專利名稱：一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhOP－1)的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(hOP-1)基因的釣取，尤其是在大腸桿菌系統(tǒng)中重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhOP-1)的表達(dá)和純化，屬基因工程制藥技術(shù)領(lǐng)域。
hOP-1存在于正常人體，屬細(xì)胞因子中的一種，其主要生理作用是誘導(dǎo)骨細(xì)胞的形成，尤其適用于骨損傷和骨缺失部位的快速愈合。現(xiàn)有技術(shù)中，骨損傷和骨缺失的治療主要采用下述材料，但均存在明顯缺陷(1) 自體植骨自體植骨的優(yōu)點(diǎn)是植骨后無(wú)免疫排斥反應(yīng)，且新骨形成較快。
但存在病人要面對(duì)二次手術(shù)的痛苦，如出現(xiàn)大面積骨缺失，來(lái)源受到限制。(2) 高分子合成材料，包括PGA和PLA及二者的混合材料PLGA，這些材料對(duì)骨細(xì)胞的形成無(wú)任何促進(jìn)作用，僅屬物理性衍接。(3) 無(wú)機(jī)植骨材料包括甲殼素、珊瑚制品、CPC等，在國(guó)內(nèi)尚無(wú)任何廠家報(bào)批。(4) 異種或異體骨各種頑固性病毒包括瘋牛病病毒的存在，人們不敢輕易使用該種材料。
因此，用基因重組技術(shù)制備大量的rhOP-1藥物及用其開(kāi)發(fā)具有誘骨活性的復(fù)合材料，可以大大改善傳統(tǒng)的自體植骨、高分子合成材料、無(wú)機(jī)植骨材料及各種異種或異體骨等各種治療方法，給廣大骨損傷和骨缺失病人帶來(lái)福音。
人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的發(fā)現(xiàn)起源于早期對(duì)骨組分的研究，1965年美國(guó)Urist[Urist MR.Science，150893-399(1965)]發(fā)現(xiàn)，牛骨中的基質(zhì)明膠中存在誘骨生成的物質(zhì)。經(jīng)過(guò)三十多年的努力，現(xiàn)已從人的各種組織cDNA文庫(kù)中找到了十多個(gè)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因，OP-1屬其中之一，分子量為14000道兒頓，其中含有堿性氨基酸，如賴氨酸和精氨酸多個(gè)，為一堿性蛋白。OP-1 cDNA encodes an osteogenicprotein in the TGF-β family//The EMBO Journal，1990；9；2085和Identification ofTGF-B family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone//Proc Natl Acad Sci USA，1990，879843分別公開(kāi)了BMP-5、6、7的克隆化研究。其基本程序是從骨基質(zhì)中提取骨形態(tài)發(fā)生蛋白，純化后用胰酶消化得到數(shù)個(gè)肽片段，進(jìn)行氨基酸測(cè)序，以此為依據(jù)并參照氨基酸密碼寫(xiě)出骨形態(tài)發(fā)生蛋白的核苷酸序列，分別合成數(shù)個(gè)寡核苷酸片段為探針，從基因庫(kù)和cDNA文庫(kù)進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。Process of producing osteogenic protein l using yeast//KR97043049公開(kāi)了用酵母生產(chǎn)成骨蛋白的過(guò)程。成骨蛋白-1成熟蛋白編碼區(qū)cDNA克隆與序列分析//牙體牙髓牙周病學(xué)雜志97，7(2)84-87公開(kāi)了第四軍醫(yī)大口腔醫(yī)學(xué)院陳文等用一步酸酚法從健康人胎盤(pán)組織中提取總RNA，用Oligo(dt)作引物逆轉(zhuǎn)錄合成胎盤(pán)cDNA文庫(kù)，然后利用PCR技術(shù)，從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出編碼人OP-1成熟區(qū)的基因片段，將所得基因片段插入DGEM-3If(t)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑選陽(yáng)性克隆?？寺〉降腛P-1的成熟蛋白基因均為人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的結(jié)構(gòu)基因。在國(guó)外hOP-1曾在真核細(xì)胞CHO中表達(dá)，但產(chǎn)量低，成本高。目前未見(jiàn)采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法的報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的生產(chǎn)方法，從而獲得具有商業(yè)價(jià)值的藥用植骨材料。
實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述方案實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)和純化，包括利用RT-PCR方法從正常胎兒腎組織cDNA中，放大獲得人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(hOP-1)的基因片段；通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；在培養(yǎng)液不含誘導(dǎo)劑的條件下表達(dá)rhOP-1；通過(guò)離子交換柱層析，疏水柱層析和分子篩柱層析獲得高純度藥用rhOP-1蛋白。
通過(guò)RT-PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，并改造獲得rhOP-1基因片段，其目標(biāo)蛋白基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列為5′ ATG AGA GGA TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGCMet Arg Gly Ser The Gly Ser Lys Gln ArgAGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATGSer Gln Asn Arg Ser Lys The Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg MetGCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAGAla Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys LysAAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGGLys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp TrpATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGTIle Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu CysGCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTGAla Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala The Asn His Ala Ile ValCAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGCGln The Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu The Val Pro Lys Pro CysTGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GACCys Ala Pro The Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp AspAGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCCSer Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg AlaTGT GGC TGC CAC TAG 3′Cys Gly Cys His其中離子交換柱填料為DEAE、Q、QAE、SP或CM類型的陰離子交換劑；疏水柱填料為butyl-、phenyl-或octyl-基的疏水介質(zhì)；分子篩填料為Sepha·ryl系列、Superdex系列或Sepharose系列的介質(zhì)。
其中離子交換層析流動(dòng)相I為20-50mM咪唑鹽酸巴比妥鹽、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩沖液、pH的范圍在6.0-9.0；流動(dòng)相II為上述相應(yīng)流動(dòng)相I中加入0.01-0.5M NaCl梯度洗脫。
其中疏水柱層析流動(dòng)相I為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩沖液，pH的范圍在6.0-9.0，其中加入0.1-1.0M(NH4)2SO4或0.1-1.0M NaCl，流動(dòng)相II分別以20-50mM pH范圍在7.0-9.0的磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序洗脫。
本發(fā)明在無(wú)誘導(dǎo)劑存在下表達(dá)rhOP-1，并通過(guò)層析精制純化獲得高純度藥用rhOP-1。這種rhOP-1不僅具有誘骨形成能力，且與膠原蛋白或珊瑚粉類材料復(fù)合，對(duì)骨損傷和骨缺失具有明顯的療效作用。本發(fā)明涉及的是用原核細(xì)胞對(duì)hOP-1進(jìn)行表達(dá)，同真核細(xì)胞和酵母系統(tǒng)相比，具有表達(dá)量高、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。該方法的特點(diǎn)是(1)通過(guò)大量載體和宿主的篩選，確保載體、目的基因和宿主之間達(dá)到高度的協(xié)調(diào)，使所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌把rhOP-1蛋白視為自身的內(nèi)源性物質(zhì)，以至于可以在無(wú)誘導(dǎo)劑的存在下高產(chǎn)量表達(dá)生產(chǎn)出rhOP-1，表達(dá)量可達(dá)30％以上。
(2)純化過(guò)程利用了陰離子交換樹(shù)脂。其原理是將目標(biāo)蛋白通過(guò)靜電相互作用，結(jié)合于填料表面，經(jīng)洗脫去除非結(jié)合非特異性組分后，用高鹽濃度將rhOP-1洗脫下來(lái)。
(3)為精制rhOP-1使其濃度達(dá)到醫(yī)用目的，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂純化后的粗品rhOP-1，再通過(guò)疏水柱層析和分子篩進(jìn)行純化，所得到的目標(biāo)蛋白純度大于98％，可以直接用于制劑的配制。
(4)精制純化獲得的rhOP-1與膠原蛋白或珊瑚粉等混合后，進(jìn)行透析，經(jīng)冷凍干燥即可獲得具有商業(yè)價(jià)值的植骨材料。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。


圖1是表達(dá)載體SWP-1的組成與特性圖。
圖2是離子交換層析圖譜。
圖3是疏水層析圖譜。
圖4是分子篩層析圖譜。
圖5是重組工程菌的SDS-PAGE電泳圖。
圖6是rhOP-1凍干產(chǎn)品樣品照片。
參見(jiàn)附圖，本發(fā)明提供一種在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)和純化方法。利用RT-PCR技術(shù)釣取得到hOP-1基因，經(jīng)DNA重組技術(shù)，獲得可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌且具有rhOP-1高效表達(dá)功能的質(zhì)粒SWP-1，見(jiàn)
圖1。在培養(yǎng)液不含誘導(dǎo)劑的條件下表達(dá)rhOP-1，通過(guò)離子交換柱析、疏水柱層析和分子篩柱層析獲高純度藥用rhOP-1蛋白。
具體實(shí)施例方式
如下1、rhOP-1工程菌的構(gòu)建從醫(yī)院取華人胎兒的腎細(xì)胞，直接用異硫氰酸胍/酚氯仿抽提出總RNA。以總RNA為模板，合成的反義3’端寡核苷酸為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在反轉(zhuǎn)錄液中加入合成的5’端和反義鏈3’端寡核苷酸引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)合成rhOP-1結(jié)構(gòu)基因。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分離開(kāi)合成引物，切取λHind III分子標(biāo)準(zhǔn)564bp處的DNA條帶。用第二次RT-PCR后的反應(yīng)液，經(jīng)純化后以粘性末端方法和質(zhì)粒載體pUC19直接重組連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α宿主菌中得到轉(zhuǎn)化體，按單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒DNA，作DNA測(cè)序，確證含有hOP-1的結(jié)構(gòu)基因，其DNA序列與Genbank Accession No.115078中的結(jié)構(gòu)基因完全一致。
本方法所用的5’端和3’端DNA寡聚核苷酸引物分別為N端引物5’ATC CGG TCC ACGG3’C端引物5’GAG GAG CTA GTG GCA3’本方法所用的RT-PCR條件為第一次反應(yīng)37℃2min℃→72℃2min→90℃1min循環(huán)5次再42℃2min→72℃2min→90℃1min循環(huán)30次再72℃保溫5min第二次反應(yīng)55℃1min→72℃2min℃→90℃1min→循環(huán)30次72℃保溫5min本方法所用的表達(dá)型重組質(zhì)粒的構(gòu)建，是利用引物寡核苷酸引入結(jié)構(gòu)基因兩端的pst I和EcoR I酶切位點(diǎn)，酶切回收OP-1基因，插入連接到以pUC為基礎(chǔ)，T7噬菌體啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒載體SWP-1上，轉(zhuǎn)化進(jìn)行入宿主菌E.coli DH5α，然后篩選獲得rhOP-1的無(wú)誘導(dǎo)高表達(dá)重組體。
2、rhOP-1在無(wú)誘導(dǎo)劑存在下的表達(dá)以平板上挑選出來(lái)的高表達(dá)單菌落為發(fā)酵種子，在500ml三角瓶中加入100mlLB液體培養(yǎng)基，接入5-10％的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子，于37℃恒溫條件下，150rpm搖瓶發(fā)酵24h。rhOP-1的表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的30％以上，如圖5所示。
3、藥用rhOP-1的精制和純化用pH7.0-9.0的20mMTris-HCl平衡CM-Sephadex C-50柱，以100cm/h上樣，用離子交換流動(dòng)相I加0.01-0.5M NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集A峰，如圖2所示。
在離子交換目標(biāo)峰收集液中加入0.1-1.0(NH4)2SO4，上Octyl-SepharoseFF柱，用20-50mM硼砂-硼酸緩沖液，在pH7.0-9.0洗脫，再用pH7.0-9.0的20mMTris-HCl洗脫，收集洗脫峰B，如圖3所示。在疏水層析目標(biāo)峰收集液中加入(NH4)2SO4，4℃透析過(guò)夜，低溫下10000rpm離心10min收集沉淀，用pH4.0的5-50mMNaAc-Hac溶解沉淀，上Sephacyl S-100柱，洗脫，收集目標(biāo)峰流出液，如圖4所示。
將分子篩層析洗脫目標(biāo)峰流出液，經(jīng)超濾濃縮，填充、冷凍干燥得到如圖6所示的樣品。
權(quán)利要求
1.一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhOP-1)的生產(chǎn)方法，其特征在于利用RT-PCR方法從正常胎兒腎組織cDNA中，放大獲得人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhOP-1)的基因片段；通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；在培養(yǎng)液不含誘導(dǎo)劑的條件下表達(dá)rhOP-1；通過(guò)離子交換柱層析，疏水柱層析和分子篩柱層析獲得高純度藥用rhOP-1蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于通過(guò)RT-PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，并改造獲得rhOP-1基因片段，其目標(biāo)蛋白基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列為5′ ATG AGA GGA TCC ACG GGG AGC AAA CAG CGCMet Arg Gly Ser The Gly Ser Lys Gln ArgAGC CAG AAC CGC TCC AAG ACG CCC AAG AAC CAG GAA GCC CTG CGG ATGSer Gln Asn Arg Ser Lys The Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg MetGCC AAC GTG GCA GAG AAC AGC AGC AGC GAC CAG AGG CAG GCC TGT AAGAla Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys LysAAG CAC GAG CTG TAT GTC AGC TTC CGA GAC CTG GGC TGG CAG GAC TGGLys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp TrpATC ATC GCG CCT GAA GGC TAC GCC GCC TAC TAC TGT GAG GGG GAG TGTIle Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu CysGCC TTC CCT CTG AAC TCC TAC ATG AAC GCC ACC AAC CAC GCC ATC GTGAla Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala The Asn His Ala Ile ValCAG ACG CTG GTC CAC TTC ATC AAC CCG GAA ACG GTG CCC AAG CCC TGCGln The Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu The Val Pro Lys Pro CysTGT GCG CCC ACG CAG CTC AAT GCC ATC TCC GTC CTC TAC TTC GAT GACCys Ala Pro The Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp AspAGC TCC AAC GTC ATC CTG AAG AAA TAC AGA AAC ATG GTG GTC CGG GCCSer Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg AlaTGT GGC TGC CAC TAG 3′Cys Gly Cys His
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中離子交換柱填料為DEAE、Q、QAE、SP或CM類型的陰離子交換劑；疏水柱填料為butyl-、phenyl-或octyl-基的疏水介質(zhì)；分子篩填料為Sepharyl系列、Superdex系列或Sepharose系列的介質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中離子交換層析流動(dòng)相1為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩沖液、pH的范圍在6.0-9.0；流動(dòng)相II為上述相應(yīng)流動(dòng)相I中加入0.01-0.5MNaCl梯度洗脫。
5.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中疏水柱層析流動(dòng)相I為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂的硼酸或磷酸緩沖液，pH的范圍在6.0-9.0，其中加入0.1-1.0M(NH4)2SO4或0 1-1.0M NaCl，流動(dòng)相II分別以20-50mM pH范圍在7.0-9.0的磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及在大腸桿菌系統(tǒng)中重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)和純化方法,屬基因工程制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用RT－PCR方法從正常胎兒腎組織cDNA中,放大獲得人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhOP－1)的基因片段,通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌在培養(yǎng)液不含誘導(dǎo)劑的條件下表達(dá)rhOP－1;通過(guò)離子交換柱層析,疏水柱層析和分子篩層析獲得高純度藥用rhOP－1蛋白。這種rhOP－1不僅具有誘骨形成形力,且與膠原蛋白或珊瑚粉類材料復(fù)合,對(duì)骨損傷和骨缺失具有明顯的療效作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1273976SQ0011287
公開(kāi)日2000年11月22日 申請(qǐng)日期2000年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月21日
發(fā)明者崔太安, 劉紅, 尹葆康, 潘紅春, 張濤, 譚滿秋, 李定祥, 楊紅濤, 李天泉 申請(qǐng)人:西南藥業(yè)股份有限公司