專利名稱：生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2成熟肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
1965年美國醫(yī)師Urist發(fā)現(xiàn)脫鈣的骨基質(zhì)有誘導(dǎo)異位成骨作用，他認(rèn)為在脫鈣的骨基質(zhì)中含有一種能誘導(dǎo)新骨形成的物質(zhì)，并將其命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)。1988年他領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在世界上首先分離出4種人的不同的BMP。最近人們又成功地克隆了另外15個人BMP的基因，這些都為BMP的研究提供了很好的材料。除BMP-1之外，它們都是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族成員，彼此之間無論在基因或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，還是在生物學(xué)功能上都非常相似。
BMP的生物學(xué)作用無明顯的種屬特異性，具有跨種誘導(dǎo)成骨的能力。比如，在小鼠股部肌肉中植入0.1mg/kg體重的BMP，2～3周即可出現(xiàn)軟骨。新骨的發(fā)生量與BMP的植入量呈正相關(guān)。在臨床上，如果骨缺損范圍較大，一般不可能自行修復(fù)愈合，通常采用自體骨、異體骨或異體脫鈣骨基質(zhì)以及某些生物材料進(jìn)行移植修復(fù)。在這種情況下，由于骨缺損修復(fù)的速度和修復(fù)骨的強(qiáng)度的不同，以及微生物的污染以及異體脫鈣骨的排斥反應(yīng)等問題，對疾病的治療都帶來影響。因此，用重組人BMP修復(fù)骨的缺損受到了普遍的重視。Bolande發(fā)現(xiàn)，如果將BMP與脫鈣骨基質(zhì)粉混合植入，將提高修復(fù)能力。這種混合物用于兔尺骨干2cm長的缺損，其效果明顯優(yōu)于單純脫鈣骨或自體骨移植對照組。自然界中BMP雖然廣泛存在于各種動物的骨組織中，但含量極低，以人BMP-2為例，每公斤骨僅含幾十～幾百微克，難以滿足臨床應(yīng)用需要。利用基因工程的方法大規(guī)模生產(chǎn)有生物活性的BMP是極富吸引力的方法。自1988年美國的Genetics Institute克隆出4個人的BMP的cDNA以來，國外學(xué)者又克隆出11個新的BMP。其中對重組人BMP-2(rhBMP-2)的結(jié)構(gòu)與功能的研究最為深入。
Genetics Institute公司將人的人BMP-2cDNA轉(zhuǎn)入真核工程細(xì)胞中(如COS和CHO細(xì)胞)表達(dá)。但用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的rhBMP-2成本很高且產(chǎn)量較低，價格昂貴不適合我國的臨床實(shí)際需要。尋找新的方法勢在必行。
本發(fā)明的目的是提供一種成本低，能形成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是用重組DNA技術(shù)構(gòu)建截短型人BMP-2基因(BMP-2-108)，并在大腸桿菌中高效表達(dá)這個基因，得到有生物活性的rhBMP-2-108蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法包括以下步驟1)人工合成編碼人BMP-2羧基端107個氨基酸殘基的核苷酸序列天然人BMP-2成熟肽由114個氨基酸殘基組成。實(shí)驗(yàn)證明在人BMP-2成熟肽的N端第一個半胱氨酸之前有兩組三個成串的堿性氨基酸殘基組成的片段的丟失并不影響其生物活性。第55位的天冬氨酸殘基上有一個潛在的糖基化位點(diǎn)，糖基化作用與其生物半衰期有關(guān)，而與活性無關(guān)。為了在大腸桿菌系統(tǒng)中更高效地表達(dá)人BMP-2成熟肽，首先合成了其羧基端的107個氨基酸殘基的基因編碼序列，并在第一個氨基酸殘基的密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，將第二個氨基酸精氨酸殘基突變?yōu)橘嚢彼釟埢驮谧詈笠粋€氨基酸殘基的密碼子之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，構(gòu)建截短型人BMP-2基因SEQ IDNO1長度324bp類型脫氧核糖核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源人工合成特征編碼人BMP-2成熟肽羧基端的107個氨基酸殘基的序列人BMP-2-108的基因編碼序列5’ ATG AAA AAA CTG AAA TCC TCC TGC AAA AGA CAT CCG CTG TATGTG GAT TTT AGC GAT GTG GGC TGG AAC GAT TGG ATT GTG GCGCCG CCG GGC TAT CAT GCG TTT TAT TGC CAT GGC GAA TGC CCG TTTCCG CTG GCG GAT CAT CTG AAC TCC ACC AAC CAT GCG ATT GTGCAG ACC CTG GTG AAC TCT GTG AAC AGC AAA ATT CCG AAA GCGTGC TGT GTG CCG ACC GAA CTG AGC GCG ATT TCG ATG CTG TATCTG GAT GAA AAC GAA AAA GTG GTG CTG AAA AAC TAT CAG GAT ATGGTG GTG GAA GGT TGT GGC TGT CGC TAA 3’人BMP-2-108的氨基酸殘基序列MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)構(gòu)建含BMP-2-108基因的表達(dá)載體將合成的BMP-2-108基因和含有與該基因相同限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的載體分別用相關(guān)的限制性內(nèi)切酶切開，酶切溫度為25～38℃，酶切時間為1～5小時。然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，用常規(guī)方法從凝膠中回收并純化載體和基因兩個DNA片段。再將兩個片段同時置于T4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液中，加入T4DNA連接酶，在4～22℃下進(jìn)行為時1小時～1周的連接反應(yīng)，其中所使用的基因表達(dá)載體或?yàn)榛瘜W(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，或?yàn)橥ㄟ^溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體。
加在合成基因首、末兩端的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)可以為Ndel和BamHl，或者也可以是Ncol和HindIII，前者相關(guān)的基因表達(dá)載體可以用購自美國Novagen公司的含有Ndel和BamHl兩個酶切位點(diǎn)的pET系列的化學(xué)試劑誘導(dǎo)型載體或pJLA系列的溫度誘導(dǎo)型載體。后者基因表達(dá)載體可選用購自美國Promega公司的含有Ncol和HindIII兩個酶切位點(diǎn)的pTrc99A載體。實(shí)驗(yàn)中所用的限制性內(nèi)切酶及酶切緩沖液為TAKARA公司產(chǎn)品。
3)采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞用無菌鉑絲直接蘸取凍存的大腸桿菌，在LB平板表面劃線，于25～38℃下培養(yǎng)10～20小時。將1個分隔良好的單菌落接種到50～100毫升LB培養(yǎng)液中，在25～38℃下，以150～300次/分鐘的振蕩速度培養(yǎng)至OD600＝0.3～1.0。將培養(yǎng)物裝于離心管內(nèi)，置冰上5～20分鐘。隨后，將培養(yǎng)物于2～6℃離心5～20分鐘，速度為1500～2000g。將離心所得的沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮之后，第二次在2～6℃下離心5～7分鐘，速度為1000～1500g。將離心所得沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮，冰上放置28～32分鐘。然后第三次在2～6℃下離心5～7分鐘，速度為1000～1500g。將離心所得沉淀用2～5毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮。最后按每管100～200微升的量將懸浮液分裝于無菌離心管中，將管口密封后，立即凍于-70℃。
4)將上述第2)步所得的連接反應(yīng)物與第3)步所得的感受態(tài)細(xì)菌混勻，在冰上放置10～50分鐘，接著在42℃的水浴中放置30～150秒，再冰浴1～10分鐘，然后加入0.5～5毫升的LB培養(yǎng)基，在28～38℃的水浴或培養(yǎng)箱中溫浴20～120分鐘。隨后，將150～250微升被轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，將平板置于室溫下直至液體被吸收后，倒置平板，于25～38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～30小時后，即可出現(xiàn)重組菌的菌落，完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化步驟；抗生素可以用卡那霉素、氨芐青霉等，針對不同的載體，選用相應(yīng)的抗生素，如采用pET系列中的pET9a為載體，則用卡那霉素，采用pET-11b為載體，則用氨芐青霉素。
5)從被轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有1～10毫升LB培養(yǎng)液的試管中，在25～38℃的溫度下中速振蕩培養(yǎng)6～15小時，再對收獲的菌體采用常規(guī)的堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA；6)將上述抽提的DNA用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，酶切溫度為30～37℃，酶切時間為1～3小時。正確重組子中應(yīng)當(dāng)含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(載體DNA)的酶切片段。凡能切出上述大小酶切片段的克隆即為轉(zhuǎn)化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，構(gòu)建基因工程菌獲得成功(此基因工程菌種已保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO.M201011)。
7)在含葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌按1％的接種量將基因工程菌接入5～10毫升的LB培養(yǎng)基中，以100～200次/分速度振蕩培養(yǎng)2～3小時。對以化學(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，培養(yǎng)溫度是30～32℃；對通過溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，培養(yǎng)溫度是28～30℃。
8)rhBMP-2-108基因的誘導(dǎo)表達(dá)。在進(jìn)行7)步驟后，按1％的比例，將培養(yǎng)物接種到含有200～500毫升LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以200～300次/分振蕩速度，按照步驟7)指定的培養(yǎng)溫度下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2～1.4，培養(yǎng)時間為10～12小時。然后，接入大罐中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。接種量為5∶1(培養(yǎng)液∶種子液)，pH7.0。對于以化學(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的基因工程菌，培養(yǎng)溫度為30～32℃，振蕩速度100～600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)4個小時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3～4小時，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體；對于通過溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的基因工程菌則將培養(yǎng)溫度迅速升到42～45℃，并在劇烈震蕩下繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體。
9)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，經(jīng)復(fù)性，分離，純化后，獲得本發(fā)明的產(chǎn)品截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)試驗(yàn)表明，本發(fā)明通過構(gòu)建截短型人BMP-2基因而得到的表達(dá)量高的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽，更易于純化和復(fù)性，因而有更高的生物活性。相對而言，國內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)部門在進(jìn)行相關(guān)工作時，卻因無法進(jìn)一步復(fù)性和純化大腸桿菌產(chǎn)生的人全長BMP-2，使工作只停留在實(shí)驗(yàn)室水平，無法進(jìn)入醫(yī)藥用階段，更難以形成產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明的基因工程菌所產(chǎn)生的人截短型BMP-2的量達(dá)到細(xì)菌總可溶蛋白量的30～50％，本發(fā)明建立的重組蛋白分離純化技術(shù)簡便實(shí)用，有利于大量生產(chǎn)醫(yī)療用的BMP-2，為其用于臨床，造福病人奠定基礎(chǔ)。


圖1為含有合成的截短型人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽基因的，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)型載體(pET11b-BMP-2-108)圖2為含有合成的截短型人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽基因的，溫度誘導(dǎo)表達(dá)型載體(pJLA503-BMP-2-108)圖3為pET11b-BMP-2-108的NdeI和BamHI兩個限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，圖中M1和M2為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～6為不同的樣品；A為載體片段(5.7Kb)，B為插入的基因片段(324bp)圖4為截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(從上到下依次為97.4，66，43，31，20.1和14.4Kd)，C為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對照樣品，1-5為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的樣品，箭頭所指處為BMP-2-108蛋白圖5為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的Western blot圖，箭頭所指處為BMP-2-108圖6為純化的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的毛細(xì)管電泳分析圖，表明其純度超過97％，橫座標(biāo)為時間(分鐘)，縱座標(biāo)為光吸收值。
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1用化學(xué)試劑誘導(dǎo)型表達(dá)載體生產(chǎn)截短型人BMP-2成熟肽的方法本發(fā)明的方法包括如下步驟1)人工合成編碼人BMP-2羧基端107個氨基酸殘基的核苷酸序列首先合成了其羧基端107個氨基酸殘基的基因編碼序列，并在第一個氨基酸殘基的密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶Ndel的識別位點(diǎn)，將第二個氨基酸精氨酸殘基突變?yōu)橘嚢彼釟埢驮谧詈笠粋€氨基酸殘基的密碼子之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶BamHl的識別位點(diǎn)。構(gòu)建成截短型人BMP-2基因SEQ IDNO1長度324bp類型脫氧核糖核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源人工合成特征編碼人BMP-2成熟肽羧基端的107個氨基酸殘基的序列人BMP-2-108的基因序列5’ ATG AAA AAA CTG AAA TCC TCC TGC AAA AGA CAT CCG CTG TATGTG GAT TTT AGC GAT GTG GGC TGG AAC GAT TGG ATT GTG GCGCCG CCG GGC TAT CAT GCG TTT TAT TGC CAT GGC GAA TGC CCG TTTCCG CTG GCG GAT CAT CTG AAC TCC ACC AAC CAT GCG ATT GTGCAG ACC CTG GTG AAC TCT GTG AAC AGC AAA ATT CCG AAA GCGTGC TGT GTG CCG ACC GAA CTG AGC GCG ATT TCG ATG CTG TATCTG GAT GAA AAC GAA AAA GTG GTG CTG AAA AAC TAT CAG GAT ATGGTG GTG GAA GGT TGT GGC TGT CGC TAA 3’人BMP-2-108的氨基酸殘基序列MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)構(gòu)建含BMP-2-108基因的表達(dá)載體用化學(xué)試劑誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET-11b，將合成的BMP-2基因，(起始端含Ndel酶切位點(diǎn)，終止端含BamHl酶切位點(diǎn))，與pET-11b分別經(jīng)Ndel和BamHl雙酶切處理，酶切條件為37℃溫育3小時。然后將酶切產(chǎn)物用1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳30分鐘，電壓70伏。用Bio101純化試劑盒純化上述兩個DNA片段。其過程為用干凈手術(shù)刀切下目的片段，分別放入兩個1.5毫升離心管中。加200～500微升Nal，置于溫水(45～55℃)中至膠完全融化。將玻璃珠(Glassmilk，為Bio101純化試劑盒中的商品)渦旋1分鐘，取7微升加入上述兩管，冰上放置5分鐘，每1-2分鐘混勻一次。將兩管在13000g下離心5秒。去上清，再將沉淀物重懸浮于500微升New Wash液。而后又在13000g下離心5秒。再去上清。重復(fù)上述步驟二次(重復(fù)懸浮，離心三次)。最后一次小心吸凈上清。在空氣中干燥5～10分鐘。將沉淀用17～50微升TE溶解，在13000g下離心2分鐘。小心吸出上清，分別移至兩個新的1.0ml離心管中。從上述兩管DNA中吸取適量加入一個1.0ml離心管中。其中包括DNA片段1～17微升，T4 DNA連接酶(MBI公司)1μl，10倍濃度DNA連接緩沖液2微升，加水至總體積為20微升。混勻后略加離心，于22℃進(jìn)行為時1小時的連接反應(yīng)。所構(gòu)建的pET-11b-BMP-2-108見附圖1。
3)采用分子克隆技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣方法制備大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞用無菌鉑絲直接蘸取凍存的大腸桿菌BL21(DE3)，在LB平板表面劃線，于37℃下于培養(yǎng)16小時。將1個分隔良好的單菌落接種到50毫升LB培養(yǎng)液中，于37℃下，以250次/分鐘的速度振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.3～0.8。將培養(yǎng)物分裝于2個50毫升的離心管內(nèi)，置冰上10分鐘。然后，于4℃離心7分鐘，速度為1600g。離心得的沉淀用10毫升冰冷的CaCl2溶液溶解，4℃離心5分鐘，離心速度為1100g。將離心所得沉淀再用10毫升冰冷的CaCl2溶液溶解，冰上放置30分鐘，4℃離心5分鐘，離速為1100g。再將離心所得沉淀第三次用冰冷的CaCl2溶液溶解，用量為2毫升。按每管200微升加于1.5毫升無菌離心管中，立即凍于-70℃。
CaCl2溶液配方(60mmol/L CaCl2，15％(V/V)甘油，10mmol/LPIPES，pH7.0)無水CaCl2 3.33g，PIPES 1.5126g，甘油75ml，H2O 350ml，混合后加10mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，定容于500ml。
4)取上述第2)步所得的連接反應(yīng)物10微升與第3)步所得的感受態(tài)細(xì)菌100微升輕輕混勻，在冰上放置50分鐘，接著在42℃的水浴中放置90秒，再置冰浴1～2分鐘，然后加入0.8毫升的LB培養(yǎng)基，在37℃條件下溫浴60分鐘。隨后，將100微升被轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素抗生素的LB平板上，將平板置于室溫下直至液體被吸收后，倒置平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～30小時后，即可出現(xiàn)重組菌的菌落，完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化；5)從轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有3毫升LB培養(yǎng)液的試管中，在37℃溫度下中速振蕩培養(yǎng)10小時，再對收獲的菌體采用常規(guī)的堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA；此例抽提過程如下將培養(yǎng)15小時的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管中，12000g離心30秒。棄上清，細(xì)菌沉淀略干燥。將沉淀重懸浮于100微升冰冷的SolI中，渦旋使沉淀分散完全。加入200微升新配的SolII，顛倒6-8次，離心管置于冰上。再加150微升冰冷的SolIII，顛倒6-8次，離心管置于冰上30分鐘。12000g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的1.5毫升離心管中。加400微升酚氯仿溶液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)，于上清，渦旋混勻，12000g離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的1.5毫升離心管中。加相當(dāng)于上清2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃放置30分鐘。12000g離心10分鐘。棄上清，加1毫升70％乙醇，12000g離心2分鐘。小心去上清，空氣干燥沉淀。用30微升含胰RNA酶(20微克/毫升)的TE重新溶解沉淀，經(jīng)37℃消化半小時后儲于-20℃?zhèn)溆?。溶液配?.SolI125ml 200mmol/L葡萄糖，12.5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容于500ml，高壓滅菌，終濃度50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)。
2.SolII10mol/L NaOH 60μl，10％SDS 300μl，ddH2O 2640μl或10mol/L NaOH 20μl，10％SDS 100μl，ddH2O 880μl3.SolIII(3mol/L NaAc(pH4.8))無水NaAc 24.6g，用70ml ddH2O溶解，用約20ml冰乙酸調(diào)pH至4.8，定容至100ml。
4.TE5ml 1mol/L Tris·Cl(pH8.0)，1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容于500ml，高壓滅菌，終濃度10mM Tris·Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)。
6)將上述抽提的DNA用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，酶切溫度為30～37℃，酶切時間為1～3小時。正確重組子中應(yīng)當(dāng)含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(載體DNA)的酶切片段。凡能切出上述大小酶切片段的克隆即為轉(zhuǎn)化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，構(gòu)建基因工程菌獲得成功(菌種已保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO.M201011)。附圖3為其酶切鑒定圖，圖中M1和M2為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～6為不同的樣品；A為載體片段(5.7Kb)，B為插入的基因片段(324bp)。
7)在含葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌按1％的接種量將基因工程菌接入5～10毫升的LB培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速100～200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2～3小時。培養(yǎng)溫度是30～32℃。
8)rhBMP-2-108基因的誘導(dǎo)表達(dá)。在進(jìn)行7)步驟后，按1％的比例，將培養(yǎng)物接種到含有200～500毫升LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以200～300轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，在30～32℃下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2～1.4，培養(yǎng)時間為10～12小時。然后，接入大罐中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。接種量為5∶1(培養(yǎng)液∶種子液)，pH7.0，培養(yǎng)溫度為30～32℃，攪拌速度100～600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)4個小時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3～4小時，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定說明已經(jīng)產(chǎn)生該蛋白質(zhì)(見附圖4)；9)用物理方法或化學(xué)試劑誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。把收集的冷凍濕菌體按1∶5的比例加入Tris-Cl(50mmol/L)-EDTA(mmol/L)緩沖液中攪拌溶解，加入1∶100的100mmol/L的PMSF使得終濃度為1mmol/L。經(jīng)超聲破菌后離心收集沉淀，再用Triton X-100清洗一次，收集沉淀的包含體。然后用1mol/L的尿素再次清洗收集沉淀冷凍保存。其中Tris-EDTA緩沖液的pH為8.0。整個過程需要時間大約5～6小時，在4℃下進(jìn)行，離心轉(zhuǎn)速12500轉(zhuǎn)/分，將沉淀溶解于裂解液(Gu.HCl，7mol/L；Tris，50mmol/L；EDTA-Na，1mmol/L；DTT，10mmol/L)，在磁力攪拌器上攪拌至包含體完全裂解。將攪拌均勻的包含體裂解液在18000g下離心20分鐘，棄沉淀，上清液用于復(fù)性。然后，進(jìn)一步經(jīng)過Q柱和CM柱層析純化，就獲得本發(fā)明的產(chǎn)品重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，毛細(xì)管電泳鑒定純度為97％以上(見附圖5、圖6)。實(shí)施例2用溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體生產(chǎn)截短型人BMP-2成熟肽的方法1)與實(shí)施例1第1)步相同。
2)構(gòu)建含BMP-2-108基因的溫度誘導(dǎo)型表達(dá)載體，操作方法同實(shí)施例1，僅將所用表達(dá)載體pET-11b換成pJLA503。構(gòu)建成的pJLA503-BMP-2-108(見附圖2)。
3)與實(shí)施例1第3)步相同。
4)與實(shí)施例1第4)步相同。
5)與實(shí)施例1第5)步相同。
6)與實(shí)施例1第6)步相同。
7)在含葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌，其方法同實(shí)施例1，僅培養(yǎng)溫度為28～30℃。
8)rhBMP-2-108基因的誘導(dǎo)表達(dá)，在進(jìn)行7)步驟后，按1％的比例，將培養(yǎng)物接種到含有200-500毫升LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以200-300轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速，在28～30℃下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2～1.4，培養(yǎng)時間為10～12小時。然后，接入大罐中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。接種量為5∶1(培養(yǎng)液∶種子液)，pH7.0，將培養(yǎng)溫度迅速升到42～45℃，并在劇烈震蕩下繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時，然后，在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體。
9)與實(shí)施例1第6)步相同。
生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明用本發(fā)明方法制得的截短型人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽，具有促進(jìn)骨修復(fù)的活性。生物活性測定方法如下1、體外培養(yǎng)細(xì)胞測活按Thies等人的方法用鼠W-20-17干細(xì)胞株測定堿性磷酸酶活性。堿性磷酸酶活性單位定義堿性磷酸酶(AP)比活力指每毫克蛋白質(zhì)中含有的酶活力單位數(shù)，表示為U/mg，一個酶活力單位定義為在37℃，pH10.5條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1umol對硝基苯磷酸(pNPP)所需酶量。檢測證明堿性磷酸酶比活力與BMP-2劑量呈依賴性，即隨BMP-2的劑量增加而增加，說明本產(chǎn)品有明確的生物活性。
2、體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)按照國際上通用方法制備鼠股四頭肌袋模型。每個小鼠股四頭肌陷窩內(nèi)給予0.5mg rhBMP-2-108，加等量的I型膠原(購自Sigma公司)作為賦型劑。對照組只植入0.5mgI型膠原。三周后，進(jìn)行X-射線檢測。結(jié)果顯示，對照組沒有異位成骨現(xiàn)象，而植入rhBMP-2-108的實(shí)驗(yàn)動物都有明顯的異位成骨效應(yīng)。
在用rhBMP-2-108修復(fù)狗長達(dá)2cm的橈骨缺損實(shí)驗(yàn)中也獲得滿意的效果，在骨缺損部位植入含rhBMP-2-108的材料后4～12周，經(jīng)X-射線檢查，發(fā)現(xiàn)植入材料被完全吸收，缺損部位產(chǎn)生新骨。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)人工合成編碼BMP-2羧基端107個氨基酸殘基的核苷酸序列，并在第一個氨基酸殘基密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，將第二個氨基酸精氨酸殘基突變?yōu)橘嚢彼釟埢驮谧詈笠粋€氨基酸殘基的密碼子之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，構(gòu)成截短型人BMP-2基因SEQ IDNO1長度324bp類型脫氧核糖核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源人工合成特征編碼人BMP-2成熟肽羧基端的107個氨基酸殘基的序列人BMP-2-108的基因編碼序列5’ ATG AAA AAA CTG AAA TCC TCC TGC AAA AGA CAT CCG CTG TATGTG GAT TTT AGC GAT GTG GGC TGG AAC GAT TGG ATT GTG GCGCCG CCG GGC TAT CAT GCG TTT TAT TGC CAT GGC GAA TGC CCG TTTCCG CTG GCG GAT CAT CTG AAC TCC ACC AAC CAT GCG ATT GTGCAG ACC CTG GTG AAC TCT GTG AAC AGC AAA ATT CCG AAA GCGTGC TGT GTG CCG ACC GAA CTG AGC GCG ATT TCG ATG CTG TATCTG GAT GAA AAC GAA AAA GTG GTG CTG AAA AAC TAT CAG GAT ATGGTG GTG GAA GGT TGT GGC TGT CGC TAA 3’人BMP-2-108的氨基酸殘基序列MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)構(gòu)建含BMP-2-108基因的表達(dá)載體，將合成的BMP-2-108基因和含有與該基因相同限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的載體分別用相關(guān)限制性內(nèi)切酶切開，酶切溫度為25～38℃，酶切時間為1～5小時，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，用常規(guī)方法從凝膠中回收并純化載體和基因兩個DNA片段，再將兩個片段同時置于T4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液中，加入T4DNA連接酶，在4～22℃下進(jìn)行為時1小時-1周的連接反應(yīng)，其中所使用的基因表達(dá)載體或?yàn)橛没瘜W(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體或?yàn)橥ㄟ^溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體；3)采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞用無菌鉑絲直接蘸取凍存的大腸桿菌，在LB平板表面劃線，于25～38℃下培養(yǎng)10～20小時，將1個分隔良好的單菌落接種到50-100毫升LB培養(yǎng)液中，在25～38℃下，以150～300次/分鐘的振蕩速度培養(yǎng)至OD600＝0.3-1.0，將培養(yǎng)物裝于離心管內(nèi)，置冰上5～20分鐘，隨后，將培養(yǎng)物于2～6℃離心5～20分鐘，速度為1500～2000g，將離心所得的沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮之后，第二次在2～6℃下離心5～7分鐘，速度為1000～1500g，將離心所得沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮，冰上放置28～32分鐘，然后第三次在2～6℃下離心5～7分鐘，速度為1000～1500g，將離心所得沉淀用2～5毫升冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮，最后按每管100～200微升的量將懸浮液分裝于無菌離心管中，將管口密封后，立即凍于-70℃；4)將上述第2)步所得的連接反應(yīng)物與第3)步所得的感受態(tài)細(xì)菌混勻，在冰上放置10～50分鐘，接著在42℃的水浴中放置30～150秒，再冰浴1～10分鐘，然后加入0.5～5毫升的LB培養(yǎng)基，在28～38℃的水浴或培養(yǎng)箱中溫浴20～120分鐘，隨后，將150～250微升被轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，將平板置于室溫下直至液體被吸收后，倒置平板，于25～38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～30小時后，即可出現(xiàn)重組菌的菌落，至此完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化過程；5)從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有1～10毫升LB培養(yǎng)液的試管中，在25～38℃的溫度下中速振蕩培養(yǎng)6～15小時，再對收獲的菌體采用常規(guī)的堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA；6)將上述抽提的DNA用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，酶切溫度為30～37℃，酶切時間為1～3小時，正確重組子中應(yīng)當(dāng)含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(載體DNA)的酶切片段，凡能切出上述大小酶切片段的克隆即為轉(zhuǎn)化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，構(gòu)建基因工程菌獲得成功；7)在含葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌按1％的接種量將基因工程菌接入5～10毫升的LB培養(yǎng)基中，以振蕩速度100～200次/分培養(yǎng)2～3小時，對以化學(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，培養(yǎng)溫度是30～32℃，對通過溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，培養(yǎng)溫度是28～30℃；8)rhBMP-2-108基因的誘導(dǎo)表達(dá)，在進(jìn)行7)步驟后，按1％的比例，將培養(yǎng)物接種到含有200～500毫升LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以200～300次/分的振蕩速度，在步驟7)指定的培養(yǎng)溫度下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2～1.4，培養(yǎng)時間為10～12小時，然后，接入大罐中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為5∶1(培養(yǎng)液∶種子液)，pH7.0，對于以化學(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的基因工程菌，培養(yǎng)溫度為30～32℃，攪拌速度100～600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)4個小時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3～4小時，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體，對于通過溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的基因工程菌則將培養(yǎng)溫度迅速升到42～45℃，并在劇烈震蕩下繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體；9)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，經(jīng)復(fù)性，分離，純化后，獲得本發(fā)明的產(chǎn)品截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2成熟肽(rhBMP－2－108)的方法,該方法通過構(gòu)建含截短型人BMP－2基因的基因工程菌而得到表達(dá)量高的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2成熟肽,更易于純化和復(fù)性,因而有更高的生物活性。本發(fā)明的基因工程菌所產(chǎn)生的人截短型BMP－2的量達(dá)到細(xì)菌總可溶蛋白量的30～50%,本發(fā)明建立的重組蛋白分離純化技術(shù)簡便實(shí)用,有利于大量生產(chǎn)醫(yī)療用的BMP－2,為其用于臨床,造福病人奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/70GK1382803SQ0111675
公開日2002年12月4日 申請日期2001年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月21日
發(fā)明者徐放 申請人:杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)公司