專利名稱：：人白細(xì)胞介素-15的生產(chǎn)方法人白細(xì)胞介素-15的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
木發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明提供了一種高密度、高效的重組人白細(xì)胞介素-15的生產(chǎn)工藝。技術(shù)背景白細(xì)胞介素-15(IL-15)是Grabstdn等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子。IL-15是一個(gè)多效能細(xì)胞因子，低劑量的外源IL-15能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、NK-T細(xì)胞和CD8+記憶T細(xì)胞的發(fā)育、增殖及活化，提高機(jī)體CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤或抗病原體功能，而不產(chǎn)生明顯毒副作用。在IL-15的功能研究中，WilliamMunger等人首先報(bào)道了IL-15具有抗腫瘤作用。在腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型中比較IL-15與IL72的療效時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然IL-15誘導(dǎo)體內(nèi)特異性殺傷效應(yīng)只有IL-2的1/3，但是它誘導(dǎo)的NK殺傷活性比IL-2高3—4倍。在大鼠結(jié)腸癌模型中還發(fā)現(xiàn)，IL-15能顯著降低化療引起的胃腸道毒性，增加藥物的最大耐受劑量。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-15可以刺激成年T細(xì)胞白血病患者外周血淋巴細(xì)胞的增殖，提高34例肺癌患者和20例對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNCS)和胸膜腔單個(gè)核細(xì)胞(MNCS)的NK活性和CTL活性。IL-15可能是治療實(shí)體瘤，尤其是抑制對(duì)IL-2有抗性的廣譜實(shí)體瘤生長的有效候選因子。本發(fā)明人在國內(nèi)較早開展對(duì)IL-15的研究，截至2001年已完成了下述工作克隆了WL-15cDNA，進(jìn)行了原核及真核表達(dá)；構(gòu)建了轉(zhuǎn)染hIL-15cDNA的小鼠肺腺癌細(xì)胞系LA795A和人肺鱗癌細(xì)胞系PG1，并進(jìn)行了體內(nèi)致瘤性研究。研究結(jié)果顯示，LA795A細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的致瘤性明顯降低，有明顯的抑制腫瘤生長作用；PG1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生抗腫瘤肺轉(zhuǎn)移作用，其抗瘤作用的產(chǎn)生至少為NK和T細(xì)胞依賴的。研究還發(fā)現(xiàn)IL-15基因修飾瘤苗通過分泌IL-153誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-y和TNF-a，提高機(jī)體的CTL活性和NK殺傷活性來增強(qiáng)對(duì)腫瘤的抑制作用。此外，IL-15基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞表面MHCI類分子表達(dá)顯著降低，對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性大大增強(qiáng)。隨后進(jìn)行的基因治療研究發(fā)現(xiàn)，IL-15裸質(zhì)粒DNA對(duì)T739荷瘤小鼠有明顯的早期局部治療作用，可提高小鼠的存活率，延長存活期，并對(duì)防止腫瘤發(fā)生有一定的保護(hù)作用。此夕卜，研究還發(fā)現(xiàn)，IL-15裸質(zhì)粒DNA治療后，小鼠脾細(xì)胞I類及II類MHC分子表達(dá)和CTL/NK細(xì)胞毒活性均升高，進(jìn)一步佐證IL-15是通過促進(jìn)機(jī)體APC細(xì)胞的呈遞作用增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的CTL活性，而且，NK細(xì)胞毒的殺瘤作用舉足輕重，也是提高腫瘤殺傷能力的關(guān)鍵因素。以陽性克隆建立原始種于庫，該種子庫的檢測表明無外源因子污染，各項(xiàng)生化指標(biāo)達(dá)到要求，表達(dá)水平達(dá)到要求。本發(fā)明提供了一種重組人IL-15的新型發(fā)酵方法，采用大腸桿菌表達(dá)體系以包涵體表達(dá)，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，整個(gè)過程穩(wěn)定、快速、簡便，獲得高密度、高表達(dá)水平的重組人IL-15。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種高密度的重組人IL-15的表達(dá)方案。包括用于該方案的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組人IL-15的中試生產(chǎn)方法，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，在搖瓶中培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，從而以包涵體形式表達(dá)出重組人IL-15;b)在適合的表達(dá)條件下，在5L發(fā)酵罐中優(yōu)化出最佳中試生產(chǎn)方案。在本發(fā)明的二方面，提供了一種工程菌，其特征在于，它含有編碼人IL-15的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌是大腸桿菌。無。，具體實(shí)施方式本發(fā)明人根據(jù)人IL-15的氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性原則，人工合成重組人白細(xì)胞介素-15基因的全序列，將它克隆入質(zhì)粒pET-30a(+)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)表達(dá)篩選獲得IL-15高表達(dá)工程菌。發(fā)明人通過深入、廣泛的研究，通過對(duì)重組人IL-15的一系統(tǒng)列優(yōu)化表達(dá)實(shí)驗(yàn)，為上罐發(fā)酵確定了基木工藝條件；然后該工藝又通過在發(fā)酵罐水平(5L)進(jìn)行了不斷地優(yōu)化與驗(yàn)證，最終確定了本工程菌穩(wěn)定的發(fā)酵工藝，通過表達(dá)穩(wěn)定性研究，獲得了能在大腸桿菌表達(dá)體系中穩(wěn)定高效表達(dá)的重組人IL-15。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明表達(dá)載體選用了大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)，受體菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌株，pET30a(+)載體帶有卡那霉素的抗性基因，因此可以通過卡那霉素的抗性平板篩選重組轉(zhuǎn)化子，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可以在宿主菌中高效表達(dá)外源基因。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pET-pelB/IL-15。搖瓶發(fā)酵的目的主要是在盡可能與發(fā)酵罐條件相近的條件下，通過一系列實(shí)驗(yàn)如培養(yǎng)基的選擇、誘導(dǎo)PH值、誘導(dǎo)菌密度等情況，摸索并確立初步的發(fā)酵工藝為采用改良M9-5培養(yǎng)基、誘導(dǎo).pH為6.8~7.2，起始OD選擇在35之間。搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化為中試上罐研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。初步完成中試實(shí)驗(yàn)，得到一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為后期中試穩(wěn)定高表達(dá)工藝提供一定的數(shù)據(jù)參考，為以后進(jìn)一步優(yōu)化中試工藝提供依據(jù)。以6.5L發(fā)酵罐，工作體積為3L。按照6.5L罐發(fā)酵工藝線性放大，確定并穩(wěn)定中試發(fā)酵工藝，該工藝經(jīng)過連續(xù)多批中試規(guī)模(6.5L和300L體積)，數(shù)據(jù)見表1，證實(shí)工藝穩(wěn)定。對(duì)重組人IL-15上罐工藝研究，在5L發(fā)酵罐穩(wěn)定工藝的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了連續(xù)三批的工藝放大，每升發(fā)酵液IL-15蛋白量達(dá)880mg以上，批與批之間工藝穩(wěn)定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了罐體補(bǔ)料的最佳方案。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，證實(shí)該發(fā)酵工藝是穩(wěn)定、成熟而且高水平的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，提供了中試發(fā)酵工藝優(yōu)化最佳方案。中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液表達(dá)重組人IL-15量可達(dá)857mg，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)此方案具有高穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)。對(duì)此高密度高效表達(dá)方法進(jìn)行了發(fā)酵工藝穩(wěn)定驗(yàn)證，證實(shí)該工藝穩(wěn)定性好。(2)通過控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達(dá)水平較高。(3)發(fā)酵工藝簡便，表達(dá)量高。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1最佳培養(yǎng)基摸索'挑單克隆，接種到LBK—級(jí)種子液中，培養(yǎng)17-20hr;按1:50的比例二級(jí)接種于300mlLB的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)2~3hr左右，待006()()達(dá)到0.5~1即上罐發(fā)酵(培養(yǎng)基分別是改良M9-2、M9-3、M9-4培養(yǎng)基)，pH6.8~7.2、溫度37°C、DO>50%，待OD6oo達(dá)到3~4加入0.8mM的IPTG開始誘導(dǎo)，每lhr留樣，誘導(dǎo)3hr結(jié)束。樣品檢測SDS-PAGE、蛋白含量。改良M9-3誘導(dǎo)2小時(shí)表達(dá)量最高，但在誘導(dǎo)3小時(shí)后，改良M9-4培養(yǎng)基中的表達(dá)量最高，說明改良M9-4培養(yǎng)基表達(dá)最穩(wěn)定，這也驗(yàn)證了前面搖瓶實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基對(duì)比結(jié)果。實(shí)施例2起始誘導(dǎo)ODe。。摸索方法同實(shí)施例l。結(jié)果顯示誘導(dǎo)OD低能夠獲得較高的表達(dá)水平，但總表達(dá)量不高；反之則表達(dá)水平低不利于后續(xù)純化。如何在兩者之間獲得一個(gè)平衡是關(guān)鍵，從以上2次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可得誘導(dǎo)OD控制在l-2之間能夠較好的解決以上的矛盾。實(shí)施例3中試發(fā)酵工藝優(yōu)化按照6.5L罐發(fā)酵工藝線性放大，工作體積3L，進(jìn)行連續(xù)3批中試生產(chǎn)。1工程菌培養(yǎng)階段優(yōu)化結(jié)果培養(yǎng)基高密度改良M9培養(yǎng)基接種比例1:10擴(kuò)增溫度37°C擴(kuò)增階段pH:6.87.2起始D02:大于50%起始轉(zhuǎn)速200rpm通氣量11.5L/min/L培液連動(dòng)轉(zhuǎn)速:200600rpm擴(kuò)增時(shí)間56hr0D6。。61(K補(bǔ)料初始流速0.5ml/min/培液pH調(diào)節(jié)氨水2工程菌誘導(dǎo)階段優(yōu)化結(jié)果誘導(dǎo)階段pH:7.0誘導(dǎo)溫度37°C誘導(dǎo)時(shí)間34hr;誘導(dǎo)階段DO:》50%;誘導(dǎo)劑濃度lmM誘導(dǎo)結(jié)束0D6。。1520;在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.一種人白細(xì)胞介素-15的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，在搖瓶中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而以包涵體形式表達(dá)出人IL-15；b)在適合的表達(dá)條件下，在發(fā)酵罐中大規(guī)模的進(jìn)行生產(chǎn)。2.如權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌。3.如權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有一種原核表達(dá)載體。4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，它是含有編碼人白細(xì)胞介素-15的核苷酸序列。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)所示的表達(dá)條件為較佳培養(yǎng)基為改良M9-5培養(yǎng)基，搖瓶水平誘導(dǎo)起始菌密度選擇在OD,3~5之間，誘導(dǎo)溫度為42。C，誘導(dǎo)pH為6.8~7.2，誘導(dǎo)時(shí)間在3~4小時(shí)的范圍為最佳，并且補(bǔ)料以選擇Yeastextract和葡萄糖作為IL-15表達(dá)的首選補(bǔ)料搭配。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)所示的表達(dá)條件為誘導(dǎo)OD6oo控制在1.22之間較佳，溫度37。C，DO》50%，OD6(M)1.2-2時(shí)用lmM的IPTG開始誘導(dǎo)，pH控制在6.8~7.2，誘導(dǎo)最佳時(shí)間應(yīng)為34hr。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用大腸桿菌表達(dá)重組人白細(xì)胞介素-15的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的表達(dá)載體與表達(dá)工藝。重組人IL-15在大腸桿菌中以包涵體的形式存在，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高了表達(dá)量，具有穩(wěn)定性好、表達(dá)水平高(目的蛋白達(dá)每升菌液200mg以上)、生產(chǎn)工藝簡便的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡便、低成本的獲得重組人IL-15。文檔編號(hào)C12N15/19GK101165185SQ20071016296公開日2008年4月23日申請(qǐng)日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者軍任,徐曉燕,黃陽濱申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司