專利名稱：：檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，具體地說檢測與老年黃斑變性疾病相關(guān)HTRA1基因變異的試劑盒。
背景技術(shù)：
：黃斑變性疾病被認(rèn)為是一類以進(jìn)行性中心視力下降及黃斑部視網(wǎng)膜色素上皮變性為特征的異質(zhì)性疾病，是重要的致盲性眼病。黃斑變性包括老年黃斑變性、黃斑營養(yǎng)不良(stargart病、best病、sorsby眼底營養(yǎng)不良等)。老年黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)現(xiàn)已成為老年人最主要的致盲性眼病之一，全世界患病人數(shù)1000萬，我國60-69歲人群AMD患病率為7.77%，70歲以上可達(dá)15.33%。目前對于AMD還無有效的治療方法，其主要原因就是發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來研究認(rèn)為，黃斑變性是一組異質(zhì)性疾病，遺傳因素在其發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。一些與老年黃斑變性(AMD)有相似臨床和組織病理表現(xiàn)的其他類型黃斑變性的研究已取得重要進(jìn)展，比如近年研究發(fā)現(xiàn)隱性Stargardt黃斑變性在ABCR基因上有變異；顯性Stargardt黃斑變性(STGD3)在ELOVL4基因上有變異；Best黃斑營養(yǎng)不良(BMD)在VMD2基因上有變異；Sorsby眼底營養(yǎng)不良患者在TIMP3基因存在點(diǎn)變異，還有黃斑蝶樣萎縮等與Peripherin/RDS基因變異有關(guān)。老年性黃斑變性是導(dǎo)致發(fā)展中國家不可逆性視力喪失的主要原因，很多研究顯示其具有顯著的遺傳傾向。目前針對不同人群和種族的黃斑變性疾病的研究，正成為國際研究熱點(diǎn)之一。國內(nèi)單基因性黃斑變性疾病及疾病人群和種族相匹配對照人群的基因分析(多基因疾病分析)工作尚未真正系統(tǒng)性開展，亦沒有相關(guān)的基因譜分析。AMD的前期研究證實(shí)補(bǔ)體旁路途徑成員的編碼基因，包括補(bǔ)體因子H(CFH)以及因子B/C2和個體患病風(fēng)險有關(guān)，尤其是位于染色體lq31上的CFH被認(rèn)為是AMD主要的風(fēng)險因子。其他一些關(guān)聯(lián)分析還顯示染色體10q26上存在另一個AMD的風(fēng)險位點(diǎn)。然而其確切致病基因尚不清楚。老年黃斑變性是一種和年齡增長有關(guān)的多因素復(fù)合作用的眼底病。多發(fā)生在45歲以上，年齡越大，患病率越高。是全球成人致盲的首要疾病之一。老年性黃斑變性有時發(fā)展很慢，使患者不易察覺，有時卻進(jìn)展很快，迅速剝奪患者視物能力，因而其早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防顯得至關(guān)重要。本病真正病因不明，系多因素疾病，影響因素除年齡外，還有人種、性別、代謝等，遺傳因素至關(guān)重要。臨床上分為萎縮型(干性型)和滲出型(濕性型)。干性者，在眼底可見玻璃膜疣，逐歩引起黃斑區(qū)變薄，從而影響功能。目前尚無特別有效的方法治療。濕性者，多引起視力的嚴(yán)重障礙，其視力破壞的原因主要是異常的新生血管在視網(wǎng)膜下生長，引起視網(wǎng)膜出血、水腫及視網(wǎng)膜組織的破壞，最終導(dǎo)致疤痕形成，從而引起視力的喪失。濕性AMD—旦發(fā)病，病程迅速，常規(guī)治療的效果不佳，難以大幅度地恢復(fù)其已經(jīng)喪失的視功能。因此，早期診斷發(fā)現(xiàn)，及早干預(yù)，能更好的延緩病程，減少病人的視力喪失，提高生活質(zhì)量。目前的AMD診斷于依賴1、多于50歲以上老年人發(fā)病，年齡越大，發(fā)病率越高；2、雙眼先后發(fā)生視物變形、視力減退或明顯視力障礙；3、眼底有較明顯的玻璃膜疣及兩型各自的表現(xiàn)；4、眼底熒光血管造影。但是，在病人發(fā)病初期缺乏監(jiān)測診斷指標(biāo)，可以早期篩選發(fā)現(xiàn)AMD高危人群，并實(shí)施早期檢測和預(yù)防，減少其視力損害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，該試劑盒通過檢測來源于待測個體的樣本中是否存在HTRA1基因512G—A變異，而在早期監(jiān)測或診斷老年黃斑變性疾病的發(fā)生，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考。本發(fā)明針對染色體10q26的易感位點(diǎn)進(jìn)行了AMD和正常對照的基因型分析，發(fā)現(xiàn)位于10q26染色體HTRA1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游512bp處的G—A變異是導(dǎo)致AMD的主要病因，此處等位基因G—A的改變屬于單核苷酸序列多態(tài)性(SNPrsl1200638)，于2003年在基因組研究時發(fā)現(xiàn)報道。然而該變異的意義尚不清楚。本發(fā)明全世界首次發(fā)現(xiàn)了rsl1200638和AMD的直接關(guān)聯(lián)性。即使相對于包含己知AMD風(fēng)險基因CHF變異的對照者，分析得到rsl1200638變異的人群歸因危險度也達(dá)到49.3%。將rsl1200638和CHF基因變異協(xié)同分析，得到人群歸因危險度達(dá)到71.4%。此外，染色體10q26上的rsl0490924G—T變異也和AMD高度相關(guān)，并且rsl1200638和rsl0490924處于一個LD。研究結(jié)果顯示存在G—A變異的AMD患者淋巴細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞HTRA1的轉(zhuǎn)錄翻譯水平上調(diào)，免疫印跡也顯示AMD患者眼睛HTRA1抗體反應(yīng)強(qiáng)陽性。由此可見，rsll200638的G—A變異引起了HTRAl的表達(dá)上調(diào)，從而在AMD易感性中占據(jù)重要地位。HTRA1基因編碼分泌型絲氨酸蛋白酶，其編碼產(chǎn)物在小鼠視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)HTRA1蛋白參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖降解，促進(jìn)了基質(zhì)蛋白降解酶對底物的降解作用，例如膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶。可以想見，HTRA1的過度表達(dá)會破壞Bruch's膜的完整性，使得脈絡(luò)膜血管易于穿透侵入細(xì)胞外基質(zhì)，形成濕性AMD。此外，TGF-(3在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解和血管生成中發(fā)揮著重要作用，而HTRA1能夠結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)化生長因子TGF-(3。因此，rsl1200638的G—A上調(diào)了HTRA1表達(dá)，繼而HTRA1蛋白及其下游信號活性分子的改變影響了眼內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)代謝降解過程以及血管生成，最終參與了AMD的發(fā)病進(jìn)程。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，試劑盒的檢測原理為檢測與老年黃斑變性疾病密切相關(guān)的HTRA1rsl1200638G—A變異位點(diǎn)是否存在，試劑盒中可以包括任選的用于檢測HTRA1基因512G—A變異的試劑，例如檢測HTRA1基因512G—A突變的試劑和任選的用于擴(kuò)增HTRA1基因或包含HTRA1基因rsl1200638基因片段的試劑。首先對獲得的樣本提取DNA并針對HTRA1基因或其512位堿基位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測方法可以參考本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的檢測基因點(diǎn)突變位點(diǎn)的方法，例如直接測序法或使用限制性片段長度多態(tài)方法或單堿基引物延伸法或Taqman法或芯片雜交等，判斷rsll200638位點(diǎn)的等位基因型。優(yōu)選地，可以在試劑盒中進(jìn)一歩包括擴(kuò)增和檢測CHF基因Y402H變異的相關(guān)試劑，通過檢測HTRA1和CHF兩個基因的點(diǎn)突變發(fā)生的協(xié)同作用，由于rsl1200638和rsl0490924連鎖度高，檢測rsl0490924也具有診斷AMD的效力?？梢栽谠噭┖兄屑尤雛sl0490924位點(diǎn)的擴(kuò)增和檢測試劑，進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，由于HTRA1基因512G—A突變導(dǎo)致AMD患者的HTRA1轉(zhuǎn)錄翻譯水平上調(diào)和HTRA1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，因此針對HTRA1基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平設(shè)計的試劑盒同樣適用本發(fā)明。對于檢測HTRA1基因的RNA轉(zhuǎn)錄水平可以采用例如RT-PCR技術(shù)，提取mRNA,檢測患者淋巴細(xì)胞內(nèi)的HTRA1基因轉(zhuǎn)錄水平而獲得檢測結(jié)果。對于蛋白表達(dá)水平的檢測，可以通過提取來源于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的總蛋白，與HTRA1蛋白抗體進(jìn)行反應(yīng)，測定蛋白的表達(dá)水平而獲得檢測結(jié)果。更進(jìn)一步，可以通過制備HTRA1蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體，采用免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交方法在原位進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的檢測。本發(fā)明提供了檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，可用于早期監(jiān)控和檢測AMD高危人群，實(shí)施早期預(yù)防和治療，減少其視力損害。本發(fā)明試劑盒以HTRA1基因512G—A突變及其相關(guān)位點(diǎn)/基因?yàn)槟繕?biāo)，與AMD的關(guān)聯(lián)度高，協(xié)同CHF基因突變的分析，更可提高檢測的準(zhǔn)確性。圖1是Snapshot檢測SNPrsl1200638的基因型圖；圖2是HTRA1基因含rsl1200638位點(diǎn)的測序結(jié)果圖；圖3是免疫組化圖；圖4是熒光免疫組化圖5是定量RT-PCR檢測人淋巴細(xì)胞中HTRA1mRNA豐度結(jié)果；圖6為Western檢測HTRA1在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的表達(dá)結(jié)果；圖7為PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所用試劑，除非特別說明，均為市售購買。實(shí)施例1血液樣本收集選取581例老年性黃斑變性(AMD)患者以及309例對照者。患者為臨床確診的AMD，其中392例濕性AMD患者，189例干性AMD患者，對照是符合AMD患者年齡段的大于或等于60歲、非玻璃疣和視網(wǎng)膜色素改變的人群。對所有參加者詳細(xì)調(diào)查其病史以及家族史，并對其進(jìn)行體格檢查和詳細(xì)的眼科?？茩z查。在簽署知情同意書以后每人采集血樣510ml。實(shí)施例2包含rsll200638基因的PCR擴(kuò)增和基因型分析1、提取AMD患者和對照組的血液基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增基因組DNA片段(包含rsl1200638)引物序列正向5'-ATGCCACCCACAACAACTTT-3，反向5，-CGCGTCCTTCAAACTAATCC-3'反應(yīng)條件95。C3minutes,(94。C30seconds,52°C30seconds,72°C45seconds)*35cycles3、基因分型限制性內(nèi)切酶鑒定(1)PCR產(chǎn)物采用EagI酶切鑒定G等位基因采用NEB的限制性內(nèi)切酶EagI(5'...CAGGCCG...3')，反應(yīng)體系如下3.9ulH2O+5ulPCR產(chǎn)物+lulbuffer3+0.1ulEagl;反應(yīng)條件如下37°C12houra(2)2%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶判讀基因型(AA純合子為原PCR產(chǎn)物等大小的一條DNA條帶；GG純合子包括兩條完全酶切后的產(chǎn)物，其大小之和等于PCR產(chǎn)物大??；AG雜合子是三條條帶，其中一條較大的與原PCR產(chǎn)物大小相同，另外兩條與完全酶切產(chǎn)物相同)。Snapshot基因分型1.純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物總體積9^1Exol酶0.1piSAPbuffer0.1jilddH20O.一SAP_2^1共計12(il注PCR產(chǎn)物總體積9pl視PCR反應(yīng)數(shù)量而定，N對引物的PCR，則每對引物獲得的產(chǎn)物加樣為9pl/N。反應(yīng)條件37°Clhour;75°C15min2.單堿基引物延伸反應(yīng)體系純化產(chǎn)物1^1SNaPshotMultiplexSNaPshotprimer0.2xNDdH20_補(bǔ)足5|al共計5^1反應(yīng)條件96°Clmin3.純化反應(yīng)物反應(yīng)體系0.7^1SAP/well反應(yīng)條件37°Clhour;75°C15min4.變性反應(yīng)體系純化產(chǎn)物1^1HP_9^1共計lOpl反應(yīng)條件95°C5min;迅速冰浴冷卻5.ABI3100上機(jī)讀取基因型結(jié)果核苷酸序列測定1、膠回收(1)將放有膠回收的管中加入BindingBuffer30ulfangru55。C孵育7min。(待完全溶化)(2)膠溶化后，取出柱管，作好標(biāo)記，把液體轉(zhuǎn)入柱管中，10000rpm/lmin96。C10sec50°C5sec^25個循環(huán)60°C30sec」離心，完畢后倒掉上清液，再加入700ulSpw，靜置23min，10000rpm/lmin離心，倒掉上清液。(3)重復(fù)上述2操作一次。(4)倒掉上清液后，把柱管1000rpm/lmin空轉(zhuǎn)。(5)加入15ulElutionBuffer到柱中央，靜置23min，10000rpm/lmin離心。(6)重復(fù)上述操作(7)把洗脫下來的液體輕轉(zhuǎn)至干凈管中，作好標(biāo)記，置于冰箱中。2、測序前擴(kuò)增反應(yīng)體系DNAlul5xBuffer1ulPrimer(0.2pm)0.5ulS叫0.5ulddH702ul共計5ul反應(yīng)條件96。Clmin96。C15sec50°C10sec60°C4sec「29個循環(huán)3、第二步純化NaAc12ulEDTA12ul4、上機(jī)測序混勻后lul/well，25ul無水乙醇/wel避光保存15min，4100rpm/30min離心。盡量吸干上清液，70。/。乙醇40ul/well,4100rpm/10min離心.。吸干上清液,室溫避光保存15min。加入9ul/we11，避光放置lhour。圖1為Snapshot檢測SNPrsl1200638的基因型圖(綠色峰為A，藍(lán)色為G)。該檢査結(jié)果為雜合子基因型的個體，其包含一個風(fēng)險等位基因A;如果是純合子AA型就表現(xiàn)為綠色單峰，GG則為藍(lán)色單峰。相混合資AA型患病風(fēng)險顯著高于GG型，雜合AG型患病風(fēng)險介于二者之間。圖2為HTRA1基因含rsl1200638位點(diǎn)的測序結(jié)果圖。箭頭所示為該位點(diǎn)信號，雜合子A/G。等位基因型的意義如前所示。實(shí)施例3包含rsl0490924基因的PCR擴(kuò)增和基因型分析1、提取AMD患者和對照的血液基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增基因組DNA片段(包含rs10490924)。引物序列正向5'-TACCCAGGACCGATGGTAAC-3，；反向5，-GAGGAAGGCTGAATTGCCTA-3，。反應(yīng)條件95。C3minutes,(94°C30seconds,52°C30seconds,72°C45seconds)*35cycles3、基因分型限制性內(nèi)切酶鑒定(1)PCR產(chǎn)物采用PVUII酶切鑒定G等位基因。采用NEB的限制性內(nèi)切酶PVUII(5'...CAGACTG...3')，反應(yīng)體系如下3.9ulH20+5ulPCR產(chǎn)物+lulbuffer2十O.lulPVUII;反應(yīng)條件如下37°C12hour。(2)2%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶判讀基因型(TT純合子為原PCR產(chǎn)物等大小的一條DNA條帶；GG純合子包括兩條完全酶切后的產(chǎn)物，其大小之和等于PCR產(chǎn)物大?。籘G雜合子是三條條帶，其中一條較大的與原PCR產(chǎn)物大小相同，另外兩條與完全酶切產(chǎn)物相同)。實(shí)施例410q26上15個SNP的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果采用SNaPshot方法，在ABI3130遺傳分析儀上進(jìn)行。表l15個SNP的關(guān)聯(lián)性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>基因組10q26上15SNP的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，rsl1200638的意義最顯著(P值)，該單核苷酸多態(tài)性A風(fēng)險等位基因和AMD的關(guān)聯(lián)性最高。實(shí)施例5rsl0490924和rsl1200638的患病風(fēng)險度比較首先對442例AMD患者(265濕性AMD和177干性AMD)和309對照進(jìn)行了基因型分析，比較等位基因出現(xiàn)頻率，隨后針對581例AMD患者(392例濕性AMD和189例干性AMD),研究rsl0490924和rsl1200638基因型，比較了二者AMD的患病風(fēng)險度。結(jié)果顯示rsl04卯924與AMD相關(guān)性較高，與之前報道一致。同時發(fā)現(xiàn)在15個SNP中rsl1200638為相關(guān)性最高的變化位點(diǎn)(p=lxl(r9,ORhet=1.86(1.35，2.56)，ORhom=6.56(3.23,13.31)，Aallele:40.3%incasesversus25.2%incontrols;)。并且rsl0490924和rsl1200638為T一A型的相關(guān)性高于單純rsl0490924(T)，但低于rsl1200638(A)。為了進(jìn)一歩研究其相關(guān)性，追加了139例AMD病人，比較上述兩種變異體的差異，結(jié)果顯示二者與AMD的相關(guān)性均升高，(rsl04%924:p=1.2xl0-8，rsll200638:p=1.6xl0-11)，并且rsl1200638仍然是相關(guān)度最高的單個變異體(OR^=1.90(1.40，2.58),ORh。m=7.51(3.75，15.04))。此外還對比了rsl1200638和CFH基因rsl061170變異體(位于人染色體lq31的己知的AMD重要患病風(fēng)險因子)。結(jié)果顯示rsll200638與AMD高度相關(guān)，即使是基于包含CFH等位風(fēng)險基因(C)的分析(p=5.9xl0_8)。所有的AMD患者的研究結(jié)果顯示rsl1200638的AA同源等位基因風(fēng)險性大于AG異源等位基因(ORh。m=7.29(3.18,16.74);ORhet=1.83(1.25，2.68))，證實(shí)了等位基因劑量效應(yīng)。采用等位基因劑量模型，得到rsl1200638的AMD人群歸隱危險度為49.3%。rsll200638和CFHY402H的結(jié)合模式分析，得到二者相加效應(yīng)的AMD人群歸隱危險度為71.4%(即任意一個位點(diǎn)變異)。實(shí)施例6數(shù)據(jù)分析10q26:采用卡方檢驗(yàn)分析等位基因相關(guān)性，同時計算優(yōu)勢比和95%可信區(qū)間，評價純合子和雜合子的患病風(fēng)險度。lq31上CFHY402H和10q26上rs11200638雙位點(diǎn)分析基于病例-對照以及雙位點(diǎn)基因型組合構(gòu)建列聯(lián)表，CFHY402H和rsl1200638雙位點(diǎn)基因型組合包括TT/GG，TT/AG，TT/AA，CT/GG，CT/AG，CT/AA，CC/GG，CC/AG禾卩CC/AA。雙位點(diǎn)9x2列聯(lián)表全部采用8自由度卡方檢驗(yàn)處理。以正常的純合子等位基因組合TT/GG為對照，計算每種基因組合的優(yōu)勢比和95%可信區(qū)間。采用Levin公式計算人群歸因危險度(populationattributablerisks,PAR),反映人群中該基因型的總的患病風(fēng)險。表2白種人HTRA1rsl1200638禾口CFHrsl061170兩個位點(diǎn)的oddsratios結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，同時具有HTRA1rsll200638位點(diǎn)AA風(fēng)險等位基因型和CFHrsl061170位點(diǎn)CC風(fēng)險等位基因型的個體患病風(fēng)險度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他個體(oddsratios為31.52)表3中國人AMD關(guān)聯(lián)分析結(jié)果HTRA1(rsl1200638)禾QARMS2(rsl0490924)同CNV(非Drusen)的相關(guān)性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，HTRAlrsll200638和中國人AMD高度相關(guān)，尤其是危害嚴(yán)重的濕'性AMD。實(shí)施例7HTRA1免疫組化AMD患者眼球多聚甲醛固定，含0.3%H202的甲醇滅活內(nèi)源性過氧物酶活性。HTRA1多抗為R&D公司產(chǎn)品(HTRA1/PRSS11MAb,Clone275615,100UG)，濃度5(ig/ml。采用VectorStainEliteABCkit試劑盒，采用NikonEclipse80i顯微鏡采集信號。免疫組化結(jié)果如圖3，熒光免疫化學(xué)結(jié)果如圖4。實(shí)施例8定量RT-PCR檢測人淋巴細(xì)胞中HTRAlmRNA豐度采用實(shí)時定量PCR系統(tǒng)(Opticon;MJResearch,Watertown,MA)反映HTRA1在AMD患者淋巴細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。1、采用RNeasy試劑盒(Qiagen)提取患者外周血液淋巴細(xì)胞總RNA。2、使用QuantiTectSYBRGreenRT-PCRkit(Qiagen)RT-PCR一歩法擴(kuò)增HTRA1mRNA，引物正向5，-AGCCAAAATCAAGGATGTGG-3，；反向5，-GATGGCGACCACGAACTC-3，。RNA用量100ng。采用0—400ng總RNA,平行擴(kuò)增看家基因GAPDH得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物正向5，-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3，；反向5，陽GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。3、計算AA基因型相對于GG基因型的HTRA1RNA豐度。結(jié)果見圖5。實(shí)施例9Western檢測HTRA1在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的表達(dá)提取四位AA基因型的濕性AMD患者和六位GG基因型的正常對照的RPE的總蛋白，取25嗎進(jìn)行SDS-PAGE電泳，抗體濃度1.5pg/ml進(jìn)行Westernblotting。HTRA1蛋白表達(dá)水平以卩-actin為內(nèi)參。采用SPSSversion13.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，計算其統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果如圖6，結(jié)果表明，AA基因型的HTRA1蛋白表達(dá)是GG基因型蛋白表達(dá)的約1.8倍。實(shí)施例10試劑盒檢測本試劑盒用于1、AMD患者的早期診斷和分型參考；2、AMD易感人群的基因檢測和風(fēng)險評估。[試劑]試劑盒清單試劑可進(jìn)行50份測定.成分PCR反應(yīng)混合液ml(l瓶)450ulEag-I限制性內(nèi)切酶ul幽5ul10x酶切Bufferul(l瓶)lOOulControlDNA-1ml(l瓶)A/A基因型的對照DNAControlDNA-2ml(l瓶)G/G基因型的對照DNAControlDNA陽3ml(l瓶)A/G基因型的對照DNArsll200638基因的PCR擴(kuò)增和基因型分析l取樣取患者全血(EDTA抗凝)lml，提取AMD患者的血液基因組DNA。2.PCR操作引物設(shè)計PCR擴(kuò)增基因組DNA片段(包含rsl1200638)引物序歹U:正向5'-ATGCCACCCACAACAACTTT-3，反向5，-CGCGTCCTTCAAACTAATCC-3，3.加樣體系取出lul基因組DNA(濃度為50100ng)加入反應(yīng)混合液9ul4.反應(yīng)條件1、95。C預(yù)變性5minutes2、95。C變性30seconds3、52。C退火30seconds4、72。C延伸45se謹(jǐn)ds5、步驟24共35個循環(huán)6、4。C保存5.PCR產(chǎn)物采用EagI酶切鑒定等位基因反應(yīng)體系3.9ulH20+5ulPCR產(chǎn)物+10xBufferlul+0.1ulEag-I;反應(yīng)條件37"C酶切12小時；2%瓊脂糖凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7，泳道1為AA純合子樣品DNA的酶切結(jié)果，泳道2為GG純合子樣品DNA的酶切結(jié)果，泳道6為AG雜合子的酶切結(jié)果。權(quán)利要求1、用于檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的用于檢測HTRA1基因rs11200638變異用于AMD篩選診斷的相關(guān)試劑。2、權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測HTRAl基因512G—A變異的試劑；以及任選的用于擴(kuò)增包含HTRAl基因rsl1200638基因片段的試劑。3、權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述檢測HTRAl基因512G—A變異的試劑為測序用試劑。4、權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述檢測HTRAl基因512G—A變異的試劑為限制性片段長度多態(tài)方法用試劑。5、權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述檢測HTRAl基因512G—A變異的試劑為Snapshot試劑。6、權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于進(jìn)一歩包括檢測CHF基因Y402H基因變異的試劑，和/或任選的用于檢測10q26上rsl04卯924變異的試劑。7、用于檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的檢測HTRAl蛋白表達(dá)用于AMD篩選診斷的試劑。8、權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的檢測HTRAl蛋白表達(dá)的試劑包括HTRAl蛋白的抗體；以及任選的檢測HTRAl蛋白表達(dá)量的試劑。9、用于檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的檢測HTRAlmRNA用于AMD篩選診斷的試劑。10、權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述檢測HTRAlmRNA的試劑為定量RT-PCR試劑。全文摘要本發(fā)明提供了檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，可用于早期監(jiān)控和檢測AMD高危人群，實(shí)施早期預(yù)防和治療，減少其視力損害。本發(fā)明試劑盒以HTRA1基因512G→A突變及其相關(guān)位點(diǎn)/基因?yàn)槟繕?biāo)，與AMD的關(guān)聯(lián)度高，協(xié)同CHF基因突變的分析，更可提高檢測的準(zhǔn)確性。文檔編號C12Q1/68GK101173314SQ20071016286公開日2008年5月7日申請日期2007年10月16日優(yōu)先權(quán)日2006年10月18日發(fā)明者康張,楊正林,芳魯申請人:四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(四川省人民醫(yī)院)