專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2成熟肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的方法，特別是獲得與天 然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致的BMP-2成熟肽的方法。(二) 背景技術(shù)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BoneMorphogeneticProtein-2， BMP-2 )屬于轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng)因子超家族成員。BMP具有誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨、骨分化，并且 對(duì)胚胎骨骼及多種器官的形成和發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用。BMP獨(dú)特的誘導(dǎo)成 骨活性使其在骨骼損傷與疾患，如骨折、骨缺損及口腔頗面外科中具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，通過(guò)DNA重組技術(shù)，十多種重組BMP蛋白在基礎(chǔ)及 臨床應(yīng)用上均得到了廣泛研究，對(duì)BMP在生物進(jìn)化，發(fā)育和遺傳等方面作用 的研究正不斷深入。BMP在細(xì)胞內(nèi)先以前體的方式產(chǎn)生，包括信號(hào)肽、前肽和羧基端的成熟 肽。成熟肽中含有7個(gè)高度保守的半胱氨酸，它們形成三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵及一 個(gè)鏈間二硫鍵并將兩條多肽鏈連接為二聚體，BMP前體蛋白經(jīng)過(guò)N位糖基化， 蛋白水解酶裂解及二聚體化而形成BMP成熟肽，其活性形成多為其同源二聚 體，沒(méi)有糖基化的同源二聚體仍然具有生物學(xué)活性。多種組織細(xì)胞在胚胎發(fā) 育的不同階段表達(dá)BMP，并已從牛、鼠、兔、人等多種動(dòng)物骨組織中分離出 了 BMP。另外，牙質(zhì)、胎盤(pán)、骨肉瘤等組織中均含有豐富的BMP。應(yīng)用放射 免疫技術(shù)能檢測(cè)到血清中的BMP,成年人約14-18n/mlg,兒童為20-72ng/ml。天然BMP-2成熟肽的第一個(gè)氨基酸不是曱硫氨酸，常規(guī)的制備技術(shù)是在 成熟肽或截短型的N末端添加曱硫氨酸，利用大腸桿菌直接表達(dá)，包含體復(fù) 性法制備BMP-2，如華東基因技術(shù)研究所開(kāi)發(fā)截短型的rhBMP-2，去除N端 7個(gè)氨基酸后，人為添加一個(gè)甲硫氨酸，以其密碼子ATG作為起始密碼子， 在大腸桿菌胞內(nèi)高效表達(dá)，包含體蛋白復(fù)性得到有生物活性同二聚體。在本發(fā)明之前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)33巻5期(2005/10)康春雨章慶國(guó)發(fā)表的《人 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2真核表達(dá)質(zhì)粒的制備、轉(zhuǎn)染及表達(dá)》介紹了制備攜帶有 hBMP-2的全長(zhǎng)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP2的方法，通過(guò)脂質(zhì)體法將所得 到的重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，用G418進(jìn)行梯度篩選，從而得 到能夠穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的細(xì)胞克隆。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合SW:反應(yīng)(RT-PCR)檢 測(cè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)hBMP-2mRNA的表達(dá)。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN1484651介紹了將蛋白質(zhì)在原核生物中表達(dá)，該械束達(dá) 蛋白質(zhì)氨末端由一種TGF- 0超家族的蛋白質(zhì)的前序列或其部分組成，將蛋白 質(zhì)或另 一種TGF- P超家族蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域連接到該蛋白質(zhì)上，所連接上的 蛋白質(zhì)具有和成熟區(qū)BMP - 2至少35 %的同源性。蛋白質(zhì)的表達(dá)在至少有一 部分蛋白質(zhì)以包含體的形式而獲得。眾所周知，利用原核體系表達(dá)藥用蛋白具有成本低廉，易于大規(guī)模生產(chǎn) 的優(yōu)點(diǎn)。由于去糖基化的BMP-2仍然有生物學(xué)活性，這為原核體系表達(dá)BMP-2 創(chuàng)造了條件，華東基因技術(shù)研究所成功地利用大腸桿菌制備得到具有生物學(xué) 活性的重組人BMP-2。但是得到的產(chǎn)物與天然的BMP-2氨基酸序列不一致， 用于人體可能產(chǎn)生免疫原性。利用包含體制備目標(biāo)蛋白雖然具有成本低的優(yōu) 點(diǎn)，但是包含體中含有一定的雜蛋白和核酸，目標(biāo)蛋白占總蛋白的80%左右。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的方法，該方法制 得的產(chǎn)物可與天然BMP-2成熟肽M酸序列完全一致，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的， 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，本發(fā)明制備BMP-2成熟肽的方法包括如下順序步 驟(1) 刪除DsbA基因信號(hào)肽第2-18個(gè)氨基酸編碼基因，保留第一個(gè)曱硫 氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到編碼不含信號(hào)肽的DsbA的 DNA片段，將該片段重組于表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒1;所述DsbA 基因可以大腸桿菌染色體的DNA作模板擴(kuò)增出來(lái)，也可用pET等 含有DsbA基因的質(zhì)粒作為模板擴(kuò)增出來(lái)，用質(zhì)粒做模板更容易一(2) 將編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2完整成熟狀的DNA重組于重組質(zhì)粒 l中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2;(3) 將重組質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化入宿主菌株的菌體中，得到工程菌，所述宿主菌 為無(wú)疏氧還蛋白還原酶缺陷的大腸桿菌宿主的DE3溶原菌；(4) 工程菌在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加誘導(dǎo)劑使目的基因表達(dá)； (5 )工程菌細(xì)胞經(jīng)破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白； 蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。其中，所述步驟(l)中含有DsbA基因的質(zhì)粒優(yōu)選為pET39。大腸桿菌 基因組DNA中也含有該基因，可以用PCR方法擴(kuò)增得到編碼DsbA的基因。 所述步驟(3)中宿主菌抹優(yōu)選為大腸桿菌BL21 (DE3)。所述步驟(4)中目 的基因的表達(dá)在缺乏氧化環(huán)境條件下進(jìn)行。所述步驟(6)中蛋白酶為腸激酶 或重組腸激酶輕鏈。所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，所述步驟(2)中，重組質(zhì)粒2中骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA與DsbA基因的下 游之間，還重組有編碼 "Linker-6His-蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)"的序列。所述6His部件也可位于DsbA基因的上游，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)為腸激酶。具體地說(shuō)，例如， 取含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39,刪除pET39中的DsbA信號(hào)肽基因，獲得重 組質(zhì)粒1: pET39 ( SP-);將編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片段與編碼骨 形態(tài)發(fā)生蛋白 BMP-2成熟肽的 DNA拼接，獲得編碼 "Linker-6His-Eksite-BMP-2 " 的 DNA 片段；再將編碼 "Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶^/ TI和5awHI 重組于重組質(zhì)粒1: pET39 (SP-)中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2: pET39 ( SP- BMP-2 )。所述方法推薦按如下順序步驟進(jìn)行 (1 )以含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39作為PCR模板，利用PCR技術(shù)刪除 pET39中的DsbA信號(hào)肽基因第2~18個(gè)氨基酸編碼基因，保留第一個(gè)曱 硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，獲得的DNA片段重組于表達(dá)載體中， 獲得重組質(zhì)粒1: pET39 ( SP-);(2) 將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組于重組質(zhì)粒1中DsbA 基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2: pET39 ( SP-BMP-2 );(3) 將重組質(zhì)粒2: pET39(SP-BMP-2)轉(zhuǎn)化入宿主菌林大腸桿菌的菌體中， 得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使目標(biāo)融合蛋白得到表達(dá)；(5) 工程菌細(xì)胞經(jīng)破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白；(6) 以腸激酶酶切BMP-2融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 BMP-2成熟肽。進(jìn)一步，骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，優(yōu)選按如下順序步驟進(jìn)行(1) 以含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39為模板，刪除該質(zhì)粒中的DsbA信號(hào) 肽基因第2~18個(gè)氨基酸編碼基因，保留第一個(gè)曱硫氨酸的密碼子作為起 始密碼子，得到的片段重組于表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒1: pET39(SP-);(2) 將編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片段與編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白 BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA 片段；再將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段重組于重組質(zhì) 粒1: pET39( SP-)中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2: pET39( SP-BMP-2 );(3 )將重組質(zhì)粒2: pET39( SP- BMP-2 )轉(zhuǎn)化入宿主菌抹￡.co// BL21 (DE3 ) 的菌體中，得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培養(yǎng)基中，30°C 、 200 r/min培養(yǎng)到ODgoo約 0.5時(shí)，添加終濃度為O.l-lmM誘導(dǎo)劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷，30-37 。C下繼續(xù)培養(yǎng)2 10h，使目的基因表達(dá)；(5) 發(fā)酵結(jié)束后，離心收集工程菌細(xì)胞，破菌后，離心，收集上清液過(guò) 含N產(chǎn)的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液預(yù)洗脫，以含咪唑120~150mM的 緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液；50mM咪唑緩沖液(pH7.3 )配制取 咪唑0.68g和氯化鈉1.17g，加水使溶解成100ml,加入O.lmol/ml鹽酸溶 液42.2ml，再加水稀釋至200ml，即得。(6)往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度0.1 lmM的二乙胺四乙 酸，以及腸激酶5U/mL, 25。C下進(jìn)行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，經(jīng)分離 得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。U為酶活單位，定義為在23。C條 件下，8小時(shí)將50嗎胰蛋白酶原95%轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶所需的酶量，下同。 再進(jìn)一步，具體地說(shuō)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法按如下 順序步驟進(jìn)行(1 )以含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39為模版，引物 DsbA-l: 5， -AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，， DsbA-2: 5' -TCGCTTAAGTATTTCACTGT-3'， PCR參數(shù)94 。C 3min94°C 30s 40°C 30s 72°C lmin3個(gè)循環(huán) 94。C 30s 48°C 30s 72°C lmin 27個(gè)循環(huán) 72 °C lOmin 4°C lOmin以iV&I和5s/ TI酶切PCR產(chǎn)物和pET39質(zhì)粒，使不含信號(hào)肽基因的 DNA片段置換pET39中原有的DsbA基因，獲得不含DsbA信號(hào)肽基因的 重組質(zhì)粒1: pET39 (SP-); (2 )將編碼"Linker-6His-Eksite "的DNA片段 ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCATC ATGATGACGATGACAAA,其中CTTAAG為55pTI識(shí)別序列，與編碼骨形態(tài) 發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段虧1物L(fēng)inker-1: 5 ，-ATAQHMSCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTC ATCATCATC AT-3' 引物L(fēng)inker-2: 5， -TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGATGACC 3， 虧1物BMP2-1: 5 ，-GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA-3 ， 引物BMP2-2: 5，-TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT-3，取濃度為lOuM的引物L(fēng)inker-1和Link-2各2uL,加入2uL dNTP, 5uL 10 x DNA Polymerase Buffer,補(bǔ)ddH20至50uL反應(yīng)體系，沸水浴lOmin,放入50t:7JC浴冷卻3min，補(bǔ)加2.5U Pfti DNA polymerase,轉(zhuǎn)入72水浴 10min,使兩個(gè)引物互為模板，形成DNA雙鏈，得到反應(yīng)產(chǎn)物A;以引物BMP2-1和BMP2-2作為正反向引物，以BMP-2基因?yàn)槟０暹M(jìn) 行PCR擴(kuò)增，退火溫度設(shè)為50。C，延伸時(shí)間30s,得到反應(yīng)產(chǎn)物B;以產(chǎn)物A和產(chǎn)物B作為PCR模板，以引物L(fēng)inker-l和BMP2-2作為正 反向引物進(jìn)行基因拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片 段，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)如下 PCR參數(shù)94 X: 3min94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30個(gè)循環(huán) 72*C lOmin 化 lOmin ;(3) 將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片,殳重組于重組質(zhì)粒 pET39 (SP-)中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2: pET39 ( SP-BMP誦2 );(4) 將重組質(zhì)粒2: pET39( SP- BMP-2 )轉(zhuǎn)化入宿主菌抹￡.co//BL21(DE3) 的菌體中，得到工程菌；(5) 工程菌在Luria-Bertani培養(yǎng)基中經(jīng)種子培養(yǎng)得工程菌種子液，培養(yǎng) 好的工程菌種子液按1%的接種量接種到搖瓶裝液量為20%的 Luria-Bertani培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，30°C、 200 r/min培養(yǎng)到OD柳約為 0.5時(shí)添加誘導(dǎo)劑異丙基石危代-P -D-半乳糖苷至終濃度為0.2mM， 30 r溫度下繼續(xù)培養(yǎng)3h，使目的基因表達(dá)；(6) 發(fā)酵結(jié)束后，離心收集工程菌細(xì)胞，超聲破菌后，離心，收集上清 液過(guò)含Ni2+的螯合柱，以50mM咪喳緩沖液預(yù)洗脫，以含150mM咪 唑的Tris-HCl (pH7.8)緩沖液洗脫，收集洗脫液；(7) 往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度lmM的二乙胺四乙 酸，以及腸激酶5U/mL， 25。C下進(jìn)行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。 本發(fā)明首先要把DsbA信號(hào)肽基因的去除，以實(shí)現(xiàn)DsbA的胞內(nèi)表達(dá)，二 石克鍵形成蛋白A (disulfide bond formation protein A, DsbA)是大腸桿菌周質(zhì)胞 腔中輔助多種含有二疏鍵的蛋白質(zhì)正確折疊并具有生物學(xué)活性的一種二石克鍵 異構(gòu)酶.于1991年由Bardwe11發(fā)現(xiàn),是該家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，它存在 于E. coli周質(zhì)空間(periplasm)中,具有最強(qiáng)的氧化性，分子量為21 kD. DsbA能 催化周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白質(zhì)形成二硫鍵，而且具有很好的溶解性。天然的DsbA 基因含有信號(hào)肽基因，指導(dǎo)DsbA分泌至具有氧化環(huán)境的周質(zhì)空間。含有七個(gè) 半胱氨酸殘基的BMP-2融合蛋白在具有氧化環(huán)境的周質(zhì)空間表達(dá)會(huì)通過(guò)二硫 鍵形成多聚體。為了使DsbA融合蛋白在缺乏氧化環(huán)境的胞內(nèi)表達(dá)，必須刪除 其編碼信號(hào)肽第2-18氨基酸殘基的DNA片段，保留第一個(gè)氨基酸甲硫氨酸 密碼子ATG作為翻譯其始密碼子。設(shè)計(jì)5，突變引物，以攜帶DsbA基因的pET39為模板，利用PCR技術(shù) 擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽基因的編碼DsbA的DNA片段，利用限制性?xún)?nèi)切酶TWfeI 和ApTI將突變后DNA重組于pET39中，得到質(zhì)粒pET39 ( SP-)構(gòu)建編碼 "DsbA-Linker-6His-Eksite-BMP-2"融合蛋白的工程菌為了使融合蛋白的兩個(gè) 主要部分在空間上相互獨(dú)立，在DsbA的C端設(shè)計(jì)GSGSG作為連接肽(G、 S分別是甘氨酸、絲氨酸的單字母縮寫(xiě))。為了方便融合蛋白的分離純化，在 Linker的C端設(shè)計(jì)6His親和標(biāo)簽，為表達(dá)產(chǎn)物可用N嚴(yán)親和層析分離純化創(chuàng) 造條件。為了獲得與天然BMP-2氨基酸序列完全一致的產(chǎn)物，在BMP-2的N 端設(shè)計(jì)腸激酶的識(shí)別位點(diǎn)(DDDDK)(D、 K分別是天冬氨酸、賴(lài)氨酸的單字 母縮寫(xiě))。由于實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有編碼BMP-2的基因，為了構(gòu)建該工程菌，在已經(jīng)刪除DsbA信號(hào)肽基因的J^出上，利用DsbA基因3，末端含有的^; TI 位點(diǎn)，設(shè)計(jì)編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA與編碼BMP-2的基因拼接，利 用限制性?xún)?nèi)切酶^pTI和BamHI將突變后DNA重組于pET39 ( SP (-)中。 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主五.coZ/BL21 (DE3)得到工程菌。工程菌的表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，工程菌在含有抗生素的LB培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)至OD6oo=0.5左右，加入終濃度為O.l-lmM的IPTG，使目的基因表達(dá)， 工程菌細(xì)胞經(jīng)超聲破菌后12000rpm離心，利用SDS-PAGE分析沉淀和上清， 確定融合蛋白的溶解性?？扇艿娜诤系鞍捉?jīng)N嚴(yán)親和層析一步分離純化，可得到純度大于95%的 BMP-2融合蛋白。BMP-2成熟肽單體的獲得，用重組腸激酶酶切融合蛋白，由于BMP-2成 熟肽在水溶液中的溶解度很小，在酶切過(guò)程中出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，離心分離后， DsbA擔(dān)體和腸激酶在上清液中，大部分BMP-2成熟肽單體在沉淀中，從而 成功得到BMP-2成熟肽單體，BMP-2成熟肽單體可用于復(fù)性法制備具有生物 學(xué)活性的二聚體。利用本發(fā)明方法，可以得到與天然BMP-2氨基酸序列完全一致的BMP-2 成熟肽。而且采用融合表達(dá)策略以后，融合蛋白溶解性好，含有親和層析的 標(biāo)簽，可以用N產(chǎn)親和純化的方法分離純化融合蛋白，純度可達(dá)950/。以上。 酶切后BMP-2成熟肽單體由于在水溶液中的溶解度小而沉淀出來(lái)，可以用簡(jiǎn) 單的離心分離目標(biāo)蛋白和融合伴侶(DsbA擔(dān)體蛋白)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果體現(xiàn)在用本發(fā)明方法制得的產(chǎn)物 與天然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致；融合表達(dá)實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，融合 蛋白可以用N產(chǎn)親和層析一步純化，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了 BMP-2復(fù)性前的純化步驟。(四)


圖1為重組質(zhì)粒pETDsbA-BMP的質(zhì)粒圖譜。(五)
具體實(shí)施例方式以下以具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此實(shí)施例l: DsbA信號(hào)肽基因的去除引物設(shè)計(jì)DsbA-l: 5, AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT 3， 24bpDsbA-2: 5' TCGCTTAAGTATTTCACTGT 3' 20bp PCR模板pET39質(zhì)粒 PCR參數(shù) 94 。C 3min94°C 30s 40匸30s 72°C lmin 3個(gè)循環(huán) 94°C 30s 48°C 30s 72°C lmin 27個(gè)循環(huán) 72 。C lOmin 4°C lOmin以AWel和5s; TI酶切PCR產(chǎn)物和pET39質(zhì)粒，使不含信號(hào)肽基因的DNA 片段置換pET39中原有的DsbA基因，獲得的重組質(zhì)粒命名為pET39 ( SP-)。實(shí)施例2:編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"基因的獲得首先根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片 段，序列如下ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCAT CATCATCATCATGATGACGATGACAAA，其中劃線部分為仏/ TI識(shí)別序列。 為了使該DNA片段與BMP-2基因順利拼接，設(shè)計(jì)以下四條引物，以SOE技術(shù)進(jìn)行拼接。引物L(fēng)inker-1:5， ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT 3， 46bp引物L(fēng)inker-2:5， TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGAT GACC3， 54 bp 引物BMP2-1:5， GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA 3， 30 bp 引物BMP2-2:5' TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT 3' 30 bp 操作方法由于引物L(fēng)inker-l和引物L(fēng)inker-2有18bp反向互補(bǔ)，取濃度為10uM 的引物L(fēng)inker-1和Link-2各2uL，加入2uL dNTP， 5uL 10X DNA Polymerase Buffer,補(bǔ)ddH20至50uL反應(yīng)體系，沸水浴10min，放入50。C水浴冷卻 3min,補(bǔ)加2.5U Pfii DNA polymerase,轉(zhuǎn)入72水浴10min，使兩個(gè)引物 互為模板，形成DNA雙鏈。反應(yīng)產(chǎn)物命名為產(chǎn)物A。BMP-2基因的重新擴(kuò)增以引物BMP2-1和BMP2-2作為正反向引物， 以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到的BMP-2基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度設(shè)為50 。C，延伸時(shí)間30s，得到的產(chǎn)物命名為產(chǎn)物B?；蚱唇右援a(chǎn)物A和產(chǎn)物B作為PCR模板，以引物L(fēng)inker-l和BMP2-2 作為正反向引物進(jìn)行基因拼接，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)如下 PCR參數(shù) 94 X: 3min94"C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30個(gè)循環(huán)72 °C 10min 4°C 10min得到的PCR產(chǎn)物命名為產(chǎn)物C,為編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的 DNA片段。實(shí)施例3:工程菌構(gòu)建以j^/ TI和JSamffl酶切產(chǎn)物C，按常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)重組于pET39( SP-) 中，得到重組質(zhì)粒pETDsbA-BMP(質(zhì)粒圖傳見(jiàn)圖1 )，重組質(zhì)粒pETDsbA-BMP 轉(zhuǎn)化五.co&BL21 (DE3)，經(jīng)測(cè)序鑒定后保存該工程菌。用于表達(dá)研究和生產(chǎn)。實(shí)施例4: "DsbA-Linker-6His-Eksite-BMP-2"融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)試驗(yàn)用無(wú)菌牙簽挑取陽(yáng)性克隆的單菌落于含有50ug/mL卡那霉素的3mL LB培養(yǎng)基中，30 。C、 200r/min培養(yǎng)16小時(shí)，得工程菌種子液。培養(yǎng)好的工程菌種子液按1%的接種量接種到搖瓶裝液量為20 %的Luria-Bertani培養(yǎng)基中，30 。C、 200 r/min培養(yǎng)到(9￡)600約0.5時(shí)，添加誘導(dǎo)劑 IPTG至終濃度為0.2mM,誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，在30。C溫度下繼續(xù)培養(yǎng)3h。 收集菌體作全菌SDS-PAGE分析，可得到表觀分子量為36kD的表達(dá)產(chǎn)物。實(shí)施例5:融合蛋白的溶解性分析以及分離純化發(fā)酵結(jié)束后，以3000rpm轉(zhuǎn)速離心收集工程菌細(xì)胞，以20mM Tris-HCl pH8.0緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，以離心12000rpm轉(zhuǎn)速離心，分別收集 沉淀和上請(qǐng)，沉淀以4MUrea, O.lMNaCl溶液溶解，以SDS-PAGE分析沉淀 和上清夜目標(biāo)蛋白的含量，本發(fā)明中，融合蛋白主要存在于上清液中，說(shuō)明 融合蛋白以可溶的形式存在于工程菌細(xì)胞中。(1) 融合蛋白的分離純化由于融合蛋白含有6His親和純化標(biāo)簽，融合蛋白可以特異性地吸附于Ni2+ 螯合柱上，以50mM咪唑緩沖液預(yù)洗脫，以含咪唑150mM的Tris-HCl、 pH7.8緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液；(2) 融合蛋白的酶切以及BMP-2成熟肽單體的獲得在N嚴(yán)螯合親和層析的含有融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度為lmM 的EDTA和5U/mL的腸激酶，在25。C條件下進(jìn)行酶切，在酶切過(guò)程中釋 放出BMP-2成熟肽單體，由于BMP-2成熟肽單體的溶解性很小，酶切過(guò) 程中溶液由澄清逐漸變?yōu)闇啙帷?酶切結(jié)束后，以大于5000rpm的轉(zhuǎn)速離心收集沉淀，用20mM Tris-HCl 洗滌沉淀一次，沉淀為純度大于90。/。的BMP-2成熟肽單體，該單體可用于進(jìn) 一步復(fù)性以制備具有生物學(xué)活性的重組同源二聚體。BMP-2成熟肽單體的N-端15個(gè)氨基酸序列測(cè)定結(jié)果為N-Gln Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys，與天然的BMP-2成熟肽N-端氨 基酸序列完全一致。實(shí)施例6:以得到的BMP-2成熟肽單體體外復(fù)性獲得同源二聚體用含有8M尿素、10mM 二硫蘇糖醇(DDT )、 5mM EDTA的Tris-HCl pH8.5 的緩沖液溶解BMP-2單體沉淀，室溫下磁力攪拌2小時(shí)，以稀釋法復(fù)性，復(fù) 性體系主要物質(zhì)的終濃度如下0.5ML-精氨酸、O.IM氯化鈉、0.5M尿素、 lmM還原型谷胱甘肽GSH、 O.lmM氧化型谷胱甘肽GSSG。在4-10。C冰箱放 置24小時(shí)以上，以非還原性SDS-PAGE分析二聚體的形成情況，隨著復(fù)性時(shí) 間的延長(zhǎng)，表觀分子量為25kD的蛋白質(zhì)逐漸增多。以還原性SDS-PAGE分析 時(shí)該條帶消失，可以推斷表觀分子量為25kD的蛋白質(zhì)為BMP-2成熟肽的二聚體。實(shí)施例7:基因測(cè)序分析經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明所得BMP-2融合蛋白的基因序列如下(劃線部分為BMP-2 成熟肽基因)ATGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAAC CGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTCTGCCCG CACTGCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAA AAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATG GGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATG GCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTA CAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATC AACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGACGTGGAACAGCTTC GTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTG CAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAA TCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGTTTGTTCAGCAGTATGCTGATATCATCATCATGATGACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAACGGAAGAGGCTGAAATCCTCCTGCAAAAGACATCCGCTGTATGTGGATTTTAGCGATGTGGGCTGGAACGATTGGATTGTGGCGCCGCCGGGCTATCATGCGTTTTATTGCCATGGCGAATGCCCGTTTCCGCTGGCGGATCATCTGAACTCCACCAACCATGCGATTGTGCAGACCCTGGTGAACTCTGTGAACAGCAAAATTCCGAAAGCGTGCTGTGTGCCGACCGAACTGAGCGCGATTTCGATGCTGTATCTGGATGAAAACGAAAAAGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGATATGGTGGTGGAAGGTTGTGGCTGTCGCTAA:本發(fā)明所得BMP-2融合蛋白的氨基酸序列如下(劃線部分為BMP-2成熟 肽氨基酸)MAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFCPHCYQFEEVLHISDNVKKKYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVOTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLD ENEKVVLKNYODMVVEGCGCR* :結(jié)論用本發(fā)明方法制得的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽與天然BMP-2 成熟肽氨基酸序列完全一致。序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110><120〉<130><160><170><210> <211〉 <212> <213><220> <223>浙江工業(yè)大學(xué)一種制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的方法 8Patentlri version 3. 2 165 DNAUnknown 人工序列<400〉 1atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcatcatc ettgatgacga 60 tgaca 65<210〉 2<211〉 46<212> DNA <213〉人工序列<■〉 2atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcat 46<210> 3 <211〉 54 <212〉 DNA <213〉人工序列<400> 3 一—ttgcttatgc tttgcttgtt tgtcatcgtc atcatgatga tgatgatgat gacc 54<210〉 4<211〉 30<212> DNA <213〉人工序列<400> 4gacgatgaca aacaagcaaa gcataagcaa 30<210〉 5<211〉 29<212> DNA <213>人工序列<400> 5ttcggatcct tagcgacagc cacaacctt 29<210〉 6<211〉 957<212> DNA <213>人工合成<400> 6atggcgcagt atgaagatgg taaacagtac actaccctgg aaaaaccggt 3gctggcgcg 60ccgcaagtgc tggagttttt ctctttcttc tgcccgcact gctatcagtt tgaagaagtt 120ctgcatattt ctgataatgt gaagaaaaaa ctgccggaag gcgtgaagat gactasatac 180cacgtcaact tcatgggtgg tgacctgggc aaagatctga ctcaggcatg ggctgtggcg 240atggcgctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgt300cagaccattcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggt360gaagagtacgacgcgacgtggaacagcttcgtggtga幼tctctggtcgctc8gcaggaa420aaagctgcagctgacgtgcaattgcgtggcgUccggcgatgtttgttaacggtaaatat480cagctgaatccgcsgggtatggataccagcaatatgtttgttcagcagtatgctgataca540gtgaaatacttaagcgagaaaaaaggttctggttctggtcatcatcatcatcatcatgat600gacgatgaca幼CEiaigcaaeigcataagcaacgga卿ggctgaaatcctcctgcaa幼ga660catccgctgtatgtggattttagcgatgtgggctgg咖gattggattgtggcgccgccg720ggctatcatgcgttttattgccatggcgaatgcccgtttccgctggcggatcatctgaac780tccaccaaccatgcgattgtgcagaccctggtgaactctgtgaacagcaa840gcgtgctgtgtgccgaccgaactgagcgcgatttcgatgctgtatctgga900aaagtggtgctgaaaaactatcaggatatggtggtggaaggttgtggctgtcgctaa957<210> 7<211> 318<212> PRT <213>人工合成<400> 7Met Ala Gin Tyr Glu Asp Gly Lys Gin Tyr Thr Thr Leu Glu Lys Pro1510 15Val Ala Gly Ala Pro Gin Val Leu Glu Phe Phe Ser Phe Phe Cys Pro2025 30His Cys Tyr Gin Phe Glu Glu Val Leu His lie Ser Asp Asn Val Lys3540 45Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met Thr Lys Tyr His Val Asn Phe5055 60Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Asp Leu Thr Gin Ala Trp Ala Val Ala6570 75 80Met Ala Leu Gly Val Glu Asp Lys Val Thr Val Pro Leu Phe Glu Gly8590 95Val Gin Lys Thr Gin Thr lie Arg Ser Ala Ser Asp lie Arg Asp Val100105 110Phe lie Asn Ala Gly lie Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Thr Trp Asn115120 125Ser Phe Val Val Lys Ser Leu Val Ala Gin Gin Glu Lys Ala Ala Ala130135 140Asp Val Gin Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly Lys Tyr145150 155 160Gin Leu Asn Pro Gin Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Phe Val Gin Gin165170 175Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys Gly Ser Gly Ser 180 185 190Gly His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Gin Ala Lys His 195 200 205Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr 210 215 220Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp lie Val Ala Pro Pro225 230235240Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala 245 250 255Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala lie Val Gin Thr Leu Val Asn 260 265 270Ser Val Asn Ser Lys lie Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu 275 280 285Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu 290 295 300Lys Asn Tyr Gin Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 305 310 315<210〉 <211> <212> <213><220〉 <223><400>815PRTUnknown人工合成 8Gin Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 15 10 1權(quán)利要求
1. 一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其特征在于所述方法包括如下順序步驟(1)刪除DsbA基因信號(hào)肽第2～18個(gè)氨基酸編碼基因，保留第一個(gè)甲硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到編碼不含信號(hào)肽的DsbA的DNA片段，將該片段重組于表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒1；(2)將編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組于重組質(zhì)粒1中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2；(3)將重組質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化入宿主菌株的菌體中，得到工程菌，所述宿主菌為無(wú)硫氧還蛋白還原酶缺陷的大腸桿菌宿主的DE3溶原菌；(4)工程菌在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加誘導(dǎo)劑使目的基因表達(dá)；(5)工程菌細(xì)胞經(jīng)破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白；(6)蛋白酶酶切BMP-2融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其 特征在于所述步驟(1)中所述DsbA基因來(lái)自質(zhì)粒pET39。
3. 如權(quán)利要求1所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其 特征在于所述步驟(3)中宿主菌林為大腸桿菌BL21(DE3)。
4. 如權(quán)利要求1所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中目的基因的表達(dá)在缺乏氧化環(huán)境條件下進(jìn)行。
5. 如權(quán)利要求1所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其 特征在于所述步驟(6)中蛋白酶為下列之一腸激酶，重組腸激酶 輕鏈。
6. 如權(quán)利要求1~5之一所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方 法，其特征在于所述步驟(2)中，重組質(zhì)粒2中骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2 完整成熟肽的DNA與DsbA基因的下游之間，還重組有編碼"Linker-6His-蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)"的序列。
7. 如權(quán)利要求6所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其 特征在于所述蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)為腸激酶或凝血因子。
8. 如權(quán)利要求1所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其 特征在于所述方法按如下順序步驟進(jìn)行(1)以含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39作為PCR模板，利用PCR技 術(shù)刪除pET39中的DsbA信號(hào)肽基因第2 18個(gè)氨基酸編碼基 因，保留第一個(gè)曱硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，獲得的 DNA片段重組于表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒l: pET39(SP-);(2 )將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組于重組質(zhì)粒 1中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2: pET39(SP-BMP-2);(3) 將重組質(zhì)粒2: pET39 (SP-BMP-2)轉(zhuǎn)化入宿主菌株大腸桿菌 的菌體中，得到工程菌；(4) 工程菌在Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，^f吏目標(biāo)融合蛋白得到表 達(dá)；(5) 工程菌細(xì)胞經(jīng)破菌，分離純化得到BMP-2融合蛋白；(6) 以腸激酶酶切BMP-2融合蛋白，經(jīng)分離得到所迷的骨形態(tài)發(fā)生 蛋白BMP-2成熟肽。
9.如權(quán)利要求8所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其 特征在于所述方法按如下順序步驟進(jìn)行(1)以含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39為模板，刪除該質(zhì)粒中的DsbA 信號(hào)肽基因第2-18個(gè)氨基酸編碼基因，保留第一個(gè)曱硫氨酸的密碼 子作為起始密碼子，得到的片段重組于表達(dá)栽體中，獲得重組質(zhì)粒1: pET39 ( SP-);(2 )將編碼"Linker-6His-Eksite"的DNA片段與編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋 白BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段；再將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片段 重組于重組質(zhì)粒l: pET39(SP-)中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì) 粒2: pET39 ( SP誦BMP-2 );(3 )將重組質(zhì)粒2: pET39 ( SP- BMP-2 )轉(zhuǎn)化入宿主菌林BL21(DE3)的菌體中，得到工程菌；(4 )工程菌在Luria-Bertani培養(yǎng)基中，30°C 、 200 r/min培養(yǎng)到OD600 約0.5時(shí)，添加終濃度為O.l-lmM i秀導(dǎo)劑異丙基辟"戈-p-D-半乳泮唐 苷，30-37匸下繼續(xù)培養(yǎng)2 10h,使目的基因表達(dá)；(5)發(fā)酵結(jié)束后，離心收集工程菌細(xì)胞，破菌后，離心，收集上清 液過(guò)含N產(chǎn)的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液預(yù)洗脫，以含咪唑 120~150mM的緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液；(6 )往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度O.l-lmM的二乙胺四乙酸，以及腸激酶5U/mL， 25。C下進(jìn)行酶切，蛋白酶酶切融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。
10.如權(quán)利要求8所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的制備方法，其特征在于所述方法按如下順序步驟進(jìn)行(1)以含有DsbA基因的質(zhì)粒pET39為模版，引物DsbA-l: 5， -AAGCATATGGCGCAGTATGAAGAT-3，，DsbA-2: 5， -TCGCTTAAGTATTTCACTGT畫(huà)3，， PCR參數(shù)94 °C 3min94X: 30s 40。C 30s 72°C lmin3個(gè)循環(huán) 94€ 30s 48°C 30s 72°C lmin 27個(gè)循環(huán) 721: lOmin 4。C lOmin以iV&I和仏; TI酶切PCR產(chǎn)物和pET39質(zhì)粒，使不含信號(hào)肽基 因的DNA片段置換pET39中原有的DsbA基因，獲得不含DsbA信 號(hào)肽基因的重組質(zhì)粒l: pET39(SP-); (2)將編碼 "Linker-6His-Eksite " 的 DNA 片段 ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCA TCATCATGATGACGATGACAAA,其中CTTAAG為丑spTI識(shí)別序列， 與編碼骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的DNA拼接，獲得編碼 "Linker-6His國(guó)Eksite-BMP國(guó)2"的DNA片段引物L(fēng)inker-1: 5 ，-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTC ATC ATC ATC AT國(guó)3' 引物L(fēng)inker-2: 5， -TTGCTTATGCTTTGCTTGTTTGTCATCGTCATCATGATGATGATGATGATGACC 3， 虧i物BMP2-1: 5 ，-GACGATGACAAACAAGCAAAGCATAAGCAA-3 ， 引物BMP2-2: 5，-TTCGGATCCTTAGCGACAGCCACAACCTT-3，取濃度為lOuM的引物L(fēng)inker-l和Link-2各2uL,加入2uL dNTP， 5uL 10 xDNA Polymerase Buffer,補(bǔ)ddH20至50uL反應(yīng)體系，沸水浴 10min,放入50。C水浴冷卻3min，補(bǔ)加2.5U PfU DNA polymerase,轉(zhuǎn) 入72水浴10min，使兩個(gè)引物互為才莫板，形成DNA雙鏈，得到反應(yīng) 產(chǎn)物A;以引物BMP2-1和BMP2-2作為正反向引物，以BMP-2基因?yàn)槟?板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度設(shè)為50。C，延伸時(shí)間30s,得到反應(yīng)產(chǎn)物 B;以產(chǎn)物A和產(chǎn)物B作為PCR模板，以引物L(fēng)inker-l和BMP2-2作 為正反向引物進(jìn)行基因拼接，獲得編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2" 的DNA片段，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)如下 PCR參數(shù)94 °C 3min94°C 30s 60°C 30s 72°C lmin 30個(gè)循環(huán) 72 °C lOmin 4。C lOmin ;(3) 將編碼"Linker-6His-Eksite-BMP-2"的DNA片^殳重組于重組 質(zhì)粒pET39( SP-)中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2: pET39(SP誦BMP-2 );(4) 將重組質(zhì)粒2: pET39( SP- BMP-2 )轉(zhuǎn)化入宿主菌林Eco" BL21(DE3)的菌體中，得到工程菌； (5 )工程菌在Luria-Bertani培養(yǎng)基中經(jīng)種子培養(yǎng)得工程菌種子液， 培養(yǎng)好的工程菌種子液按1%的接種量接種到搖瓶裝液量為20 %的Luria-Bertani培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，30°C、 200 r/min培養(yǎng)到 OD6。。約為0.5時(shí)添加誘導(dǎo)劑異丙基琉代-p-D-半乳糖苷至終濃 度為0.2mM， 30X:溫度下繼續(xù)培養(yǎng)3h,使目的基因表達(dá)；(6) 發(fā)酵結(jié)束后，離心收集工程菌細(xì)胞，超聲破菌后，離心，收集 上清液過(guò)含N產(chǎn)的螯合柱，以50mM咪唑緩沖液預(yù)洗脫，以含 150mM咪唑的Tris-HCl、 pH7.8緩沖液洗脫，收集洗脫液；(7) 往含BMP-2融合蛋白的洗脫液中，加入終濃度lmM的二乙胺 四乙酸，以及腸激酶5U/mL， 25。C下進(jìn)行酶切，蛋白酶酶切融 合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽的方法刪除DsbA基因信號(hào)肽第2～18個(gè)氨基酸編碼基因，保留第一個(gè)甲硫氨酸的密碼子作為起始密碼子，得到片段重組于表達(dá)載體中，獲得的重組質(zhì)粒1；將骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2完整成熟肽的DNA重組于重組質(zhì)粒1中DsbA基因的下游，獲得重組質(zhì)粒2；將重組質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌株的菌體中，得到工程菌經(jīng)培養(yǎng)、添加誘導(dǎo)劑使目的基因表達(dá)，破菌、分離純化得到DsbA-BMP-2融合蛋白，蛋白酶酶切DsbA-BMP-2融合蛋白，經(jīng)分離得到所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2成熟肽。本發(fā)明方法制得的產(chǎn)物可與天然BMP-2成熟肽氨基酸序列完全一致，實(shí)現(xiàn)可溶性胞內(nèi)融合表達(dá)，融合蛋白可以用Ni²⁺親和層析一步純化，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了BMP-2復(fù)性前的純化步驟。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101235084SQ200710067138
公開(kāi)日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2007年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月31日
發(fā)明者于真真, 付水星, 任慧穎, 偉 徐, 林陳水, 明 許, 鄭小玲, 錢(qián)俊青, 黎小軍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)