多肽均可以單獨(dú)是天 然或修飾的。例如，NS4A-NS3部分中包含的NS4A多肽可以是天然的，而 NS3多肽包含如下述的至少一個(gè)修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白中包含的所有NS多肽均源自相 同的HCV毒株或分離株。或者，至少兩個(gè)NS多肽源自不同的HCV毒株或分 離株，以提供對(duì)抗更廣泛的HCV基因型的保護(hù)作用。其也可以使所述融合 蛋白適應(yīng)特定的地理區(qū)域，將該區(qū)域特有的HCV分離株的至少一個(gè)NS多肽 包括進(jìn)來(lái)而在該地使用(例如基因型la、 lb、 2和3在北美洲、歐洲和亞洲最
普遍；基因型4在北非和中非較普遍；基因型5目前主要在南非鑒別，基因 型6分離株主要在越南和香港發(fā)現(xiàn))。例如，如果所述融合蛋白包含NS多肽、 NS4A多肽和NS5B多肽，則所述NS3多肽可源自第一個(gè)HCV毒株，所述NS4A 和NS5B多肽源自第二個(gè)HCV毒株?；蛘?，所述NS4A多肽可源自第一個(gè)HCV 毒株，而NS3和NS5B多肽可源自第二個(gè)HCV毒株?；蛘撸鯪S5B多肽可 源自第一個(gè)HCV毒株，而NS3和NS4A多肽可源自第二個(gè)HCV毒株。或者， NS3、 NS4A和NS5B多肽源自不同的HCV毒株。當(dāng)本發(fā)明的融合蛋白也包 含NS4B多肽時(shí)，其可源自與其它多肽相同或不同的HCV毒株。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及一種融合蛋白，其包含NS4A多肽、NS3多 肽和NS5B多肽或者基本上由或者由NS4A多肽、NS3多肽和NS5B多肽組成， NS4A在N末端而NS5B在C末端(NS4A-3-5B融合體)。任選地，所述融合也 可包括NS4B多肽(或者其片段或變體)，以進(jìn)一步改善所得融合蛋白的免疫 原性。所述NS4B多肽優(yōu)選包含在所述NS3與NS5B多肽之間。因此，本發(fā)明 還涉及一種融合蛋白，其包含NS4A多肽、NS3多肽、NS4B多肽禾QNS5B多 肽或者基本上由或者由NS4A多肽、NS3多肽、NS4B多肽和NS5B多肽組成， NS4A在N末端，NS5B在C末端(NS4A-3-4B-5B融合體)。除了NS3、 NS4A、 NS5B和任選的NS4B多肽之外，優(yōu)選的是本發(fā)明的融合蛋白不含有其它 HCV多肽，特別是不含有核心蛋白，并且如上所述與NS多肽相關(guān)時(shí)不含有 NS5A多肽。更具體地，術(shù)語(yǔ)"NS3多肽"是指得自任何HCV毒株的天然NS3蛋白、 多肽或肽，或者是指如上所定義的修飾的NS3蛋白、多肽或肽。本發(fā)明中使 用的NS3多肽的長(zhǎng)度為至少200個(gè)氨基酸，有利地至少300個(gè)氨基酸，優(yōu)選至 少400個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少500個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選至少600個(gè)氨基酸。為 舉例目的，天然HCV-1NS3蛋白長(zhǎng)度為631個(gè)氨基酸，且位于多蛋白前體中 大約第1027至1657位。天然NS3多肽包含兩個(gè)不同的活性結(jié)構(gòu)域，即N末端 中的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和C末端中的解旋酶結(jié)構(gòu)域。NS3蛋白酶負(fù)責(zé)在 NS3/NS4A、 NS4A/NS4B、 NS4B/NS5A和NS5A/NS5B交界處加工HCV多蛋 白前體，且需要NS4A作為蛋白酶解活性(Tomei et al.， 1993, J. Virol. 67， 4017-4026)和正確折疊(Yao et al.， 1999， Structure (London) 7 pp 1353)的輔因 子。由在裂解位點(diǎn)上游第6位的天冬氨酸或谷氨酸和在第1位的半胱氨酸或 蘇氨酸及在裂解位點(diǎn)下游第1位的絲氨酸或丙氨酸組成的基序由HCV NS3 蛋白酶特異識(shí)別。NS3解旋酶被認(rèn)為對(duì)于在病毒復(fù)制期間解旋雙鏈RNA中 間體是重要的(Tai et al.， 1996, J. Virol. 70， 8477-8484)。"NS4A多肽"是指來(lái)自任何HCV毒株的天然NS4A蛋白、多肽或肽， 或者如上定義的修飾的NS4A蛋白、多肽或肽。本發(fā)明中使用的NS4A多肽 的長(zhǎng)度為至少10個(gè)氨基酸，有利地至少ll個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少12個(gè)氨基酸， 更優(yōu)選至少13個(gè)氨基酸。"NS4B多肽"是指來(lái)自任何HCV毒株的天然NS4B 蛋白、多肽或肽，或者如上定義的修飾的NS4B蛋白、多肽或肽。本發(fā)明中 使用的NS4B多肽的長(zhǎng)度為至少20個(gè)氨基酸，有利地至少25個(gè)氨基酸，優(yōu)選 至少30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少31個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選至少32個(gè)氨基酸。為 舉例目的，天然HCV-1 NS4(A-B)蛋白長(zhǎng)度為315個(gè)氨基酸，且位于多蛋白 前體中大約第1658至1972位。NS4A多肽(第1658至1711位)是NS3蛋白酶的 輔因子，而且也是NS3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜中的穩(wěn)定性和定位所需要的(Faillaet al., 1994， J. Virol. 68， 3753—3760)。 NS4B多肽(第1712至1972位)是一種完整 的膜蛋白，其功能仍未知。預(yù)測(cè)算法提示存在4-6個(gè)跨膜節(jié)段。然而，其表 達(dá)誘導(dǎo)表面上ER衍生的膜狀網(wǎng)的形成(Egger et al., 2002, J. Virol. 76, 5974-5984)。"NS5B多肽"是指來(lái)自任何HCV毒株的天然NS5B蛋白、多肽或肽， 或者如上述定義的修飾的NS5B蛋白、多肽或肽。本發(fā)明中使用的NS5B多 肽的長(zhǎng)度為至少200個(gè)氨基酸，有利地至少300個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少400個(gè)氨 基酸，更優(yōu)選至少500個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選至少550個(gè)氨基酸。為舉例目的， 天然HCV-1 NS5B蛋白長(zhǎng)度為591個(gè)氨基酸，且位于多蛋白前體中大約第 2421至3011位。天然NS5B蛋白發(fā)揮RNA依賴性RNA聚合酶作用，其被認(rèn)為 允許負(fù)鏈RNA中間體和正鏈子代拷貝的合成(Lohman et al.， 1997， J. Virol. 71 8416-8428)。發(fā)現(xiàn)其通過(guò)21個(gè)C末端氨基酸序列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合 (Schmidt-Mende et al., 2001, J. Biol. Chem. 276， 44052-44063)。
為清楚起見(jiàn)，本文提及的關(guān)于NS3、 NS4A、 NS4B和NS5B多肽的氨基 酸序列段是針對(duì)其在HCV-l多蛋白前體中的位置而給出的(如Choo et al.， 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 2451-2455所述，或者在GenBank登錄號(hào) M62321中所述)。然而，如上所述，本發(fā)明還涉及其它HCV毒株和分離株 的NS多肽，以及修飾的NS多肽。因此，除了另外明確指出，當(dāng)其在本文是 指HCV-1多蛋白前體的NS多肽或其肽時(shí)，是指HCV-1的NS多肽或其肽、任 何其它HCV毒株或分離株的NS多肽或其肽，或者修飾的NS多肽或其肽。本 發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案涉及融合蛋白，其包含源自基因型lbHCVJA毒株的 NS3、 NS4A、 NS5B和任選的NS4B多肽(Kato et al., 1990， Proc. Natl. Acad.， Sci. 87, 9524-9528)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白中包含的NS3多肽與相應(yīng)的天然 NS3多肽相比被修飾，以呈現(xiàn)出明顯降低的蛋白酶活性，并因此不能介導(dǎo)所 述融合蛋白裂解為單獨(dú)的多肽。蛋白酶活性位于NS3多肽的N末端部分，相 對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約第1027位至大約1207位(從SEQIDNO: l所示 天然HCV-JANS3多肽的大約第1位至大約181位)。更特別地，NS3蛋白酶活 性歸因于催化三聯(lián)體殘基，所述催化三聯(lián)體殘基即在第1083位的殘基His (H)、在第1107位的Asp(D)和在第1165位的Ser(S)(分別為SEQIDNO: l的 第57、 81和139位)。合適的蛋白酶缺陷的NS3多肽的代表性實(shí)例在 Bartenshlager et al.， 1993， J. Virol. 67， 3835-3844和Tomei et al., 1993, J. Virol. 67， 4017-4026中描述。優(yōu)選地，因?yàn)榇呋缘腁sp和Ser殘基位于預(yù)計(jì)的抗 原性結(jié)構(gòu)域，因此本發(fā)明中使用的NS3多肽包含在第1083位的His殘基(相應(yīng) 于SEQ ID NO: 1的第57位)或者位于另一HCV血清型的天然NS3多肽的等價(jià) 位置的氨基酸由除了扭s之外的任何氨基酸殘基取代，優(yōu)選由Ala殘基取代 (H1083A)。蛋白酶活性的破壞可以使用本領(lǐng)域熟知的測(cè)定法確定(Takeshita et al" 1997， Anal. Biochem. 247， 242-246; Kakiuchi et al" 1997 J. Biochem 122， 749-755; Sali et al.， 1998， Biochemistry 37， 3392-3401; Kakiuchi et al.， 1999, J.ViroLMeth. 80,77-84)?；蛘呋蛳嘟M合地，本發(fā)明融合蛋白中包含的NS3多肽與相應(yīng)的天然NS3
多肽相比被修飾，以呈現(xiàn)顯著降低的解旋酶活性。四個(gè)殘基參與NS3相關(guān)的 解旋酶活性，分別是在相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-l多蛋白的第1295位的Thr、在第 1437位的Thr、在第14卯位的Arg及在第1493位的Arg(相應(yīng)于SEQ ID NO: 1 所示天然HCV-JA NS3多肽的第269位和41 l位的Thr殘基及第464和467位的 Arg殘基)。合適的解旋酶缺陷的NS3多肽的代表性實(shí)例在Kim et al. (1997, J. Virol. 71, 9400)和Lin and Kim (1999, J. Virol. 73, 8798-8807)中描述。優(yōu)選 地，本發(fā)明中使用的NS3多肽包含第1490位(相應(yīng)于SEQIDNO: l的第464 位)的Arg殘基或者位于另一HCV血清型的天然NS3多肽的等價(jià)位置的氨基 酸殘基由除了Arg之外的任何氨基酸殘基取代，在第1295位(相應(yīng)于SEQ ID NO: l的第269位)的Thr殘基或者位于另一血清型的天然NS3多肽的等價(jià)位 置的氨基酸殘基由除了Thr之外的任何氨基酸殘基取代，優(yōu)選在這兩種情況 中均由Ala殘基取代(T1295A和R1490A)。解旋酶活性的破壞可以使用本領(lǐng) 域熟知的測(cè)定法確定，例如通過(guò)評(píng)估解旋活性而確定。最優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的NS3多肽被突變，以降低或破壞天然NS3多 肽的蛋白酶和解旋酶活性，并包含如上論述的關(guān)于這些酶功能方面的修飾， 優(yōu)選突變體H1083A、 T1295A和R1490A?；蛘呋蚺c上文關(guān)于NS3多肽建議的修飾相組合，本發(fā)明的融合蛋白中包 含的NS5B多肽與相應(yīng)的天然NS5B多肽相比被修飾，以呈現(xiàn)顯著降低的 RNA依賴性RNA聚合酶活性。兩個(gè)Asp殘基參與這種酶功能，分別位于相 對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白第2640位和2738位(相應(yīng)于SEQ ID NO: 4所示天然 HCV-JANS5B多肽的第220和318位的Asp殘基)。合適的聚合酶缺陷的NS5B 多肽的代表性例子在Lohmann et al. (1997， J. Virol. 71, 8416-8428)中描述。 優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的NS5B多肽包含至少第2640位(相應(yīng)于SEQ ID NO: 4的第220位)的Asp殘基或者位于另一HCV血清型的天然NS5B多肽的等價(jià) 位置的氨基酸殘基由除了Asp之外的任何氨基酸殘基取代，和/或第2738位 (相應(yīng)于SEQ ID NO: 4的第318位)的Asp殘基或者位于另一HCV血清型的天 然NS5B多肽的等價(jià)位置的氨基酸殘基由除了Asp之外的任何氨基酸殘基取 代，優(yōu)選在這兩種情況中均由Asn殘基取代。RNA聚合酶活性的破壞可以使
用本領(lǐng)域熟知的測(cè)定法確定，例如基于在新生RNA產(chǎn)物中摻入放射性核苷 酸底物的常規(guī)復(fù)制酶測(cè)定法(見(jiàn)例如Behrens et al.， 1996，EMBOJ. 15, 12-22; Ferrari et al.， 1999， J. Virol. 73， 1649-1654)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白中包含的NS多肽與相應(yīng)的天 然NS多肽相比可進(jìn)一步包含額外的修飾。合適的修飾是有益于所得融合蛋 白的加工、穩(wěn)定性和溶解性的那些修飾，例如旨在失活潛在的裂解位點(diǎn)、 膜錨定和/或糖基化的那些修飾，如下文所述。有利地，本發(fā)明的融合蛋白不包含正常存在于天然HCV多蛋白前體的 NS3/NS4A、 NS4A/NS4B、 NS4B/NS5A和NS5A/NS5B交界處(junction)的一 或多個(gè)NS3識(shí)別的裂解位點(diǎn)，以避免其加工為單獨(dú)的NS多肽。盡管本發(fā)明 中使用的優(yōu)選的NS3多肽呈現(xiàn)顯著降低的蛋白酶活性，但是NS3識(shí)別的裂解 位點(diǎn)的失活使得安全性進(jìn) 一 步增強(qiáng)。裂解位點(diǎn)的共有序列是 Asp/Glu-X4-Cys/Thr-Ser/Ala，其中X是任何氨基酸殘基。天然NS3多肽的裂 解在Cys/Thr殘基之后發(fā)生。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的NS3多肽不包含正常 存在于天然NS3多肽C末端的Thr或Cys殘基(HCV-l多蛋白的第1657位，相應(yīng) 于SEQ ID NO: 1的第361位或者另一HCV血清型的天然NS3多肽的等價(jià)位 置)。或者或相組合地，NS4A多肽不包含正常存在于天然NS4A多肽C末端 的Cys殘基(HCV-l多蛋白的第1711位，相應(yīng)于SEQIDNO:2的第54位或者另 一HCV血清型的天然NS4A多肽的等價(jià)位置)?；蛘呋蛳嘟M合地，任選NS4B 多肽不包含正常存在于天然NS4B多肽C末端的Cys殘基(HCV-1多蛋白第 1972位，相應(yīng)于SEQ ID NO: 3的第261位或者另一HCV血清型的天然NS4B 多肽的等價(jià)位置)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以被進(jìn)一步修飾，以缺失 正常參與天然NS4A、NS4B和/或NS5B多肽的膜錨定的一或多個(gè)疏水性結(jié)構(gòu) 域。在天然NS4B多肽中已經(jīng)鑒別了六個(gè)膜錨定疏水性結(jié)構(gòu)域，然而一個(gè)結(jié) 構(gòu)域存在于天然NS4A多肽的N末端部分，一個(gè)結(jié)構(gòu)域存在于NS5B天然多肽 的C末端部分。其至少部分缺失可以改善所述融合蛋白的溶解性并因此便于 通過(guò)重組方式產(chǎn)生。與在指定的宿主生物體中給予單獨(dú)的HCV多肽相比，
這也可以限制所述融合蛋白的整體細(xì)胞毒性。在這方面，NS4A多肽通過(guò)缺失或取代正常存在于天然NS4A多肽N末端 部分中的一或多個(gè)疏水性氨基酸殘基而被有利地修飾。優(yōu)選的NS4A多肽缺 失N末端的達(dá)前20個(gè)氨基酸(例如優(yōu)選缺失相對(duì)于全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約 第1658位至第1677位，相應(yīng)于缺失SEQ ID NO: 2所示天然HCV-JA NS4A多 肽的大約第1位至大約第20位)，而保留全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的從大約第1678 位至大約1690位的天然NS4A多肽部分(從SEQ ID NO: 2所示天然HCV-JA NS4A多肽的第21位至大約33位)?？梢员Ａ艋蛘卟槐Ａ籼烊籒S4A多肽的C 末端部分，例如全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約第1691位至大約1711位的那部分 (相應(yīng)于SEQ ID NO: 2所示天然HCV-JA NS4A多肽的大約第34位至大約54 位)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白中包含的NS4A多肽由全長(zhǎng)HCV-1多蛋白 的第1678位至第1690位的天然NS4A多肽部分組成灘應(yīng)于SEQ ID NO: 2所 示天然HCV-JANS4A多肽的第21位至第33位的NS4A部分)?；蛘呋蛳嘟M合地，優(yōu)選的NS5B多肽缺失正常存在于天然NS5B多肽C末 端的10-30個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選缺失最后21個(gè)C末端氨基酸殘基(例如HCV-1 多蛋白的第2991位至第3011位，相應(yīng)于SEQIDNO:4的第571位至591位)?；蛘呋蛳嘟M合地，優(yōu)選的任選NS4B多肽缺失六個(gè)膜錨定疏水性結(jié)構(gòu)域 的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地，任選NS4B多肽在相應(yīng)的天然NS4B多肽的N 和C末端截短一或多個(gè)氨基酸，以基本上保留內(nèi)部抗原性結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地， 本發(fā)明中使用的任選的NS4B多肽包含全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約第1789位 至大約第1820位的氨基酸序列段或者基本上由全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約第 1789位至大約第1820位的氨基酸序列段組成(相應(yīng)于SEQ ID NO: 3所示天然 HCV-J NS4B多肽的大約第78位至大約109位)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白被進(jìn)一步修飾，以當(dāng)在指定 的宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)抑制潛在的N-糖基化。在這點(diǎn)上，已經(jīng)在天然NS5B多 肽中從全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的第2789位至第2792位鑒別了共有的糖基化位點(diǎn) Asn-Val-Ser-Val(SEQ ID NO: 4所示天然HCV-JA NS5B蛋白的第369位至372 位)。由此， 一個(gè)突變的例子是全長(zhǎng)HCV-l多蛋白第2791位(SEQIDNO:4的 第371位)的Ser殘基由不同于Ser的殘基取代，例如由Gly殘基取代。希望的是，本發(fā)明的融合蛋白是免疫原性的，即在導(dǎo)入宿主生物體中 時(shí)能誘導(dǎo)或刺激抗原特異性免疫應(yīng)答-體液免疫或細(xì)胞免疫或者這二者。本 發(fā)明還涉及這樣的融合蛋白，其已經(jīng)被工程化，以增強(qiáng)免疫原性(例如通過(guò) 二硫鍵氧化)。希望的是，本發(fā)明的融合蛋白中包含的各種NS多肽的折疊與 天然NS多肽的折疊相同。在本發(fā)明中，優(yōu)選所述融合蛋白保留T細(xì)胞受體 識(shí)別的一或多個(gè)抗原性結(jié)構(gòu)域。可以適當(dāng)保留在所述融合蛋白中的許多 HCV抗原性結(jié)構(gòu)域在文獻(xiàn)中描述(見(jiàn)例如Chien et al.， 1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10011-10015; Chien et al., 1993， J. Gastroent. Hepatol. 8， S33-39 and WO03/097677)。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白中包含的NS3多肽保留全長(zhǎng)HCV-1多蛋白 的大約第1038位至第1082位、大約第1096位至大約1181位及大約1244位至 大約1274位的天然NS3多肽部分(例如SEQ ID NO: 1所示天然HCV-JA NS3 多肽的大約第12位至大約第56位、大約70位至大約155位和/或大約第218位 至大約第248位)。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白中包含的NS5B多肽保留全長(zhǎng) HCV-1多蛋白的第2573位至第2601位的天然NS5B多肽部分(例如SEQ ID NO: 4所示天然HCV-JNS5B多肽的大約第155位至大約第182位)。當(dāng)本發(fā)明 的融合蛋白包含NS4B多肽時(shí)，優(yōu)選保留全長(zhǎng)HCV-1多蛋白的大約第1789位 至第1820位的天然NS4B多肽部分(例如SEQ ID NO: 3所示天然HCV-J NS4B 多肽的大約第78位至大約第109位)。本發(fā)明的融合蛋白的免疫原性活性可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的許多技術(shù)評(píng) 估，如后文關(guān)于本發(fā)明的方法或者在實(shí)施例中例證的那些技術(shù)。在本發(fā)明 中，優(yōu)選所述融合蛋白的免疫原性活性在延伸和/或天然狀態(tài)比天然NS多肽 提供的通常的免疫原性活性高。例如，當(dāng)在宿主生物體中導(dǎo)入所述融合蛋 白時(shí)，所述免疫應(yīng)答可以是更強(qiáng)、更廣泛(例如包括更多的免疫細(xì)胞如^04+ 和CD8+細(xì)胞)，或者其范圍與導(dǎo)入天然NS多肽的范圍不同(例如針對(duì)非顯性 的隱蔽表位)。由此增強(qiáng)了治療作用，因此可以減少給藥劑量并改善生命質(zhì) 里0
優(yōu)選的NS3多肽源自SEQ ID NO: 1所示天然HCV-JA NS3蛋白，所述NS3 多肽經(jīng)至少如下方式修飾從而 其保留從第12位至第56位、第70位至第155位及從第218位至248位的部分； 其包含第57位His殘基由不同于His的氨基酸殘基如Ala殘基的取代； 其包含第269位Thr殘基由不同于Thr的氨基酸殘基如Ala殘基的取代；及 其包含第464位Arg殘基由不同于Arg的氨基酸殘基如Ala殘基的取代；及 其在第631位不包含Thr殘基。更優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的NS3多肽包含、基本上由或者由SEQIDNO. 5所示氨基酸序列組成。優(yōu)選的NS4A多肽多肽源自SEQ ID NO: 2所示天然HCV-JA NS4A蛋白， 所述NS4A多肽經(jīng)至少如下方式修飾從而 其含有SEQIDNO:2的第21位至第33位的部分； 其不含有SEQIDNO:2的第1位至第20位的部分。 更優(yōu)選地，NS4A多肽具有基本上由起始子Met殘基在前及隨后SEQ IDNO:2的第21位至第33位的那部分組成的氨基酸序列。最優(yōu)選地，NS4A 多肽基本上由起始子Met在前及隨后SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列組成。優(yōu)選的任選的NS4B多肽源自SEQ ID NO: 3所示天然HCV-JA NS4B蛋 白，所述NS4B多肽經(jīng)至少如下方式修飾從而 其包含第78位Ser殘基至第109位Leu殘基的部分； 其不包含第261位Cys殘基。更優(yōu)選地，任選的NS4B多肽基本上由或者由SEQ ID NO: 7所示氨基 酸序列組成。優(yōu)選的NS5B多肽源自SEQ ID NO: 4所示天然HCV-JA NS5B蛋白，所 述NS5B多肽經(jīng)至少如下方式修飾從而 其包含第154位Arg殘基至第182位Leu殘基的部分； 其包含第220位Asp殘基由不同于Asp的氨基酸殘基如Asn殘基的取代； 其包含在318位Asp殘基由不同于Asp的氨基酸殘基如Asn殘基的取代； 其不包含第571位Trp殘基至第591位Arg殘基的部分。 更優(yōu)選地，NS5B多肽包含、基本上由或者由SEQ IDNO: 8所示氨基 酸序列組成。本發(fā)明最優(yōu)選的融合蛋白包含或者基本上由或者由與SEQ ID NO: 9或 IO所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列組成。SEQIDNO:9(圖l)所示 序列相應(yīng)于上述優(yōu)選的NS4A、 NS3與NS5B多肽的融合體，其中N末端起始 子Met在第l位，NS4A多肽從第2位氨基酸殘基延伸至第14位氨基酸殘基， 接頭肽從第15位氨基酸殘基延伸至第17位氨基酸殘基，NS3多肽從第18位氨 基酸殘基延伸至第647位氨基酸殘基，接頭從第648位氨基酸殘基延伸至第 652位氨基酸殘基，及NS5B多肽從第653位氨基酸殘基延伸至第1222位氨基 酸殘基。SEQIDNO: 10(圖2)所示序列相應(yīng)于上述最優(yōu)選的NS4A、 NS3、 NS4B與NS5B多肽的融合體，其中N-末端起始子Met在第l位，NS4A多肽從 第2位氨基酸殘基延伸至第14位氨基酸殘基，接頭肽從第15位氨基酸殘基延 伸至第17位氨基酸殘基，NS3多肽從第18位氨基酸殘基延伸至第647位氨基 酸殘基，NS4B多肽從第648位氨基酸殘基延伸至第679位氨基酸殘基，及 NS5B多肽從第680位氨基酸殘基延伸至第1249位氨基酸殘基。本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明的融合蛋白的新的肽片段，特別是SEQ ID NO: 9或SEQIDNO: 10所示那些片段。如本文所用，所述片段包含本發(fā)明揭示 的融合蛋白的至少10、 15、 20、 50或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基?？梢曰?完成功能的能力選擇這種片段，例如基于結(jié)合底物或者作為免疫原的能力 加以選擇。合適的肽片段典型是包含含有新的免疫原性結(jié)構(gòu)的融合蛋白的 結(jié)構(gòu)域或基序的那些片段。預(yù)測(cè)的免疫原性結(jié)構(gòu)域可易于通過(guò)熟知且易于 為暴露于技術(shù)人員所利用的計(jì)算機(jī)程序鑒別。本發(fā)明的肽片段可以使用已 知的蛋白質(zhì)合成方法合成。
本發(fā)明的融合蛋白及其肽片段可以通過(guò)任何合適方法產(chǎn)生，例如標(biāo)準(zhǔn)的直接肽合成技術(shù)(例如Bodanszky， 1984在Principles of peptide synthesis, Springer-Verlag中所述)及如下文關(guān)于本發(fā)明載體描述的重組DNA技術(shù)。因此，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明融合蛋白的分離的核酸分子，優(yōu)選 所述核酸分子編碼一種融合蛋白，所述融合蛋白包含或者基本上由或者由 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: IO所示氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: IO同源的氨基酸序列組成。希望的是，本發(fā)明的核酸分子經(jīng)優(yōu)化以提供在特定宿主細(xì)胞中高水平 表達(dá)，所述宿主細(xì)胞例如是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母(例如釀酒酵母 (Sacc/zflroAwyc&s cerev/s/ae)、 iSacc/2ar0wyc&s / o/w6e或巴斯德畢赤氏酵母 (尸/A/a/;ayto/^))或者原核宿主(例如大腸桿菌)細(xì)胞。已經(jīng)確實(shí)觀測(cè)到當(dāng)可利 用一個(gè)以上的密碼子編碼指定的氨基酸時(shí)，生物體的密碼子使用是高度隨 機(jī)的(見(jiàn)例如Wada et al.， 1992， Nucleic Acids Res. 20， 2111-2118)，且密碼子 的使用在不同宿主之間可以顯著不同(見(jiàn)例如Nakamura et al., 1996， Nucleic Acids Res. 24, 214-215)。由于本發(fā)明中使用的NS編碼核苷酸序列源于病毒 (HCV)，因此它們也許具有對(duì)于在宿主細(xì)胞如細(xì)菌或者低等真核細(xì)胞中有效 表達(dá)不適當(dāng)?shù)拿艽a子使用模式。典型地，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過(guò)將相應(yīng)于在這種特定宿主細(xì)胞中不太 常用的密碼子的一或多個(gè)"天然"(例如HCV)密碼子用一或多個(gè)編碼相同氨 基酸且更常用的一或多個(gè)密碼子置換進(jìn)行。這可以通過(guò)常規(guī)的誘變方法或 者通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)(例如產(chǎn)生合成的核酸分子)實(shí)現(xiàn)。不是必需置換相應(yīng)于 不常用的密碼子的全部天然密碼子，因?yàn)橥ㄟ^(guò)部分置換即可達(dá)到表達(dá)增加。 另外，可以對(duì)優(yōu)化的密碼子的嚴(yán)格遵守進(jìn)行一些變化，以適應(yīng)限制位點(diǎn)導(dǎo) 入所得核酸分子中。為了進(jìn)一步優(yōu)化密碼子的使用，可以通過(guò)對(duì)核苷酸序列進(jìn)行額外的修 飾而進(jìn)一步改良宿主細(xì)胞中的表達(dá)。例如，可以對(duì)本發(fā)明的核酸分子進(jìn)行 修飾，以防止?jié)饪s區(qū)域中存在的罕見(jiàn)的非優(yōu)化的密碼子聚集，和/或抑制或
修飾預(yù)期負(fù)面影響表達(dá)水平的至少部分陰性序列元件。這種陰性序列元件包括但非限于具有極高(〉80。/。)或極低(〈30。/。)GC濃度的區(qū)域；AT-富集或者 GC富集序列段；不穩(wěn)定的正向或反向重復(fù)序列；RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；和/或內(nèi)部 隱蔽的調(diào)節(jié)元件如內(nèi)部TATA-盒、chi-位點(diǎn)、核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，和/或剪接 供體/受體位點(diǎn)。與在相同條件(例如相同細(xì)胞類(lèi)型、相同培養(yǎng)條件、相同表達(dá)載體等) 下的涉及相應(yīng)天然HCV基因的核酸分子表達(dá)水平相比，本發(fā)明優(yōu)化的核酸 分子優(yōu)選在指定宿主細(xì)胞中能以更高水平即至少110%、有利地至少150%及 優(yōu)選至少200%表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白。表達(dá)水平可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)如 Westem印跡法評(píng)估，使用特異于本發(fā)明的融合蛋白中包含的HCV多肽之一 的抗體進(jìn)行。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了核酸分子，其包含或者基本 上由或者由與SEQ ID NO: 11-16所示序列同源或者更優(yōu)選相同的核苷酸序 列組成。SEQIDNO: 11的核酸分子編碼NS4A-3-5B融合蛋白，其核苷酸序 列已經(jīng)被優(yōu)化以在哺乳動(dòng)物(例如人)細(xì)胞中表達(dá)。SEQIDNO: 12的核酸分 子編碼NS4A-3-4B-5B融合體，其核苷酸序列已經(jīng)被優(yōu)化以在哺乳動(dòng)物(例如 人細(xì)胞)中表達(dá)。SEQIDNO:13的核酸分子編碼NS4A-3-5B融合體，其核苷 酸序列已經(jīng)被優(yōu)化以在酵母(例如巴斯德畢赤氏酵母)中表達(dá)。SEQ IDNO: 14的核酸分子編碼NS4A-3-4B-5B融合體，其核苷酸序列已經(jīng)被優(yōu)化以在酵 母(例如巴斯德畢赤氏酵母)中表達(dá)。SEQIDNO: 15的核酸分子編碼 NS4A-3-5B融合體，其核苷酸序列已經(jīng)被優(yōu)化以在原核生物(例如大腸桿菌) 中表達(dá)。SEQIDNO:16的核酸分子編碼NS4A-3-4B-5B融合體，其核苷酸序 列已經(jīng)被優(yōu)化以在原核生物(例如大腸桿菌)中表達(dá)。當(dāng)然，如果需要，則所 述序列可具有5，和3'非編碼序列，起始子Met在5'末端， 一或多個(gè)終止密碼 子在3，末端，及合適的限制位點(diǎn)在這兩端以便于進(jìn)行克隆(clonage)步驟。核 酸分子的例子也在圖3-8中提供。本發(fā)明還涉及在嚴(yán)格條件下能與上述核酸分子雜交的核酸分子。嚴(yán)格 條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。典型地，雜交在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)后在0.2XSSC、0.1。/。SDS中在50-65。C洗滌一或多次。 優(yōu)選地，這種增加核酸與上述核酸分子在全長(zhǎng)核苷酸序列或者其較短的片 段(例如長(zhǎng)度為至少30、 45、 50、 60、 80、 100、 150、 200個(gè)核苷酸)對(duì)比中 呈現(xiàn)高于70%的序列相同性。更優(yōu)選地，它們之間的相同性程度高于70%、 有利地高于80%、期望高于85%、優(yōu)選高于90%、更優(yōu)選高于95%、還更優(yōu) 選高于97。/。。這種雜交核酸分子的代表性例子包括但非限于這樣的核酸分子，其與 SEQIDNO:ll-16任一序列中包含的至少大約20、 30、 40、 50、 100或者150 個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)(例如反義核酸分子)。舉例示出的序列的變化如簡(jiǎn)并密碼 子或者不同HCV的分離株/毒株之間的多態(tài)性或者得自如DNA改組等技術(shù) 的變化也包含在本發(fā)明中。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明核酸分子的片段，例如限制性核 酸內(nèi)切酶和PCR產(chǎn)生的片段。這種片段可用作探針、引物或者編碼本發(fā)明 免疫原性部分的片段。本發(fā)明的核酸分子可以使用本領(lǐng)域可登陸的序列數(shù)據(jù)庫(kù)及本發(fā)明提供 的序列信息產(chǎn)生。編碼本發(fā)明的融合蛋白中包含的每個(gè)HCV多肽的DNA序 列可以直接分離自含有HCV的細(xì)胞、cDNA和基因組文庫(kù)、病毒基因組或者 已知包含其的任何現(xiàn)有載體，通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)或者PCR技術(shù)分離， 且如果需要，可以通過(guò)常規(guī)誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步修飾(例如優(yōu)化在特定宿主 細(xì)胞中表達(dá)，順應(yīng)基因型或亞型特異性序列，如上文所述)。融合編碼每個(gè) HCV多肽的序列可以例如通過(guò)框內(nèi)直接連接或者通過(guò)編碼肽接頭的序列連 接而實(shí)現(xiàn)?；蛘?，本發(fā)明的核酸分子也可以通過(guò)化學(xué)合成法自動(dòng)化產(chǎn)生(例 如從重疊合成的寡核苷酸中裝配，例如Edge, 1981，Nature292， 756; Nambair etal" 1984， Science 223， 1299; Jayetal" 1984, J. Biol. Chem. 259,631 l所述)。本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明核酸分子的一或多個(gè)拷貝的載體。例 如，其可以有利地在同一載體中包含編碼源自不同基因型或亞型的融合蛋 白的核酸分子。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)"載體"既是指表達(dá)載體也是指非表達(dá)載體，且包 括病毒載體以及非病毒載體，包括染色體外載體(例如多拷貝質(zhì)粒)和設(shè)計(jì)為 摻入宿主染色體中的整合載體。本發(fā)明中特別重要的是用于基因治療的載 體(即能將核酸分子輸送至宿主生物體)以及用于各種表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載 體?？梢允褂枚喾N宿主-載體系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，包括用含有編碼 融合蛋白的核酸分子的噬菌體、質(zhì)?；蛘沉］d體轉(zhuǎn)化的原核生物如細(xì)菌(例如大腸桿菌或枯草桿菌)；用含有編碼融合蛋白的核酸分子的酵母表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化的酵母(例如釀酒酵母、5^cc/2wow;;c" pow&、巴斯德畢赤氏酵母)； 用含有編碼融合蛋白的核酸分子的病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆 蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)(例如Sf9細(xì)胞)；用含有編碼融合蛋白的核酸分子的病毒表達(dá)載 體(例如花椰菜花葉病毒CaMV;煙草花葉病毒TMV)感染的或者用質(zhì)粒表達(dá) 載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者用含有編碼融合蛋白的核酸分 子的質(zhì)粒或病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如培養(yǎng)的細(xì) 胞)。用于原核系統(tǒng)中的合適載體包括但非限于pBR322 (Gibco BRL)、 pUC (Gibco BRL)、 pBluescript (Stratagene)、 p Poly (Lathe et al" 1987， Gene 57， 193-201)、 pTrc (Amann et al,, 1988, Gene 69， 301-315); pET lid (Studier et al.， 1990， Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 60-89); pIN (I畫(huà)ye et al" 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109; Van Heeke et al" 1989， J. Biol. Chem. 264, 5503-5509);和pGEX載體，其中本發(fā)明的核酸序列 可以在具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體中表達(dá)。質(zhì)粒pGEX-2T (Amersham Biosciences Product code: 27-4801-01, Genbank accession No. U13850)特別適用于本發(fā)明中。用于在酵母(例如釀酒酵母)中表達(dá)的合適載體包括但非限于pYepSecl (Baldari et al.， 1987, EMBO J. 6， 229-234)、 pMFa (Kujan et al., 1982， Cell 30, 933-943)、 pJRY88 (Schultz et al.， 1987, Gene 54， 113-123)、 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego， Calif.)禾卩pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product code: P03303)。適于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體可以是源于病毒載體或非病毒 載體(例如質(zhì)粒DNA)。合適的質(zhì)粒載體包括但非限于pREP4、 pCEP4 (Irwitrogene) 、 pCI (Promega)、 pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329， 840)禾口 pMT2PC (Kaufman et al.， 1987, EMBO J. 6， 187-195)、 pVAX及pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al.， 2002, J. Virol, 76， 12735-12746)。另外，本發(fā)明中使用的宿主載體系統(tǒng)也可以包含使得本發(fā)明的核酸分 子在宿主細(xì)胞中維持、增殖或表達(dá)的一或多個(gè)額外元件。這種額外的元件 包括但非限于標(biāo)記基因，以便于重組宿主細(xì)胞的鑒別和分離(例如通過(guò)細(xì)胞 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)或者通過(guò)抗生素抗性)；穩(wěn)定元件(例如cw序列，如 Summers and Sherrat， 1984, Cell 36, 1097-1103所述；及DAP系統(tǒng)，如US 5，198，343所述)；及整合元件(例如LTR病毒序列和轉(zhuǎn)座子)。在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的合適的標(biāo)記基因包括四環(huán)素和氨芐青霉素抗 性基因。同樣，抗性基因也可以用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)，如二氫 葉酸還原酶(dhfr)，其賦予氨甲喋呤抗性(Wigler et al.， 1980， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567; O'Hare et al.， 1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,1527); gpt，其賦予霉酚酸抗性(Mulligan and Berg， 1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,2072); neo，其賦予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin et al.， 1981， J. Mol.Biol. 150, 1); zeo，其賦予新霉素抗性；kana，其賦予卡那霉素抗性； 及hygro，其賦予潮霉素抗性(Santerre et al., 1984， Gene 30, 147)。 URA3和 LEU2基因可用于在酵母系統(tǒng)中表達(dá)，其與um3或leu2酵母突變體互補(bǔ)。特 別地，可有利地使用其中已經(jīng)缺失了啟動(dòng)子的URA3基因。在本發(fā)明中也可以使用衍生自各種不同病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病 毒、AAV、痘病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒等)的眾多基于病毒的 表達(dá)系統(tǒng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"病毒載體"包含載體DNA以及其產(chǎn)生的病 毒顆粒。病毒載體可以是具有復(fù)制能力，或者可以經(jīng)遺傳失效以成為復(fù)制
缺陷的或者復(fù)制削弱的狀態(tài)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"具有復(fù)制能力"包含復(fù) 制選擇性和有條件地復(fù)制的病毒載體，其被工程化為在特定宿主細(xì)胞(例如 腫瘤細(xì)胞)中更好或選擇性地復(fù)制。這種載體包括例如腺病毒載體，在基因轉(zhuǎn)移或者重組產(chǎn)生中其具有許多經(jīng)充分論證的優(yōu)勢(shì)(見(jiàn)"Adenoviral vectors for gene therapy", 2002， Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press所述)。根據(jù)本發(fā)明使用的腺病毒載體 可以衍生自許多人或動(dòng)物來(lái)源?？蓱?yīng)用從腺病毒血清型1至51的任何血清 型，優(yōu)選人腺病毒2(Ad2)、 5 (Ad5)、 6 (Ad6)、 ll(Adll)、 24 (Ad24)和35 (Ad35)。所述腺病毒可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC， Rockville, Md.)，且已經(jīng)有許多出版物描述了其序列、組構(gòu)和生產(chǎn)方法，使得技術(shù)人 員可以應(yīng)用其(見(jiàn)例如US 6，133，028; US 6,110,735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP 1016711; Vogels et al.， 2003， J. Virol. 77, 8263-8271)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體具有復(fù)制能力。這種具有復(fù) 制能力的腺病毒載體的例子為本領(lǐng)域所熟知，且易于技術(shù)人員利用(見(jiàn)例如 Hemandez-Alcoceba et al" 2000, Human Gene Ther. 11,2009-2024; Nemunaitis et al., 2001， Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al.， 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727)。用于本發(fā)明的合適的具有復(fù)制能力的腺病毒載體可以從野生 型腺病毒基因組中工程化，通過(guò)E1A CR2結(jié)構(gòu)域中缺失以消除與Rb的結(jié)合 (見(jiàn)例如WO00/24408)和/或通過(guò)用組織、腫瘤或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子置換天然 E1禾口/或E4啟動(dòng)子(見(jiàn)例如US5,998,205、 WO99/25860 、 US5，698，443 、 WO00/46355、 WO00/15820和WO01/36650)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體是復(fù)制缺陷的(見(jiàn)例如 W094/28152; Luskyetal.， 1998，J.Virol 72,2022-2032)。優(yōu)選的復(fù)制缺陷性 腺病毒載體是E1-缺陷的(見(jiàn)例如US 6,136，594和US 6，013，638)，其中E1缺陷 從大約第459位延伸至第3328位或者從大約第459位延伸至3510位(參考 GeneBank中登記號(hào)為M 73260的人腺病毒5型的序列及Chroboczek et al.， 1992， Virol. 186, 280-285所述)。克隆能力可以通過(guò)缺失腺病毒基因組的額
外部分(全部或部分非必需的E3區(qū)域或者其它必需的E2、 E4區(qū)域)而進(jìn)一步 改良。
本發(fā)明的核酸分子可以被插入腺病毒基因組的任何位置。優(yōu)選地，將 其插入以置換E1區(qū)域。其也可以與所述區(qū)域的天然轉(zhuǎn)錄方向的有義或反義 方向放置。
其它合適的病毒載體衍生自痘病毒(見(jiàn)例如Cox et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J, M. Hos， Carolina Academic Press)。在本發(fā)明中， 痘病毒可以得自痘病毒科的任何成員，特別是金絲雀痘病毒、鳥(niǎo)痘病毒和 痘苗病毒，優(yōu)選痘苗病毒。合適的痘苗病毒包括但非限于Copenhagen毒株 (Goebel et al., 1990， Virol. 179， 247-266 and 517-563; Johnson et al.， 1993， Virol. 196,381-401)、 Wyeth毒株和修飾的Ankara (MVA)毒株(Antoine et al" 1998, Virol. 244, 365-396)。構(gòu)建痘病毒的一般條件為本領(lǐng)域所熟知(見(jiàn)例如 EP 206 920; Mayr et al" 1975, Infection 3, 6-14; Sutter and Moss， 1992, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 89， 10847-10851; US 6,440,422)。本發(fā)明的核酸分子優(yōu) 選插入在痘病毒基因組的非必需基因座中。胸苷激酶基因特別適于插入 Copenhagen痘苗載體中(Hruby et al" 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80， 3411-3415; Weir et al.， 1983， J. Virol. 46， 530-537)及缺失II或III以插入MVA 載體中(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72， 1031-1038; Sutter et al.， 1994， Vaccine 12， 1032-1040)。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的載體包含適于在宿主細(xì)胞或生物 體中表達(dá)的形式的本發(fā)明的核酸分子，這意味著所述核酸分子被置于適于 所述載體和/或宿主細(xì)胞的一或多個(gè)調(diào)節(jié)序列的控制下。如本文所用，術(shù)語(yǔ) "調(diào)節(jié)序列"是指允許、有助于或者調(diào)節(jié)核酸分子在指定宿主細(xì)胞中表達(dá) 包括復(fù)制(replication)、倍增(duplication)、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、穩(wěn)定性和/ 或所述核酸分子或其衍生物之一(即mRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞中的任何序列。 本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到所述調(diào)節(jié)序列的選擇可以根據(jù)宿主細(xì)胞、希望的表 達(dá)水平等這類(lèi)因素進(jìn)行。 啟動(dòng)子是特別重要的，本發(fā)明中使用的合適啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子， 其指導(dǎo)核酸分子在許多類(lèi)型宿主細(xì)胞中表達(dá)，及指導(dǎo)核苷酸序列僅在特定 宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些啟動(dòng)子(例如肝特異性調(diào)節(jié)序列)或者應(yīng)答特定事件 或外界因素(例如溫度、營(yíng)養(yǎng)添加劑、激素或其它配體)的那些啟動(dòng)子。
適于在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子包括但非限于噬菌體X pL啟 動(dòng)子、lac、 TRP和IPTG-誘導(dǎo)型pTAC啟動(dòng)子。適于在酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子 包括TEF (Mumberg et al., 1995， Gene 156， 119-122)、 PGK (Hitzeman et al" 1983, Science 219， 620-625)、 MF a(Inokuchi et al,， 1987, Mol. Cell. Biol. 7， 3185-3193)、 CYC-1 (G畫(huà)nte et al, 1981， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,2199)、 GAL-1、 GAL4、 GALIO、 PH05、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)和 醇脫氫酶(ADH)(Denisetal.， 1983， J.Biol. Chem.25,1165)啟動(dòng)子。為了在痘 病毒載體中表達(dá)，可以使用痘苗7.5K、 H5R、 TK、 p28、 pll或KlL啟動(dòng)子， 在Chakrabarti et al. (1997， Biotechniques 23， 1094-1097)、 Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66， 135-138)和Kumar和Boyle (1990, Virology79, 151-158)中描述的合成啟動(dòng)子，以及早期/晚期嵌合啟動(dòng)子。適于在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中組成型表達(dá)的啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子 (Boshartetal.， 1985， Cell41， 521-530)、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、單純皰疹病 毒(HSV)-l的磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子(Adra et al.， 1987， Gene 60， 65-74)和 胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子。由外源提供的化合物調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型真核啟動(dòng)子包括 但非限于鋅-誘導(dǎo)型金屬硫蛋白(MT)啟動(dòng)子(Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7， 838-848)、地塞米松(Dex)-誘導(dǎo)型小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、 T7聚合酶啟動(dòng)子系統(tǒng)(WO 98/10088)、蛻皮激素昆蟲(chóng)啟動(dòng)子(No et al., 1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 3346-3351)、四環(huán)素抑制型啟動(dòng)子(Gossen et al.， 1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 5547-5551)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Kim etal., 1995, J. Virol. 69,2565-2573)、 RU486誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Wang et al.， 1997， Nat. Biotech. 15, 239-243 and Wang et al" 1997， Gene Ther. 4， 432-441)及雷 帕霉素(rapamycin)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Magari et al., 1997， J. Clin. Invest. 100， 2865-2872)。
也可以使用組織特異性啟動(dòng)子，特別是可以靶向HCV感染的細(xì)胞發(fā)揮 預(yù)期治療益處的那些啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括肝特異性啟動(dòng)子如 HMG-CoA還原酶(Luskey， 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1881-1893)、甾醇調(diào)節(jié)元 件l (SRE-1; Smith etal.， 1990， J. Biol. Chem. 265， 2306-2310)、白蛋白(Pinkert et al.， 1987, Genes Dev. 1， 268-277)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK) (Eisenberger et al.， 1992, Mol. Cell Biol. 12, 1396-1403)、人C-反應(yīng)蛋白(CRP) (Li et al.， 1990, J. Biol. Chem. 265, 4136-4142)、人葡糖激酶(Tanizawa et al" 1992， Mol. Endocrinology 6， 1070-1081 )、膽固醇7-a羥化酶(CYP-7) (Lee et al.， 1994, J. Biol. Chem. 269， 14681-14689)、 a-l抗胰蛋白酶(Ciliberto et al.， 1985， Cell 41， 531-540)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP-1) (Babajko et al.， 1993, Biochem Biophys. Res. Comm. 196, 480-486)、人運(yùn)鐵蛋白(Mendelzon etal., 1990， Nucleic Acids Res. 18, 5717-5721)、 I型膠原(Houglum et al., 1994, J. Clin. Invest. 94， 808-814)和FIX (US 5，814，716)基因。
適用于本發(fā)明中的其它的啟動(dòng)子可以得自優(yōu)先在增殖性腫瘤細(xì)胞中表 達(dá)的基因，如在肝癌中過(guò)表達(dá)的a-甲胎蛋白基因的啟動(dòng)子(Kanaieta1.,1997， Cancer Res. 57， 461-465)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT) (W099/27113, WO 02/053760和Horikawa et al.， 1999， Cancer Res. 59， 826)及缺氧反應(yīng)元件(HRE) 啟動(dòng)子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到控制本發(fā)明的核酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)元件可進(jìn)一 步包含額外的元件用于在宿主細(xì)胞或生物體中正確起始、調(diào)節(jié)和/或終止轉(zhuǎn) 錄(例如polyA轉(zhuǎn)錄終止序列)、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)(例如核定位信號(hào)序列)、加工(例 如剪接信號(hào))和穩(wěn)定性(例如內(nèi)含子和非編碼5'和3'序列)、翻譯(例如肽信號(hào)、 原肽、三元前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgamo序列等)以及純化步 驟(例如標(biāo)記)中。
例如，信號(hào)肽最后與原肽組合，可用于促進(jìn)融合蛋白在培養(yǎng)基中的分 泌。信號(hào)肽典型被插入在融合蛋白的N末端緊鄰Met起始子之后，且如果需 要，則所述原肽插入在信號(hào)肽的下游。 非限于交配型因子(MF.)a(KurjanandHerskowitz, 1982， Cell 30， 933-934和US 5，879,926)、轉(zhuǎn)化酶(W084/01153)、 PH05(DK 3614/83)、 YAP3(酵母天冬氨 酸蛋白酶3; WO95/02059)及BARl(WO87/02670)的信號(hào)肽序列。在進(jìn)入ER 期間，信號(hào)肽在加工位點(diǎn)從前體多肽裂解分離。所述加工位點(diǎn)可包含由宿 主細(xì)胞蛋白裂解酶識(shí)別的任何肽序列。優(yōu)選的加工位點(diǎn)的例子包括但非限 于兩個(gè)堿性堿基Lys和Arg (優(yōu)選Lys-Arg)的任意組合，其被釀酒酵母的 KEX2基因編碼的內(nèi)肽酶(見(jiàn)Fuller et aL, 1986， Microbiology, 273-278)或者其 它酵母物種的等價(jià)蛋白酶(見(jiàn)Julius et al., 1983， Cell 32， 839-852)裂解。
肽標(biāo)記(例如能由可獲得的抗血清識(shí)別的短肽序列)可用于促進(jìn)重組融 合蛋白從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清中純化。優(yōu)選地，所述標(biāo)記插入在融合蛋白 的C末端。所述標(biāo)記的例子包括但非限于His標(biāo)記(例如由6個(gè)或更多個(gè)組氨 酸殘基組成)、來(lái)自S廳"w"/的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的肽序列、來(lái)自大 腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白(MPB)、人堿性磷酸酶、FLAG八肽，及e-標(biāo)記(US 6,686,152)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在酵母中表達(dá)的穿梭質(zhì)粒，其包含置于TEF 啟動(dòng)子及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列(例如細(xì)胞色素cyc終止子)控制下的本發(fā)明 的核酸分子(例如核苷酸序列SEQIDNO: 13和14)，其進(jìn)一步包含大腸桿菌 和酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)(例如分別為ORI和2p)，適于在大腸桿菌(例如 氨芐青霉素抗性基因)和酵母(例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型URA3和leu2-3)中表達(dá)的選擇 標(biāo)記。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及適于在大腸桿菌中表達(dá)的pGEX質(zhì) 粒，其包含置于IPTG誘導(dǎo)型pTAC啟動(dòng)子及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列控制下的 本發(fā)明的核酸分子(例如核苷酸序列SEQIDNO: 15和16)，其進(jìn)一步包含大 腸桿菌合適的復(fù)制起點(diǎn)(例如ORI)及合適的選擇標(biāo)記(例如氨芐青霉素抗性 基因)。
本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的復(fù)制缺 陷的腺病毒載體，其包含置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件控制下的本發(fā)明的核酸分子 (例如核苷酸序列SEQ ID NO: 11和12)。優(yōu)選復(fù)制缺陷的腺病毒載體是缺失 El和E3的Ad5基因組，El缺失從大約第459位核苷酸延伸至大約第3511位核 苷酸，E3缺失從大約第28592位核苷酸延伸至大約第30470位核苷酸。優(yōu)選 的腺病毒載體包含Ad5序列，從大約第1位核苷酸至大約第458位核苷酸，從 5，至3，的含有CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的表達(dá)盒，嵌合的人(3-球蛋白 /IgG內(nèi)含子(如在可得自Promega的pCI載體中發(fā)現(xiàn))，編碼兩個(gè)多蛋白形式中 任一個(gè)的序列(SEQIDNO: 11或12)及SV40晚期聚腺苷酸化信號(hào)，隨后是從 大約第3512位核苷酸至大約第28592位核苷酸及從大約第30470位核苷酸至 大約第35935位核苷酸的Ad5序列。
如果需要，本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包含一或多個(gè)轉(zhuǎn)基因，例如與本發(fā) 明的核苷酸分子一起在宿主細(xì)胞或生物體中表達(dá)的感興趣的基因。理想地， 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對(duì)于HCV相關(guān)疾病或病變具有治療或保護(hù)性活性。合適的轉(zhuǎn) 基因包括但非限于細(xì)胞因子編碼基因(例如IL-2、 IL-7、 IL-15、 IL-18、 IL-21、 IFNg)、毒素編碼基因(例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素)、自殺基因， 特別是編碼TK HSV-l的基因(Caruso et al.， 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028)(其與無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷(acyclovir)或者更昔洛韋(ganciclovir)前體藥物 組合使用)、胞嘧啶脫氨酶(CDase)、尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRTase)(其與 前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)組合使用)。基因產(chǎn)物(在WO 99/54481中 描述)特別適用于此。如果使用轉(zhuǎn)基因，其置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件的控制下， 且可以插入本發(fā)明的載體的任何位置或者插入與本發(fā)明的載體組合使用的 獨(dú)立載體中。
將本發(fā)明的核酸分子插入載體主鏈中可以通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法進(jìn) 行，例如Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory)所述方法。插入腺病毒載體或痘病毒載體中可以通 過(guò)同源重組技術(shù)進(jìn)行，分別如Chartier et al. (1996， J. Virol. 70， 4805-4810)和 Paul et al. (2002， Cancer gene Ther. 9， 470-477)所述。
本發(fā)明還包含與脂質(zhì)或聚合物復(fù)合以形成特殊結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體、 lipoplexes或納米顆粒的載體(例如質(zhì)粒DNA)。這種技術(shù)可為本領(lǐng)域所利用 (見(jiàn)例如Arangoa et al., 2003， Gene Ther. 10: 5-14; Eliaz et al., 2002， Gene Ther.
9， 1230-1237禾口Betageri et al" 1993, "Liposome drug delivery systems", Technomic Publishing Company, Inc)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了感染性病毒顆粒，其包含上述本 發(fā)明的核酸分子或載體。
典型地，這種病毒顆粒通過(guò)包括如下步驟的方法產(chǎn)生
(a) 將本發(fā)明的病毒載體導(dǎo)入合適的細(xì)胞系中，
(b) 在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，以產(chǎn)生所述感染性病毒顆粒，
(c) 從所述細(xì)胞系的培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的感染性病毒顆粒，及
(d) 任選純化所述回收的感染性病毒顆粒。 當(dāng)所述病毒載體是缺陷的時(shí)，感染性顆粒通常在互補(bǔ)細(xì)胞系中產(chǎn)生，
或者通過(guò)使用輔助病毒產(chǎn)生，所述輔助病毒提供反式非功能性病毒基因。
例如，適于互補(bǔ)的El缺失的腺病毒載體的細(xì)胞系包括293細(xì)胞(Grahameta1., 1997， J. Gen. Virol. 36， 59-72)以及PER-C6細(xì)胞(Fallaux et al.， 1998， Human GeneTher.9，l卯9-1917)。適于增殖性痘病毒載體的細(xì)胞是禽細(xì)胞，最優(yōu)選 從得自受精卵的雞胚中制備的雞胚原代成纖維細(xì)胞(CEF)。
感染性病毒顆粒可以從培養(yǎng)上清中或者從細(xì)胞溶解后的細(xì)胞中回收。 可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步純化(層析法、在氯化銫梯度超速離心法，例 如W096/27677、 WO98/00524、 W098/22588、 WO98/26048、 WO00/40702、 EP1016700和WO00/50573所述)。
本發(fā)明還包含已經(jīng)修飾以優(yōu)先靶向特定靶細(xì)胞的載體或病毒顆粒(見(jiàn) 例如Wickam et al., 1997， J. Virol. 71， 8221-8229; Arnberg et al.， 1997， Virol. 227， 239-244; Michael et al., 1995， Gene Therapy 2, 660-668; WO94/10323; WO02/96939和EP 1 146 125)。本發(fā)明的靶向載體和病毒顆粒的特征是在其 表面存在能識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞和表面暴露的成分的配體，所述成分如細(xì)胞特 異性標(biāo)記(例如HCV-感染的細(xì)胞)、組織特異性標(biāo)記(例如肝特異性標(biāo)記)以 及病毒(例如HCV)抗原。合適的配體的例子包括針對(duì)HCV抗原性結(jié)構(gòu)域的 抗體或其片段。細(xì)胞靶向可以通過(guò)將配體經(jīng)遺傳插入病毒表面上存在的多
肽(例如腺病毒纖維、五鄰體(penton)、 pIX或者痘苗pl4基因產(chǎn)物)中而進(jìn)行。 本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的核酸分子、載體或者感染性 病毒顆粒。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"應(yīng)理解為包括但非限于組織、 器官或分離的細(xì)胞中的特定組構(gòu)。這種細(xì)胞可以是獨(dú)特類(lèi)型的細(xì)胞或者一 組不同類(lèi)型的細(xì)胞，并包含培養(yǎng)的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和增殖性細(xì)胞。
在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、低等真核細(xì)胞如酵母，及其它 真核細(xì)胞如昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物(例如人或非人)細(xì)胞。優(yōu)選的大 腸桿菌宿主細(xì)胞包括但非限于大腸桿菌BL21(得自Amersham Biosciences)。
優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞包括但非限于釀酒酵母、5".pOAW&、巴斯德畢赤氏酵母，
特別優(yōu)選EP 607 080中所述表達(dá)KEX-2的酵母細(xì)胞如TGY47.1 (或其同基因 的Leir轉(zhuǎn)化體TGY73.4)酵母株，及在US 5,879,926、 US 5，162，208和US 6,103，515中描述的那些宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但非限于 BHK(幼倉(cāng)鼠腎)、CV-1(非洲猴腎細(xì)胞系)、COS(例如COS-7)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng) 鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，小鼠NIH/3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和Vero細(xì)胞。宿主細(xì)胞也 包含能互補(bǔ)本發(fā)明復(fù)制缺陷的載體(例如腺病毒載體)的至少一種缺陷的功 能的互補(bǔ)細(xì)胞，如293和PERC.6細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特殊實(shí)施方案，宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步形成微囊。先 前對(duì)細(xì)胞微囊化技術(shù)已經(jīng)加以描述(Trescoetal.， 1992， ASAIOJ.38， 17-23; Aebischer et al., 1996， Human Gene Ther. 7， 851-860)。
本發(fā)明另一方面提供了一種應(yīng)用本發(fā)明的載體、感染性病毒顆粒和/或 宿主細(xì)胞經(jīng)重組產(chǎn)生融合蛋白的方法。產(chǎn)生融合蛋白的方法包括(a)將本
發(fā)明的載體或感染性病毒顆粒導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的或感 染的宿主細(xì)胞，(b)在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，在體外培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染或
感染的宿主細(xì)胞，(c)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述融合蛋白，(d)任選地純化回
收的融合蛋白。
預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可用于在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的融 合蛋白的多種表達(dá)系統(tǒng)，及將載體或感染性病毒顆粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方
法。這種方法包括但非限于顯微注射法(Capechi et al" 1980， Cell 22， 479-488)、 CaP04-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Chen and Okayama， 1987， Mol. Cell Biol. 7， 2745-2752)、 DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔(Chuetal.， 1987, Nucleic Acid Res. 15， 1311-1326)、脂染/月旨質(zhì)體融合(Felgner et al.， 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84， 7413-7417)、粒子轟擊(Yang et al.， 19卯，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572)、基因槍、轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒感染以及通過(guò)各種方式直接給予 宿主生物體。本發(fā)明的載體可以與脂染試劑聯(lián)合應(yīng)用，以便于將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 中，所述脂染試劑如聚陽(yáng)離子聚合物(例如殼聚糖、聚甲基丙烯酸酯、PEI 等)及陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如DC-Chol/DOPE，目前得自Promega的轉(zhuǎn)染lipofectin)。 另外，如上文所論述，可以使用重組DNA技術(shù)改良核酸分子在宿主細(xì)胞中 的表達(dá)，例如使用高拷貝數(shù)載體、取代或修飾一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)、優(yōu)化融合體編碼核酸對(duì)于宿主細(xì)胞的密碼子使用，及 抑制可使轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的陰性序列。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器、培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿中培 養(yǎng)。培養(yǎng)可以在適于指定宿主細(xì)胞的溫度、pH和氧含量的條件下進(jìn)行。本 文未試圖詳細(xì)描述在原核和真核細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的各種方法。融合蛋白 的產(chǎn)生可以在宿主細(xì)胞的周質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)或者分泌到細(xì)胞外部(例如培養(yǎng)基 中)。在融合蛋白未分泌至或者未完全分泌至生產(chǎn)宿主細(xì)胞外部的情況中， 可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞溶解方法回收所述融合蛋白，包括冷凍-解凍法、超聲 法、機(jī)械破壞法、使用細(xì)胞溶解劑等。如果分泌，可以從培養(yǎng)基中直接回 收。然后可以通過(guò)熟知的純化方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，所述方法包括硫 酸銨沉淀、酸提取、凝膠電泳、過(guò)濾和層析方法(例如反向?qū)游觥⒋笮∨抛?層析、離子交換層析、親和層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用、羥 磷灰石層析，或者高效液相層析)。用于純化本發(fā)明特殊融合蛋白的條件和 技術(shù)依賴于許多因素，如凈電荷、分子量、疏水性、親水性，這些為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所顯而易見(jiàn)。另外，純化水平依賴于指定用途。也己知根據(jù)生 產(chǎn)宿主細(xì)胞，融合蛋白可具有許多糖基化模式，或者可以是非糖基化的(例 如當(dāng)在細(xì)菌中產(chǎn)生時(shí))。另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的融合蛋白、核 酸分子、載體、感染性病毒顆粒、宿主細(xì)胞(在此也稱作"活性劑")或者其 任意組合(例如融合蛋白或者編碼不同基因型或亞型的融合蛋白的載體/病 毒顆粒的組合)。優(yōu)選地，所述組合物是藥物組合物，其進(jìn)一步包含治療有 效量的活性劑，藥物可接受的載體。如本文所用，"治療有效量"是足以 減輕與希望治療的疾病或病變正常相關(guān)的一或多個(gè)癥狀的劑量。當(dāng)涉及預(yù) 防性應(yīng)用時(shí)，該術(shù)語(yǔ)是指足以預(yù)防或延緩疾病或病變發(fā)生的劑量。例如， 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的治療有效量可以是導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活必需的量(例如導(dǎo)致抗HCV應(yīng)答的發(fā)生)。如本文所用，"藥物可接受的載體"是指包括與藥物給予相容的任何 及所有載體、溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑、分散介質(zhì)、包膜、抗菌劑和 抗真菌劑，及延緩吸收劑等。適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明的藥物組合物包含適于人或動(dòng)物應(yīng)用的稀釋劑。優(yōu)選 等張、低滲或弱高滲的稀釋劑，且具有相對(duì)較低的離子濃度。代表性例子 包括無(wú)菌注射用水、生理鹽水(例如氯化鈉)、Ringer's溶液、葡萄糖溶液、 海藻糖溶液或者蔗糖溶液、Hank's溶液，及其它生理平衡的鹽溶液(見(jiàn)例如 最新版本Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro， Lippincott,Williams&Wilkins)。對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行適當(dāng)緩沖，以在生理 狀態(tài)或略堿性pH值(例如大約pH 7至大約pH 9之間)用于人體。合適的緩沖 液包括但非限于磷酸鹽緩沖液(例如PBS)、碳酸氫鹽緩沖液和/或Tris緩沖 液。所述組合物也可以含有其它藥物學(xué)可接受的賦形劑，以提供希望的藥 物學(xué)或藥效學(xué)性質(zhì)，包括例如更改或維持pH、滲量、粘性、透明度、顏色、 無(wú)菌、穩(wěn)定性、配制品的溶解速度、更改或維持釋放或吸收進(jìn)人或動(dòng)物體
中、促進(jìn)通過(guò)血液屏障或者滲入特定器官(例如肝)中。合適的賦形劑包括氨 基酸。本發(fā)明的組合物中包含的藥物可接受的載體必須也允許在生產(chǎn)和在冷凍(例如-70。C、 -20。C)、冷藏(例如4。C)或者室溫下長(zhǎng)期貯存(即至少一個(gè)月) 條件下保持其穩(wěn)定性。在這方面，特別適于本發(fā)明組合物的配方包括'1M蔗糖、150mMNaCl、 lmM MgCl2、 54 mg/1 Tween 80、 10 mM TrispH8.5(尤其當(dāng)活性劑是腺病毒載體時(shí))，及 10mg/ml甘露醇、lmg/mlHAS、 20 mM Tris, pH 7.2及150 mMNaCl 生理鹽水。另外，本發(fā)明的組合物可包含適于全身性或經(jīng)粘膜應(yīng)用于人體的一或 多個(gè)佐劑。優(yōu)選地，所述佐劑能刺激本發(fā)明組合物的免疫原性，特別是T細(xì) 胞介導(dǎo)的免疫原性，例如通過(guò)toll樣受體(TLR)如TLR-7、 TLR-8和TLR-9介 導(dǎo)的免疫原性。有益的佐劑的代表性例子包括但非限于明礬、礦物質(zhì)油乳 狀液如弗氏完全和不完全佐劑(IFA)、脂多糖或其衍生物(Ribi et al., 1986， Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY， p407-419)、皂苷如QS21 (Sumino et al., 1998， J.Virol. 72， 4931-4939; WO 98/56415)、咪唑-喹啉化合物如Imiquimod (Suader， 2000， J. Am Acad Dermatol. 43, S6-S11)及相關(guān)的化合物S-27609 (Smorlesi, 2005, GeneTher. 12,1324-1332)、胞嘧啶磷酸鳥(niǎo)苷寡脫氧核苷酸如CpG(Chuetal., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al.， 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547) 及陽(yáng)離子肽如IC-31 (Kritsch et al.， 2005， J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-270)。本發(fā)明的組合物可以通過(guò)多種給予方式給予，包括全身性、局部和定 位給予。注射可以通過(guò)任何方式進(jìn)行，例如通過(guò)皮下注射、皮內(nèi)注射、肌 內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、腫瘤內(nèi)注射、血管內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注 射或者直接注入動(dòng)脈中(例如通過(guò)肝動(dòng)脈注入)或者肝臟靜脈介入(例如注入 門(mén)靜脈)。注射可以使用常規(guī)注射器和注射針頭或者本領(lǐng)域可獲得的任何其
它適當(dāng)設(shè)備進(jìn)行。或者，本發(fā)明的組合物可以通過(guò)粘膜途徑給予，如口腔/ 食物、鼻、氣管內(nèi)、肺內(nèi)、陰道內(nèi)或者直腸內(nèi)途徑。在呼吸道中給藥可以 通過(guò)組合物霧滴的霧化吸入、噴霧或者使用加壓容器(例如具有合適的推進(jìn) 劑如二氯二氟甲垸、丙垸、氮?dú)獾?或者于非加壓分配器中給予干粉組合物。 局部給藥也可以使用經(jīng)皮方式進(jìn)行(例如皮膚貼片等)。在本發(fā)明中，優(yōu)選肌 內(nèi)和皮下給藥途徑。本發(fā)明的組合物可以是各種形式，例如固體、液體或冷凍形式。固體(例 如干粉或者凍干的)組合物可以通過(guò)包括真空干燥和凍干的方法獲得。對(duì)于 經(jīng)粘膜給藥而言，所述組合物可以配制為口服的腸溶膠囊和顆粒形式、經(jīng) 直腸或陰道給藥的栓劑，最后與用于增加粘膜孔大小的吸收增強(qiáng)劑組合。 這種吸收增強(qiáng)劑典型是與粘膜的磷脂結(jié)構(gòu)域具有結(jié)構(gòu)相似性的物質(zhì)，如去 氧膽酸鈉、甘膽酸鈉、二甲基-P-環(huán)式糊精、十二烷酰-l-溶血卵磷脂)。合適的劑量可以根據(jù)多個(gè)參數(shù)加以調(diào)整，特別是根據(jù)給藥模式、應(yīng)用 的組合物、宿主的生物體年齡、健康狀況、體重、癥狀的性質(zhì)和程度、協(xié) 同治療的種類(lèi)、治療頻率、和/或預(yù)防或治療的需要加以調(diào)整。為確定適當(dāng) 的治療劑量必需的進(jìn)一步精確計(jì)算由從業(yè)人員根據(jù)相應(yīng)的情況常規(guī)進(jìn)行。 作為一般性指導(dǎo)，給予包含病毒的組合物(例如腺病毒顆粒)的合適劑量為大約l()S至l(^iu(感染單位)，希望的是大約107至1012^。給予載體質(zhì)粒的組 合物的給藥劑量可以是10jLig至20mg，有利地是100pg至2mg。蛋白質(zhì)組合 物的給藥劑量可以是給予一或多劑10ng至20mg，優(yōu)選劑量為每公斤體重大 約O.l ng至大約2mg治療蛋白。給藥組合物可以一次給藥或者以一定時(shí)間間 隔重復(fù)給藥一或幾次。本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療多種疾病和病變的方法中，特別是 用于治療HCV感染的那些方法中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"治療"包括預(yù)防和/ 或治療。其特別用于治療HCV長(zhǎng)期感染和HCV感染患者中的肝癌病變。術(shù) 語(yǔ)"癌癥"涵蓋了任何癌癥病變，包括播散的或局部的腫瘤、癌癥轉(zhuǎn)移、 癌性息肉以及癌前病變(例如肝硬化)。優(yōu)選地，當(dāng)根據(jù)本文所述方案 (modalities)導(dǎo)入宿主生物體中時(shí)，本發(fā)明的組合物為治療宿主提供了治療
益處。術(shù)語(yǔ)"宿主生物體"是指包含任何動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物如任何的小鼠、大鼠、牛、豬、狗、貓、馬、猴或人對(duì)象，例如感染HCV的人。所 述治療益處可以通過(guò)許多情形證實(shí)，例如在感染的個(gè)體的血液、血漿或血 清中檢測(cè)的HCV病毒血癥較治療之前降低，和域檢測(cè)到抗HCV免疫應(yīng)答 (例如抗HCV抗體的產(chǎn)生和域T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)，或者延緩HCV感染相關(guān)癥 狀的出現(xiàn)(例如延緩肝硬化或肝癌的發(fā)生)，或者降低與HCV感染典型相關(guān)的 肝炎癥/脂肪變性/纖維化病變，或者改善個(gè)體對(duì)于常規(guī)治療的反應(yīng)。因此，本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性 病毒顆粒、宿主細(xì)胞或組合物在制備用于治療或預(yù)防HCV感染性疾病、HCV 相關(guān)疾病和病變的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防人或動(dòng)物生物體的方法，包括給予所述生 物體治療有效量的本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒顆粒、 宿主細(xì)胞或者組合物。如果需要，本發(fā)明的方法可以與一或多種常規(guī)治療方案(例如放療、化 療和/或手術(shù))聯(lián)合進(jìn)行。多種治療方法的應(yīng)用為患者提供了更廣泛的基本干 預(yù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以在手術(shù)之前或之后進(jìn)行。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以在放療(例如Y射線放射)之前或之后進(jìn) 行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于制定合適的放療方案及使用的參數(shù)(見(jiàn)例如Perez and Brady, 1992， Principles and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB LippincottCo;使用合適的版本和修改方案易于為該領(lǐng)域技術(shù)人員所明了)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法或應(yīng)用與化療聯(lián)合應(yīng)用，所述化 療使用常規(guī)用于治療或預(yù)防HCV感染、HCV相關(guān)疾病和病變的一或多種 HCV藥物。HCV藥物的代表性例子包括但非限于蛋白酶抑制劑(例如絲氨酸 蛋白酶抑制劑如Vertex的VX950)、聚合酶抑制劑、解旋酶抑制劑、抗肝纖 維化藥物(antifibrotics)、核苷類(lèi)似物、TLR激動(dòng)劑、N-糖基化抑制劑、siRNA、 反義寡核苷酸、抗-HCV抗體、免疫調(diào)節(jié)劑、通常用于治療HCV相關(guān)的肝癌 的治療疫苗和抗腫瘤制劑(例如阿霉素或者碘油阿霉素與的混合物，通常在 肝動(dòng)脈中通過(guò)化療栓塞給藥)。例如，治療疫苗包括重組抗原、VLP、基于
或編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白(核心、包膜E1和/或E2蛋白)的載體或合成的肽，其特 別適于觸發(fā)抗HCV體液應(yīng)答。這種HCV藥物可以單一劑量提供，或者根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)方案、用量和狀況以多重劑量提供，間隔幾小時(shí)、幾天和/或幾周給藥。 給藥HCV藥物可以在給藥本發(fā)明的組合物之前、同時(shí)或隨后給藥。特別合 適的組合包括在進(jìn)行本發(fā)明的方法之前、同時(shí)或隨后用聚乙二醇化的 IFN-a2a (例如劑量為10pg/周)和/或三氮唑核苷(例如800-1200 mg/天)治療24 至48周。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法或應(yīng)用根據(jù)引發(fā)加強(qiáng)(primeboost) 治療形式進(jìn)行，包括相繼給予一或多種引發(fā)組合物及一或多種加強(qiáng)組合物。 典型地，所述引發(fā)和加強(qiáng)組合物使用包含或編碼至少一個(gè)普通的抗原性結(jié) 構(gòu)域的不同載體。所述引發(fā)組合物最先被給予宿主生物體，隨后在1天至12 個(gè)月之后給予加強(qiáng)組合物。本發(fā)明的方法可包括1-10次相繼給予引發(fā)組合 物，隨后1-10次相繼給予加強(qiáng)組合物。期望的注射間隔為1周至6個(gè)月。另 外，所述引發(fā)和加強(qiáng)組合物可以在同一位置或者在不同位置通過(guò)相同或不 同給予途徑給予。例如，基于多肽的組合物可以通過(guò)經(jīng)粘膜途徑給予，而 基于載體的組合物優(yōu)選例如經(jīng)皮下注射(對(duì)于MVA載體)、肌內(nèi)注射(對(duì)于 DNA質(zhì)粒和腺病毒載體)給予。在本發(fā)明中，本發(fā)明的組合物用于引發(fā)或加強(qiáng)或者既引發(fā)又加強(qiáng)抗 HCV免疫應(yīng)答。優(yōu)選的本發(fā)明的引發(fā)組合物是包含編碼融合體的腺病毒載 體/病毒和編碼融合體的質(zhì)粒DNA的那些組合物。編碼融合體的MVA載體/ 病毒優(yōu)選用于加強(qiáng)。另一方面，重組產(chǎn)生的融合蛋白可單獨(dú)用于引發(fā)或加 強(qiáng)。例如，可以用具有SEQIDNO:9或SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的重 組產(chǎn)生的融合蛋白引發(fā)，及用編碼這種融合蛋白的腺病毒載體加強(qiáng)。再例 如，可以用編碼具有SEQIDNO: 9或SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的融合 蛋白的DNA質(zhì)粒引發(fā)，及用編碼這種融合蛋白的MVA病毒顆粒加強(qiáng)。本發(fā)明的組合物也可以與編碼或包含與本發(fā)明的組合物共有的抗原性 結(jié)構(gòu)域(例如NS3、NS4B和/或NS5B多肽的抗原性結(jié)構(gòu)域)的任何現(xiàn)有技術(shù)材 料組合使用。這種材料的來(lái)源很廣泛，包括但非限于肽、蛋白質(zhì)、來(lái)自多
種病毒的病毒載體、質(zhì)粒DNA、蛋白質(zhì)樣顆粒如病毒樣顆粒(Burns et al.， 1994，Mol. Biol. Techno. 1， 137-145),及細(xì)胞材料如經(jīng)照射的細(xì)胞、病毒顆 粒等。例如，特別適用于本發(fā)明的載體是WO2004/111082中描述的腺病毒 和MVA載體，其編碼NS3、 NS4和NS5B。再例如，WO03/097677中描述的 包含NS3、 NS4B和NS5B的抗原性結(jié)構(gòu)域的肽也可用于本發(fā)明中。為了舉例 說(shuō)明，可以用WO2004/111082所述腺病毒顆粒引發(fā)，隨后用SEQIDNO:9 或SEQ ID NO: IO所示重組產(chǎn)生的融合蛋白或者用編碼SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示融合蛋白的MVA載體/病毒加強(qiáng)。再例如，可以用編碼SEQID NO: 9或SEQ ID NO: 10所示融合蛋白的DNA質(zhì)粒引發(fā)，及用WO2004/111082 所述MVA載體加強(qiáng)。然而，本發(fā)明也可以使用其它引發(fā)-加強(qiáng)組合。本發(fā)明還提供了在宿主生物體中誘導(dǎo)或刺激抗HCV免疫應(yīng)答的方法， 包括給予所述生物體本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒顆 粒、宿主細(xì)胞或組合物，以誘導(dǎo)或刺激所述免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以 是特異性和/或非特異性、體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選是 針對(duì)HCV抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。當(dāng)給予動(dòng)物或人生物體時(shí)，本發(fā)明的方法誘導(dǎo)或刺激抗HCV免疫應(yīng)答 的能力可以在體外或體內(nèi)使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的多種測(cè)定方法評(píng)估。關(guān)于可用 于評(píng)估免疫應(yīng)答發(fā)生和激活，見(jiàn)例如Coligan et al. (1992 and 1994, Current Protocols in Immunology ; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health) 所述。細(xì)胞免疫性的測(cè)量可以通過(guò)測(cè)量激活的效應(yīng)細(xì)胞包括衍生自CD4+和 CD8+T-細(xì)胞的那些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(例如通過(guò)ELIspot量化細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-10或IFN力、通過(guò)確定免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活狀態(tài)(例如通過(guò)經(jīng)典fH]胸苷吸 收進(jìn)行T細(xì)胞增殖測(cè)定)、測(cè)定激活的對(duì)象中抗原特異性T淋巴細(xì)胞(例如在 胞毒性測(cè)定中肽特異性細(xì)胞溶解)進(jìn)行。刺激體液應(yīng)答的能力可以通過(guò)抗體 結(jié)合禾卩/或結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)分析確定(見(jiàn)例如Harlow， 1989， Antibodies, Cold Spring HarborPress)。本發(fā)明的方法也可進(jìn)一步在用適當(dāng)?shù)母腥拘曰蛘T導(dǎo)腫瘤的藥 劑(例如表達(dá)NS基因的痘苗病毒)激發(fā)的動(dòng)物模型中驗(yàn)證，以確定所述感染
性或誘導(dǎo)腫瘤的制劑的中和作用，及最后對(duì)于相關(guān)癥狀的部分抗性，反映抗HCV免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)或增強(qiáng)。本發(fā)明組合物的測(cè)試和驗(yàn)證也在所附實(shí)施 例中例證。本發(fā)明還提供了選擇性結(jié)合本發(fā)明的融合蛋白或其肽片段的抗體。如 本文所用，當(dāng)抗體結(jié)合靶肽而不明顯結(jié)合不相關(guān)蛋白質(zhì)時(shí)，稱該抗體選擇 性結(jié)合所述靶肽。在一些情況中，應(yīng)理解盡管存在一定程度的交叉反應(yīng)性， 仍認(rèn)為所述抗體與所述肽的結(jié)合是選擇性的。但是優(yōu)選本發(fā)明的抗體不是 高度親和性或高度選擇性地結(jié)合各個(gè)天然NS多肽及結(jié)合天然構(gòu)型的NS多肽的融合體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)抗體的含義與本領(lǐng)域認(rèn)可的含義一致。本發(fā)明的抗 體包括多克隆抗體和單克隆抗體，以及這種抗體的片段，包括但非限于Fab 或F(ab')2和Fv片段。本發(fā)明的抗體可以使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生，例如給予 動(dòng)物有效量的本發(fā)明融合蛋白和/或其肽片段而產(chǎn)生?？贵w優(yōu)選從本發(fā)明的 融合蛋白的包含獨(dú)特序列的區(qū)域或分離的片段中制備，所述片段如重疊 NS4A與NS3多肽及NS3與NS5B多肽之間的融合位點(diǎn)的那些。本發(fā)明的抗體具有多種潛在用途，這些用途包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。例 如，這種抗體可(a)用作測(cè)定試劑以檢測(cè)本發(fā)明的融合蛋白，(b訴作測(cè)定試 劑以檢測(cè)生物學(xué)樣品中HCV病毒的存在，和/或(c)用作工具以從蛋白質(zhì)混合 物及其它污染物中回收重組產(chǎn)生的本發(fā)明的融合蛋白(例如允許通過(guò)親和 層析或者免疫沉淀方法從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中純化)。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒 顆粒、宿主細(xì)胞、組合物或抗體，檢測(cè)和/或量化取自懷疑感染所述HCV病 毒的生物學(xué)樣品(例如血漿、血清、組織)中HCV病毒或者抗HCV抗體的方 法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法特別適于檢測(cè)和/或量化生物學(xué)樣品 中的HCV病毒，包括至少如下步驟將所述生物學(xué)樣品與至少一種本發(fā)明 的抗體在使得所述病毒與抗體之間形成復(fù)合物的條件下接觸，并通過(guò)合適 方式檢測(cè)和/或量化所述復(fù)合物的形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法特別適于檢測(cè)和/或量化生物學(xué)樣 品中抗HCV抗體，包括至少如下步驟將所述生物學(xué)樣品與至少一種本發(fā) 明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒顆粒、宿主細(xì)胞、組合物在使得抗HCV抗體與本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒顆粒、 宿主細(xì)胞、組合物之間形成復(fù)合物的條件下接觸，并通過(guò)合適方式檢測(cè)和/ 或量化所述復(fù)合物的形成。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定用于本發(fā)明中的抗體、融合蛋白、核酸分子、 載體、感染性病毒顆粒、宿主細(xì)胞、組合物的數(shù)量。檢測(cè)和/或量化病毒的 方法是本領(lǐng)域常規(guī)方法且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，可以利用印跡、 ELISA、所謂的夾心技術(shù)、競(jìng)爭(zhēng)技術(shù)和PCR技術(shù)，特別是所謂的"實(shí)時(shí)"技 術(shù)。本發(fā)明的抗體、融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒顆粒、宿主 細(xì)胞或組合物作為試劑的應(yīng)用，可以通過(guò)與可檢測(cè)的物質(zhì)的結(jié)合(即物理連 接)而便于應(yīng)用?？蓹z測(cè)的物質(zhì)的例子包括各種酶(例如辣根過(guò)氧化物酶、堿 性磷酸酶、p-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶)、輔基(例如鏈霉親和素/生物素， 或者抗生物素蛋白/生物素)、熒光材料(例如7-羥基香豆素、熒光素、或者熒 光素衍生物)、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料(例如熒光素酶、螢光素或水母發(fā)光 蛋白)，及放射性材料(例如1251、 1311、 "S或&)。最后，本發(fā)明涉及本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒 顆粒、宿主細(xì)胞、組合物或抗體在體外診斷生物學(xué)樣品中HCV感染中的應(yīng) 用。本發(fā)明已經(jīng)以例證的方式加以描述，應(yīng)理解所用技術(shù)只是進(jìn)行描述而 非限于此。顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改和改變。因此， 應(yīng)理解在本發(fā)明所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)，可以與本文所述不同的方式進(jìn) 行本發(fā)明。上述所有引用的專(zhuān)利、出版物和數(shù)據(jù)庫(kù)均以其全部?jī)?nèi)容并入本文作參 考，如同這種各個(gè)專(zhuān)利、出版物或數(shù)據(jù)庫(kù)是專(zhuān)門(mén)且單獨(dú)指定并入作參考一 樣。附圖簡(jiǎn)述

圖1示出NS4A-3-5B融合蛋白的氨基酸序列。添加或修飾的氨基酸殘基 以下劃線標(biāo)出，置換的天然殘基在序列下方示出。圖2示出NS4A-3-4B-5B融合蛋白的氨基酸序列。添加或修飾的氨基酸 殘基以下劃線標(biāo)出，置換的天然殘基在序列下方示出。圖3示出經(jīng)優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的編碼NS4A-3-5B融合蛋 白的核苷酸序列。圖4示出經(jīng)優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的編碼NS4A-3-4B-5B融合 蛋白的核苷酸序列。圖5示出經(jīng)優(yōu)化用于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的編碼NS4A-3-5B融合蛋白的 核苷酸序列。圖6示出經(jīng)優(yōu)化用于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的編碼NS4A-3-4B -SB融合蛋白 的核苷酸序列。圖7示出經(jīng)優(yōu)化用于在原核細(xì)胞中表達(dá)的編碼NS4A-3-5B融合蛋白的 核苷酸序列。圖8示出經(jīng)優(yōu)化用于在原核細(xì)胞中表達(dá)的編碼NS4A-3-4B -SB融合蛋白 的核苷酸序列。圖9示出在如下實(shí)施例中舉例說(shuō)明的NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B融合 蛋白的設(shè)計(jì)示意圖。A、 B、 C、 D和E代表可以在NS3、 NS4B和NS5B多肽 中預(yù)知的抗原性結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)W003/097677)。圖10示出gWiz NS4A-3-5B Hs和gWiz NS4A-3-4B-5B Hs表達(dá)載體的構(gòu) 建示意圖。圖ll示出通過(guò)Western印跡檢測(cè)的用gWizNS4A-3-5B (A泳道1和C泳道 3)、 gWiz NS4A-3-4B-5B (B泳道1和C泳道2)禾口gWiz (A泳道2、 B泳道2和C 泳道l)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后的體外表達(dá)。轉(zhuǎn)染的Huh-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小 時(shí)裂解，融合蛋白通過(guò)印跡法使用小鼠單克隆抗NS3 (A和B)或者小鼠單克 隆抗-NS5B (C)抗體檢測(cè)。圖12示出通過(guò)IFNY ELISPOT測(cè)定法評(píng)估在肌內(nèi)注射gWiz NS4A-3-5B Hs之后CD8+T細(xì)胞的NS3特異性應(yīng)答。將各個(gè)小鼠的脾細(xì)胞在存在NS3特異 性肽GLL或者不相關(guān)肽的條件下培養(yǎng)40小時(shí)。結(jié)果以一式三份孔中獲得的 106個(gè)脾細(xì)胞檢測(cè)到的斑點(diǎn)數(shù)的平均值表示。Ml、 M2、 M3和M4代表用gWiz NS4A-3-5B Hs免疫的四只小鼠。Mc是對(duì)照小鼠。圖13示出了融合蛋白從腺病毒感染的細(xì)胞中的表達(dá)。將A549細(xì)胞(L5 X 1(^個(gè)細(xì)胞)以MOI為10分別用不同腺病毒-表達(dá)融合體的腺病毒 AdTG17476和AdTG17477-感染，空腺病毒和不相關(guān)的重組腺病毒作為陰性 對(duì)照感染。將細(xì)胞用10%血清培養(yǎng)48小時(shí)，之后用Laemmli緩沖液裂解。將 蛋白質(zhì)樣品(1/20體積)力卩樣于SDS PAGE電泳凝膠上。通過(guò)Coomassie Blue 檢測(cè)蛋白質(zhì)。泳道l:分子量標(biāo)記；泳道2:未感染的A549細(xì)胞；泳道3:空 腺病毒感染的A549細(xì)胞；泳道4:不相關(guān)腺病毒感染的A549細(xì)胞；泳道5: AdTG17476感染的A549細(xì)胞；泳道6: AdTG17477感染的A 549細(xì)胞。圖14示出在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠中Ad HCV融合蛋白誘導(dǎo)的IFNy Elispot應(yīng)答。將AdTG17476、 AdTG17477或空腺病毒經(jīng)一次肌內(nèi)注射進(jìn)小 鼠脛骨前肌，劑量為109117/小鼠。注射2周后通過(guò)IFNYELISPOT檢測(cè)每組動(dòng) 物的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況(測(cè)試組4只小鼠，對(duì)照組2只小鼠)。存在各個(gè)小鼠 (M1-4)對(duì)于NS3-特異性HLA-A2限制表位GLL (圖14A)和KLT (圖14B)及 NS5B-特異性HLA-A2限制表位KLQ (圖14C)的應(yīng)答。不相關(guān)的肽DLM用作 陰性對(duì)照。如果106個(gè)脾細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)高于50(截?cái)嗑€)，則認(rèn)為ELISPOT應(yīng) 答是陽(yáng)性的。如下實(shí)施例例證了本發(fā)明。實(shí)施例 材料和方法
下述構(gòu)建體根據(jù)如Sambrook et al. (2001， Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)詳述的基因工程和分子克隆的通用技術(shù)制備，或者當(dāng)使用商購(gòu)試劑盒時(shí) 根據(jù)廠商推薦制備。PCR擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見(jiàn)例如PCR Protocols — A guide to Methods and applications, 1990; Ed Innis， Gelfand， Sninsky and White, Academic Press Inc)。使用人Huh-7肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系評(píng)價(jià) 下述實(shí)施例所述的構(gòu)建體對(duì)融合蛋白的正確表達(dá)。培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域常規(guī) 的。為舉例目的，細(xì)胞在含有補(bǔ)加10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和 100IU/ml青霉素/鏈霉素的Dulbecco，s改良的Eagles培養(yǎng)基的完全 DMEM(Sigma)中在5。/。C02氣氛下于37'C生長(zhǎng)。細(xì)胞用Lipofectamine Plus 試劑(Invitmgen)根據(jù)廠商指導(dǎo)轉(zhuǎn)染。針對(duì)NS3和NS5B的小鼠單克隆抗體可 商業(yè)購(gòu)買(mǎi)或可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備。質(zhì)粒構(gòu)建用重疊寡核苷酸產(chǎn)生分別編碼NS4A-NS3-NS5B (3666個(gè)核苷酸)和 NS4A-NS3-NS4B-NS5B (3747個(gè)核苷酸)融合蛋白的合成基因(GeneART， Regensburg, Germany)。融合體的設(shè)計(jì)如圖9所示。核苷酸序列被優(yōu)化以在 人(SEQ ID NO: 11和12及圖3和4)，畢赤氏酵母(SEQ ID NO: 13和14及圖5 和6)和大腸桿菌(SEQ ID NO: 15和16及圖7和8)中高表達(dá)。所得融合體的氨 基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO: 9(NS4A-NS3-NS5B)和SEQ ID NO: 10 (NS4A-NS3-NS4B-NS5B)。將每種合成核苷酸序列克隆進(jìn)pPCR-Script質(zhì)粒 (Stratagene)的Sac/和《; "/限制位點(diǎn)。為了在哺乳動(dòng)物中的瞬時(shí)表達(dá)，將優(yōu)化用于在人中表達(dá)的融合體編碼 基因(SEQ ID NO: 11-12及圖3和4)插入到gWiz表達(dá)載體(Gene Therapy Systems)的&c/和M^/限制位點(diǎn)中，在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，以 產(chǎn)生gWizNS4A-3-5B Hs和gWizNS4A-3-4B-5B Hs載體(圖10)。該序列然 后用SEQ ID NO: 17所示寡核苷酸(5，-ATG TAC GTC GAC CACC ATG GGC AGC GTG GTG ATT GTG GGC CGG ATC 3')修飾以改進(jìn)Kozak共有序列，
并用SEQ ID NO: 18所示寡核苷酸(5，-CAT GTA GC GGC CGC TCA TCA TCT AGG CCT GGC CCT GGA CAG-3，)修飾以產(chǎn)生終止密碼子(黑體)。所 有質(zhì)粒用測(cè)序驗(yàn)證。 體外表達(dá)研究,/，伊跡分析轉(zhuǎn)染前一天，將Huh-7 (5 x 105每孔)鋪板進(jìn)6孔板。細(xì)胞用gWiz NS4A-3-5B Hs, gWiz NS4A-3-4B-5B Hs載體或作為陰性對(duì)照的gWiz質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞在50mM Tris-HCl， 150mM NaCl, 0.1% SDS， 1% NP40和0.5%脫氧膽酸鈉中裂解。裂解物樣品在95'C加熱5分鐘，在 SDS-8。/。聚丙烯酰胺上電泳分離蛋白質(zhì)。用特異于NS3的小鼠單克隆抗體 (例如8G4C3,bioM&ieux)或特異于NS5B的小鼠單克隆抗體(例如11F6C8， bioM6rieux)作為第一抗體，之后用山羊抗小鼠IgG-過(guò)氧化物酶抗體(Sigma) 作為第二抗體進(jìn)行免疫印跡。信號(hào)用商業(yè)ECL試劑盒(AmershamBiosciences) 顯不。^瘦炎為分杯轉(zhuǎn)染前一天，將蓋玻片置于6孔板中并用0.2%明膠處理10分鐘，然 后將5xl05Huh-7細(xì)胞鋪板進(jìn)每孔中。將細(xì)胞單層用gWizNS4A-3-5B Hs， gWiz NS4A-3-4B-5B Hs載體或作為陰性對(duì)照的gWiz質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，蓋玻片在PBS中洗2次，細(xì)胞用4WPFA固定10分鐘，然后用在PBS 中的0.1。/。TritonX-100洗滌和透化10分鐘。洗滌蓋玻片并用特異于NS3的 小鼠單克隆抗體(例如8D8El,bioM6rieux)或特異于NS5B的小鼠單克隆抗 體(例如5B-12B7 provided by D. Moradpour)提供作為第一抗體在室溫處理1 小時(shí)。洗滌后，加入TRITC抗小鼠IgG(Dako)30分鐘。洗滌后，蓋玻片在 80。/。甘油中固定(mounted)。用Carl Zeiss Axioplan顯微鏡觀測(cè)熒光(Lames) 并用AxioCam Color數(shù)碼相機(jī)取圖像。體內(nèi)表達(dá)研究
喂養(yǎng)根據(jù)Pascolo et al. (1997， J. of Experimental Medicine 185, 2043-205l)所述產(chǎn)生的HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠敲除了 H-2Db和小 鼠P2-微球蛋白基因并表達(dá)轉(zhuǎn)基因單鏈組織相容性I類(lèi)分子，其中人(32m 的C末端與嵌合重鏈(HLA-A2.1 al-a2, H-2Db a3跨膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域) 的N末端共價(jià)連接。在質(zhì)粒注射5天前，用10 fiM心臟毒素(Latoxan)預(yù)處理HLA-A2轉(zhuǎn) 基因小鼠。以lOOiag劑量(于100pllXPBS中)以2周間隔肌肉內(nèi)注射gWiz NS4A-3-5B, gWIZNS4A-3-4B-5B和gWiz (陰性對(duì)照)質(zhì)粒2次。在第二次 免疫后2周如Himoudi et al. (2002, J. Virol. 76, 12735-46)所述研究HLA-A2 限制的008+-丁細(xì)胞應(yīng)答。淑^s7w ,/定層Jl艦芬脾細(xì)胞(2 x 1()5)在用抗小鼠IFNy單克隆抗體(Pharmingen; 10 )ig/ml) 包被的Multiscreen平板(Millipore)中的一式三份的孔中培養(yǎng)40小時(shí)，所述 細(xì)胞培養(yǎng)在完全aMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中，在所述培養(yǎng)基中單獨(dú)存在10 單位/ml重組IL-2(PeproTechlnc，England)的孔作為陰性對(duì)照，存在5 ng/ml Concavalin A的孔作為陽(yáng)性對(duì)照，另一孔的培養(yǎng)基中含有10 jiM肽(DLM 無(wú)關(guān)肽，位于NS3蛋白中的GLL肽，如Martin et al" 2004， J. Med. Virol. 74, 397-405和Himoudi et al.， 2002, J. Virol. 76, 12735-46所述)。產(chǎn)生IFNy的細(xì) 胞用先前所述(Himoudi et al., 2002， J. Virol. 76， 12735-46)的細(xì)胞因子特異性 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定(ELISPOT)量化。從含有肽的測(cè)試孔的斑點(diǎn)數(shù)中減去在 陰性對(duì)照孔中的斑點(diǎn)數(shù)(代表個(gè)體產(chǎn)生IFNy的細(xì)胞)。結(jié)果以得自三份孔的 平均值表示。實(shí)施例1: NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B多蛋白的體外表達(dá) 編碼融合蛋白NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B的序列如圖9所示構(gòu)建。
序列被優(yōu)化以用于分別在三種不同的宿主(GeneART, Regensburg, Germany),人(Hs)，巴斯德畢赤氏酵母(Pp)和大腸桿菌(Ec)中表達(dá)，如下 所列優(yōu)化用于在人中表達(dá)的NS4A-3-5B Hs (SEQIDNO: ll和圖3) 優(yōu)化用于在畢赤氏酵母中表達(dá)的NS4A-3-5B Pp (SEQ ID NO: 13和圖 5)優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)的NS4A-3-5B Ec (SEQIDNO: 15和圖7) 優(yōu)化用于在人中表達(dá)的NS4A-3-4B-5B Hs (SEQIDNO: 12和圖4) 優(yōu)化用于在畢赤氏酵母中表達(dá)的NS4A-3-4B-5B Pp (SEQ ID NO: 14和 圖6)優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)的NS4A-3-4B-5B Ec (SEQ ID NO: 16和圖 8)編碼NS4A-NS3-NS4B-NS5B和NS4A-NS3-NS5B融合體的優(yōu)化用于在 人中表達(dá)的序列被克隆到gWiz表達(dá)載體(GeneTherapy Systems)中處于巨細(xì) 胞病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下(圖10)。 NS融合蛋白的表達(dá)通過(guò)Westem印跡和 用gWiz NS4A-3-5B Hs, gWiz NS4A-3-4B-5B Hs載體或作為陰性對(duì)照的 gWiz質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh-7細(xì)胞中的免疫熒光評(píng)價(jià)。如圖1 l所示，在用抗NS3(圖11A和7B)或抗NS5B(圖11C)特異性抗體檢 測(cè)后，Westem印跡分析揭示了針對(duì)每個(gè)個(gè)體融合體的具有約135kDa的預(yù)期 分子量的獨(dú)特條帶(圖11A泳道l和圖11C泳道3，針對(duì)短的NS4A-3-5B融合 體；圖11B泳道l和圖11C泳道2，針對(duì)長(zhǎng)的NS4A-3-4B-5B融合體)。如所預(yù) 期的，在得自用gWiz質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hnh-7細(xì)胞的樣品中沒(méi)有檢測(cè)到蛋白(圖 11A泳道2，圖11B泳道2和圖11C泳道l)。這些結(jié)果證實(shí)短的融合體 NS4A-NS3-NS5B和額外摻入NS4B的長(zhǎng)的融合體在Huh-7細(xì)胞中表達(dá)。免疫熒光分析證實(shí)兩個(gè)融合蛋白在Huh-7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)。令人 感興趣地，兩個(gè)融合蛋白均顯示細(xì)胞質(zhì)定位，提示缺失大部分疏水性膜錨 定結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的正確加工。用gWiz質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不顯示任何信號(hào)。 實(shí)施例2: gWIZ NS4A-3-5B Hs和NS4A-3-4B-5B Hs免疫原性的體內(nèi)評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)質(zhì)粒gWizNS4A-3-5B Hs和NS4A-3-4B-5B Hs在HLA-A2轉(zhuǎn)基 因小鼠中誘導(dǎo)008+-丁細(xì)胞應(yīng)答的能力，如材料和方法中所述在^八-八2轉(zhuǎn)基 因小鼠中進(jìn)行免疫原性研究。在第二次免疫后2周經(jīng)IFNYELISP0T測(cè)定研究 見(jiàn)八-八2限制的008+-丁細(xì)胞應(yīng)答。如圖12所示，pgWizNS4A-3-5B能夠誘 導(dǎo)特異于HLA-A2限制的公知免疫顯性GLL肽(NS3蛋白，Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405)的產(chǎn)生IFNy的T細(xì)胞，提示這一表位的正確呈遞。還可以使用臨床前小鼠攻擊測(cè)定以評(píng)價(jià)融合蛋白的保護(hù)性免疫。由于 小鼠不能被HCV病毒直接感染，這些測(cè)定采用表達(dá)HCVNS抗原的重組痘苗 病毒(WR株)或李斯特菌。注射痘苗病毒或李斯特菌后，小鼠產(chǎn)生感染，在 注射后2-6天達(dá)到峰值，導(dǎo)致在注射的小鼠的卵巢(痘苗病毒模型)或肝臟(李 斯特菌模型)中檢測(cè)到病毒或細(xì)菌。臨床前評(píng)價(jià)涉及用候選疫苗(給予重組融 合蛋白或表達(dá)融合蛋白的腺病毒顆粒)、對(duì)照(例如給予天然構(gòu)型的NS多肽 的融合體)和陰性構(gòu)建體(例如非HCV抗原或空腺病毒)免疫小鼠。動(dòng)物隨后 用表達(dá)所有HCV NS抗原(NS2至NS5)的重組痘苗病毒或表達(dá)包括在候選疫 苗中的NS抗原之一的李斯特菌攻擊。如果疫苗成功引起特異性T細(xì)胞，被 攻擊的小鼠將產(chǎn)生對(duì)痘苗病毒或李斯特菌載體或?qū)S抗原的免疫應(yīng)答。候 選疫苗的保護(hù)性活性將導(dǎo)致與在未免疫的小鼠的卵巢或肝臟中測(cè)得的痘苗 病毒或李斯特菌效價(jià)相比降低的在免疫的小鼠的卵巢或肝臟中測(cè)得的痘苗 病毒或李斯特菌效價(jià)。實(shí)施例3: NS4A-3-5B和NS4A-3-4B-5B融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)相應(yīng)于NS4A-NS3-NS5B (3666個(gè)核苷酸)和NS4A-NS3-NS4B-NS5B (3747個(gè)核苷酸)的經(jīng)優(yōu)化用于在人中表達(dá)的融合體編碼合成基因(SEQ ID NO: 11-12)經(jīng)PCR從相應(yīng)的pPCR-Script質(zhì)粒中擴(kuò)增出，使用下述引物 OTG18033 (GGGGGGCTAGCGCCACCATGGGCAGCGTGGTGATTG ; SEQ ID NO: 19) 禾卩 OTG18036(GGGGGGGTACCCTCATCATCTAGGCCTGGCCCTG; SEQ ID NO: 20)。 兩個(gè)片段被插入到含有由腺病毒序列(腺病毒核苷酸l-458和核苷酸 3328-5788)圍繞的CMV驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒的腺病毒穿梭質(zhì)粒的A^d和X/ "I限制 位點(diǎn)中，以通過(guò)同源重組產(chǎn)生載體基因組(Chartier et al.， 1996, J. Virol. 70， 4805-4810)。所得的腺病毒載體是E3(核苷酸28592-30470)和El(核苷酸 459-3511)缺失的，El區(qū)由表達(dá)盒置換，該表達(dá)盒從5，到3，含有CMV立即早 期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、嵌合人P-球蛋白/IgG內(nèi)含子(在得自Promega的pCI載體 中發(fā)現(xiàn)的)、編碼兩種多蛋白形式之一種的序列和SV40晚期聚腺苷酸化信 號(hào)。所得腺病毒載體命名為pTG17476 (NS4A-3-4B-5B)和pTG17477 (NS4A-3-5B)。通過(guò)將尸ac/線性化病毒基因組轉(zhuǎn)染進(jìn)常規(guī)El互補(bǔ)細(xì)胞系而產(chǎn) 生重組腺病毒AdTG17476和AdTG17477。如先前所述(Erbs, 2000, Cancer Res. 60,3813-3822)進(jìn)行病毒繁殖、純化和滴定。融合蛋白的表達(dá)在腺病毒感染的細(xì)胞中經(jīng)SDS PAGE電泳評(píng)價(jià)。將 A549細(xì)胞(1.5xl()6細(xì)胞)(ATCC CCL-185)以MOI 10或100用融合表達(dá)腺病 毒AdTG17476和AdTG17477以及作為陰性對(duì)照的空腺病毒和無(wú)關(guān)重組腺病 毒進(jìn)行感染。細(xì)胞用10%血清培養(yǎng)48小時(shí)，之后用Laemmli緩沖液裂解。蛋 白質(zhì)樣品(1/20體積)上樣至SDS PAGE電泳凝膠上并且用考馬斯藍(lán)染色蛋白 質(zhì)。如圖13所示，在用AdTG17476和AdTG17477感染的細(xì)胞中觀察到具有 大約135kDa的預(yù)期分子量的獨(dú)特條帶(泳道5和6)，反映了在用融合體編碼 腺病毒載體感染的細(xì)胞中的高表達(dá)水平。另一方面，這一條帶在收集自用 陰性對(duì)照感染的細(xì)胞的樣品中不存在(泳道3和4)，在未感染的A549細(xì)胞中 也不存在(泳道2)。在以MOI為10用病毒構(gòu)建體感染48小時(shí)的A549細(xì)胞中經(jīng)Westem印跡 分析了表達(dá)水平。收集細(xì)胞沉淀并用抗NS3小鼠單克隆抗體(例如1B6， bioMerieux)和抗NS4兔多克隆抗體(例如RB, bioMerieux)探查。在用抗NS3 或抗NS4特異性抗體檢測(cè)后在收集自用AdTG17476和AdTG17477感染的細(xì) 胞的樣品中揭示了具有預(yù)期分子量的主條帶，證實(shí)了用考馬斯藍(lán)染色后檢 測(cè)到的表達(dá)水平。實(shí)施例4:表達(dá)HCV多蛋白的腺病毒在HLA A2轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫原性動(dòng)物模型HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠根據(jù)Pascolo et al. (1997， J Ex Med)所述產(chǎn)生。這 些小鼠敲除了H-2Db和小鼠&微球蛋白基因并表達(dá)轉(zhuǎn)基因單鏈組織相容性I 類(lèi)分子，其中人p2m的C末端與嵌合重鏈(HLA-A2.1 al-a2， H-2Db a3跨膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域)的N末端共價(jià)連接。 免疫方案三組小鼠包括在方案中，分別有4只小鼠注射AdTG17476 (Ad NS4A-3-4B-5B),4只小鼠注射AdTG17477(AdNS4A-3-5B)， 2只對(duì)照小鼠注 射空Ad(Ad1514)。以在10(V1 1XPBS中10"U的劑量將腺病毒在脛骨前肌 中注射1次。注射后2周研究細(xì)胞應(yīng)答。免疫應(yīng)答的監(jiān)測(cè)五丄/5TOr粼定收集每組小鼠的脾細(xì)胞并裂解紅血細(xì)胞。將2.105個(gè)細(xì)胞在用抗小鼠 IFNy單克隆抗體(Pharmingen; 10 pg/ml)包被的Multiscreen平板(Millipore) 中的三份孔中培養(yǎng)40小時(shí)，培養(yǎng)在完全aMEM培養(yǎng)基(GIBCOBRL)中， 其中在所述培養(yǎng)基中單獨(dú)存在10單位/ml重組小鼠IL-2 (PeproTech Inc, England)的孔作為陰性對(duì)照，另一孔中所述培養(yǎng)基中含有10 pM肽(DLM無(wú) 關(guān)肽，位于NS3蛋白中的GLL和KLT肽，位于NS5B蛋白中的KLQ肽 (Martin et al.， 2004, J Med Virol. 74, 397-405)和(Himoudi et al., 2002， J Virol" 76,12735-12746))，在所述培養(yǎng)基中含有5 jig/ml Concavalin A的孔作為陽(yáng)性 對(duì)照。產(chǎn)IFN/T細(xì)胞用先前所述(Himoudi et al., J Virol 2002)的細(xì)胞因子特 異性酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定(ELISPOT)量化。從含有肽的測(cè)試孔的斑點(diǎn)數(shù)中減 去在陰性對(duì)照孔中的斑點(diǎn)數(shù)(代表個(gè)體產(chǎn)IFNyT細(xì)胞)。結(jié)果以得自三份孔 的平均值表示。
結(jié)果HLA-A2限制的T細(xì)胞應(yīng)答在腺病毒免疫后2周經(jīng)IFNYELISPOT測(cè)定 進(jìn)行了研究。如圖14所示，AdTG17476和AdTG17477在所有免疫動(dòng)物中 均能誘導(dǎo)高頻率特異于HLA-A2限制的GLL表位的產(chǎn)IFNfT細(xì)胞(圖14A; 中位值:分別為1210和868個(gè)斑點(diǎn))，AdTG17476具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著更高的效 率(Mann-Whitney檢驗(yàn):P=0，0209)。兩個(gè)病毒還誘導(dǎo)特異于亞優(yōu)勢(shì)KLT表位 的產(chǎn)IFNyT細(xì)胞(圖14B)，頻率較低(中位值187和卯個(gè)斑點(diǎn))。另外，用 AdTG 17476免疫的2:4小鼠和用AdTG 17477免疫的1:4小鼠產(chǎn)生耙向NS5B 蛋白的KLQ表位的應(yīng)答(圖14C)。這表明本發(fā)明的融合蛋白可以在真核系統(tǒng)中高水平產(chǎn)生，且所得蛋白 質(zhì)在常規(guī)的動(dòng)物模型中是免疫原性的。
權(quán)利要求
1. 一種分離的融合蛋白，其包含至少三個(gè)源自丙型肝炎病毒(HCV)的NS多肽，其中所述NS多肽在所述融合蛋白中的順序構(gòu)建為不同于它們?cè)谔烊粯?gòu)型中呈現(xiàn)的順序。
2. 權(quán)利要求1的分離的融合蛋白，其中每個(gè)NS多肽之間的融合是直接融 合或者通過(guò)接頭融合。
3. 權(quán)利要求1或2的分離的融合蛋白，其中所有NS多肽均源自同一HCV 毒株或分離株。
4. 權(quán)利要求1或2的分離的融合蛋白，其中至少兩個(gè)NS多肽源自不伺的 HCV毒株或分離株。
5. 權(quán)利要求1—4任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其包含NS4A多肽、NS3多 肽和NS5B多肽，且NS4A在所述融合蛋白的N末端，NS5B在所述融合蛋白 的C末端。
6. 權(quán)利要求1一4任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其包含NS4A多肽、NS3多 肽、NS4B多肽和NS5B多肽，且NS4A在所述融合蛋白的N末端，NS5B在所 述融合蛋白的C末端。
7. 權(quán)利要求1一6任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS3多肽相對(duì)于天 然NS3多肽進(jìn)行了修飾，以呈現(xiàn)顯著降低的蛋白酶活性。
8. 權(quán)利要求1—7任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS3多肽相對(duì)于天 然NS3多肽進(jìn)行了修飾，以呈現(xiàn)顯著降低的解旋酶活性。
9. 權(quán)利要求1一8任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS5B多肽相對(duì)于 天然NS5B多肽進(jìn)行了修飾，以呈現(xiàn)顯著降低的RNA依賴性RNA聚合酶活 性。
10. 權(quán)利要求1一9任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白不包含 通常存在于天然HCV多蛋白前體NS3/NS4A、 NS4A/NS4B、 NS4B/NS5A和 NS5A/NS5B交界處的一或多個(gè)NS3識(shí)別的裂解位點(diǎn)。
11. 權(quán)利要求l一IO任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS4A、 NS4B和/或NS5B多肽被修飾，以缺失通常參與天然NS4A、 NS4B禾口/或NS5B多肽 的膜錨定的一或多個(gè)疏水性結(jié)構(gòu)域。
12. 權(quán)利要求1一ll任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS3多肽源自如 SEQ ID NO: 1所示的天然NS3蛋白，所述NS3多肽經(jīng)至少如下方式修飾從而 其保留從第12 —56位、第70—155位、及第218—248位的部分； 其包含在第57位的His殘基由不同于His的氨基酸殘基如Ala殘基的取代； 其包含在第269位的Thr殘基由不同于Thr的氨基酸殘基如Ala殘基的取代； 其包含在第464位的Arg殘基由不同于Arg的氨基酸殘基如Ala殘基的 取代；并且 其在第631位不包含Thr殘基。
13. 權(quán)利要求12的分離的融合蛋白，其中所述NS3多肽包含SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列。
14. 權(quán)利要求1一13任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS4A多肽源自 如SEQ ID NO: 2所示的天然NS4A蛋白，所述NS4A多肽經(jīng)至少如下方式修 飾從而 其含有SEQIDNO:2的第21 — 33位的部分； 其不含有SEQIDNO:2的從第l一20位的部分。
15. 權(quán)利要求14的分離的融合蛋白，其中所述NS4A多肽基本上由前面為 起始子Met殘基的SEQIDNO: 6的氨基酸序列組成。
16. 權(quán)利要求1一15任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS4B多肽源自 如SEQ ID NO: 3所示的天然NS4B蛋白，所述NS4B多肽經(jīng)至少如下方式修飾 從而 其包含從第78位Ser殘基至第109位Leu殘基的部分； 其不包含第261位的Cys殘基。
17. 權(quán)利要求16的分離的融合蛋白，其中任選的NS4B多肽基本上由SEQID NO: 7所示氨基酸序列組成。
18. 權(quán)利要求1 —17任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述NS5B多肽源自 如SEQIDNO: 4所示的天然NS5B蛋白，所述NS5B多肽經(jīng)至少如下方式修飾 從而 其包含從第155位Arg殘基至第182位Leu殘基的部分； ，其包含在第220位的Asp殘基由不同于Asp的氨基酸殘基如Asn殘基的取代； 其包含在第318位的Asp殘基由不同于Asp的氨基酸殘基如Asn殘基的取代； 其不包含從第571位Trp殘基至第591位Arg殘基的部分。
19. 權(quán)利要求18的分離的融合蛋白，其中所述多肽包含如SEQIDNO: 8 所示的氨基酸序列。
20. 權(quán)利要求12—19任一項(xiàng)的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含 與SEQ ID NO: 9或10所示氨基酸序列同源或相同的氨基酸序列。
21. —種編碼權(quán)利要求1一20任一項(xiàng)的融合蛋白的分離的核酸分子。
22. 權(quán)利要求21的分離的核酸分子，其包含在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá) 得以優(yōu)化的核苷酸序列。
23. 權(quán)利要求22的分離的核酸分子，其包含與SEQIDNO: ll或SEQID NO: 12所示核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列。
24. 權(quán)利要求21的分離的核酸分子，其具有在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)得以 優(yōu)化的核苷酸序列。
25. 權(quán)利要求24的分離的核酸分子，其中所述酵母宿主細(xì)胞選自釀酒酵 母、Saccharomycespombe和巴斯德畢赤氏酵母組成的組。
26. 權(quán)利要求25的分離的核酸分子，其包含與SEQIDNO: 13或SEQ ID NO: 14所示核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列。
27. 權(quán)利要求21的分離的核酸分子，其具有經(jīng)優(yōu)化以用于在原核宿主細(xì) 胞中表達(dá)的核苷酸序列。
28. 權(quán)利要求27的分離的核酸分子，其包含與SEQIDNO: 15或SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列。
29. —種載體，包含權(quán)利要求21—28任一項(xiàng)的核酸分子的一或多個(gè)拷貝。
30. —種感染性病毒顆粒，其包含權(quán)利要求21 —28任一項(xiàng)的核酸分子或 者權(quán)利要求29的載體。
31. —種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求21—28任一項(xiàng)的核酸分子或者權(quán)利 要求29的載體或者權(quán)利要求30的感染性病毒顆粒。
32. —種重組產(chǎn)生權(quán)利要求1一20任一項(xiàng)的融合蛋白的方法，所述方法包括(a) 將權(quán)利要求29的載體或者權(quán)利要求30的感染性病毒顆粒導(dǎo)入宿主 細(xì)胞中，產(chǎn)生權(quán)利要求31的經(jīng)轉(zhuǎn)染或感染的宿主細(xì)胞，(b) 將所述轉(zhuǎn)染或感染的宿主細(xì)胞在適于所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下 在體外培養(yǎng)；(c) 從所述細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述融合蛋白；和(d) 任選純化回收的融合蛋白。
33. —種組合物，其包含權(quán)利要求1一20任一項(xiàng)的融合蛋白、權(quán)利要求21 一28任一項(xiàng)的核酸分子、權(quán)利要求29的載體、權(quán)利要求30的感染性病毒顆 粒、權(quán)利要求31的宿主細(xì)胞或者其任意組合。
34. 權(quán)利要求1一20任一項(xiàng)的融合蛋白、權(quán)利要求21—28任一項(xiàng)的核酸 分子、權(quán)利要求29的載體、權(quán)利要求30的感染性病毒顆粒、權(quán)利要求31的 宿主細(xì)胞或者權(quán)利要求33的組合物在制備用于治療或預(yù)防HCV感染、HCV 相關(guān)疾病和病變的藥物中的應(yīng)用。
35. 權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用根據(jù)引發(fā)-加強(qiáng)治療方案(prime boost therapeutic modality)進(jìn)行，其中權(quán)利要求33的組合物用于引發(fā)或者加 強(qiáng)或者既引發(fā)又加強(qiáng)抗HCV免疫應(yīng)答。
36. 權(quán)利要求34或35的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用與使用一或多種HCV藥物的 化療聯(lián)合進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的融合蛋白，其包含至少三個(gè)源自丙型肝炎病毒的NS多肽，它們?cè)谒鋈诤系鞍字械捻樞驑?gòu)建為不同于它們?cè)谔烊粯?gòu)型中呈現(xiàn)的順序。本發(fā)明還涉及編碼這種融合蛋白的核酸分子及包含這種核酸分子的載體。本發(fā)明還提供了包含這種核酸分子或這種載體的感染性病毒顆粒及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及重組產(chǎn)生這種融合蛋白的方法。最后，本發(fā)明還提供了包含這種融合蛋白、核酸分子、載體、感染性病毒顆粒及宿主細(xì)胞的藥物組合物，及這種組合物在治療或者預(yù)防HCV感染、HCV相關(guān)疾病和病變中的應(yīng)用，以及在宿主生物體中誘導(dǎo)或刺激抗HCV免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101400366SQ200780007977
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者A·富爾尼利爾, F·佩寧, G·安紹斯普, L·喬特爾 申請(qǐng)人:特蘭斯吉恩股份有限公司