專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenopy藩atecarboxylase;EC.4.1.1.31)可將HC(V和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenopyruvate,PEP)不可逆的轉(zhuǎn)化為草酰乙酸(oxaloacetate，OAA)和無(wú)機(jī)磷(UUer，M.F，andKolenbrander,H.M.1972.FormationofoxaloactetatebyC02fixationonphosphoenolpyruvate.In77e^)iz7/z7e51(Boyer，P.D.，ed.).NewYork:AcademicPress,pp.117-136)(圖l)，是由Bandurski禾口Greiner(BandurskiRS，GreinerCM.1953.Theenzymaticsynthesisofoxalacetatefromphosphoenolpyruvateandcarbondioxide.J.Biol.Chem.204，781-786)最先在菠菜葉片中發(fā)現(xiàn)的。在體內(nèi)它是以同源四聚體的形式存在的，單體的大小為100-110kDa(0'LearyM.1982.Phosphoenolpyruvatecarboxylase:anenzymologist'sview.Annu.Rev.PlantPhysiol.33:297-315)。1984年，人們第一次從￡coh'中克隆到了/^H:，并由此推斷出PEPC的蛋白序列(FujitaN,MiwaT，IshijimaS,IzuiK,KatsukiH.1984.Theprimarystructureofphosphoenolpyruvatecarboxylaseof^sc力eWc/isco/丄Nucleotidesequenceofthe//cgeneanddeducedaminoacidsequence.J.Biochem.(Tokyo)95:909-916)，這一結(jié)果極大的推動(dòng)了人們對(duì)PEPC的認(rèn)識(shí)。到目前為止，人們己經(jīng)從細(xì)菌和光合生物，例如植物、藻類(lèi)(Algae)和藻青菌(6ya/70力scteris)中克隆到大約60個(gè)/^尸C基因。不過(guò)令人費(fèi)解的是至今還沒(méi)有在動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)/^尸C基因，據(jù)推測(cè)可能是在進(jìn)化過(guò)程中丟失了。在植物中，/^尸C是以基因家族的形式存在的，目前已經(jīng)對(duì)它的功能、結(jié)構(gòu)以及調(diào)控進(jìn)行了大量的研究(CholletR，VidalJ，0'learyMH.1996.Phosphoenolpyruvatecarboxylase:aubiquitous,highlyregulatedenzymeinplants.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol47:273-298;IzuiK，MatsumuraH，F(xiàn)urumotoT，KaiY.2004.Phosphoenolpyruvatecarboxylase:aneweraofstructuralbiology.AnnuRevPlantBiol55:69—84;LepiniecL，VidalJ,CholletR，GadalP，CretinC.1994.Phosphoenolpyruvatecarboxylase:structure,regulationandevolution.PlantScience99:111-124)。在植物中，PEPC基因家族的不同成員具有不同的生理功能。例如在C4和CAM(Crassulaceae)植物中，有一種特定的PEPC，它們?cè)诠夂辖M織中特異表達(dá)，催化了光合作用過(guò)程中固定C02的第一步反應(yīng)(ErnstK，WesthoffP.1997.Thephosphoenolpyruvatecarboxylase(ppc)genefamilyofj^VsyerisWyerw's(C4)and尸./TTJ'y^Zei(C3):molecularcharacterizationandexpressionanalysisoftheppc"and,Cgenes.PlantMolBiol34:427-443;GehrigH,FaistK,KlugeM1998.Identificationofphosphoenolpyruvatecarboxylaseisoformsinleaf,stemandrootsoftheobligateCAMplantF朋j77sp7朋i/bh'a5"a7iZ.(Orchidaceae):aphysiologicalandmolecularapproach.PlantMolBiol38:1215-1223)，這類(lèi)PEPC被稱(chēng)之為C4型PEPC或光合型PEPC。由于C4型PEPC在光合作用中的重要作用，人們對(duì)其進(jìn)行了深入的研究。與之相對(duì)應(yīng)的是C3型PEPC，C3型PEPC在C3植物以及C4植物的非光合組織中發(fā)揮作用。近些年，隨著對(duì)C3型PEPC的逐漸深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到了它們?cè)谥参镏械闹匾δ?。C3型PEPC可為三羧酸循環(huán)(TricarboxylicAcidCycle,TCA)補(bǔ)充中間產(chǎn)物。PEP是糖酵解的中間產(chǎn)物，在PEP被PEPC羧化為OAA后，又會(huì)很快被蘋(píng)果酸脫氫酶(MalateDehydrogenase)轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸(Malate)，因此為T(mén)CA循環(huán)補(bǔ)充了中間產(chǎn)物。而TCA循環(huán)過(guò)程中的許多中間產(chǎn)物都是氨基酸合成所需的底物，所以在大多數(shù)生物中，PEPC的主要作用是分流糖酵解、為T(mén)CA循環(huán)補(bǔ)充中間產(chǎn)物，最終為氨基酸的合成提供原料(Jea騰auM，Vidal丄Gousset-D叩ontA，LebouteillerB，HodgesM，GerentesD，PerezP.2002.ManipulatingPEPClevelsinplants.J.Exp.Bot.53:1837-1845;MiyaoM，F(xiàn)ukayamaH.2003.MetabolicconsequencesofoverproductionofphosphoenolpyruvatecarboxylaseinC3plants.ArchBiochemBiophys414:197-2033)。通過(guò)對(duì)正在生長(zhǎng)的小麥種子的PEPC進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)(Immunocytochemical)分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，PEPC為蛋白的合成提供了碳源(Araus幾，BortJ，B而nRH，BassettCL，CortadellasN.1993.Immunocytochemicallocalizationofphosphoenolpyruvatecarboxylaseandphotosynthesisgas-exchangecharacteristicsinearsofTriticumdurumDesf.Planta191:507-514;GonzalezMC，0sunaL，EchevarriaC，VidalJ，CejudoFJ.1998.Expressionandlocalizationofphosphoenolpyruvstecarboxylaseindevelopingandgerminatingwheatgrains.PlantPhysiol116:1249-1258)。研究表明，C3型PEPC還參與了植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)。例如磷是植物生長(zhǎng)所必須的元素，當(dāng)環(huán)境中磷匱乏時(shí)，為了攝取到更多的磷，植物的根通常會(huì)向根圍區(qū)域分泌大量的有機(jī)酸，例如檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸(RaghothamaKG.1999.Phosphateacquisition.ArmuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.50:665-693)，這些分泌到根圍區(qū)域中的有機(jī)酸，可以酸化土壤，使植物根系更加有效的吸收土壤中的磷，而這些有機(jī)酸主要就是通過(guò)C3型PEPC合成的。因此，當(dāng)環(huán)境磷缺乏時(shí)，C3型尸^fiH7的表達(dá)量會(huì)隨之增加(NeumanG，MassonneauA，MartinoiaE，RomheldV.1999.Physiologicaladaptationstophosphorusdeficiencyduringproteoidrootdevelopmentinwhitelupin.Planta208:373-382)。此夕卜，當(dāng)土壤中Al3+過(guò)量時(shí)，為減輕Al3+對(duì)植物的毒害作用，C3型/^尸C的表達(dá)量也會(huì)增加，合成并外排大量的蘋(píng)果酸等有機(jī)酸，酸化根圍的土壤并螯合金屬離子，以減輕金屬離子對(duì)植物的傷害(RyanPR，DelhaizeE，JonesDL2001.Functionandmechanismoforganicanionexudationfromplantroots.ArmuRevPlantPhysiolPlantMolBiol52:527-560)。Gonzalez等從小麥中克隆到一個(gè)尸f尸C，發(fā)現(xiàn)其受到與水相關(guān)的環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。最近，Sanchez等發(fā)現(xiàn)擬南芥的Atppc4基因受到干旱和高鹽的誘導(dǎo)表達(dá)，表明它可能與植物適應(yīng)外界脅迫相關(guān)。在CAM植物中，/^/T也可被環(huán)境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并促使機(jī)體由C3向CAM轉(zhuǎn)化。此外，C3型PEPC對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的pH值起著重要的作用。例如植物細(xì)胞在同化氮時(shí)會(huì)生成大量的堿性物質(zhì)，為了中和這些堿性物質(zhì)，植物會(huì)通過(guò)PEPC合成大量有機(jī)酸，以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)pH值。另外PEPC可能在大麥種子發(fā)育晚期的胚乳酸化過(guò)程中起到一定的作用。此外有實(shí)驗(yàn)表明，PEPC也為種子合成貯藏性脂肪酸提供碳源。在大豆(Soybean)中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)/^R7在根瘤中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，它可能對(duì)穩(wěn)定根瘤的C/N平衡起著重要的作用。不過(guò)到目前為止，盡管人們已經(jīng)對(duì)PEPC有了一定的認(rèn)識(shí)，但是還不了解每個(gè)PEPC成員的具體生理功能。目前，人們對(duì)植物PEPC的調(diào)控機(jī)制研究的還不是很清楚。通過(guò)對(duì)已經(jīng)解析到的￡和玉米中C4型PEPC的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和植物的PEPC的三維結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的保守性(KaiY,MatsumaraH,InoueT，TeradaK，NagaraY,YoshinagaT，KiharaA,TsumuraK，IzuiK.1999.Three-dimensionalstructureofphosphoenolpyruvatecarboxylase:aproposedmechanismforallostericinhibition.ProcNatlAcadSciUSA96:823-828;Mats觀raH，XieY，ShirakataS，InoueT，YoshinagaT，UenoY,IzuiK，KaiY.2002.CrystalstructureofC4formmaizeandquaternarycomplexof￡co7iphosphoenolpyruvatecarboxylase.Structure10:1721-1730)。但是二者也有一個(gè)明顯的不同即在植物PEPC的N'端有一個(gè)可逆的磷酸化位點(diǎn)，但在細(xì)菌的PEPC中沒(méi)有。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這一保守的位點(diǎn)中的1個(gè)Ser殘基可被PEPC激酶所調(diào)控(VidalJ，CholletR.1997.RegulatoryphosphorylationofC4phosphoenolpyruvatecarboxylase.TrendsPlantSci2:230-237)。目前已經(jīng)從很多植物中克隆到了數(shù)個(gè)PEPC激酶基因，實(shí)驗(yàn)證明二者存在著調(diào)控的關(guān)系(SullivanS，JenkinsGI，Ni腿oHG.2004.Roots,cyclesandleaves.Expressionofthephosphoenolpyruvatecarboxylasekinasegenefamilyinsoybean.PlantPhysiol135:2078-2087)。植物中不同的PEPC與底物的親合力、以及受代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)程度都不同。例如，C4型PEPC對(duì)PEP的親合力較C3型PEPC弱，但更容易被6-磷酸葡萄糖所激活。此外C4型PEPC對(duì)其代謝產(chǎn)物蘋(píng)果酸的抑制作用也不如C3型PEPC敏感(Svensson，P.，Biasing,0.E.andWesthoff，P.1997.EvolutionoftheenzymaticcharacteristicsofC4phosphoenolpyruvatecarboxylase.AcomparisonoftheorthologousPPCAphosphoenolpyruvatecarboxylasesof尸7smrz's^r/nerK/s(C4)and,7a「eria/7ri/^7ei(C3).EurJ.Biochem.246:452-460)。Rademacher等(RademacherT，HauslerRE，HirschHJ，ZhangL，LipkaV，WeierD，KreuzalerF，PeterhanselC.2002.Anengineeredphosphoenolpyruvatecarboxylaseredirectscarbonandnitrogenflowintransgenicpotatoplants.PlantJ.32:25-39)將馬鈴薯的PEPC進(jìn)行突變用C4型PEPC(來(lái)自F^ai/ei^az^j'"erWa)N'端序列(包括磷酸化調(diào)控位點(diǎn))替換馬鈴薯的C3型PEPC的對(duì)應(yīng)序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種修飾降低了蘋(píng)果酸對(duì)PEPC的抑制程度，增加了PEPC對(duì)PEP的親合力。利用"C02進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的代謝流發(fā)生了變化淀粉和可溶性糖的合成減少了，而有機(jī)酸(主要是蘋(píng)果酸)和氨基酸的合成增加了近4倍，并且蘋(píng)果酸和氨基酸的增加量與淀粉和可溶性糖的量成反比例關(guān)系。C4植物/^ayen'a中的C4型PEPC在其774位有一個(gè)保守的Serine殘基，而在C3型的PEPC中，為Alanine所代替(Biasing0E,WesthoffP，S雨ssonP2000.EvolutionofC4phosphoenolpyruvatecarboxylaseinFlaveria，aconservedserineresidueinthecarboxyl-terminalpartoftheenzymeisamajordeterminantforC4-specificcharacteristics.JBiolChem275:27917-27923)，這一位點(diǎn)是C4型和C3型PEPC的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，/^^en'a的C4型PEPC的774位Serine和296到347位的區(qū)域決定著C4植物PEPC的活性(EngelmannS，Biasing0E，WesthoffP，SvenssonP.2002.Serine774andaminoacids296to437comprisethemajorC4determinantsoftheC4phosphoenolpyruvatecarboxylaseof/^/ai/er/ato'"erw'aFEBSLett524:11-14)。在C4植物中，光照會(huì)誘導(dǎo)對(duì)PEPC的磷酸化，以降低蘋(píng)果酸的負(fù)調(diào)控。在CAM植物中，相應(yīng)的磷酸化調(diào)控是在夜里進(jìn)行的，即與CAM植物進(jìn)行C02固定同步進(jìn)行。最近，從CAM植物A^朋c力oefeo^sc力e/^w'中克隆到了PEPC激酶基因，這一激酶在轉(zhuǎn)錄水平受到光的負(fù)調(diào)控，這也從分子的水平證明了PEPC的磷酸化與PEPC酶活之間的關(guān)系。同樣，在C3植物中，也有類(lèi)似的磷酸化調(diào)控機(jī)制，只是磷酸化的程度同樣取決于特定的代謝狀態(tài)和胞質(zhì)的pH值。此外，/^尸C還可能受到翻譯后調(diào)控。植物中的細(xì)菌型PEPC:模式植物擬南芥的基因組編碼著4個(gè)PEPC，其中Atppcl、Atppc2和Atppc3和其它植物中的PEPC高度同源(84-91%)，這三個(gè)成員都有著植物型PEPC的特征N，末端保守的磷酸化區(qū)域。但是，當(dāng)Atppc4被發(fā)現(xiàn)后，讓人們感到費(fèi)解，因?yàn)樗幋a的PEPC沒(méi)有N'端的磷酸化調(diào)控區(qū)，而且與其它植物型PEPC的同源性也較低(39-40%)。用免疫學(xué)的方法證明，這兩種PEPC在結(jié)構(gòu)上也有很大的不同。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明擬南芥的4個(gè)/^尸C的表達(dá)模式是不同的:競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR的實(shí)驗(yàn)表明，力^pc2是組成型表達(dá)的，在所有的器官中都表達(dá)，^0pW在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，^0pc7在根和花中表達(dá)，Jtp/W的表達(dá)模式類(lèi)似于^fppc7主要在根和花中表達(dá)。由于擬南芥的4個(gè)/^尸C在根中都表達(dá)，所以根部的PEPC活性是所有的器官中最高的。此外，人們還在水稻和大豆中也發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌型/^尸C，但是到目前為止，人們還不能確定細(xì)菌型PEPC在植物中的確切功能。早在50年代，品質(zhì)遺傳育種學(xué)家就報(bào)道，油菜蛋白質(zhì)含量與油脂含量呈高度負(fù)相關(guān)。80年代末，日本學(xué)者杉本博士發(fā)現(xiàn)大豆籽粒蛋白質(zhì)含量與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性密切相關(guān)(SugimotoT,TanakaK，et37.PhosphoenolpyruvatecarboxylaselevelinSoybeanseedhighlycorrelatestoitscontentsofproteinandlipid.AgricBiolChem,1989，53:885-887;SugimotoT,KawasakiT,"3丄cDNAsequenceandexpressionofaphosphoenolpyruvatecarboxylasegenefromsoybean.PlantMolBio,1992，20:743-747)，受此啟發(fā)，后來(lái)逐步提出了"底物競(jìng)爭(zhēng)"假說(shuō)，認(rèn)為籽粒的主要貯藏物質(zhì)油脂、蛋白質(zhì)均來(lái)自葡萄糖酵解的產(chǎn)物--丙酮酸，兩者之間存在著底物競(jìng)爭(zhēng)。底物競(jìng)爭(zhēng)的平衡點(diǎn)，取決于兩類(lèi)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，PEPC和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的相對(duì)活性。PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸進(jìn)入蛋白質(zhì)代謝；ACCase催化磷酸烯醇式丙酮酸合成乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪代謝。上述兩種酶的相對(duì)活性是調(diào)控籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率的關(guān)鍵。以往的實(shí)驗(yàn)證明，增加油菜籽中ACCase的活性，可以提高植物種子貯藏性脂肪酸的含量達(dá)3-5%(RoeslerK，ShintaniD，SavageL,Bodd叩alliS,0hlroggeJ.1997.TargetingoftheArabidopsishomomericacetyl-coenzymeAcarboxylasetoplastidsofrapeseeds.PlantPhysiol.113:75-81)。此夕卜，也有人認(rèn)為當(dāng)油菜種子中的PEPC活性被抑制后，種子的含油量也會(huì)有提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，名稱(chēng)為GhPEPC2，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由971個(gè)氨基酸殘基組成。氨基酸殘基序列是序列表中的序列2的GhPEPC2具有目前已知的PEPC所有功能位點(diǎn)自序列表中序列2的氨基末端的第17位氨基酸殘基為磷酸化調(diào)控位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第178、639位氨基酸殘基為酶催化位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第184、185、233和372位氨基酸殘基為6-磷酸葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第289、564、598位氨基酸殘基為疏水袋位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第456、647、759、773位氨基酸殘基為磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第493、498位氨基酸殘基為四聚體形成位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第566、603位氨基酸殘基為鎂離子結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第606、762-764位氨基酸殘基為碳酸氫根結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第647、835、894、969位氨基酸殘基為天冬氨酸結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基末端的第780位氨基酸殘基為C3/C4型PEPC標(biāo)志(在C3型PEPC中，此位點(diǎn)為A，在C4型PEPC中，此位點(diǎn)為S)。在其N(xiāo)，端(自序列表中序列3的氨基末端的第13至23位氨基酸殘基)有一個(gè)PEPC保守的磷酸化調(diào)控序列(EKLASIDAQLR)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述PEPC功能位點(diǎn)和PEPC保守的磷酸化調(diào)控序列之外進(jìn)行取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的GhPEPC2便于純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述(b)中的GhPEPC2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的GhPEPC2的編碼基因可通過(guò)將序列表中SEQIDNa:1的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因(ft^fiH:i0也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因的編碼序列可為序列表中序列1的自5'末端第135位至3050位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因，具體可為如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA分子；所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5。/。SDS，5XDenhardt，0.1mg/mL鮭精DNA的溶液中，在65。C下雜交，并用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液洗膜。序列表中的序列1由3396個(gè)脫氧核苷酸組成，是GhPEPC2的cDNA基因序列。序列表中序列1的自5'末端第135位至3050位脫氧核苷酸為編碼序列。含有上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在其它作物，如油菜中，利用反義RNA技術(shù)降低種子中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性后，可將種子中的油脂含量提高約25%(陳錦清，郎春秀，胡張華等；反義PEP基因調(diào)控油菜籽粒油脂蛋白質(zhì)含量比率的研究;農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1997，7(4):316-320)。本發(fā)明的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶可廣泛用于提高植物，特別是提高植物特定器官或組織中的油脂含量，如種子。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。圖1為PEPC所催化的反應(yīng)9圖2為PEPC的磷酸化調(diào)控位點(diǎn)區(qū)域的序列比對(duì)圖3為PEPC進(jìn)化樹(shù)圖4A為用^尸y^C的編碼區(qū)為探針的Southern雜交結(jié)果圖4B為用Gi^fiH^的3，非翻譯區(qū)為探針的Southern雜交結(jié)果圖5為fi^fiFC2的組織表達(dá)特征圖6為C^i5R2的PCR擴(kuò)增鑒定電泳圖譜圖7為體外表達(dá)載體pGEX-PEPC2的構(gòu)建流程圖圖8為GhPEPC2原核表達(dá)電泳圖譜圖9為GhPEPC2體外活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)圖具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、&/^°6^的獲得及其表達(dá)特性棉花材料本實(shí)驗(yàn)中所用的植物材料為我國(guó)培育出的優(yōu)良棉花品種中棉35(fo^"^7/z力j卯t咖cv.zhongmian35)。將中棉35的種子播種于小盆，在溫室(25°C，16小時(shí)光照/天)中生長(zhǎng)。生長(zhǎng)大約兩周后，取幼苗的根、莖、子葉和真葉，在液氮中速凍，然后在-80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ≡跍厥疑L(zhǎng)的成年中棉35植株的花、種、胚和纖維(5天)，在液氮中速凍，保存于-80°C備用。一、ffl/EF(2的克隆經(jīng)調(diào)研，搜索到了一些已克隆的/^尸C，其中一個(gè)來(lái)自棉花(a尸f尸a)。根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的植物z^/r的DNA序列，對(duì)不同來(lái)源的i^/f進(jìn)行了序列比對(duì)，找到WH7中的保守區(qū)域。根據(jù)這些保守的序列，在NCBI中找到了一個(gè)陸地棉的EST(登錄號(hào)AI725699)。通過(guò)分析這條EST序列發(fā)現(xiàn)，它不同于已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的&/^尸67，因此可能編碼著棉花中的另一個(gè)/^尸。根據(jù)這個(gè)EST，開(kāi)始了對(duì)棉花ft^fiT2的克隆。首先設(shè)計(jì)了兩條特異引物PEP2一F1:5，-ATGGATCTTTGCCTGGACACAG-3，和PEP2一F2:5，-ATGCTGCAGGAGATGTACAATG-3，。首先利用3，-FullRACECoreSet試劑盒(TaKaRa)，將從中棉35子葉中提取的總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并以此cDNA為模板，利用3'-FullRACECoreSet試劑盒(TaKaRa)，按照該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行半巢式PCR，克隆到了這個(gè)基因完整的3'端共761bp。根據(jù)得到的序列，在下游設(shè)計(jì)了一個(gè)特異于棉花^尸^p(^的引物pep2Ji:5，-TTTCTTCAAAGTTGGttctcAACC-3，。由于上游的序列不知道，所以，將已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的/^尸C序列進(jìn)行比對(duì)，在翻譯起始密碼子大約140堿基處找到了一段保守序列，根據(jù)這段保守序列，設(shè)計(jì)了一個(gè)上游引物PEP2一F3:5，-CGATATTCTTCAGGATTTGCATGG-3，，同樣用3，-FullRACECoreSet試劑盒(TaKaRa)，將從中棉35子葉中提取的總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并以此cDNA為模板，經(jīng)過(guò)半巢式PCR，克隆到了位^/^中部共2435bp的片段。最后，應(yīng)用染色體步行法，將這個(gè)基因5'剩余的部分端克隆完整，PCR所用引物為PEP2-WK1:5，-CCAAGTTAAGCATGTGGGAGAAAGCC-3，和PEP2-WK2:5，-TCCTCAAGTTTCTTGGGGGTACTCTTC-3'，其中PCR模板為從中棉35葉片中提取的基因組MA所構(gòu)建的染色體步行庫(kù)(GenomeWalkerKit(Clontech))。所有擴(kuò)增出的片段首先切膠回收，連接到pMD18-TVector(購(gòu)自TaKaRa公司)，然后送交測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)拼接，得到ffl/^/^的全長(zhǎng)cDNA序列(序列表中的序列l(wèi))。"/^尸^的cDNA序列長(zhǎng)度為3396bp。6^/^尸C的編碼序列為自序列表中序列1的5'端的第135位至第3050位脫氧核苷酸，編碼971個(gè)氨基酸(序列表中序列2)。為驗(yàn)證該拼接得到的M/^尸6^的全長(zhǎng)cDNA序列的正確性，以中棉35的子葉的cDNA為模板(該作為模板的cDNA是利用PurescriptRNA純化試劑盒(Gentrasystem,USA)提取子葉的總RNA，釆用3'-FullRACECoreSet試劑盒(TaKaRa)合成的cDNA第1條鏈)，利用1對(duì)特異性引物F1:TATGCAGACGAAGTTTTTAGGAGTG，Rl:AGAAGCCTCAAAAGGCATTCCTTG進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到了預(yù)計(jì)大小的片段3249bp(結(jié)果如圖6，M:Marker(D函0+2000，TI緒GEN)，1:PCR鑒定電泳圖譜)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pMD18-TVector載體上，進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第104至3353位脫氧核糖核苷酸。說(shuō)明上述拼接的^/^月2的cDNA序列正確。將含有該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的重組載體命名為pMD-GhPEPC2。在翻譯起始密碼子ATG(自序列1的5'端第135—137位)上游，有一個(gè)框內(nèi)的終止密碼子TGA(自序列1的5'端第69—71位)，表明克隆到了Q/^尸C^完整的5'端。進(jìn)一步對(duì)6^^月2的cDNA分析發(fā)現(xiàn)，在PolyA尾開(kāi)始前60bp的位置，有一個(gè)多聚A位點(diǎn)ATTAGA(自序列表中序列1的5'端的第3302-3307位脫氧核苷酸)。此外，在PolyA尾開(kāi)始前122bp的位置，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)胞質(zhì)多聚A位點(diǎn)(CytoplasmicPolyadenylationElement,CPE):TTTATAT(自序列表中序列2的5'端的第3239-3245位脫氧核苷酸)。這兩個(gè)位點(diǎn)表明，本發(fā)明克隆到了ft^5F6^完整的3'端。同時(shí)也表明，"/^尸C可能會(huì)在轉(zhuǎn)錄后被精細(xì)的調(diào)控。通過(guò)對(duì)GhPEPC2氨基酸序列進(jìn)行分析，找到了目前已知的PEPC所有功能位點(diǎn)，(KaiY，MatsumuraH,IzuiK，2003.Phosphoenolpyruvatecarboxylase:three-dimensionalstructureandmolecularmechanisms.ArchBiochemBiophys414:170-179)。自序列表中序列2的氨基端的第17位氨基酸殘基為磷酸化調(diào)控位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第178、639位氨基酸殘基為酶催化位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第184、185、233和372位氨基酸殘基為6-磷酸葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第289、564、598位氨基酸殘基為疏水袋位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第456、647、759、773位氨基酸殘基為磷酸烯醇式丙酮酸結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第493、498位氨基酸殘基為四聚體形成位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第566、603位氨基酸殘基為鎂離子結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第606、762-764、位氨基酸殘基為碳酸氫根結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第647、835、894、969位氨基酸殘基為天冬氨酸結(jié)合位點(diǎn)；自序列表中序列2的氨基端的第780位氨基酸殘基為C3/C4型PEPC標(biāo)志(在C3型PEPC中，此位點(diǎn)為A，在C4型PEPC中，此位點(diǎn)為S)。另外，在其N(xiāo)，端有一個(gè)PEPC保守的磷酸化調(diào)控序列(EKLA5IDAQLR)，其中這段序列的Ser就為磷酸化位點(diǎn)(圖2)。圖2中橫線表示磷酸化的位點(diǎn)，星號(hào)表示被磷酸化的絲氨酸殘基。序列來(lái)源和GenBank登錄號(hào)GhPEPl(棉花，AF008939)，AtPEPl(擬南芥，AJ532901)，AtPEP2(擬南芥，AJ532902)，AtPEP3(擬南芥，AF071788)，SyPEPl(大豆，Q02909)，PtPEP(馬鈴薯，CAA62469)，TbPEP(煙草，CAA41758),BrPEP(油菜，BAA03094)，ZmPEPl(玉米，P04711，注C4植物中的光合型PEPC)將GhPEPC2和部分已克隆到的PEPC進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，在植物中，C3型PEPC的保守性都較強(qiáng)，同源性都在80.0%以上，最高的可以達(dá)到91.2%。但是與C4型PEPC的同源性要低一點(diǎn)，在76.2%-78.6%之間。和其它植物相比，擬南芥的Atppc4的同源性很低，只為35.9%-37.2%之間，其同源性甚至要比大腸桿菌的還要低(36.5%-39.2%)。這表明，細(xì)菌型PEPC與植物型的PEPC的起源可能不同。將GhPEPC2和C3型PEPC比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與馬鈴薯(CM62469)的同源性最高，達(dá)到91.2%，甚至高于和棉花GhPEPCl的同源性(89.7%);與C4型PEPC的同源性相對(duì)較低(玉米，P04711)，為78.3%;與細(xì)菌型PEPC的同源性最低，分別只有36.6%(擬南芥的PEPC4，ATH532903)和38.1%(大腸桿菌，P00864)(表2)。表2、部分PEPC的氨基酸序列同源性比對(duì)(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>AtPEP437.236.736.736.035.936.5SyPEPl88.787.581.978.139.2PtPEP91.283.077.138.9TbPEP82.876.738.3BrPEP76.237.5ZmPEPl37.9表2中的序列來(lái)源和GenBank登錄號(hào)如下GhPEPl(棉花，AF008939)，AtPEPl(擬南芥，AJ532901)，AtPEP4(擬南芥，AJ532903)，SyPEPl(大豆，Q02909)，PtPEP(馬鈴薯，CAA62469)，TbPEP(煙草，CAA41758)，BrPEP(油菜，BAA03094)，ZmPEPl(玉米，P04711，注C4植物中的光合型PEPC)，EcPEP(大腸桿菌，P00864)。選擇了已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的23個(gè)來(lái)自于細(xì)菌、藻類(lèi)和高等植物(包括C3和C4型)的PEPC進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析(圖3)，結(jié)果表明GhPEPC2與馬鈴薯和煙草的親緣關(guān)系較近。而PEPC的進(jìn)化過(guò)程較為復(fù)雜，例如棉花的GhPEPCl與本發(fā)明的GhPEPC2分別處于兩個(gè)亞群，而擬南芥的4個(gè)PEPC被分在了3個(gè)亞群中。此外，和其它植物的PEPC相比，GhPEPC2在N'端有5個(gè)連續(xù)的天冬酰氨，這在以往的PEPC中是未發(fā)現(xiàn)的，目前還不知道這段序列的功能。圖3中的GenBank登錄號(hào)和序列來(lái)源如下Ker"ciLaZ^(AAK58635，黑藻，^Kc/ri773rer"cj77a&);Asesw'h's(AAY28731，^z^272朋t力arasesw7j、)；Appc2(A》:532902，擬南芥)；丑刀a/as(BAA03094，油菜)；Z歷aj^(P04711，玉米)；J^;c^(AJ532903，擬南芥)；Acoh'(P00864，大腸桿菌)；f/尸y57^(AF008939，棉花)；必tr朋ca"7a(ABE82904，苜蓿)；(CAA62469，馬鈴薯);7bZacco(CAA41758,煙草);尸.(AAG17619,尸7aKei^z'a^n^erva'a);尸./ri/7g7《2(CAA88829，尸7areriapi^'/7g2ei);厶a7/ws(MU07998，白羽扇豆，Z〃/w'/〃sa7Zws);《歷ax(Q02909，大豆)；Zoz^s(BAC20365，蓮花)；ciTsZ^27i/2〃/z(CAA32728，冰葉日中花，ifese/H力iTa/t力e/z〃/zciT5^a77i/w/z);力fp/cKATH532901，擬南芥)；J^pc^(AF071788，擬南芥)；ftsa"'ra(NP—913781，水稻)；5b/^力咖(CAA42549，高粱)；Zae^iV鵬(CAA07610，小麥)。二、棉花基因組DNA的提取和Southern雜交在植物中，/^尸C是以多基因家族的形式存在的。例如，在擬南芥中，有4個(gè)其中三個(gè)為植物型，一個(gè)為細(xì)菌型。因此，在棉花中，也可能存在著多個(gè)尸ZH7，而且在1997年，美國(guó)一家實(shí)驗(yàn)室報(bào)道從棉花中克隆到了一個(gè)PEPC基因("v^fiP67)，但是沒(méi)有給出這個(gè)基因的拷貝數(shù)，也沒(méi)有說(shuō)明是否在棉花中也存在PEPC基因家族。因此，本發(fā)明利用Southern雜交預(yù)測(cè)a/^/^在棉花基因組中的拷貝數(shù)，以及棉花中是否存在PEPC基因家族。按照文獻(xiàn)PatersonAH，BrubakerCL，WendelJF.1993.ArapidmethodforextractionofcottongenomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMol.Biol.R印.11:122-127描述的方法提取棉花基因組DNA。取15wg基因組DNA，分別用"raI、I、fedV、ffi/dIII和J力aI(NewEnglandBiolabs，Inc.)完全酶切后，在0.7y。瓊脂糖凝膠上電泳。然后用堿法(0.4mol/LNaOH，lmol/LNaCl)將DNA轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜(Hybond-N+，Amersham)上。雜交用了兩個(gè)探針，探針1在6J^fiR^的cDNA的編碼區(qū)，長(zhǎng)度為1015bp,用引物5，-CTCAAGAGACTTGTGGTTGATCTCAAG—3，禾卩5'—TTTGTTCTTCAGACCACTCTCGGC-3，，以pMD-GhPEPC2為模板擴(kuò)增得到，該探針內(nèi)部沒(méi)有"raI、fcoRI、￡boRV、ffi"dIII和JteI的酶切位點(diǎn)；探針2為G//^尸G的3'非翻譯區(qū)，長(zhǎng)度為304bp，用引物5'-CACCGACCTACTACACGAGGTGTG—3，禾B5'—AGAAGCCTCAAAAGGCATTCCTTG—3，，以pMD—GhPEPC2為模板擴(kuò)增得到。帶有[a-32P]dCTP的放射性探針采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒制備(RandomPrimerDNALabelingKitVer.2(TaKaRa))。雜交按照Sambrook等所描述的方法(《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，2001.p492—509)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交。雜交后，用X光底片于-80。C下曝光48小時(shí)(Kodak,NewYork,USA)。來(lái)自于W尸i5H^的cDNA的編碼區(qū)(1015bp)的探針雜交結(jié)果如圖4A所示，在AcoRI、AcoRV和A'"dIII酶切的泳道上，出現(xiàn)了大量的雜交帶，表明/^/T在棉花中也是以多基因家族的形式存在的。而在"raI和7feI酶切的泳道上，都出現(xiàn)了較粗的條帶，可能是由于多條雜交帶位置重疊的結(jié)果。第二個(gè)探針來(lái)自^Z^尸C的3'非翻譯區(qū)(304bp)，用PCR擴(kuò)增基因組DNA表明，這段序列中沒(méi)有內(nèi)含子。在這段序列的中部有一個(gè)"raI的酶切位點(diǎn)，但是由于長(zhǎng)度小于了同位素標(biāo)記試劑盒(RandomPrimerDNALabelingKitVer.2，TaKaRa)所要求的最小探針長(zhǎng)度(300bp)，所以，沒(méi)有得到明顯的雜交帶(圖4B的Zral泳道)。而在I、fcoRV和JfeI的泳道上，都出現(xiàn)了兩條雜交帶，在歷'/dIII的泳道上，出現(xiàn)了一條較粗雜交帶，可能是兩條帶位置重疊的結(jié)果(圖4B)。所以推測(cè)在棉花基因組中，^Z^尸6^基因是以雙拷貝的形式存在的。陸地棉是異源四倍體(WendelJF.1989.Newworldtetr即loidcottonscontainoldworldcytoplasm.ProcNatlAcadSciUSA86:4132-4136)，由A和D兩個(gè)亞基因組構(gòu)成，因此，ft^fiR^可能在兩個(gè)亞基因組中各含有一個(gè)拷貝。三、棉花總RNA的提取和半定量RT-PCR為了研究ft^5PC的表達(dá)模式，從棉花的不同組織中提取了總RNA，進(jìn)行半定量RT-PCR。利用PurescriptRNA純化試劑盒(Gentrasystem,USA)，從棉花的不同組織中小量提取總RNA。在紫外吸收和瓊脂糖電泳檢測(cè)后，于-80。C保存。然后，取lug總RNA加入擴(kuò)增級(jí)別DNaseI(Sigma,USA)室溫放置30分鐘以去除基因組DNA的污染，操作方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。PolyAmRNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄采用Promega公司ReverseTranscriptionSystem完成，操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為校正RT-PCR反應(yīng)的模板濃度，通過(guò)擴(kuò)增仍igw'"'/7的cDNA，進(jìn)行平行PCR反應(yīng)作為內(nèi)對(duì)照。弓l物為UBQ7-1:5，-AGGCATTCCACCTGACCAAC-3'和UBQ7-2:5'-GCTTGACCTTCTTCTTCTTGTGC-3'。對(duì)棉花6"力/^尸C的cDNA擴(kuò)增，用引物5，-CACCGACCTACTACACGAGGTGTG-3，和5，-AGAAGCCTCAAAAGGCATTCCTTG-3'擴(kuò)增得到。反應(yīng)為30個(gè)PCR循環(huán)。PCR結(jié)果用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，"/^/T2在棉花中是組成型表達(dá)的，但是在不同組織中的表達(dá)量不同。按照表達(dá)最的多少，可以大致分為3類(lèi)在根、花和胚中的表達(dá)量最多；在莖、子葉、真葉和種子中的表達(dá)量居中；而在纖維中的表達(dá)量最少。6^^尸C2在棉花的根部表達(dá)較高，這與以往報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，這表明GhPEPC2可能與植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫以及重新固定在根部呼吸過(guò)程中釋放的C02反應(yīng)相關(guān)。另外，棉花的胚在生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)合成大量的儲(chǔ)藏性蛋白，因此，GhPEPC2可能為胚中氨基酸的大量合成提供碳源。"/^H^在纖維中表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它組織。這可能是由于棉花纖維細(xì)胞大量合成纖維素，主要進(jìn)行的是糖代謝，而蛋白的合成相對(duì)比較少，因此作為分流糖酵解的中間產(chǎn)物、為氨基酸的合成提供前體的/^H7的表達(dá)量就會(huì)隨之比較低。此外，M/^尸6^在莖中的表達(dá)量也比較少，這也可能與莖中蛋白合成量相對(duì)較少有關(guān)(圖5)。圖5中，RT表示根、ST表示莖、CL表示子葉、LV表示真葉、FL表示花、SD表示種子、EB表示胚和FB表示纖維；tt^7表示仍i^/j'z^'/27為內(nèi)參，用來(lái)調(diào)整模板的濃度；0/^尸c3s"表示6^WC。在柱狀圖中，是以花(FL)的表達(dá)量為100。半定量RT-PCR的結(jié)果表明，"力/^月2的表達(dá)量與不同組織中蛋白的合成量成一定的正相關(guān)，所以其主要功能可能是為棉花蛋白的合成提供碳源。此外，由于在種子和胚中表達(dá)量較高，因此，可以抑制種子和胚中的PEPC活性，使更多的代謝底物進(jìn)入脂肪代謝的合成，通過(guò)調(diào)控籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率，最終提高棉花種子的貯藏性油脂含量。四、ffl/^/T2的原核表達(dá)及活性測(cè)定為了證明所克隆的基因?yàn)榱姿嵯┐际奖狒然福瑢?duì)所克隆的序列進(jìn)行了原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的GhPEPC2進(jìn)行了活性的測(cè)定。根據(jù)已經(jīng)克隆到的的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)弓I物Exp—Fl:GGTACCGAATTCATGGCGAGTTTTAATAAT和Exp—Rl:GTCGACTCGAGTTAACCGGTGTTTTGCAT，以W)P5R^的cDNA為模板，擴(kuò)增到2930bp的目的片段，連入pMD18-TSimple(TaKaRa)載體中，并測(cè)序。然后用&oRI和&7I雙酶切，并回收目的片段。然后用&oRI和fe〗I雙酶切表達(dá)載體pGEX-6p-1(AmershamPharmaciaBiosciences)，回收大片段，并與上一步回收的目的片段連接，構(gòu)建成pGEX-PEPC2表達(dá)載體(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖7)，然后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。由于在常規(guī)條件下(0.5mMIPTG，37°C)，表達(dá)出的融合蛋白多以包涵體的形式存在。為了提高可溶性蛋白的比例，選擇了在低IPTG(0.lmM)、低溫(25°C)條件下誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)出的融合蛋白見(jiàn)圖8所示(l為未誘導(dǎo)，2、誘導(dǎo)表達(dá)后l小時(shí)；3、誘導(dǎo)表達(dá)后2小時(shí)；4、誘導(dǎo)表達(dá)后4小時(shí)；5、誘導(dǎo)表達(dá)后8小時(shí)、6、誘導(dǎo)表達(dá)后12小時(shí)后所取的樣品)。原核表達(dá)蛋白的純化按Sambrook等(《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版，2001.p1245—1248)所描述的方法完成。在Mg2+存在時(shí)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶可催化PEP與HC03—形成草酰乙酸。而形成的草酰乙酸在還原型輔酶I(NADH)存在時(shí)，可由蘋(píng)果酸脫氫酶催化形成蘋(píng)果酸和NAD+。NADH消耗(或NAD+形成)的速率可在室溫下用分光光度計(jì)法于340nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，以0D值變化的量來(lái)計(jì)算酶的活性。利用此反應(yīng)，對(duì)GhPEPC2的催化反應(yīng)速度進(jìn)行了測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的反應(yīng)總體積為1ml，含50mMTris-HC1(pH8.0)、10mMNaHC03、5mMMgCl2、0.4raMNADH、2raMPEP、5個(gè)活性單位的蘋(píng)果酸脫氫酶。測(cè)活溫度為25。C，在加入適量純化后的GhPEPC2蛋白溶液(含2.5PgGhPEPC2蛋白)后開(kāi)始計(jì)時(shí)。測(cè)定在340nm下，反應(yīng)開(kāi)始后1分鐘內(nèi)樣品的0D變化值(A0D)，其中樣品OD值下降0.01為1個(gè)PEPC的活性單位(U)。在上述實(shí)驗(yàn)中，PEP和蘋(píng)果酸脫氫酶購(gòu)自Sigma公司，還原型輔酶I購(gòu)自Ameresco公司。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果如圖9所示。其結(jié)果表明GhPEPC2具有典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。在圖9中，CK為陰性對(duì)照，所用的是轉(zhuǎn)入pGEX-6p-l載體的BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)、純化及活性測(cè)定方法同GhPEPC2。其中，陰性對(duì)照(CK)和GhPEPC2的具體測(cè)定結(jié)果如表3:表3、吸光值和酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>初始終止初始終止初始終止CK1.5011.4901.4931.4901.5021.4870.0101.100.301.500.97GhPEPC21.4811.3591.4961.3611.4801.3740.12112.2013.5010.6012.10此外，PEPC廣泛的存在于細(xì)菌和植物中，而本實(shí)驗(yàn)所選用的表達(dá)菌株本身也有PEPC。為了確定以上實(shí)驗(yàn)中的PEPC活性完全來(lái)自于融合表達(dá)的GhPEPC2，而不是表達(dá)菌株的PEPC或其它不確定因素，設(shè)置了一個(gè)陰性對(duì)照(CK)，即用不含GhPEPC2的pGEX-6p-l載體(該載體是一個(gè)融合表達(dá)載體，不含目的基因時(shí)表達(dá)GST蛋白)進(jìn)行表達(dá)。在相同條件下，對(duì)含有pGEX-6p-1載體的菌株BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)、收集菌體、蛋白的純化以及對(duì)等量的洗脫蛋白進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果表明，用pGEX-6p-l載體(CK)表達(dá)所純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶活測(cè)定的結(jié)果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于含有目標(biāo)基因(GhPEPC2)的載體。這一結(jié)果表明，樣品中的PEPC活性來(lái)自于GhPEPC2。經(jīng)計(jì)算，此時(shí)GhPEPC2的催化反應(yīng)速度為7.781Mmolmin1mg—、此外，對(duì)上述GhPEPC2催化反應(yīng)中的兩個(gè)重要的動(dòng)力學(xué)參數(shù)最大反應(yīng)速度(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)進(jìn)行了測(cè)定。首先，在測(cè)活體系(50mMTris-HCl，pH8.0，10raMNaHC03，5mMMgCl2，0.4mMNADH，5個(gè)活性單位的蘋(píng)果酸脫氫酶，2.5PgGhPEPC2蛋白，25°C)中測(cè)定不同底物(PEP)濃度時(shí)的酶催化反應(yīng)速度，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)測(cè)3次，取平均值。以反應(yīng)速度對(duì)底物濃度作圖，并根據(jù)米氏方程，用軟件SigraaPlot9.0計(jì)算GhPEPC2對(duì)PEP的Vmax和Km。結(jié)果見(jiàn)表4，這一結(jié)果和已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的相關(guān)值相似(Svensson，P.，Biasing,0.E.andWesthoff,P.1997.EvolutionoftheenzymaticcharacteristicsofC4phosphoenolpyruvatecarboxylase.AcomparisonoftheorthologousPPCAphosphoenolpyruvatecarboxylasesof尸J3mrj.3to'/er^z's(C4)and,73reri3jDr_2.A§\Ze_/(C3).Eur.J.Biochem.246:452-460)。表4、GhPEPC2對(duì)PEP的催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax(陶ol/min/mg)Km(Mmol/L)Vmax/Km8.0183.560.0959序列表〈160>2〈210〉1〈211〉3396<212>DNA〈213〉棉花屬陸地棉(6"as57pi"/T7/ii"st/飾)<400〉1C鄉(xiāng)gC3CgCgtggtCg3Cggcccgggctggtagcttgttgtatatcaaatacttgatat60tgggtttatgatgctttggtaat11aaaattggtaattatcttttatgcagacgaagttt120ttaggagtgtggt犯tggcgagttttaataataataataatggcaagttcg卿3gttgg180catccattgatgcgcagttacggcaattggttcctgctaaagtgagtgaagatgataaat240tggtgg犯tatgatgctttgcttttggatcggtttcttgatattcttc犯gatttgcatg300gcgaggatcttaaggaaacggttcaagaatgttatga已ctttctgctgagtstgaaggg3360agagtaccccgaggagctggggaatgttttgactagtttggatcc鄉(xiāng)gg420actccattgttatagctaaggctttctcccacatgcttaacttggctgacttggctgagg480aagttcagattgcttaccggcga^ggettcaagttgaagaagccgatg卿540actctgcaacaactgaatcggatatcg犯gaaactctcaag卿cttgtggttgatctca600ag犯gtctcctg鄉(xiāng)犯gtttttgatgcacttaagaaccEigactgtggatctggtcttca660ctgctcatcctacccaatctgttcgtagatctttacttcag卿cacggaaggataagga720actgtttagctcagttgtatttactccagatg￡Lta￡LgCaggagcttgatg780aagctct3csgcgtg卿ttC犯gCCgC3tttcgtacagatgagattcgaaggactcctc840C犯CtCCCC3卿tg卿tg鄉(xiāng)gcggg犯tgagctacttccatgaaacg900gtgtccccaaattcttgcggsgagttgacacagctttgaag犯cattggaattaatgaac960gtgttccctataatgcgccacttattcagttttcttcatggatgggtggtgatcgtgatg1020gcaatccaagggtagctcctg已ggtc已casgggatgtttgcttgttggct卿atgatgg1080ctgccaatttgtactattcccaaatcgaggatctgatgtttgagttgtcaatgtggcgtt1140gc敏gstg3gcttcgtgttcgtgc卿cg已a(bǔ)cttcatagatcttcaagg3ga^tgct31200aacactacat卿gttctgg犯aa^igttcctcca^atgaaccctaccgtgttattcttg1260gtgatgttagggac犯gctgtatcagacacgtg認(rèn)ggtctcgccaaatgttgtctcatg1320gtatctctgacattcc已gaggagg犯actttcaccaacattgagcagtttttggaaccgc1380ttgasctatgttataggtcactttgctcttgtggtgaiccggccaattgctg已tgg已a(bǔ)gtc1440ttcttgatttcttgaggcaagtatcaacttttggcctctcacttgtcagacttgacattc1500ggca卿gtctgaccgccacaccgatgtcttagatgccatcscc^gcacttggaaattg1560gttcctgccg卿gtggtctgctattgtctgaactaggtg1620gaaggcgtcc3ttgtttggtcctgatcttcagaaattgctgatgttttgg1680ataccttcagtgtcctagcagagctcccggC3gaC33Ctttggagcatacatcatttcaa1740tggcaactgctccttctgatgttcttgctgttgagctcctacagcgtgaatgccacgtga1800agcaaccattaagagttgttccactgtttgagaagcttgcggatctggaggctgcacctg1860ctgctttggctcggctcttctcgatagattggtacagaaatcggatcaatggc犯gcaag1920aagtcatgattgggtattctgattcgggtaa卿tgctggccgtctctctgctgcctggc1980agttatacaaagctcaagaggagcttatcaatgttgctaaggaatttggtgtgaagctaa2040cgatgttccatggtcgtggtgg咖tgttggs卿ggtggtggtcccacccatcttgcta2100tattatctcaa_CC￡LCC3g^ac犯ttcax:ggctcacttcgggttacagttc朋ggtgaag2160ttattgagcaatcgtttggagaggaacacttgtgctttagaacactccagcgttttactg2220ctgccacacttgagcatggcatgcacccaccagtttcaccaaaaccaigaatggcgtgcac2280tga_tggatgaaatggctgtcgttgctactgttccattgtcttca肪gaac2340ctcgatttgttgaatatttccgccttgctacgccagagttggagtatggtagaatgaata2400ttgg犯gccgcggaeigcc犯gtgggggtatcgaatctcttcgtgcaatcc2460catggatctttgcgtggacaC3g￡lCa￡lg￡LttccatctccctgtUggctcggatttggsg2520ctgcattt犯acatgtcattCag犯ggaC3ttaagaatctccttatgctgCElgg卿tgt2580acaatgaatggcctttcttcttgatttggttgaaatggtccttgcaaaag2640g卿tcccgggattgcagccttat3Cg3t3agcttcttgtttctgaggaactctggtctt2700tcgg卿gcggttg3g犯CCaactttg犯gaaactaa犯gccttctcctccagattgctg2760ggcacaaggatcttctcgaaggggatccctacctgaagcaaagactccggctacgtgatt2820catacatcaccactctaaatgtctgccaggcctacacactcaascgtatccgtgacccaa2880attacagcgtg犯gttgcggccacatatctctagagagatcatggaatcaagcaaacctg2940ctgatgaacttgtc犯actgaacccaacaagcgsgtatgcccctggtttggaggacaccc3000tcatcttgaccatgaagggtattgctgccggcettgca犯acaccggttaaacaccgacct3060actacacgaggtgtgcttatsgtcttttaagtCC3g3g^gatgaattattcatcaaaga3120Ctg3tgtC3tttCggC3朋3acctttcttat3ggt￡L￡l￡LCa<aaagaggcggatatatatat3180aaatgctctttaaagctgtatgattatgctgttatgctttteieigactcgttttattttU3240tatatatatgtattgcggcaagtgtttattattgcccaaaagcggsttggaatggaactc3300cattagaactgatccattatcaaggaatgccttttgaggcttctggtttt3360tgtttttaaaaaaaaaaaaa3396〈210>2<211〉971<212〉PRT〈213〉棉花屬陸地棉(6bs柳i鵬/j'rs""/ff)<400>2MetAlaSerPheAsnAsnAsnAsnAsnGlyLysPheGluLysLeuAla151015SerlieAspAlaGinLeuArgGinLeuValProAlaLysValSerGlu202530AspAspLysLeuValGluTyrAspAlaLeuLeuLeuAspArgPheLeuAsplie50GluCys65LysLeuSerlieLeuAlaLysGly130GluGlu145GluValAlaHisArglieAspAsp210AlaPhe225GluMetValProlieAsnTrpMet290ThrArg305TyrSer35LeuTyrGluValGlu115AspThrPheProArg195LysArgArgLysGlu275GlyAspGinSerAspGluGinGluGlulie100GluPheLeuAspThr180AsnGinThrAlaPhe260ArgGlyVallieLeu340AspLeuLeu85AlaValAlaLysAla165GinCysGluAspGly245LeuValAspCysGlu325ArgLeuSer70GlyLysGinAspArg150LeuSerLeuLeuGlu230MetArgProArgLeu310AspValHis55AlaAsnAlalieGlu135LeuLysValAlaAsp215lieSerArgTyrAsp295LeuLeuArg40GlyGluValPheAla120AsnValAsnArgGin200GluArgTyrValAsn280GlyAlaMetAlaGluTyrLeuSer105TyrSerValGinArg185LeuAlaArgPheAsp265AlaAsnArgPheAsp345AspGluThr90HisArgAlaAspThr170SerTyrLeuThrHis250ThrProProMetGlu330GluLeuGly75SerMetArgThrLeu155ValLeuAlaGinPro235GluAlaLeuArgMet315LeuLeuLys60LysLeuArgThr140LysAspLeuLysArg220ProThrLeulieVal300AlaSerHis45GluSerAspAsnlie125GluLysLeuGinAsp205GluThrValLysGin285AlaAlaMetArgThrValGinThrProLeu110LysSerSerValLys190lielieProTrpAsn270PheProAsnTrpSer350ProLys80GlyAsp95AlaAspLeuLysAsplieProGlu160PheThr175HisGlyThrProGinAlaGinAsp240LysGly255lieGlySerSerGluValLeuTyr320ArgCys335SerArg<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>GinGlyArgThr690ProPro705AlaValArgPheArgMetlieGlu770ArgPhe785VallieAsnGluLeuAlaValSer850GluGlu865LeuGluTyrlieArgAsplieMet930ThrSer945LysGlyGlu675LeuValValValAsn755SerHisGinTrpLys835GluThrGlyThrPro915GluGlulie660ValGinSerAlaGlu740lieLeuLeuLysPro820GlyGluLysAspThr900AsnSerTyrAlalieArgProThr725TyrGlyArgProAsp805PheAspLeuSerPro885LeuTyrSerAlaAla965GluPheLys710GluPheSerAlaVal790liePheProTrpLeu870TyrAsnSerLysPro950GlyGinThr695ProGluArgArglie775TrpLysArgGlySer855LeuLeuValValPro935GlyMetSer680AlaGluTyrLeuPro760ProLeuAsnVallie840PheLeuLysCysLys920AlaLeuGin665PheAlaTrpArgAla745SerTrpGlyLeuThr825AlaGlyGinGinGin905LeuAspGluAsnGlyGluGluHis685ThrLeuGluHis700ArgAlaLeuMet715SerlieValPhe730ThrProGluLeuLysliePhebeu810lieAlaGlulieArg890AlaArgGluAspThr970ArgPheGly795MetAspLeuArgAla875LeuTyrProLeuThr955GlyLysAla780AlaLeuLeuTyrLeu860GlyArgThrHisVal940LeuPro765TrpAlaGinValAsp845ArgHisLeuLeulie925Lyslie670LeuGlyAspLysGlu750SerThrPheGluGlu830LysThrLysArgLys910SerLeuLeuCysMetGluGlu735TyrGlyGinLysMet815MetLeuAsnAspAsp895ArgArgAsnThrPheHisMet720ProGlyGlyThrHis800TyrValLeuPheLeu880SerlieGluProMet960權(quán)利要求1、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)的多核苷酸。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因的編碼序列為序列表中序列1的自5'末端第135位至3050位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。5、根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的基因，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因，為如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1;2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA分子。6、含有權(quán)利要求2至5中任一所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因的重組表達(dá)載體。7、含有權(quán)利要求2至5中任一所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組細(xì)胞系。8、含有權(quán)利要求2至5中任一所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因。該磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因可用于提高植物中的油脂含量。文檔編號(hào)C12N5/10GK101100661SQ20071011781公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2007年6月25日優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日發(fā)明者喬志新,劉進(jìn)元申請(qǐng)人:清華大學(xué)