專利名稱：一株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)領(lǐng)域，具體地涉及一株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是谷氨酸單體之間以其α-氨基和γ-羧基縮合而成的一種高分子聚合物，聚合度一般大于30萬。γ-PGA可由微生物合成、水溶性好、吸水性強(qiáng)、且生物可降解、對人體無毒害作用，因而被廣泛用于食品、化妝品、水處理、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域。例如，γ-PGA是一種理想的藥物載體，γ-PGA分子鏈上具有高活性的羧基(-COOH)，可與一些藥物結(jié)合生成較穩(wěn)定的復(fù)合物，該復(fù)合物在體內(nèi)可被降解為內(nèi)源性谷氨酸并釋放出藥物。又如γ-PGA的兩次重復(fù)吸水可達(dá)到1108.4倍，比市售的聚丙烯酸鹽類樹脂高2.85倍，因此γ-PGA可用于制備高吸水樹脂，該樹脂對土壤改良、促進(jìn)土壤中團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成、增強(qiáng)土壤通透性和防止土壤侵蝕具有很好的作用。
國內(nèi)外對于γ-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢桿菌屬(Bacillus)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。目前，芽孢菌屬微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，所以未能實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明利用誘變技術(shù)篩選得到一株γ-PGA的高產(chǎn)菌株，并優(yōu)化其發(fā)酵工藝，提高γ-PGA的產(chǎn)量，有效降低了生產(chǎn)成本，實現(xiàn)了γ-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)。


發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是提供一株γ-PGA的高產(chǎn)菌株，本發(fā)明的又一目的是提供該菌株的培養(yǎng)方法及適用的培養(yǎng)基。
(二)技術(shù)方案 本發(fā)明通過物理誘變，篩選出一株高產(chǎn)γ-PGA的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)，該菌株已于2007年7月13日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.2108。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的形態(tài)學(xué)特征為 菌體形態(tài)桿狀，數(shù)個菌體可連成鏈狀，在細(xì)胞生長后期生成芽孢； 菌落特征乳白色，培養(yǎng)24小時后菌落直徑大小為0.3-0.8cm，表面凸起、有褶皺，挑起時有粘稠感。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)特征為 好氧，在有氧條件下才能生長，在γ-PGA的合成階段要有充足的氧氣。最適生長溫度為37℃，最適pH為7，在菌體的生長期pH會降低到5-6，當(dāng)γ-PGA開始合成時pH升高，可達(dá)到8以上。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的誘變篩選方法為挑取出發(fā)菌株CICC 10023(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的單菌落，接入裝有玻璃珠的無菌三角瓶內(nèi)，加30毫升無菌水，以170r/min的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩20min，將菌落打散，制成菌懸液。將裝有菌懸液的平皿置于磁力攪拌器上，用40瓦的紫光燈分別照射1min、2min、3min，然后將三個處理的菌懸液分別稀釋至10-5和10-3，涂發(fā)酵培養(yǎng)基固體平板，避光培養(yǎng)24小時，然后篩選出菌落形態(tài)特征發(fā)生改變的突變株。將初步篩選得到的菌株反復(fù)誘變多次，最終得到本發(fā)明所述的γ-PGA高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)CGMCC No..2108。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)方法為 (1)菌種的活化接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108至斜面培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)48小時或在37℃下培養(yǎng)24小時； (2)種子培養(yǎng)在500ml滅菌的三角瓶內(nèi)裝100ml液體種子培養(yǎng)基，然后將活化的菌種接至種子培養(yǎng)基中，在37℃下、以215-220r/min的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子液； (3)發(fā)酵培養(yǎng)以體積比3％的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，215r-220r/min振蕩培養(yǎng)48-60小時。
其中，所用到的培養(yǎng)基組成為 (1)斜面培養(yǎng)基葡萄糖20g/l，瓊脂15g/l，馬鈴薯200g/l(制法為將200g馬鈴薯去皮洗凈，切成直徑1厘米小塊加水800ml，用500瓦的電爐煮沸20分鐘，紗布過濾，再用去離子水補(bǔ)足至1000ml)，pH自然； (2)種子培養(yǎng)基葡萄糖20-30g/l，酵母膏5-7g/l，谷氨酸鈉20-30g/l，磷酸氫二鉀2g/l，硫酸鎂0.25g/l，pH＝7； (3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40-60g/l，酵母膏5-9g/l，谷氨酸鈉40-60g/l，磷酸氫二鉀2-6g/l，硫酸鎂0.25g/l，pH＝7。
(三)有益效果 本發(fā)明提供的γ-PGA高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCCNO.2108是由購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的納豆芽孢桿菌CICC10023經(jīng)紫外誘變所得，原納豆芽孢桿菌CICC 10023發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量為10.2g/l，經(jīng)過反復(fù)誘變篩選后，目前的γ-PGA高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC NO.2108的最高產(chǎn)量可達(dá)34.1g/l，較原菌株的產(chǎn)量有飛躍性的提高，且該菌株營養(yǎng)要求簡單，傳代穩(wěn)定，高于目前報道的發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的產(chǎn)量。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法簡便易行，所用培養(yǎng)基的原料來源廣泛，價格低廉，有效降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的γ-PGA的高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)LX-3，該菌株已于2007年7月13日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.2108。

具體實施例方式 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1γ-PGA高產(chǎn)菌株的誘變篩選 挑取出發(fā)菌株納豆芽孢桿菌CICC 10023(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的單菌落，接入裝有玻璃珠的無菌250ml三角瓶內(nèi)，加入30毫升無菌水，在HZQ-X100搖床(爾濱東聯(lián)電子公司)上以170r/min的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩20min，將菌落打碎，制成菌懸液。將裝有30ml菌懸液的平皿置于78-1磁力攪拌器(國華電器公司)上，用40瓦紫光燈分別照射1min、2min、3min，然后將三個不同照射劑量的菌懸液分別制成10-5和10-3的稀釋液，涂板(發(fā)酵培養(yǎng)基固體平板的配方見技術(shù)方案部分)，避光培養(yǎng)24小時，篩選出菌落形態(tài)特征發(fā)生改變的突變株。對上述突變體進(jìn)行發(fā)酵檢測，復(fù)篩高產(chǎn)菌株。
本發(fā)明依此方法誘變篩選得到高產(chǎn)突變體枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)CGMCC No.2108。經(jīng)傳代試驗證明，在100代以內(nèi)其生產(chǎn)性能穩(wěn)定。
實施例2枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 (1)菌種活化挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)于斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂15g/l，pH值自然。將接種后的斜面放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48小時。
(2)種子培養(yǎng)取活化好的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCCNo.2108一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中(500ml三角瓶放100ml培養(yǎng)液)，種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸鈉20g/l，磷酸氫二鉀2g/l，硫酸鎂0.25g/l。將接種好的種子培養(yǎng)液放入37℃恒溫?fù)u床中218r/min培養(yǎng)24小時。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液取3ml接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(500ml三角瓶裝100ml發(fā)酵液)，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為甘油40-60g/l，酵母膏5-9g/l，谷氨酸鈉40-60g/l，磷酸氫二鉀2g/l，硫酸鎂0.25g/l。將接好的發(fā)酵培養(yǎng)基放入37℃恒溫?fù)u床上218r/min培養(yǎng)36-72小時。
(4)γ-PGA產(chǎn)量的測定取20ml發(fā)酵液放于500ml三角瓶中，加入已經(jīng)在冰箱中放置過夜的冰無水乙醇40ml，震蕩，直至有沉淀產(chǎn)生，將沉淀取出，放入50℃烘箱中烘烤12小時，取出稱取重量。
檢測結(jié)果用以上培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA產(chǎn)量為6.5g/l。
實施例3枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)于斜面培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48小時后取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中，將接種好的種子培養(yǎng)液放入37℃恒溫?fù)u床中218r/min培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液取3ml接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為檸檬酸40-60g/l，其余組分同實施例2。將接好的發(fā)酵培養(yǎng)基放入37℃恒溫?fù)u床上218r/min培養(yǎng)36-72小時。
檢測結(jié)果用以上培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA產(chǎn)量為8.2g/l。
實施例4枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)于斜面培養(yǎng)基上，將涂好的斜面放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48小時后取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中將接種好的種子培養(yǎng)液放入37℃恒溫?fù)u床中218r/min培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖40-60g/l，其余組分同實施例2。將接好的發(fā)酵培養(yǎng)基放入37℃恒溫?fù)u床上218r/min培養(yǎng)36-72小時。
檢測結(jié)果用以上培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA產(chǎn)量為26.5g/l。檢測結(jié)果說明用葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)方法最終獲得的γ-PGA產(chǎn)量高。
實施例5枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 (1)菌種活化挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)于斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂15g/l，pH值自然。將涂好的斜面放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48小時。
(2)γ-PGA種子培養(yǎng)取活化好的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中(500ml三角瓶放100ml培養(yǎng)液)，種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸鈉20g/l，磷酸氫二鉀2g/l，硫酸鎂0.25g/l。將接種好的種子培養(yǎng)液放入37℃恒溫?fù)u床中218r/min培養(yǎng)24小時。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液取3ml接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(500ml三角瓶裝100ml發(fā)酵液)，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖50g/l，氯化銨5-9g/l，谷氨酸鈉40g/l，磷酸氫二鉀2g/l，硫酸鎂0.25g/l。將接好的發(fā)酵培養(yǎng)基放入37℃恒溫?fù)u床上218r/min培養(yǎng)36-72小時。
(4)γ-PGA產(chǎn)量的測定取20ml發(fā)酵液放于500ml三角瓶中，加入已經(jīng)在冰箱中放置過夜的冰無水乙醇40ml，震蕩，直至有沉淀產(chǎn)生，將沉淀取出，放入50℃烘箱中烘烤12小時，取出稱取重量。
檢測結(jié)果用氯化銨為氮源的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA產(chǎn)量為10.2g/l。
實施例6枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)于斜面培養(yǎng)基上，將涂好的斜面放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48小時后取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中，將接種好的種子培養(yǎng)液放入37℃恒溫?fù)u床中218r/min培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為硫酸銨5-9g/l，其余組分同實施例5。將接好的發(fā)酵培養(yǎng)基放入37℃恒溫?fù)u床上218r/min培養(yǎng)36-72小時。
檢測結(jié)果用硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA產(chǎn)量為12.2g/l。
實施例7枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 挑取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一環(huán)于斜面培養(yǎng)基上，將涂好的斜面放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)48小時后取一環(huán)接于種子培養(yǎng)基中，將接種好的種子培養(yǎng)液放入37℃恒溫?fù)u床中218r/min培養(yǎng)24小時。
將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母膏5-9g/l，其余組分同實施例5。將接好的發(fā)酵培養(yǎng)基放入37℃恒溫?fù)u床上218r/min培養(yǎng)36-72小時。
檢測結(jié)果用酵母膏為氮源的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA產(chǎn)量為26.5g/l。檢測結(jié)果說明用酵母膏為氮源的方法最終獲得的γ-PGA產(chǎn)量高。
實施例8枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培養(yǎng)及γ-PGA檢測 將發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀調(diào)為2-6g/l，培養(yǎng)基其余成分和發(fā)酵工藝同實施例7。
檢測結(jié)果用提高磷酸氫二鉀的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法發(fā)酵獲得的γ-PGA產(chǎn)量為34.1g/l。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCCNo.2108。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株的培養(yǎng)方法為
(1)菌種的活化接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No._2108至斜面培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)48小時或在37℃下培養(yǎng)24小時；
(2)種子培養(yǎng)在500ml滅菌的三角瓶內(nèi)裝100ml液體種子培養(yǎng)基，然后將活化的菌種接至種子培養(yǎng)基中，在37℃下、以215-220r/min的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)以體積比3％的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，215r-220r/min振蕩培養(yǎng)48-60小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所用到的培養(yǎng)基組成為
(1)斜面培養(yǎng)基葡萄糖20g/l，瓊脂15g/l，馬鈴薯200g/l，pH自然；
(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖20-30g/l，酵母膏5-7g/l，谷氨酸鈉20-30g/l，磷酸氫二鉀2g/l，硫酸鎂0.25g/l，pH＝7；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40-60g/l，酵母膏5-9g/l，谷氨酸鈉40-60g/l，磷酸氫二鉀2-6g/l，硫酸鎂0.25g/l，pH＝7。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株γ-聚谷氨酸的高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)CGMCC No.2108，本發(fā)明還提供了該菌株的培養(yǎng)方法及適用的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株營養(yǎng)要求簡單，傳代穩(wěn)定，γ-聚谷氨酸的最高產(chǎn)量可達(dá)34.1g/l，而且培養(yǎng)方法簡便易行，所用培養(yǎng)基的原料來源廣泛，價格低廉，有效降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P13/00GK101109010SQ200710130248
公開日2008年1月23日 申請日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日
發(fā)明者穎 李, 孟永宏, 孫杉杉 申請人:秦皇島領(lǐng)先科技發(fā)展有限公司