專利名稱:重組人纖溶酶原k5的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,更具體地,本發(fā)明提供了一種高密度、高效的重組
人纖溶酶原K5表達(dá)工藝。
背景技術(shù):
現(xiàn)在,癌癥病人仍主要依賴手術(shù)或放療來(lái)切除腫瘤或使原發(fā)瘤消退,再緊接著 進(jìn)行放化療,以消除體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞。然而,正常細(xì)胞也對(duì)化療藥物敏感,而且 癌細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定,經(jīng)常暴露于化療下最終導(dǎo)致抗藥性。腫瘤治療的另一方法是 間接策略,即抗血管生成治療,它不直接破壞腫瘤,而是通過(guò)限制腫瘤的血液供給, 使腫瘤阻止腫瘤生長(zhǎng)或使其消退。應(yīng)用這一策略,腫瘤學(xué)家的注意力就不僅僅局限 于單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞本身,而是總體腫瘤組織,尤其是血管生成過(guò)程。基于這種概念, 人們采用新方法來(lái)尋找新型抗癌藥物。
人纖溶酶原(plasminogen) K5具有特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移的活性。同 時(shí),它以劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細(xì)胞周期的阻滯,使其不能進(jìn)入S期,并引起內(nèi) 皮細(xì)胞的凋亡。因此,K5可能是一種更有潛力的抗血管生成蛋白,具有抗腫瘤的活 性。
MMP-3可以特異性地水解Pgn,產(chǎn)生三個(gè)片段55KD的包含Kl-K4的angiostatin 樣片段,包含K5的14KD的片段以及包含絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的30KD片段。從人Pgn 水解片段得到的K5,對(duì)BCE細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(ED50)約為50 — 60nM,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 angiostatin的140nM。因此,K5似乎比angiostatin更能抑制bFGF刺激的BCE細(xì)胞生
長(zhǎng)。用大腸桿菌表達(dá)正確折疊的重組鼠K5,抑制活性與水解片段得到的人纖溶酶原 K5相似。在內(nèi)皮細(xì)胞遷移方面,重組K5蛋白同樣具有抑制作用,其IC50約為500nM。 K5的發(fā)現(xiàn),可更好地了解Pgn的聯(lián)環(huán)區(qū)在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生方面的作用。
本發(fā)明人在畢赤酵母系統(tǒng)中首次表達(dá)了人源PgnK5 (hK5)?;钚詼y(cè)定表明,hK5 可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成。而且,酵母表達(dá)的重組hK5在小鼠體內(nèi)表 現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性。同時(shí),我們實(shí)現(xiàn)了hK5的高效分泌表達(dá)(搖瓶表達(dá)量超過(guò) 150mg/L發(fā)酵液),為進(jìn)一步研究hK5作用機(jī)理和可能的臨床應(yīng)用創(chuàng)造了良好條件.
以陽(yáng)性克隆建立原始種子庫(kù),該種子庫(kù)的檢測(cè)表明無(wú)外源因子污染,各項(xiàng)生化 指標(biāo)達(dá)到要求,表達(dá)水平達(dá)到要求。本發(fā)明提供了一種重組人纖溶酶原K5的新型發(fā) 酵方法,采用畢赤酵母以分泌形式表達(dá),通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝,萆個(gè)過(guò)程穩(wěn)定、快速、 簡(jiǎn)便,獲得高密度、高表達(dá)水平的重組人纖溶酶原K5。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高密度的重組人纖溶酶原K5的表達(dá)方案。包括用于 該方案的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件。
在本發(fā)明的第一方面,提供了一種重組人纖溶酶原K5的中試生產(chǎn)方法,該方法 包括步驟
a) 在適合的表達(dá)條件下,在搖瓶中培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體,從而 以分泌形式表達(dá)出重組人纖溶酶原K5; .
b) 在適合的表達(dá)條件下,在5L發(fā)酵罐中優(yōu)化出最佳中試生產(chǎn)方案。
在本發(fā)明的二方面,提供了一種工程菌,其特征在于,它含有編碼人纖溶酶原 K5的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中,所述的工程菌是畢赤酵母。
無(wú)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的K5序列,按照尸/c/n'"酵母密碼子偏愛(ài)性在不改變氨基 酸序列的條件下,人工合成重組K5基因的全序列.發(fā)明人通過(guò)深入、廣泛的研究, 通過(guò)對(duì)重組人纖溶酶原K5的一系列優(yōu)化表達(dá)實(shí)驗(yàn),為上罐發(fā)酵確定了基本工'藝條件; 然后該工藝又通過(guò)在發(fā)酵罐水平(5L)進(jìn)行了不斷地優(yōu)化與驗(yàn)證,最終確定了本工 程菌穩(wěn)定的發(fā)酵工藝,通過(guò)表達(dá)穩(wěn)定性研究,獲得了能在畢赤酵母表達(dá)體系中穩(wěn)定 高效表達(dá)的重組人纖溶酶原K5。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
搖瓶發(fā)酵的目的主要是在盡可能與發(fā)酵罐條件相近的條件下,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn) 如培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)菌密度等情況,摸索并確立初步的發(fā)酵工藝為-采用低鹽培養(yǎng)基、誘導(dǎo)pH為5.0。搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化為中試上罐研究提供一定的數(shù) 據(jù)參考。
初步完成中試實(shí)驗(yàn),得到一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為后期中試穩(wěn)定高表達(dá)工藝提供一 定的數(shù)據(jù)參考,為以后進(jìn)一步優(yōu)化中試工藝提供依據(jù)。以5L發(fā)酵罐,工作體積為3L。 按照5L罐發(fā)酵工藝線性放大,確定并穩(wěn)定中試發(fā)酵工藝,該工藝經(jīng)過(guò)連續(xù)多批中試 規(guī)模(5L體積),證實(shí)工藝穩(wěn)定。對(duì)重組人纖溶酶原K5上罐工藝研究,在5L發(fā)酵罐 穩(wěn)定工藝的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了連續(xù)三批的工藝放大,每升發(fā)酵液衾達(dá)重組人纖溶酶原 K5量可達(dá)1400mg,批與批之間工藝穩(wěn)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中,提供了罐體補(bǔ)料的最佳方案。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中,證實(shí)該發(fā)酵工藝是穩(wěn)定、成熟而且高水平的。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中,提供了中試發(fā)酵工藝優(yōu)化最佳方案。
中試研究表明,產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)單,周期短,成本低,每升發(fā)酵液 表達(dá)重組人纖溶酶原K5量可達(dá)1400mg,適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 此方案具有高穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)。對(duì)此高密度高效表達(dá)方法進(jìn)行了發(fā)酵工藝 穩(wěn)定驗(yàn)證,證實(shí)該工藝穩(wěn)定性好。
(2) 通過(guò)控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件,使表達(dá)水平較高。
(3) 發(fā)酵工藝簡(jiǎn)便,表達(dá)量高。
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常 按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例l在YPD培養(yǎng)基中小搖表達(dá)研究
挑取表達(dá)菌株單菌落,接種含20mlYPD-甘油培養(yǎng)基的100ml搖瓶,3(TC培
養(yǎng)48小時(shí)(菌液OD,》0),離心菌液,棄上清;重懸菌體于20mlYPD-甲醇培養(yǎng) 基,3CTC繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí),每隔24小時(shí)按培養(yǎng)液1%的體積補(bǔ)充無(wú)水甲醇,每隔 12小時(shí)取樣,離心,SDS-PAGE檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的YhK5表達(dá)量。
從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來(lái)看,K5在YPD培養(yǎng)基中有較好的表達(dá),不用在摸索其他 培養(yǎng)基配方了;在誘導(dǎo)36小時(shí)后有較多的表達(dá),此后,表達(dá)量逐漸升高,48-60小 時(shí),表達(dá)產(chǎn)物積累達(dá)到峰值;放大重復(fù)該實(shí)驗(yàn),如果能得到相似的結(jié)果,就能提供 足夠的含K5的發(fā)酵液供純化實(shí)驗(yàn)研究。
實(shí)施例2中試條件優(yōu)化整合摸索
取單克隆,接種到BMGY—級(jí)種子液中,培養(yǎng)19-22hr,0D6。。為2. 5-3. 9;按1:20 的比例二級(jí)接種于l瓶300mlBMGY的lL三角燒瓶中,培養(yǎng)6 8hr, OD,為l. 5-2. 5, 上罐發(fā)酵初始pH 5.0,誘導(dǎo)pH 5.0、溫度30。C、 DO>35%,待溶氧上升后以15轉(zhuǎn)度 流加50。/。甘油300ml,待甘油耗盡,溶氧再次上升后用100%甲醇以轉(zhuǎn)度1開(kāi)始誘導(dǎo), 逐漸提速,誘導(dǎo)后每隔4hr留樣離心-20'C凍存,誘導(dǎo)48hr結(jié)束。樣品檢測(cè)SDS-PAGE、 蛋白含量。
實(shí)施例3中試發(fā)酵工藝優(yōu)化
按照5L罐發(fā)酵工藝線性放大,工作體積3L,進(jìn)行連續(xù)3批中試生產(chǎn)。 1工程菌培養(yǎng)階段優(yōu)化結(jié)果
培養(yǎng)基低鹽培養(yǎng)基 接種比例1:20
擴(kuò)增溫度30°C 擴(kuò)增階段pH: 5.0
起始D02:》35°/。
通氣量1 1. 5L/min/L培液
擴(kuò)增時(shí)間19 22hr
pH調(diào)節(jié)氨水
2工程菌誘導(dǎo)階段優(yōu)化結(jié)果-
誘導(dǎo)階段pH: 5.0
誘導(dǎo)溫度30°C
起始轉(zhuǎn)速200rpm
連動(dòng)轉(zhuǎn)速200 600rpm
補(bǔ)料初始轉(zhuǎn)度15
誘導(dǎo)階段DO:》35% 誘導(dǎo)時(shí)間48hr;
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單. 獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利 要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種人纖溶酶原(plasminogen)K5(K5)的生產(chǎn)方法,其特征在于,該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下,在搖瓶中培養(yǎng)宿主細(xì)胞,從而表達(dá)出人纖溶酶原K5;b)在適合的表達(dá)條件下,在5L發(fā)酵罐中優(yōu)化出最佳中試生產(chǎn)方案。
2. 如權(quán)利要求l所述的宿主細(xì)胞,其特征在于,它是畢赤酵母。
3. 如權(quán)利要求l所述的宿主細(xì)胞,其特征在于,它含有一種真核表達(dá)載體。
4. 如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體,其特征在于,它是含有編碼人纖溶酶原K5的核苷 酸序列。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(a)所示的表達(dá)條件為較佳培養(yǎng) 基為YPD培養(yǎng)基,搖瓶水平誘導(dǎo)溫度為30'C,誘導(dǎo)時(shí)間在48-60小時(shí)的范圍為最佳。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于,步驟(b)所示的表達(dá)條件為較佳培養(yǎng) 基為低鹽培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中碳源耗盡時(shí)補(bǔ)加50%甘油,甘油補(bǔ)加速度l. 14ml/min,培 養(yǎng)及誘導(dǎo)溫度30'C, pH控制在5.0, DO》35%,甘油補(bǔ)料耗完時(shí)用甲醇開(kāi)始誘導(dǎo), 誘導(dǎo)最佳時(shí)間應(yīng)為48h。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用畢赤酵母表達(dá)重組人纖溶酶原K5的中試生產(chǎn)方法,以及有關(guān)的表達(dá)載體與表達(dá)工藝。重組人纖溶酶原K5在畢赤酵母中以分泌形式表達(dá),通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化,提高了表達(dá)量,具有穩(wěn)定性好、表達(dá)水平高(發(fā)酵上清表達(dá)量可達(dá)1.497mg/ml)、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便、低成本的獲得重組人纖溶酶原K5。
文檔編號(hào)C12N9/68GK101165176SQ200710162968
公開(kāi)日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者軍 任, 華 劉, 黃陽(yáng)濱 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司