專利名稱：使用多基因計分預(yù)測向晚期老年性黃斑變性的進(jìn)展的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定具有更大風(fēng)險進(jìn)展為晚期老年性黃斑變性(AMD)的患有中期AMD的個體的方法，所述方法使用基于全基因組基因關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果計算的多基因計分，并使用數(shù)千種單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
背景技術(shù)：
老年件黃斑變件(Age-Related Macular Degeneration, AMD)AMD是老年性黃斑變性，其是60歲以上個體不可逆視覺功能障礙的主要原因。存在兩類AMD，非滲出性(干性)和滲出性(濕性)AMD。干性或非滲出性形式涉及在中心視網(wǎng)膜(黃斑)之下的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的萎縮性及肥大性改變以及RPE上的沉淀(玻璃疣)?；加蟹菨B出性AMD的患者可能進(jìn)展為濕性或滲出性形式的AMD。當(dāng)疾病進(jìn)展時，初始形成的玻璃疣在尺寸和數(shù)量上增長。在AMD的晚期，被稱為脈絡(luò)膜新生血管膜(CNVM)的異常血管在視網(wǎng)膜下發(fā)展，滲出流體和血，并最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜中和視網(wǎng)膜下的致盲的橢圓形瘢痕。非滲出性AMD，通常是滲出性AMD的前身，其更常見。全基因組關(guān)聯(lián)研究在人基因組測序的同時，進(jìn)行了國際范圍的努力以開發(fā)人基因組的單體型圖譜，即HapMap,其描述了人DNA序列變化的一般模式。HapMap項目始于2002年，并且通過定期的發(fā)表其結(jié)果已是公眾可自由獲知的。此外，基因分型(genotyping)技術(shù)和分析的快速改進(jìn)已經(jīng)使以下成為可能:在大群體上進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究，從而鑒別具有顯著群體頻率的遺傳變異。這又允許研究多基因病和性狀。從那時起，全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)識別大量遺傳性基因座，其中存在與多基因性狀可重復(fù)地關(guān)聯(lián)的常見遺傳變體。見，例如 Altshuler 等，Sc ience(2008), 322:881-8(genetic mapping inhuman disease (人疾病中的基因定位));Mohkle 等，Hum Mol Genet (2008) 17:R102-R108 (common geneticvariations associated with metabolic and cardiovasular diseases (與代謝和心血管疾病相關(guān)的常見遺傳變異))；Lettre 等，Hum Mol Genet (2008):17-R116-R121 (commongenetic variations associated with autoimmune diseases (與自體免疫疾病相關(guān)的常見遺傳變異));Purcell 等，Nature (2009)460(7256):748-52 (common genetic variationsassociated with risk of schizophrenia and bipolar disorder(與精神分裂癥和雙相性精神障礙的風(fēng)險相關(guān)的常見遺傳變異))jPWei等，PLoS Genet.(2009)5(10):el000678.Epub20090ct9 (I 型糖尿病)。Tufts-New England Medical Center(Boston)的 Johanna M.Seddon, M.D.,Sc.M.及同事評估了某些遺傳變體是否對于進(jìn)展為晚期AMD及相關(guān)視力喪失具有預(yù)測的重要性，并且在Seddon等，JAMA(2007) 297 =1793-1800中報道了它們的發(fā)現(xiàn)。該研究包括了老年性眼病研究(AREDS)中的1，466名白人參與者，AREDS是一項美國多中心臨床試驗，其在1990至2001之間進(jìn)行，平均隨訪時間為6.3年。在該研究期間，281名參與者的一只眼或兩眼進(jìn)展為晚期AMD,其包括:地圖狀萎縮(geographic atrophy)(導(dǎo)致視網(wǎng)膜變薄和變色)，滲出性疾病(液體、細(xì)胞和細(xì)胞碎片從血管中溢出)，或AMD導(dǎo)致的視力喪失?；诨蚍中头治?，基因CFH和L0C387715中的常見多態(tài)性被鑒定為獨立地相關(guān)于從AMD的早期(玻璃疣和色素變質(zhì)(alteration))到導(dǎo)致視覺缺陷或失明的AMD的晚期形式(地圖狀萎縮或新生血管AMD)的AMD進(jìn)展。研究者發(fā)現(xiàn)，遺傳多態(tài)性，CFH Y402H和L0C387715A69S，與進(jìn)展為更晚期AMD相關(guān)，其中在對與AMD相關(guān)的其他因素進(jìn)行控制后對于CFH進(jìn)展的風(fēng)險2.6倍更高而對于L0C387715風(fēng)險基因型進(jìn)展的風(fēng)險4.1倍更高。進(jìn)展的概率對于更高風(fēng)險基因型是百分之48，而對低?；蛐褪前俜种?。所有不利因素(兩個風(fēng)險基因型，吸煙以及25以上的體重指數(shù))的存在使風(fēng)險增加19倍。在每種風(fēng)險基因型中，吸煙和高的體重指數(shù)都使進(jìn)展的概率增加。同一課題組報道了隨后的研究結(jié)果，該研究調(diào)查了遺傳、眼睛和環(huán)境變量的聯(lián)合作用以及AMD流行和發(fā)病的預(yù)測模型。(Seddon等，Investigative Ophthalmology &Visual Science (2009) 50:2044_53。作者發(fā)現(xiàn)六個遺傳變體(CFH Y402H ；CFH rsl410996 ；L0C387715A69S(ARMS2) ；C2 E318D ；CFB ；C3 R102G)與晚期 AMD 流行和發(fā)病的獨立相關(guān)。根據(jù)作者所述，在對基線AMD級別和其他因素進(jìn)行控制后，除了 CFB，所有這些變體與進(jìn)展為晚期AMD顯著相關(guān)。確定的是，遺傳、人口學(xué)(例如年齡、性別)和環(huán)境(例如吸煙)因素都促進(jìn)AMD的發(fā)生和進(jìn)展，其中遺傳因素包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、拷貝數(shù)變體(CNV)和表觀遺傳變體，其與DNA甲基化或組蛋白修飾相關(guān)。然而，這些因素的相對作用，包括每種類型的遺傳變異對疾病風(fēng)險或進(jìn)展的作用，還是未知的。因此，需要更好的理解和工具以預(yù)測發(fā)生AMD的可能性，或者對于已被診斷患有AMD的患者，預(yù)測其病癥進(jìn)展的風(fēng)險。發(fā)明概述本發(fā)明至少部 分基于以下認(rèn)識:數(shù)千種具有適度作用規(guī)模的常見遺傳變體促進(jìn)中期AMD到晚期AMD的進(jìn)展，并且當(dāng)集合時，多基因計分可以說明并預(yù)測從中期AMD進(jìn)展到晚期AMD的風(fēng)險。在一方面中，本發(fā)明涉及用于評估人受試者發(fā)生晚期老年性黃斑變性(AMD)的風(fēng)險的方法，所述方法包括確定在來自所述受試者的生物樣品中在多個獨立基因座處是否存在與AMD相關(guān)的常見等位變體的風(fēng)險等位基因。在一個實施方案中，評估的風(fēng)險等位基因不包括補(bǔ)體rsl0737680和rsl329424 (補(bǔ)體因子 H) ；rs2285714 (補(bǔ)體因子 I) ；rs429608 和 rs9380272 (補(bǔ)體 C2)，rs3793917 (HTRAl);和 rs2230199 (補(bǔ)體 C3)。在一個具體實施方案中，在確定是否存在風(fēng)險等位基因之后是計算受試者的多基因計分，其中高的多基因計分指示發(fā)生晚期AMD的更高風(fēng)險。在多個實施方案中，在至少20，或至少50，或至少100，或至少200，或至少500，或至少750，或至少1000，或至少1500，或至少2000，或至少2500，或至少3000，或至少3，500，或至少4，000，或至少4，500，或至少5，000，或至少5，500，或至少6，000，或至少6，500，或至少7，000，或至少7，500，或至少8，000，或至少8，500，或至少9，000，或至少9，500，或至少10，000個獨立基因座處確定等位頻率。在另一個實施方案中，所述受試者已經(jīng)被診斷患有早期AMD。在另一個實施方案中，所述受試者已經(jīng)被診斷患有中期AMD。在另一個實施方案中，所述方法還包括評估受試者的個人歷史的一個或多個方面，如，例如，以下中的一個或多個:年齡、種族、體重指數(shù)、飲酒史、吸煙史、鍛煉史、飲食、AMD或其他老年性眼病的家族史，包括親屬在其被診斷時的年齡，以及AMD治療的個人歷史。在另一個實施方案中，確定是否存在風(fēng)險等位基因通過擴(kuò)增來自所述樣品的核酸實現(xiàn)。在多個實施方案中，擴(kuò)增可以包括PCR，擴(kuò)增可以是在芯片上，其中用于擴(kuò)增的引物對所測試的常見遺傳變體的等位基因是特異性的。在一個具體實施方案中，所述擴(kuò)增包括:(i)將擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對與分離自生物樣品的核酸模板混合，其中所述引物或引物對與鄰近或包含多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)或部分互補(bǔ)，并且能夠通過聚合酶在核酸模板上起始核酸聚合；以及，b)在包含聚合酶和模板核酸的DNA聚合反應(yīng)中延伸引物或引物對從而生產(chǎn)擴(kuò)增子。所述擴(kuò)增子可以，例如，通過包括以下一種或多種的方法檢測到:將擴(kuò)增子雜交到陣列，利用限制性酶消化擴(kuò)增子，或?qū)崟rPCR分析。在另一個實施方案中，所述擴(kuò)增包括使用分離自生物體或生物樣品的核酸作為PCR, RT-PCR或LCR中的模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)，或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)。在另一個實施方案中，所述方法還可以包括切割擴(kuò)增的核酸。另一個實施方案，所述生物樣品來源于體液，如唾液或血液。在其他實施方案中，所述方法還包括以下步驟:決定受試者的AMD診斷測試的時機(jī)和/或頻率和/或決定受 試者的AMD治療的時機(jī)和/或頻率。在另一個實施方案中，所述方法還包括對被鑒定為具有增加的發(fā)生晚期AMD風(fēng)險的受試者進(jìn)行AMD治療的步驟，其中所述治療可以，例如，包括給予選自由以下組成的組的藥物:抗因子D抗體，抗VEGF抗體，CRIg和CRIg-1g融合體。在另一個實施方案中，所述方法包括對于表SI中所列的所有單核苷酸多態(tài)性確定是否存在風(fēng)險等位基因，并且基于該確定計算多基因計分。在另一個實施方案中，所述方法還包括在計算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄所述確定的結(jié)果的步驟。在另一個實施方案中，所述結(jié)果被傳達(dá)給受試者或者受試者的醫(yī)生和/或以報告的形式被記錄。在另一方面中，本發(fā)明涉及包含本文中的方法的結(jié)果的報告。附圖簡述本專利的文件含有至少一幅彩圖。在請求并支付必要費用后，具有彩圖的本專利或?qū)＠暾埖膹?fù)件將由局方(Office)提供。

圖1:已知的能夠預(yù)測進(jìn)展的AMD風(fēng)險基因的能力。圖2:多基因計分識別處于更高風(fēng)險進(jìn)展為晚期AMD的個體。圖3:不依賴于基線臨床計分，多基因計分識別處于更高風(fēng)險進(jìn)展為晚期AMD的個體。表SI:16, 617個SNP的列表。CHR =染色體；SNP = SNP ID ；BP =物理位置(堿基對)；A1 =第一(次要)等位基因編碼；F_A-病例(case)中的等位基因I頻率;F_U:對照例(control case)中的等位基因頻率；A2 =第二(主要)等位基因編碼；CHISQ =卡方值；P = P值(病例/對照關(guān)聯(lián)檢驗的顯著性值)；0R =與AMD風(fēng)險相關(guān)的比值比。在一些情況中，次要等位基因與風(fēng)險相關(guān)(0R> I)而在一些情況中，主要等位基因與AMD風(fēng)險相關(guān)(OR < I)。發(fā)明詳述1.定義當(dāng)在本文中使用商品名時，申請人意在獨立地包括商品名產(chǎn)品制劑、一般藥物和商品名產(chǎn)品的活性藥物成分。除非另外說明，以下術(shù)語和短語當(dāng)在本文中使用時意在具有以下含義:術(shù)語"補(bǔ)體相關(guān)眼病"被最廣義地使用并且包括所有這樣的眼病，所述眼病的病理學(xué)涉及補(bǔ)體，包括經(jīng)典途徑和旁路途徑，并且尤其是補(bǔ)體的旁路途徑。補(bǔ)體相關(guān)眼病包括但不限于，黃斑變性疾病，如所有階段的老年性黃斑變性(AMD，age-relatedmacular degeneration),包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)形式，脈絡(luò)膜新生血管形成(choroidal neovascularization) (CNV),葡萄膜炎(uveitis),糖尿病性視網(wǎng)膜病和其他缺血相關(guān)的視網(wǎng)膜病，以及其他眼內(nèi)新生血管疾病，如糖尿病性黃斑水腫(diabeticmacular edema),病理性近視(pathological myopia) , von Hippel-Lindau 病，眼睛的組織胞漿菌病(histoplasmosis),視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(Central Retinal Vein Occlusion)(CRVO),角膜新生血管形成(corneal neovascularization),和視網(wǎng)膜新生血管形成。一組優(yōu)選的補(bǔ)體相關(guān)眼病包括老年性黃斑變性(AMD)，包括非滲出性(濕性)和滲出性(干性或萎縮性)AMD，脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)，糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)，和眼內(nèi)炎(endophthalmitis)。在本文中使用術(shù)語“老年性黃斑變性”或“AMD”以包括所有階段的AMD，包括2類(早期)，3類(中期)和4類(晚期)AMD。"治療"是為了防止疾病發(fā)生或改變疾病病理學(xué)而進(jìn)行的干預(yù)。因此，"治療"是指治療性處理和預(yù)防性或防止性措施。需要治療的人包括已經(jīng)患有疾病的人以及要防止其患病的人。在補(bǔ)體相關(guān)眼病、如AMD的治療中，治療劑可以直接地有益地改變疾病的程度、嚴(yán)重性、進(jìn)展或癥狀，或使疾病更易于通過其他治療劑治療。疾病如包括AMD在內(nèi)的補(bǔ)體相關(guān)眼病的"病理學(xué)"，包括損害患者健康的所有現(xiàn)象。這包括但不限于，與疾病的不同階段相關(guān)的形態(tài)學(xué)，如在一只或雙眼中玻璃疣的出現(xiàn)、數(shù)量和大小，積累基底層狀沉淀(basal laminar deposits) (BLamD)和基底線狀沉淀(basal linear deposits) (BLinD)，色素變化，地圖狀萎縮(GA)和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)改變，視網(wǎng)膜中心區(qū)域中的感光細(xì)胞和支持組織的破壞(晚期干性形式)，或視網(wǎng)膜下的異常和易碎血管(濕性形式)；生理學(xué)變化，如受損的視力，部分或完全視力喪失。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語"哺乳動物"是指被分類為哺乳動物的任何動物，包括但不限于，人，高等靈長類，家養(yǎng)和農(nóng)場動物，以及動物園、體育或?qū)櫸飫游锶珩R、豬、牛、狗、貓和雪貂等。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物是人或另一種高等靈長類。"結(jié)合"一種或多種其他治療劑給藥包括同時(共同)和以任何次序相繼給藥。"表型"是可以在個體或群體中觀察到的性狀或性狀的集合。性狀可以是數(shù)量的(數(shù)量性狀，或QTL)或定性的。例如，對AMD的易感性是可以根據(jù)本文中的方法、組合物、試劑盒和系統(tǒng)監(jiān)測的表型。" AMD易感性表型"是個體中顯示易發(fā)生AMD的體質(zhì)的表型。顯示易患AMD的體質(zhì)的表型，可以，例如，顯示:在給定的一組環(huán)境條件(飲食、身體運動狀態(tài)、地理位置等)下，與相關(guān)一般群體的成員相比AMD將更有可能在具有該表型的個體中發(fā)生。“種族”可以是基于自我證實(自己報告)，但是我們優(yōu)選地是基于使用全基因組SNP數(shù)據(jù)以確定樣品如何相關(guān)，以及將樣品與來自Human HapMap項目的參比群體相比以確定種族。包括在HapMap中的群體有尼日利亞伊巴丹(Ibadan, Nigeria)的約魯巴人(Yoruba)(簡寫:YRI);日本東京的日本人(簡寫JPT);中國北京的漢族人(簡寫:CHB)；和 CEPH(Centre d' Etude du Polymorphisme Humain (人類多態(tài)性研究中心))(具有來自北歐和西歐的祖先的猶他居民)(簡寫:CEU)。主成分方法(principal componentsapproach)使用基因型數(shù)據(jù)以評估可以被解釋為描述個體群組內(nèi)的連續(xù)祖先異質(zhì)性的變化軸(axes of variation) 0這些變化軸被定義成在研究群體中的個體之間的協(xié)方差矩陣的頂部特征向量(top eigenvector) 0然后，可以對于可歸因于沿每個軸的祖先的關(guān)聯(lián)性調(diào)整基因型和表型之間的關(guān)聯(lián)。典型地，屬于明顯異常值的樣品(相對于目的群體)被排除在分析之外從而對群體分層進(jìn)行控制。具體地，來自整個基因組的基因型被用于計算特征向量(主成分分析(PCA)的一種形式)，然后基于初級特征向量來分析樣品。除去極端異常值(sigma >6)，并且使用前5個特征向量作為協(xié)變量來修正關(guān)聯(lián)結(jié)果。同樣JAL Price, A.L.等 Principal components analysis corrects for stratification ingenome-wide association studies (用于全基因組關(guān)聯(lián)研究中的分層的主成分分析修正) Nat.Genet.38，904-909 (2006)，和實施例。"多態(tài)性"是可變的基因座；即，在群體內(nèi)，在多態(tài)性處的核苷酸序列具有超過一種形式或等位基因。術(shù)語"等位基因"是指存在或被編碼在特定基因座處的兩種以上不同核苷酸序列中的一個，或由所述基因座編碼的兩種以上不同多肽序列。例如，第一等位基因可以存在于一個染色體上，而第二 等位基因存在于第二同源染色體上，例如，當(dāng)存在于雜合個體的不同染色體時，或當(dāng)存在于群體中不同的純合或雜合個體之間時。多態(tài)性的一個實例是"單核苷酸多態(tài)性"(SNP)，其是在基因組中單個核苷酸位置處的多態(tài)性(在指定位置處的核苷酸在個體或群體之間變化)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀相聯(lián)系并且當(dāng)?shù)任换虻拇嬖谥甘拘誀罨蛐誀钚问綄⒃诎摰任换虻膫€體中發(fā)生時，等位基因"正"相關(guān)于性狀。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀相聯(lián)系并且當(dāng)?shù)任换虻拇嬖谥甘拘誀罨蛐誀钚问綄⒉辉诎摰任换虻膫€體中發(fā)生時，等位基因負(fù)相關(guān)于性狀。當(dāng)其可以在統(tǒng)計學(xué)上與表型相聯(lián)系(正或負(fù))時，標(biāo)記多態(tài)性或等位基因與指定表型(例如AMD易感性等)"相關(guān)"或"相關(guān)聯(lián)"。即，相比于在對照群體(例如，不具有乳腺癌的個體)中，指定的多態(tài)性更普遍地發(fā)生于病例(case)群體(例如，AMD患者)中。該相關(guān)性通常被推斷為是性質(zhì)上的原因，但是其不必需如此-表型之下對于性狀基因座的簡單遺傳連鎖(關(guān)聯(lián))足以產(chǎn)生相關(guān)性/關(guān)聯(lián)性。"有利(favorable)等位基因"是在特定基因座處、正相關(guān)于所需表型(例如，對AMD的抗性)的等位基因，例如，與易患AMD的體質(zhì)負(fù)相關(guān)的等位基因。有利等位基因的連鎖標(biāo)記是與所述有利等位基因一起分離的標(biāo)記等位基因。有利等位形式的染色體片段是這樣的染色體片段，其在物理上位于該染色體片段上的一個或多個遺傳基因座處包括與所需表型正相關(guān)的核苷酸序列，或與不利表型負(fù)相關(guān)的核苷酸序列。"不利等位基因"是在特定基因座處、與所需表型負(fù)相關(guān)或與不想要的表型正相關(guān)(例如，與乳腺癌易感性的正相關(guān)性)的等位基因。不利等位基因的連鎖標(biāo)記是與所述不利等位基因一起分離的標(biāo)記等位基因。不利等位形式的染色體片段是這樣的染色體片段，其在物理上位于該染色體片段上的一個或多個遺傳基因座處包括與所需表型負(fù)相關(guān)的核苷酸序列，或與不利表型正相關(guān)的核苷酸序列。“風(fēng)險等位基因”是這樣的等位基因，其與發(fā)生疾病或病癥(如AMD)的風(fēng)險正相關(guān)，即指示個體具有增加的發(fā)生AMD或進(jìn)展為更晚期的AMD的可能性?；诖罅?通常為數(shù)千種)常見遺傳變體，“多基因計分”用于定義個體發(fā)生疾病或進(jìn)展為更晚期疾病的風(fēng)險，所述常見遺傳變體每個對疾病或其進(jìn)展可能具有適度個體作用規(guī)模的貢獻(xiàn)，但是集合在一起，其具有顯著的預(yù)測值。在本案中，用于預(yù)測患者進(jìn)展為晚期AMD的可能性的多基因計分使用與AMD關(guān)聯(lián)的常見單核苷酸多態(tài)性(SNP)。來自發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)組中達(dá)到P < 0.1的每個變體的比值比(OR)的對數(shù)被用于計算多基因計分。具體地，對于計分中所用的10，617個變體中的每個，比值比的對數(shù)乘以個體攜帶的參比等位基因數(shù)目(0、1或2)。所得的總數(shù)除以每個個體中測試變體的數(shù)目，得到最終的多基因計分。根據(jù)本發(fā)明，“高多基因計分”用于指多基因計分>.0001，“低多基因計分”用于指多基因計分<.0001，而這兩個閾值之間的多基因計分被定義為“中等多基因計分”。"等位基因頻率"是指等位基因在個體內(nèi)、種系內(nèi)或種系的群體內(nèi)的基因座處出現(xiàn)的頻率(比例或百分比 )。例如，對于等位基因"A"，基因型"AA"、" Aa"或"aa"的二倍體個體可以分別具有2、1或0的等位基因頻率。種系或群體(例如，病例或?qū)φ?內(nèi)的等位基因頻率可以通過平均來自所述種系或群體的個體的樣品的等位基因頻率來評估。類似地，種系的群體內(nèi)的等位基因頻率可以通過平均構(gòu)成所述群體的品系的等位基因頻率來計算。如果個體在給定的基因座處僅具有一種類型的等位基因(例如，二倍體個體在兩個同源染色體中的每個的基因座處具有一份相同的等位基因)，則個體是"純合的"。如果超過一種等位基因類型存在于給定的基因座處(例如，二倍體個體具有兩個不同等位基因中的每個的一份拷貝)，則個體是"雜合的"。術(shù)語"同質(zhì)性"指示組中成員在一個或多個具體基因座處具有相同的基因型。相反，術(shù)語"異質(zhì)性"用于指示組內(nèi)的個體在一個或多個具體基因座處基因型不同。"基因座"是染色體位置或區(qū)域。例如，多態(tài)性基因座是多態(tài)性核酸、性狀決定子、基因或標(biāo)記所在的位置或區(qū)域。在另一個實例中，"基因座"是物種基因組中的特定染色體位置(區(qū)域)，其中可以發(fā)現(xiàn)特定基因。類似地，術(shù)語"數(shù)量性狀基因座"或"QTL"是指具有至少兩個等位基因的基因座，所述至少兩個等位基因，在至少一個遺傳背景中，例如，在至少一個群體或后代中，差異性地影響數(shù)量或連續(xù)表型性狀的表達(dá)或改變數(shù)量或連續(xù)表型性狀的變異。"標(biāo)記"、"分子標(biāo)記"或"標(biāo)記核酸"是指當(dāng)鑒定基因座或連鎖基因座時用作參考點的核苷酸序列或其編碼的產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))。標(biāo)記可以來源于基因組核苷酸序列或表達(dá)的核苷酸序列(例如，RNA、nRNA、mRNA、cDNA等)，或編碼的多肽。該術(shù)語還指與標(biāo)記序列互補(bǔ)或在標(biāo)記序列側(cè)翼(flanking)的核酸序列，如用作探針的核酸或能夠擴(kuò)增標(biāo)記序列的引物對。"標(biāo)記探針"是可以用于鑒定標(biāo)記基因座的存在的核酸序列或分子，例如，與標(biāo)記基因座序列互補(bǔ)的核酸探針。當(dāng)它們在溶液中例如，根據(jù)Watson-Crick堿基配對原則特異性雜交時，核酸是"互補(bǔ)的"。"標(biāo)記基因座"是可以用于追蹤第二個連鎖基因座的存在的基因座，例如，編碼或促進(jìn)表型性狀的群體變異的連鎖或相關(guān)的基因座。例如，標(biāo)記基因座可以用于監(jiān)測其在遺傳上或物理上與標(biāo)記基因座連鎖的基因座(如QTL)處等位基因的分離。因此，"標(biāo)記等位基因"，備選地"標(biāo)記基因座的等位基因"是在對標(biāo)記基因座具有多態(tài)性的群體中的標(biāo)記基因座處發(fā)現(xiàn)的多個多態(tài)性核苷酸序列中的一個。在一方面中，本發(fā)明提供與目的表型(例如，增加患有中期AMD的個體進(jìn)展為晚期AMD的可能性的表型)相關(guān)的標(biāo)記基因座。對應(yīng)于群體成員間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記可以通過本領(lǐng)域中良好確立的方法檢測。這些方法包括，例如，基于PCR的序列特異性擴(kuò)增方法，檢測限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，檢測同工酶標(biāo)記，檢測等位基因特異性雜交(ASH)，檢測單核苷酸延伸，檢測基因組擴(kuò)增的可變序列，檢測自我維持序列復(fù)制，檢測簡單序列重復(fù)(SSR)，檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)，或檢測擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)。"基因型"是個體(或個體的群組)在一個或多個遺傳基因座處的遺傳構(gòu)成?；蛐陀蓚€體的一個或多個已知基因座的等位基因，典型地，遺傳自其親本的等位基因的匯編(compilation)限定。"單體型"是個體在單個DNA鏈上的多個遺傳基因座處的基因型。典型地，由單體型描述的遺傳基因座在物理上和遺傳上連鎖，即，在相同的染色體鏈上。一"組"標(biāo)記或探針是指標(biāo)記或探針(或來源于其的數(shù)據(jù))的集合或組，其被用于常見目的，例如，鑒定具有指定表型(例如，AMD易感性，或發(fā)生晚期AMD的易感性)的個體。通常，對應(yīng)于標(biāo)記或探針或源自其應(yīng)用的數(shù)據(jù)存儲在電子介質(zhì)中。雖然一組中的每個成員具有關(guān)于指定目的的效用， 但是選自該組的個體標(biāo)記以及包括一些但不是全部標(biāo)記的亞組也可以有效地實現(xiàn)指定目的。"計算機(jī)可讀介質(zhì)"是可以通過計算機(jī)使用可用的或用戶界面訪問的信息存儲介質(zhì)。實例包括存儲器(例如，ROM或RAM，閃存等)，光存儲介質(zhì)(例如，⑶-ROM)，磁存儲介質(zhì)(例如，計算機(jī)硬盤驅(qū)動器、軟盤等)，穿孔卡和可用且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其他介質(zhì)。信息可以在目的系統(tǒng)和計算機(jī)之間傳輸，或傳輸?shù)交騻鬏斪杂嬎銠C(jī)，傳輸?shù)交騻鬏斪杂糜诖鎯蛟L問存儲的信息的計算機(jī)可讀介質(zhì)。該傳輸可以是電傳輸，或者可以通過其他可用方法方法如IR連接、無線連接等進(jìn)行。術(shù)語"因子D"和"補(bǔ)體因子D"可互換地使用，并且是指天然序列和變異的因子D多肽。"天然序列"因子D，是與來源于天然的因子D多肽具有相同的氨基酸序列的多肽，而不管其制備方式。因此，天然序列因子D可以分離自自然或可以通過重組和/或合成方式制備。除了成熟因子D蛋白如成熟人因子D蛋白以外，術(shù)語"天然序列因子D"，具體地包括因子D的天然存在的前體形式(例如，無活性的前體蛋白(preprotein)，其被蛋白水解切割從而產(chǎn)生活性形式)，因子D的天然存在的變體形式(例如，可變剪接形式)和天然存在的等位變體，以及與來源于天然的因子D多肽具有相同的氨基酸序列的因子D分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)象變體。包括高等靈長類和非人哺乳動物在內(nèi)的非人動物的因子D多肽特別地包括在該定義中。"因子D變體"或"補(bǔ)體因子D變體"是指如下所定義的活性因子D多肽，其與天然序列因子D多肽具有至少約80%的氨基酸序列同一性。通常，因子D變體與成熟因子D多肽具有至少約80%的氨基酸序列同一性，或至少約85%的氨基酸序列同一性，或至少約90%的氨基酸序列同一性，或至少約95%的氨基酸序列同一性，或至少約98%的氨基酸序列同一性，或至少約99%的氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，最高程度的序列同一性發(fā)生在因子D的活性位點內(nèi)。在人因子D序列中，因子D的"活性位點"由His-57、Asp-102和Ser_195(胰凝乳蛋白酶原編號)限定。因子D在主要特異性口袋的底部具有Aspl89(胰凝乳蛋白酶編號)并且切割A(yù)rg肽鍵。催化三聯(lián)體由His-57、Asp-102和Ser-195組成。與其他絲氨酸蛋白酶相比，Asp-102和His57顯不非典型構(gòu)象(Narayana等，J.Mol.Biol.235 (1994),695-708)。在SI 口袋的底部在Aspl89和Arg218之間觀察到獨特的鹽橋，其提升環(huán)214-218并產(chǎn)生深且窄的I 口袋(Jinget等，J.Mol.Biol.282 (1998) 1061-1081)。通過突變分析，該環(huán)和活性位點附近的數(shù)個其他殘基顯示為是因子D酯水解活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)決定子(Kim等，J.Biol.Chem.270 (1995) 24399-24405)?；谶@些結(jié)果，提出:在與C3b結(jié)合因子B結(jié)合后，因子D可以進(jìn)行構(gòu)象變化,導(dǎo)致蛋白水解活性的表達(dá)(Volanakis和Narayana,ProteinSc1.5(1996)553-564)。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“VEGF”或“VEGF”是指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及相關(guān)的121個、189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，如Leung等科學(xué)(Science)，246: 1306 (1989)；和 Houck 等分子內(nèi)分泌學(xué)(Mol.Endocrin.), 5:1806 (1991)，所記載的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術(shù)語"VEGF"還指來自非人物種如小鼠、大鼠或靈長類的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF用如下術(shù)語表示，諸如hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。術(shù)語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長 因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽的截短形式。在本申請中可通過例如"VEGF(8-109)〃，" VEGF (1-109)"或"VEGF.sub.165"表示對任何此類形式的VEGF的引述?！敖囟痰摹碧烊籚EGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當(dāng)?shù)膶DR和Flt-1受體的結(jié)合親和力。術(shù)語"VEGF變體"用于本文時是指在天然VEGF序列中包括一個或多個氨基酸突變的VEGF多肽。任選地，該一個或多個氨基酸突變包括氨基酸置換(一個或多個)。為了對本文描述的VEGF變體速記命名的目的，請注意數(shù)字是指根據(jù)推定的天然VEGF的氨基酸序列(在Leung等(同上)和Houck等(同上)中提供)的氨基酸殘基位置?！鞍俜直?氨基酸序列同一性”被定義為在進(jìn)行序列比對(并在必要時導(dǎo)入空隙)以獲取最大百分比序列同一性，且不將任何保守置換視為序列同一性的部分之后，候選序列中的氨基酸殘基與參照因子D序列中的氨基酸殘基相同的百分?jǐn)?shù)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法進(jìn)行比對以確定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公眾可得到的計算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括在所比較的序列全長上實現(xiàn)最大比對所需的任何算法。然后相對于較長的序列計算序列同一性，即即使較短的序列與較長序列的部分顯示100%序列同一性,整體序列同一性將低于100%。“百分比)核酸序列同一性”被定義為在進(jìn)行序列比對(并在必要時導(dǎo)入空隙)以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中的核苷酸與參照因子D編碼序列中的核苷酸相同的百分?jǐn)?shù)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法進(jìn)行比對以確定百分比核酸序列同一性，例如，使用公眾可得到的計算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括在所比較的序列全長上實現(xiàn)最大比對所需的任何算法。然后相對于較長的序列計算序列同一性，即即使較短的序列與較長序列的部分顯示100%序列同一性，整體序列同一性將低于100%?！胺蛛x的”核酸分子是這樣的核酸分子，其被鑒定并與至少一種污染性核酸分子分離，其與所述至少一種污染性核酸分子通常在所述核酸的天然來源中締合。分離的核酸分子不同于其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時的形式或環(huán)境。因此，分離的核酸分子不同于存在于天然細(xì)胞中的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括包含在通常表達(dá)編碼的多肽的細(xì)胞中的核酸分子，其中，例如，所述核酸分子存在的染色體位置與天然細(xì)胞的染色體位置不同。“分離的”編碼因子D多肽的核酸分子是這樣的核酸分子，其被鑒定并與至少一種污染性核酸分子分離，其與所述至少一種污染性核酸分子通常在編碼因子D的核酸的天然來源中締合。分離的編碼因子D多肽的核酸分子不同于其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時的形式或環(huán)境。因此，分離的編碼因子D多肽的核酸分子不同于當(dāng)其存在于天然細(xì)胞中時的編碼核酸分子。然而，分離的編碼因子D的核酸分子包括包含在通常表達(dá)因子D的細(xì)胞中的編碼因子D的核酸分子，其中，例如，所述核酸分子存在的染色體位置與天然細(xì)胞的染色體位置不同。以最廣義使用術(shù)語"拮抗劑"，并且其包括能夠中和、阻斷、部分或全部抑制、消除、降低或干擾因子D生物學(xué)活性的任何分子。因子D拮抗劑包括但不限于，抗因子D抗體及其抗原結(jié)合片段，與因子D結(jié)合并能夠中和、阻斷、部分或全部抑制、消除、降低或干擾因子D活性(如因子D參與補(bǔ)體相關(guān)眼病尤其是AMD的病理學(xué)的能力)的其他結(jié)合多肽、肽和非肽小分子。"小分子"在本文中被定義為具有低于約600、優(yōu)選低于約1000道爾頓的分子量。在因子D拮抗劑的語境中，"活性的"或"活性"或"生物學(xué)活性"是拮抗(部分或全部抑制)因子D的生物學(xué)活性的能力。優(yōu)選的因子D拮抗劑的生物學(xué)活性是實現(xiàn)因子D相關(guān)疾病或病癥、如例如補(bǔ)體相關(guān)眼病、尤其是AMD的狀態(tài)例如病理學(xué)的可測改善的能力?？梢栽隗w外或體內(nèi)測試(包括結(jié)合測定)中使用相關(guān)動物模型或人臨床試驗來測定活性。
術(shù)語"抗體"以最廣義使用，并且具體包括但不限于，單個單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑和中和抗體)和具有多表位特異性的抗體組合物。術(shù)語"單克隆抗體"在本文中使用時是指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變之外，構(gòu)成群體的各個抗體是相同的。術(shù)語"單克隆抗體"在本文中使用時是指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變之外，構(gòu)成群體的各個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與常規(guī)(多克隆)抗體制劑(其典型地包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體)相比，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單克隆”指示當(dāng)從基本上同質(zhì)的抗體群獲得時抗體的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等(1975)Nature256:495描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過重組DNA方法(見，例如，美國專利號4，816，567)制備。例如，也可以使用在Clackson等(1991)Nature352:624-628和Marks等(1991) J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫中分離"單克隆抗體"。單克隆抗體在本文中具體地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利N0.4，816，567 ;和 Morrison 等(1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855)。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于大部分情況，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高可變區(qū)域的殘基用來自具有所需特異性、親合力和能力的非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高可變區(qū)域的殘基替換。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)域(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個、典型地兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白序列的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體還將任選包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請見 Jones 等(1986)Nature321:522-525 ;Riechmann 等(1988)Nature332:323-329 ;和 Presta(1992) Curr.0p.Struct.Biol.2:593_596。“物種依賴性抗體”是這樣的抗體，其對于來自第一哺乳動物物種的抗原比其對于來自第二哺乳動物物種的該抗原的同源物具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力。正常地，該物種依賴性抗體“特異性地結(jié)合”至人抗原(即具有不超過大約1x10_7M，優(yōu)選不超過大約1x10_8M且最優(yōu)選不超過大約IxlO-9M的結(jié)合親和力(Kd)值)，但對來自第二非人哺乳動物物種的該抗原的同源物具有的結(jié)合親和力比其對該人抗原的結(jié)合親和力弱至少大約50倍，或至少大約500倍，或至少大約1000倍。物種依賴性抗體可以是上文定義的多種抗體類型的任何一種，但是優(yōu)選是人源化抗體或人抗體。用于本文時，“抗體突變體”或“抗體變體”指抗體的氨基酸序列變體，其中所述抗體的一或多個氨基酸殘基已經(jīng)被修飾。這些突變體必然與參考抗體具有不足100%的序列同一性或相似性。在優(yōu)選實施方案中，所述抗體突變體具有這樣的氨基酸序列，其與參考抗體的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，并且最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于該序列的同一性或相似性在本文中被定義為:在進(jìn)行序列比對(并在必要時導(dǎo)入空隙)來獲得最大百分比序列同一性后，候選序列中的氨基酸殘基與參考抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即來自基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)的相同組的氨基酸殘基)的百分比。N端、C端或內(nèi)部延伸、缺失或插入可變結(jié)構(gòu)域外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染組分是會干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可包括酶，激素，及其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至，⑴如通過勞里方法(Lowrymethod)測定的超過95重量％的抗體，并且最優(yōu)選超過99重量％，(2)通過使用轉(zhuǎn)杯式序列分析儀(spinning cup sequenator)足夠獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)通過SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)，或優(yōu)選銀染色，達(dá)到同質(zhì)性(homogeneity)。分離抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因為所述抗體的天然環(huán)境中的至少一個組分將不存在。但是，一般分離的抗體將通過至少一步純化步驟來制備。當(dāng)在本文中使用時，“抗體可變區(qū)”指抗體分子的輕鏈和重鏈的部分，其包括互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs:即⑶R1、⑶R2和⑶R3)和構(gòu)架區(qū)(FRs)的氨基酸序列。重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。'指輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明所用方法，指定到CDRs和FRs的氨基酸位點可以根據(jù)Kabat來定義(免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),國家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, Md.1987 和1991)?？贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號也是根據(jù)Kabat編號。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)” (OTRs:BP⑶R1，⑶R2和⑶R3)是指抗體可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，其存在對于抗原結(jié)合是必需的。每個可變結(jié)構(gòu)域通常具有鑒定為⑶R1XDR2和⑶R3的三個⑶R區(qū)。每個互補(bǔ)決定區(qū)可包含來自Kabat所定義的“互補(bǔ)決定區(qū)”的氨基酸殘基(即大約為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34 (LI)，50-56 (L2)和89-97 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35 (Hl)，50-65 (H2)和95-102 (H3) ;Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版 Public HealthService,國家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD.(1991)和/或來自“高變環(huán)(hypervariable loop) ”的那些殘基(即大致為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基 26-32 (LI) ,50-52 (L2)和 91-96 (L3)，及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和96-101 (H3) ;Chothia 和 Lesk (1987) J.Mol.Biol.196:901-917)。有些情況下，互補(bǔ)決定區(qū)能包括來自根據(jù)Kabat定義的⑶R區(qū)和高變環(huán)的氨基酸。例如，抗體4D5的重鏈的⑶RHl包括氨基酸26-35?！皹?gòu)架區(qū)”(后文是FR)是⑶R殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。每個可變結(jié)構(gòu)域通常具有鑒定為FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的四個FR。如果所述⑶R根據(jù)Kabat來定義，輕鏈 FR 殘基大致位于殘基 1-23 (LCFRl)，35-49 (LCFR2)，57-88 (LCFR3)，和 98-107 (LCFR4)，并且重鏈FR殘基大致位于重鏈殘基的殘基1-30 (HCFRl)，36-49 (HCFR2)，66-94 (HCFR3)，和103-113 (HCFR4)。如果所述CDR包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，輕鏈FR殘基大致位于輕鏈中的殘基 1-25 (LCFRl)，33-49 (LCFR2)，53-90 (LCFR3)，和 97-107 (LCFR4)，且重鏈 FR 殘基大致位于重鏈殘基的殘基 1-25 (HCFRl)，33-52 (HCFR2)，56-95 (HCFR3)，和 102-113 (HCFR4)。有些情況下，當(dāng)CDR包含來自根據(jù)Kabat定義的CDR和高變環(huán)的那些氨基酸時，F(xiàn)R殘基會相應(yīng)調(diào)整。例如，當(dāng)⑶RHl包括氨基酸H26-H35時，重鏈FRl殘基在位點1_25且FR2殘基在位點36-49。當(dāng)在本文中使用時，“密碼子組”是指用于 編碼所需變體氨基酸的不同核苷酸三聯(lián)體序列的組。可以通過例如固相合成來合成一組寡核苷酸，包括表示由密碼子組提供的核苷酸三聯(lián)體的所有可能的組合并且將編碼所需的氨基酸組的序列。密碼子指定的標(biāo)準(zhǔn)形式是IUB代碼的形式，其在本領(lǐng)域中是已知的并且在本文中得到描述。密碼子組通常由3個斜體的大寫字母表示，例如NNK、NNS, XYZ、DVK等。因此當(dāng)在本文中使用時，“非隨機(jī)密碼子組”是指編碼部分(優(yōu)選完全地)滿足本文中所述的氨基酸選擇標(biāo)準(zhǔn)的選定的氨基酸的密碼子組。在本領(lǐng)域中，在特定位置具有選定的核苷酸“簡并性”的寡核苷酸的合成是已知的，例如TRM方法(Knappek等(1999) J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)296:57-86)；Garrard & Henner (1993) Gene (基因)128:103)?？梢允褂蒙虡I(yè)核酸合成儀(例如可從Applied Biosystems, Foster City, Calif.獲得)來合成或者在商業(yè)上獲得(例如從LifeTechnologies, Rockville, Md.)這樣一組具有特定密碼子組的寡核苷酸。因此,合成的具有特定密碼子組的一組寡核苷酸組通常將包括具有不同序列的多個寡核苷酸，所述不同由整個序列內(nèi)的密碼子組產(chǎn)生。如根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸具有這樣的序列，其允許與可變結(jié)構(gòu)域核酸模板雜交并且還可以包括(但不是必須包括)可用于例如克隆目的的限制性酶位點。術(shù)語"抗體片段"被最廣義地用于本文中并且包括但不限于，F(xiàn)ab、Fab'、F{ah' )2、scFv、(scFv)2、dAb,和互補(bǔ)決定區(qū)(CTR)片段,線性抗體,單鏈抗體分子,微抗體(minibody),雙抗體,和由抗體片段形成的多特異性抗體?！癋v”片段是包含完整的抗原識別和結(jié)合位點的抗體片段。此區(qū)域由一個重鏈的和一個輕鏈的可變區(qū)緊密連接的二聚體組成，該連接(如在scFv中)可以是共價性質(zhì)的。在此構(gòu)型中，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個CDR相互作用來定義Vh-'二聚體表面上的抗原結(jié)合位點。共同地，六個⑶R或其亞組(subset)賦予所述抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使單一可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含三個對抗原特異的CDR的Fv的一半)也具有識別并結(jié)合抗原的能力，雖然通常與完整的結(jié)合位點相比其親合力較低。“Fab”片段包括 輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHI)。F(ab' )2抗體片段包含一對Fab片段，其通常在它們的羧基末端附近通過它們之間的鉸鏈半胱氨酸來共價連接。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)法也是本領(lǐng)域已知的?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。一般而言，F(xiàn)v多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成期望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies (單克隆抗體藥理學(xué)),Vol.113, Rosenburg 和 Moore 編輯，Springer-Verlag,New York, pp.269-315(1994)。術(shù)語“雙抗體(diabodies) ”是指帶有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段包含在相同多肽鏈(Vh和')中連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)。通過使用太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對的接頭，迫使結(jié)構(gòu)域與另一個鏈上的互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體在例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;和Hollinger 等(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)，90:6444-6448 中有更充分的描述?！熬€性抗體”的表述是指在 Zapata 等(1995Protein Eng, 8 (10) =1057-1062)中描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd片段(Vh-Ch1-Vh-Chi),其與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。I1.詳沭老年件昔斑奪件(AMD)老年性黃斑變性(AMD)是緩慢進(jìn)展的退行性疾病，其最終將喪失中央視覺。取決于疾病的嚴(yán)重度，可以將AMD分為四類，所述四類具有在以下表I中列出的特征。表I

權(quán)利要求
1.用于評估人受試者發(fā)生晚期老年性黃斑變性(AMD)的風(fēng)險的方法，所述方法包括: (a)確定來自所述受試者的生物樣品中多個獨立基因座處AMD相關(guān)的常見等位變體的風(fēng)險等位基因的存在或不存在，和 (b)計算所述受試者的多基因計分， 其中，聞的多基因計分指不發(fā)生晚期AMD的更聞風(fēng)險。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在至少100，或至少500，或至少1000，或至少2500，或至少5，000,或至少7，500,或至少10，000個獨立基因座處確定等位頻率。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者已經(jīng)被診斷患有早期AMD。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者已經(jīng)被診斷患有中期AMD。
5.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括評估所述受試者的個人歷史的一個或多個方面。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述一個或多個方面選自由以下各項組成的組:年齡、種族、體重指數(shù)、飲酒史、吸煙史、鍛煉史、飲食、AMD或其他老年性眼病的家族史，包括親屬在其被診斷時的年齡，以及AMD治療的個人歷史。
7.權(quán)利要求1的方法，其中通過從所述樣品擴(kuò)增核酸來確定風(fēng)險等位基因的存在或不存在。
8.權(quán)利要求7的方法，其中擴(kuò)增包括PCR。
9.權(quán)利要求7的方法，其中用于擴(kuò)增的引物位于芯片上。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述用于擴(kuò)增的引物對所述常見遺傳變體的等位基因具有特異性。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述擴(kuò)增包括:(i)將擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對與分離自所述生物樣品的核酸模板混合，其中所述引物或引物對與鄰近或包括多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)或部分互補(bǔ)，并且能夠利用聚合酶在所述核酸模板上起始核酸聚合；和，b)在包含聚合酶和所述模板核酸的DNA聚合反應(yīng)中延伸所述引物或引物對以生成擴(kuò)增子。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述擴(kuò)增子通過包括以下一項或多項的方法檢測:將所述擴(kuò)增子雜交到陣列，利用限制性酶消化所述擴(kuò)增子，或?qū)崟rPCR分析。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所述擴(kuò)增包括使用分離自所述生物體或生物樣品的核酸作為PCR、RT-PCR或LCR中的模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)，或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)。
14.權(quán)利要求7的方法，所述方法還包括切割擴(kuò)增的核酸。
15.權(quán)利要求7的方法，其中所述樣品來源于唾液或血液。
16.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括以下步驟:決定對于所述受試者進(jìn)行AMD診斷測試的時機(jī)和/或頻率。
17.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括以下步驟:決定對于所述受試者進(jìn)行AMD治療的時機(jī)和/或頻率。
18.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括以下步驟:對被鑒定為具有增加的發(fā)生晚期AMD的風(fēng)險的受試者進(jìn)行AMD治療。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述治療包括給予選自由抗因子D抗體、抗VEGF抗體、CRIg和CRIg-1g融合體組成的組的藥物。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述治療包括給予抗因子D抗體。
21.權(quán)利要求1的方法，其中對于在表I中列出的所有單核苷酸多態(tài)性，確定風(fēng)險等位基因的存在或不存在。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述多基因計分根據(jù)所述確定進(jìn)行計算。
23.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括以下步驟:在計算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄所述確定的結(jié)果。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)果被傳達(dá)給所述受試者或所述受試者的醫(yī)生。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述結(jié)果被記錄成報告的形式。
26.包含權(quán)利要求1的方法的結(jié)果的報告。
27.用于評估人受試者發(fā)生晚期老年性黃斑變性(AMD)的風(fēng)險的方法，所述方法包括確定來自所述受試者的生物樣品中多個獨立基因座處AMD相關(guān)的常見等位變體的風(fēng)險等位基因的存在或不存在。
28.權(quán)利要求27的方法，其中被評估的風(fēng)險等位基因不包括補(bǔ)體rsl0737680和rsl329424 (補(bǔ)體因子 H) ；rs2285714 (補(bǔ)體因子 I) ；rs429608 和 rs9380272 (補(bǔ)體 C2)，rs3793917 (HTRAl);和 rs2230199 (補(bǔ)體 C3)。
29.權(quán)利要求27或28的方法，所述方法還包括以下步驟:確定所述受試者的多基因計分。
30.權(quán)利要求29的方法，其中高的多基因計分指示所述受試者將發(fā)生晚期AMD的增加的可能性。`
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定具有更大風(fēng)險進(jìn)展為晚期老年性黃斑變性(AMD)的患有中期AMD的個體的方法，所述方法使用基于全基因組基因關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果計算的多基因計分，并且使用數(shù)千種單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
文檔編號C12Q1/68GK103201393SQ201180052312
公開日2013年7月10日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者蒂莫西·W·貝倫斯, 羅伯特·R·格雷厄姆 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司