專利名稱：：可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用生物工程方法構(gòu)建可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的方法。
背景技術(shù)：
：低醇啤酒既具有啤酒應(yīng)有的啤酒風味，又具有多飲不醉的優(yōu)點，同時也符合當今消費者日益重視身體健康的消費趨勢，加上婦女對酒精過敏男士對低醇啤酒的喜愛，低醇啤酒正在走俏。啤酒乙醇的含量是決定低醇啤酒的關(guān)鍵指標，它直接關(guān)系到啤酒的品質(zhì)。如何解決啤酒中乙醇的含量是生產(chǎn)低醇啤酒的關(guān)鍵。目前，降低啤酒中乙醇含量的辦法有很多種，其中最理想的方法之一就是構(gòu)建低醇啤酒基因工程菌株，通過對工業(yè)用釀酒酵母本身進行改造來生產(chǎn)低醇啤酒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種通過基因克隆技術(shù)，將出發(fā)工業(yè)用釀酒酵母菌株進行了基因改造的方法，從而構(gòu)建可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株。上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其組成包括選取工業(yè)用釀酒酵母菌株，進行初始處理，通過聚合酶鏈式反應(yīng)即PCR擴增獲得缺失乙醇脫氫酶(以下簡稱AADHI)釀酒酵母菌株，即將其自身乙醇脫氫酶I基因剔除后，將外源枯草芽孢桿菌的乙醇脫氫酶I，以下簡稱BADHI基因轉(zhuǎn)入剔除后的酵母體內(nèi)，使基因酵母菌株的乙醇、雙乙酰和乙醛含量改變，釀酒酵母BADHI-△ADHI保藏在CCTCC保藏號M207161。具體過程包括l.枯草芽孢桿菌(B.subtilis)中ADHI基因的克隆(BADHI);2.重組質(zhì)粒pYC6/CT-BADHI的構(gòu)建；3AADHI釀酒酵母菌株的獲得；4恢復突變酵母BADHI-△ADHI的獲得；5HDY-01酵母(釀酒酵母，由黑龍江大學生命科學學院微生物重點實驗室保存)、AADHI酵母、BADHI-AADHI酵母酶活力測定；6遺傳穩(wěn)定性試驗；7HDY-01酵母、AADHI酵母、BADHI-△ADHI酵母發(fā)酵實驗。這個技術(shù)方案有以下有益效果通過本發(fā)明，成功構(gòu)建了釀酒酵母的ADHI缺失菌株和恢復突變酵母BADHI-AADHI。BADHI-AADHI經(jīng)過連續(xù)15天發(fā)酵實驗證明，其乙醇含量、乙醛含量和雙乙酰含量均較出發(fā)菌株有所降低。HDY-Ol酵母、AADHI酵母、BADHI-△ADHI酵母酶活力測定ADHI在代謝過程中產(chǎn)生的H+可以和NAD〃即氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH，NADH在0D340nm下有最大吸光值，我們通過測定NADH的吸光值變化情況就可以反映出ADHI酶活力大小。酶活定義為單位濕細胞在單位時間使吸光值每發(fā)生0.001的改變定義為一個酶活。測定結(jié)果表明在相同條件下HDY-01酵母ADHI酶活力最強，AADHI酵母菌酶活力最弱，而BADHI-AADHI酵母菌酶活力位于兩者之間。這是由于AADHI酵母菌酶喪失了ADHI基因不能代謝生成乙醇,所以在檢測過程中酶活力處于最低，而BADHI-AADHI酵母菌由于轉(zhuǎn)入了枯草芽孢桿菌的BADHI基因，此基因與釀酒酵母的YADHI基因相比，酶活力不如YADHI基因，所以BADHI-AADHI酵母菌的酶活力在測定過程中要比HDY-01酵母的酶活力低。遺傳穩(wěn)定性試驗HDY-01酵母在含有100Pg/毫升潮霉素的YPD平板上不能生長，也不能在含有5(Hig/毫升的Blasticidin的YPD平板上生長，而AADHI酵母菌在含有10(^g/毫升潮霉素的平板上能夠生長，因為其中引物了從質(zhì)粒pCAMBIA克隆的潮霉素抗性基因片段。BADHI-AADHI酵母菌能夠在含50Pg/毫升的Blasticidin的YPD平板上生長，因為其中轉(zhuǎn)入了pYC6/CT質(zhì)粒，質(zhì)粒上帶有Blasticidin抗性標記。將傳代的每一代AADHI酵母菌均勻涂布在含lOO^g/毫升潮霉素的YPD平板上,BADHI-AADHI酵母菌每一代涂布在含5(mg/毫升的Blasticidin的YPD平板上，抗性傳代12代后菌株性能保持穩(wěn)定。酶活力檢測表明，連續(xù)傳代12代后，酶活力保持穩(wěn)定。HDY-01酵母、AADHI酵母、BADHI-AADHI酵母發(fā)酵實驗在啤酒發(fā)酵產(chǎn)物當中，決定啤酒是否是低醇啤酒的關(guān)鍵指標就是乙醇含量；乙醛含量則是決定啤酒口感的關(guān)鍵指標。雙乙酰含量不僅關(guān)系到啤酒口味還影響著啤酒發(fā)酵的周期。由于以上原因，我們要對發(fā)酵液中的乙醇含量，乙醛含量和雙乙酰含量，以及其他成分進行測定。HDY-01酵母、△ADHI酵母、BADHI-AADHI酵母菌分別接種于100毫升YPD液體培養(yǎng)基中，30'C，200轉(zhuǎn)/分鐘，過夜培養(yǎng)，作為種子液。然后以1:4的接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基中12'C低溫發(fā)酵15天，分別測定每天的發(fā)酵參數(shù)。其中乙醛利用氣象色譜Agilent6890型號測定，雙乙酰利用氣象色譜測PEClaus500型號測定，乙醇利用蒸餾密度瓶法測定，殘?zhí)抢锰嵌扔?WYT-10-3296)測定，懸浮酵母數(shù)利用顯微鏡直接計數(shù)法測定。結(jié)果顯示HDY-01酵母、△ADHI酵母、BADHI-△ADHI酵母菌15天發(fā)酵的過程中，乙醛含量的平均值分別為1.51毫克/升(mg/L)、1.72mg/L和1.51mg/L，說明我們最后構(gòu)建的低醇啤酒酵母BADHI-AADHI與出發(fā)工業(yè)菌株是一致的。乙醇含量結(jié)果顯示，三株菌的乙醇平均值分別為0.38(V/V)、0(V/V)和0.27(V/V)，這表明，低醇啤酒酵母BADHI-AADHI的乙醇含量較出發(fā)菌株低28%，達到了我們構(gòu)建低醇啤酒酵母的目的。從雙乙酰含量來看，三株菌的雙乙酰的平均值為17.41納克/克(卯b)、20.82(卯b)和8.54(卯b)，低醇啤酒酵母BADHI-AADHI的雙乙酰含量較出發(fā)菌株低了51%。8由此可見，構(gòu)建的低醇啤酒酵母BADHI-AADHI在乙醇、，乙酰和乙醛指標中，均較出發(fā)菌株有所改善，說明菌株構(gòu)建成功。圖l為質(zhì)粒pGMT-BADHI。圖2為pYC6/CT-BADHI構(gòu)建過程。圖3AADHI酵母的構(gòu)建過程。具體實施例方式實施例1:本專利用菌種所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的初始階段包括設(shè)計引物并進行擴增，回收純化的BADHI基因片段與T-載體pGMT-easy的16C連接過夜，連接產(chǎn)物pGMT-BADHI轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，以下簡稱^coh'DH5a后，使用Sangon麗IQ-200質(zhì)粒大量抽提試劑盒(SK241)提取重組質(zhì)粒DNA,回收。釀酒酵母BADHI-AADHI(AiccAaAwwyc"cereWsiVie)保藏在CCTCC保藏號M207161，保藏日期2007年10月16日。釀酒酵母BADHI-AADHI30'C培養(yǎng)在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，以下簡稱YPD培養(yǎng)基中，其成分為1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，12rC滅菌30分鐘。實施例2:實施例l所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的設(shè)計引物為首先進行枯草芽孢桿菌(AsW"h's)中ADHI基因的克隆(BADHI)包括根據(jù)GeneBank登陸的枯草芽孢桿菌ADHI基因序列(NC000964),設(shè)計一對特異性引物，每個引物30個堿基，用于擴增ADHI基因。在上游和下游分別加上XbaI的識別位點(斜線表示)。BADH上游引物5，一AGT7tT力fi4ATGCAGAAATTCCACACATTTG~3，；BADH下游引物5'~€GAATGCJfi476TGGATTTTGCCATATTCAC—3，。所述的擴增為用滅菌牙簽挑取少許對數(shù)生長時期的枯草芽孢桿菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90'C擴增過程擴增2小時，即可將枯草芽孢桿菌細胞破碎，使全基因組DNA游離出來，作為模板。其10ML反應(yīng)體系如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>94°Cl分鐘，56°Cl分鐘，72°C3分鐘，35個循環(huán)，擴增BADHI基因片段。實施例3:實施例1或2所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的回收是將PCR產(chǎn)物用上海華舜生物工程有限公司DNA膠回收試劑盒(GelExtraction分鐘iKit)進行回收，回收純化的BADHI基因片段與T-載體pGMT-easy的16t)連接過夜(如下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>連接產(chǎn)物命名為pGMT-BADHI,連接產(chǎn)物pGMT-BADHI轉(zhuǎn)化Aco7/DH5a后，使用Sangon麗IQ-200質(zhì)粒大量抽提試劑盒(SK241)提取重組質(zhì)粒DNA，備用。實施例4:以上實施例所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pYC6/CT-BADHI過程中為使BADHI基因與表達載體pYC6/CT進行連接，首先通過XbaI單酶切pGMT-BADHI和pYC6/CT,酶切體系如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pYC6/CT-BADHI包括的酶切為單酶切產(chǎn)物，容易發(fā)生自連，我們將單酶切后的線性pYC6/CT質(zhì)粒進行去磷酸化處理，防止自連的發(fā)生。在質(zhì)粒pYC6/CT酶切反應(yīng)后的Eppendorf管中，加入25uL10Xbuffer緩沖液、5uL堿性磷酸酶CIP和20uL雙蒸水，溫和混勻，37°C30分鐘后，用酚/氯仿抽提，至界面干凈。然后加1/10體積的3M醋酸鈉(NaAC)(pH7.0)，2.5倍體積預冷無水乙醇，一20'C沉淀30分鐘以上，離心(13000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C)10分鐘，回收質(zhì)粒DNA。用70%預冷乙醇洗滌，離心(13000r/分鐘，4°C)3分鐘，真空干燥，力tU00uLTE(l倍三羥甲基氨基甲垸，乙二胺四乙酸)將DNA完全溶解，分裝后存于一20'C。將l叱酶切后的pGMT-BADHI和l叱酶切并去磷酸化的pYC6/CT，和1叱T4DNA連接酶和7吣雙蒸水混合均勻，16'C連接反應(yīng)過夜，構(gòu)建成pYC6/CT-BADHI質(zhì)粒。pYC6/CT-BADHI質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2所示實施例5:以上實施例所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的通過PCR擴增獲得AADHI釀酒酵母菌株的過程包括通過PCR擴增兩端含有與YADHI同源片段的潮霉素基因片段和PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化酵母菌。所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的通過PCR擴增兩端含有與YADHI同源片段的潮霉素基因片段過程是設(shè)計一對引物L1、L2，此引物是依據(jù)釀酒酵母YADHI基因和質(zhì)粒pCAMBIA中的潮霉素基因設(shè)計的，該引物是用來擴增轉(zhuǎn)入的目的基因片段，既帶有與YADHI基因序列同源部分的潮霉素基因片段，引物序列如下Ll5'HTCW6tT，口,超③7T力釘覆1yOATGATGAAAAAGCCTGMCTCACCG3'L25'i77j7771蘊雄扁塒賴，"A4y47TffiCTTACTATTTCTTTGCCCTCGGACG3，其中引物兩端各有40個堿基(bp)序列(斜體部分)是和釀酒酵母HDY-Ol中YADHI基因同源部分，其他部分是潮霉素引物序列；將含有質(zhì)粒pCAMBIA的大腸桿菌于含有潮霉素的LB液體培養(yǎng)基中37'C,180轉(zhuǎn)/分鐘過夜搖床培養(yǎng)；提取pCAMBIA質(zhì)粒DNA作為模板，PCR擴增兩端含有與YADHI同源片段的潮霉素基因片段，PCR反應(yīng)體系如下反應(yīng)物加入量終濃度lOXPCRbufferl叱IX2,5mMdNTP0.8叱2mMLll叱10pmol/叱1PL1Opmol/PLpCAMBIA質(zhì)粒2JAL50ng/A2.5mMMgCL20.8叱2mMTaq酶0.2叱2瞧ddH203.2fiLIO叱94。Cl分鐘，l分鐘，72°C3分鐘，35個循環(huán)。潮霉素殺傷曲線的繪制為了確定抑制釀酒酵母HDY-01生長的最低潮霉素濃度，準備5個酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，以下簡稱YPD平板，用涂布棒將不同濃度的潮霉素均勻涂在每個平板上，然后將預先過夜培養(yǎng)的酵母菌液取0.2毫升均勻涂布在平板上，30'C培養(yǎng)48小時后觀察結(jié)果(涂布的潮霉素濃度分別為25微克/毫升、50微克/毫升、75微克/毫升、100微克/毫升、125微克/毫升)。以酵母菌不能生長的最低濃度作為篩選濃度獲得的重組子通過在含有100微克/毫升潮霉素平板上培養(yǎng)進行抗性驗證，通過PCR擴增進行轉(zhuǎn)化驗證；這對引物為直接擴增潮霉素基因片段引物，兩段不含有與YADHI基因片段的同源序列。所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，所述的通過PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化酵母菌的過程是將活化的釀酒酵母HDY-Ol挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時。取100毫升菌液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；在離心管中加入40毫升1XTE清洗菌體，然后3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液；加入2毫升1XLiAc/0.5XTE(1倍醋酸鋰/40%聚乙二醇/1倍三羥甲基氨基甲垸，乙二胺四乙酸)，室溫放置10分鐘；制成酵母菌感受態(tài)細胞；取一干凈的1.5毫升離心管，在其中依次加入10化PCR產(chǎn)物(含有與YADHI基因同源序列的潮霉素基因片段)，10.7ML魚鮭精DNA，100ML酵母菌HDY-Ol感受態(tài)細胞，700^LlXLiAc/40PEG-4000/1XTE混合，30。C反應(yīng)30分鐘；反應(yīng)完畢再離心管中加入88化DMS0原液混合均勻，40'C水浴中熱激7分鐘；熱激結(jié)束后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，棄上清，然后再離心管中加入1亳升1XTE清洗2次；13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒棄上清；在離心管中加入50-IOOMLIXTE，將其涂布于含有潮霉素的YPD平板上，30'C培^48小時。這對引物為直接擴增潮霉素基因片段引物，兩段不含有與YADHI基因片段的同源序列。因為如果含有與YADHI基因同源序列那么在PCR擴增驗證的時候?qū)绊懸锱c模板的結(jié)合。PCR反應(yīng)體系與程序與前述相同，其中模板為所得的陽性重組子基因組DNA,這里將得到的陽性重組子YADHI基因缺陷的釀酒酵母命名為AADHI酵母?；謴屯蛔兘湍窧ADHI-AADHI的獲得質(zhì)粒pYC6/CT-BADHI轉(zhuǎn)化AADHI酵母后，使缺失YADHI基因的AADHI酵母重新獲得了BADHI，又重新具有了乙醇脫氫酶的代謝能力，我們將恢復突變酵母命名為BADHI-AADHI酵母。Blasticidin即滅瘟素的抑菌濃度的測定為了確定抑制AADHI酵母生長的最低滅瘟素(Blasticidin)濃度，準備5個YPD平板，用涂布棒將不同濃度的Blasticidin均勻涂在每個平板上，然后將預先過夜培養(yǎng)的酵母菌液取O.2毫升均勻涂布在平板上，30'C培養(yǎng)48小時后觀察結(jié)果(涂布的Blasticidin濃度分別為25微克/毫升、50微克/毫升、75微克/毫升、100微克/毫升、125微克/毫升)。以酵母菌不能生長的最低濃度作為篩選濃度受體菌的前處理將AADHI酵母在YPD培養(yǎng)基上進行活化，并用"三區(qū)化線法"進行分離，30'C培養(yǎng)直至在第三區(qū)長出單菌落；將單菌落用無菌牙簽挑出，放進含有10毫升YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30'C，300轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)過夜。測定三角瓶中菌的波長=600納米下的光密度(以下簡稱OD600nm)，使其在稀釋至50毫升時的0D600nm值為0.4，計算需要加多少的菌液于50毫升培養(yǎng)基中。加入后繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時。質(zhì)粒pYG6/GT-BADHI轉(zhuǎn)化AADHI酵母將活化的AADHI酵母挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時。取100毫升菌液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清。在離心管中加入40毫升1XTE清洗菌體，然后3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液。加入2毫升1XLiAc/0.5XTE，室溫放置10分鐘。制成酵母菌感受態(tài)細胞。取一干凈的1.5毫升離心管，在其中依次加入質(zhì)粒DNApYC6/CT-BADHI，10.7ML魚鮭精DNA，100MLAADHI酵母菌感受態(tài)細胞，700叱1XLiAc/40PEG-4000/1XTE混合，30'C反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完畢再離心管中加入88jiLDMS0原液混合均勻，40'C水浴中熱激7分鐘。熱激結(jié)束后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，棄上清，然后再離心管中加入1毫升1XTE清洗2次。13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒棄上清。8、在離心管中加入50-100jiLlXTE，將其涂布于含有Blasticidin的YPD平板上，30'C培養(yǎng)48小時。將空質(zhì)粒(保存于￡轉(zhuǎn)化作為陽性對照，以及不涂菌液的空白作為負對照。這樣所獲得重組酵母為具有枯草芽孢桿菌乙醇脫氫酶的酵母菌，命名為BADHI-AADHI酵母。權(quán)利要求1.一種可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其組成包括選取工業(yè)用釀酒酵母菌株，其特征是進行初始處理，通過聚合酶鏈式反應(yīng)即PCR擴增獲得缺失乙醇脫氫酶的ΔADHI釀酒酵母菌株，即將其自身乙醇脫氫酶I基因剔除后，將外源枯草芽孢桿菌的乙醇脫氫酶I即BADHI基因轉(zhuǎn)入剔除后的酵母體內(nèi)，使基因酵母菌株的乙醇、雙乙酰和乙醛含量改變，釀酒酵母BADHI-ΔADHI保藏在CCTCC保藏號M207161。2.根據(jù)權(quán)要求l所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，,其特征是所述的初始階段包括設(shè)計引物并進行擴增，回收純化的BADHI基因片段與T-載體pGMT-easy在16X:連接過夜，連接產(chǎn)物pGMT-BADHI轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Eco力'DH5a后，使用SangonMNIQ-200質(zhì)粒大量抽提試劑盒SK241提取重組質(zhì)粒DNA，回收。3.根據(jù)權(quán)要求2所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是所述的設(shè)計引物為首先進行枯草芽孢桿菌(及s"力"7h)中ADHI基因的克隆(BADHI)包括根據(jù)GeneBank基因文庫登陸的枯草芽孢桿菌ADHI基因序列(NC000964)，設(shè)計一對特異性引物，每個引物30個堿基，用于擴增ADHI基因，在上游和下游分別加上酶切工具酶XbaI的識別位點(斜線表示)，BADH上游引物5，一AGT7tT力WATGCAGAAATTCCACACATTTG—3，；BADH下游引物5，一GGMTGCJfi47T71GGATTTTGCCATATTCAC—3，，所述的擴增為用滅菌牙簽挑取少許對數(shù)生長時期的枯草芽孢桿菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90'C擴增過程擴增2小時，即可將枯草芽孢桿菌細胞破碎，使全基因組DNA游離出來，作為模板。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是所述的回收是將PCR產(chǎn)物用上海華舜生物工程有限公司DNA膠回收試劑盒進行回收，回收純化的BADHI基因片段與T-載體pGMT-easy的16"C連接過夜，連接產(chǎn)物命名為pGMT-BADHI，連接產(chǎn)物pGMT-BADHI轉(zhuǎn)化大腸桿菌Acoh'DH5a后，使用Sangon麗IQ-200質(zhì)粒大量抽提試劑盒(SK241)提取重組質(zhì)粒DNA，備用o5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pYC6/CT-BADHI過程中為使BADHI基因與表達載體pYC6/CT進行連接，首先通過XbaI單酶切pGMT-BADHI和pYC6/CT，酶切體系如下表反應(yīng)物pGMT-BADH(A)pYC6/CT(B)質(zhì)粒DNA(1微克/5ML5ML微升)(^g/WJ1MLl叱Xbal(5U/ML)2PL2叱IOX緩沖液12叱12叱ddH20(雙蒸水)6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是所述的構(gòu)建重組質(zhì)粒pYC6/CT-BADHI包括的酶切為單酶切產(chǎn)物，容易發(fā)生自連，我們將單酶切后的線性pYC6/CT質(zhì)粒進行去磷酸化處理，防止自連的發(fā)生。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是所述的通過PCR擴增獲得AADHI釀酒酵母菌株的過程包括通過PCR擴增兩端含有與酵母的乙醇脫氫酶IYADHI同源片段的潮霉素基因片段和PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化酵母菌。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法,其特征是所述的通過PCR擴增兩端含有與YADHI同源片段的潮霉素基因片段過程是設(shè)計一對引物L1、L2，此引物是依據(jù)釀酒酵母YADHI基因和質(zhì)粒pCAMBIA(質(zhì)粒名稱，購自Irwitrogen公司)中的潮霉素基因設(shè)計的，該引物是用來擴增轉(zhuǎn)入的目的基因片段，既帶有與YADHI基因序列同源部分的潮霉素基因片段，弓l物序列如下Ll(弓l物名稱)5，7T掘OT服扁ra釘盧m鮮溫ATGATG嵐MGCCTGMCTCACCG3，L2(引物名稱)5'A4C7TJ7Tr^4rA^扁W7(^r扁7T力7]44CW力7T6GCTTACTATTTCTTTGCCCTCGGACG3'其中引物兩端各有40bp(堿基)序列(斜體部分)是和釀酒酵母HDY-01中YADHI基因同源部分，其他部分是潮霉素引物序列；將含有質(zhì)粒pCAMBIA的大腸桿菌于含有潮霉素的LB(Luria-Bertani培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基中37'C，180轉(zhuǎn)/分鐘過夜搖床培養(yǎng)；提取pCAMBIA質(zhì)粒DNA作為模板，PCR擴增兩端含有與YADHI同源片段的潮霉素基因片段，PCR反應(yīng)伴系如下反應(yīng)物加入量終濃度10XPCRbuffer(PCR緩沖液)1PL(微升)IX2.5mMdNTP(堿基名稱)0.帆2mM(毫摩爾)Lll^L10pmol/叱(皮摩爾/微L2肌升)pCAMBIA質(zhì)粒2叱10pmol/ML2.5mMMgCL2(氯化鎂)0.帆50ng/叱Taq酶(來自嗜熱菌的擴增酶)0.2PL2mMddH20(雙蒸水)3.2叱2U/ML娜L94°Cl分鐘，59'Cl分鐘，72°C3分鐘，35個循環(huán)；獲得的重組子通過在含有100微克/毫升潮霉素平板上培養(yǎng)進行抗性驗證，通過PCR擴增進行轉(zhuǎn)化驗證；這對引物為直接擴增潮霉素基因片段引物，兩段不含有與YADHI基因片段的同源序列。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是所述的通過PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化酵母菌的過程是將活化的釀酒酵母HDY-01挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30'C,200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時，取100毫升菌液3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；在離心管中加入40毫升1XTE(即l倍三羥甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)清洗菌體，然后3500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液；加入2亳升1XLiAc/0.5XTE(gpi倍醋酸鋰/0.5倍三羥甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)，室溫放置10分鐘；制成酵母菌感受態(tài)細胞；取一干凈的1.5毫升離心管，在其中依次加入10叱PCR產(chǎn)物(含有與YADHI基因同源序列的潮霉素基因片段)，10.7叱魚鮭精DNA，IOO叱酵母菌HDY-Ol感受態(tài)細胞，700MLlXLiAc/40PEG-4000/1XTE(即1倍醋酸鋰/40%聚乙二醇/l倍三羥甲基氨基甲垸，乙二胺四乙酸)混合，30'C反應(yīng)30分鐘；反應(yīng)完畢再離心管中加入88叱二甲基亞砜DMS0原液混合均勻，40'C水浴中熱激7分鐘；熱激結(jié)束后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，棄上清，然后再離心管中加入1毫升1XTE清洗2次；13000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒棄上清；在離心管中加入50-100叱1XTE，將其涂布于含有潮霉素的酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基YPD平板上，3(TC培熟8小時。全文摘要可用于生產(chǎn)低醇啤酒的基因工程菌株的構(gòu)建方法，低醇啤酒既具有啤酒應(yīng)有的啤酒風味，又具有多飲不醉的優(yōu)點，同時也符合當今消費者日益重視身體健康的消費趨勢，加上婦女對酒精過敏男士對低醇啤酒的喜愛，低醇啤酒正在走俏。啤酒乙醇的含量是決定低醇啤酒的關(guān)鍵指標，它直接關(guān)系到啤酒的品質(zhì)。如何解決啤酒中乙醇的含量是生產(chǎn)低醇啤酒的關(guān)鍵。本發(fā)明的組成包括選取工業(yè)用釀酒酵母菌株，其特征是進行初始處理，通過聚合酶鏈式反應(yīng)即PCR擴增獲得缺失乙醇脫氫酶的ΔADHI釀酒酵母菌株，即將其自身乙醇脫氫酶I基因剔除后，將外源枯草芽孢桿菌的乙醇脫氫酶I即BADHI基因轉(zhuǎn)入剔除后的酵母體內(nèi)，使基因酵母菌株的乙醇、雙乙酰和乙醛含量改變。文檔編號C12N1/19GK101451109SQ20071014473公開日2009年6月10日申請日期2007年12月4日優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日發(fā)明者凌宏志,孫宗祥,剛宋,平文祥,葛菁萍,丹趙申請人:黑龍江大學