專利名稱：德氏假單胞菌菌株及其在脫除含硫有機化合物中硫的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及德氏假單胞菌菌株及其在脫除含硫有機化合物中硫的應用。
石油和煤炭是世界上最重要的能源，這些礦物燃料中含有硫化物，燃燒時會產(chǎn)生大量硫氧化物排放到大氣環(huán)境中，形成酸雨，嚴重污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，直接威脅著地球人類的生存空間。據(jù)有關報道，全世界每年排入大氣中的SO2近兩億噸，在中國SO2的排放量達到了1795萬噸。同時硫化物的存在還會影響燃料及其產(chǎn)品的外觀，腐蝕燃燒及運輸設備。為了避免有毒硫化物存在造成的危害，在燃料燃燒前，燃燒過程中或燃燒后必須把燃料中的硫脫除，這已成為全世界極待解決的重大課題。面對日益嚴峻的環(huán)保形勢，人們的環(huán)保意識不斷增強，對于環(huán)保的要求變得越來越嚴格。因此，發(fā)達國家越來越重視燃油質量的提高，美國1990年就通過了清潔空氣法修正案，環(huán)保局提出了使用新配方汽油的要求。從1998年起，美國環(huán)保局采用復雜模型，進一步降低汽車排放污染，歐洲議會1998年曾立法要求2000年實施清潔汽油配方?？傊窈?0年內，運輸燃料(特別是汽油和柴油)的組成和質量指標將會有較大的改觀，即要求燃料的H/C比有所上升，而硫及芳烴含量要大大降低。北美和歐洲國家要求到2005年汽油、柴油中硫含量要低于50ppm，2010年汽油、柴油中硫含量要低于30ppm，甚至10ppm。我國是一個發(fā)展中國家，石油生產(chǎn)和燃料消耗已成為世界大國之一，SO2的排放量遠遠超過世界平均水平。面對日益嚴峻的環(huán)保形勢，我國實施了可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，大力推行清潔生產(chǎn)，并頒布了一系列環(huán)保法規(guī)。初步提出將目前柴油硫含量從5000ppm降低到2000ppm以下，部分大城市車用柴油中硫含量低于500ppm的要求，因此，開發(fā)和加強高效、低成本的燃料燃前脫硫技術，將對我國實施的環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略產(chǎn)生積極而深遠的影響。
降低石油、石油產(chǎn)品和煤炭中含硫量的方法有物理、化學和生物法。物理和化學法的燃前脫硫技術能有效地脫除燃料中的無機硫，但是脫除有機硫的效果很差，因為礦物燃料中含有的有機硫化物成分復雜，大部分是雜環(huán)化合物，其中的C-S化學共價鍵十分牢固，用常規(guī)的物理和化學方法無法有效去除。
目前常用的加氫催化脫除燃料中有機硫(HDB)技術必須在高溫(≥300℃)，高壓(≥100atm)，加氫及金屬催化劑存在的苛刻條件下脫硫，操作費用較高，而且金屬催化劑易受底物硫原子周圍取代基空間位阻影響，所以對于燃料中大量存在的甲基取代苯并噻吩、二苯并噻吩等結構復雜的雜環(huán)硫化物的脫除率較低。(e.g.Houalla，M.，Broderick，D.H.，Sapre，A.V.，Nag，N.K.，de Beer，V.H.J.，Gates，B.C.，Kwart，H.J.Catalt.，61，523-527(1980)).事實上，在輕汽油和柴油中，仍存在著多種二苯并噻吩的烴基取代物(e.g.Kabe，T.，Ishihara，A.and Tajima，H.Ind.Eng.Chem.Res.，31，1577-1580(1992))。低硫含量的要求使得HDS過程反應條件越來越苛刻，設備和操作費用增高，同時伴隨著烯烴飽和反應，造成燃料燃燒值損失。因此，迫切需要尋找一種能從石油或石油產(chǎn)品中脫除硫卻不造成石油燃燒值降低的，經(jīng)濟可行的新工藝。
生物催化脫硫(BDS)方法，以其具有的選擇性高，副反應少，反應條件溫和，設備簡單，運行費用低，投資少，對燃料熱值影響小，不造成二次污染等優(yōu)點，逐漸成為令人矚目的清潔石油燃料生產(chǎn)技術，有希望成為傳統(tǒng)脫氫過程的輔助途徑來進行含硫燃料的精加工，使它們達到要求水平，所以引起了眾多科學家和工程師的興趣。
目前，已分離了多種能脫有機硫的微生物。其中好氧菌或厭氧菌都能代謝柴油中的主要難處理化合物DBT，如硫酸鹽還原細菌，Desulfovibrio(去磺弧菌屬)desulfuricans M6，厭氧地降解DBT，主要的產(chǎn)物是聯(lián)苯，降解率是42％。據(jù)報道，其它的硫酸鹽還原細菌也能厭氧地將DBT轉化為聯(lián)苯，但轉化率極低。厭氧過程因為有不需要氧的加入，可以直接應用到油井中的優(yōu)點具有較大的吸引力，但是還未發(fā)現(xiàn)能用于實際石油脫硫體系的高效厭氧微生物。
通過好氧途徑代謝DBT的微生物有假單孢菌(pseudomonas sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)、棒桿菌(Corynebacterium sp.)及短桿菌(Brevibacterium sp.)等。通過對各種微生物代謝機制的研究，得知微生物的脫硫途徑主要有三種一種是專一氧化DBT的碳架(C-C鍵)，而C-S鍵依然保留，這一途徑是在從土壤中分離出的假單胞菌(Pseudomonas)，拜葉林克氏菌(Beijerinckia)及不動桿菌(Acinetobacter)和根瘤菌(Rhizobium)的混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的，代謝過程中DBT的一個苯環(huán)在斷裂前先變成為羥基化合物，硫原子未被釋放，順式4-[2-(3-羥基)-噻吩基]-2-氧-3-丁烯酸(tran-HTOB)和3-羥基-2-甲?；洁绶?HFBT)在培養(yǎng)基中積累，其它的細菌如P.eruginosa ERC-8，Beijerinckia sp.，Pseudomonas、Rhizobium melioti和Pseudomonas sp.C18等也有這樣的代謝途徑。中國科學院微生物研究所的鐘慧芳研究小組也曾分離到將DBT分解為水溶性有機硫化物的菌株，可脫除煤中有機硫22.2％～32.0％，(鐘慧芳等微生物學報35(2)130-135，1995)。這種類型的代謝，會由于含碳結構被脫除，而造成燃料能量的損失。
另-種途徑以DBT為唯-碳源、硫源、能源，直接氧化DBT的C-S鍵生成苯甲酸鹽，已經(jīng)報道的菌種有短桿菌(Brevibacterium)和節(jié)桿菌(Arthobacter)，它們將DBT-亞砜，DBT-砜脫硫最終生成苯甲酸脂和硫酸鹽，短桿菌(Brevibacterium)可以脫去粗油中DBT的硫而不攻擊非硫碳氫化合物。這一代謝途徑中，不只脫除了雜環(huán)化合物中的硫，也破壞了烴的碳骨架，同樣引起了燃料熱值的損失。
第三條途徑中，微生物專一氧化斷裂DBT的C-S鍵，而不打開C-C鍵，以特有的酶系統(tǒng)將硫從雜環(huán)中專一性地脫下來，不引起燃料熱值的損失。Atlantic ResearchCorporation最早報道微生物可從DBT中脫去硫而不改變烴的結構。1989年Kilbane等分離出了紅色紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8(以前稱為R.rhodochrous)，該菌得到了最廣泛的研究，特別是近年來，通過基因工程方法將該類微生物的脫硫基因(dsz)進行了克隆、表達、測序，并成功地改造和構建了重組菌，提高了脫硫效率，使其具有更加廣闊的工業(yè)應用前景(Denome S.A.et al.J Bacteriol.176(21)6707-6716，1994)，而且提出了DBT的脫硫途徑該途徑經(jīng)過DBT5-亞砜(DBTO)，DBT5-砜(DBTO2)和2-羥基聯(lián)苯基-2-亞磺酸鹽(HBPS)，最終將DBT代謝為2-羥基聯(lián)苯(2-HBP)，因此這一途徑也稱“4S”途徑。專一脫硫的“4S”途徑是目前比較理想，引起大家廣泛關注的研究領域。繼R.erythropolis IGTS8之后，又報道了其它幾種細菌有相似的代謝途徑，如棒桿菌屬細菌(Corynebacterium)SY1，R.erythropolis D-1，球形諾卡氏菌(Nocardia globelula)，土壤桿菌屬(Agrobacter)MC501，分枝桿菌屬(Mycobaterium)G3，黃單孢菌屬(Xanthomonas)，所有這些細菌都是革蘭氏陽性菌。
假單胞菌(Pseudomonas)CB1是Isbister等人從土壤和煤礦樣品中分離出來的，能在以苯甲酸鹽為唯一碳源和能源及高DBT存在的培養(yǎng)基中生長。用35S-DBT和14C-DBT作CB1專攻DBT雜環(huán)硫示蹤實驗，測出生成35S硫酸鹽、2-2’-二羥基聯(lián)苯及14CO2。但相當遺憾的是他們后來聲稱CB1菌株不穩(wěn)定并且丟失了(e.g.Isbister J.D1993)，所以不能進一步證實該假單胞菌確切的代謝途徑。
本發(fā)明的目的在于克服上述脫除化石燃料中有機硫技術存在的缺陷，而提供從自然界中分離出的具有專一性催化斷裂硫的有機化合物中C-S鍵能力的德氏假單胞菌菌株及其在脫除含硫有機化合物中硫的應用。
本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明提供的德氏假單胞菌菌株，其特征在于該菌株為Pseudomonasdelafildii R-8，于2001年4月29日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO.0570；該Pseudomonas delafildii R-8菌株是從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到的；其具體篩選步驟如下從中國大港石油化工公司煉油廠污水處理池中采集好氧活性污泥樣品，取樣品5克懸浮于無硫基礎培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成1000ml水中含2.44g的KH2PO4，14.03g的Na2HPO4·12H2O，2.00g的NH4Cl，0.36g的MgCl2·6H2O，1g的CaCl2·2H2O，1mg的FeCl3，4mg的MnCl2·4H2O，0.755mg的CuCl2，0.8ml的丙三醇或1-3g葡萄糖)中，在121℃下，高壓滅菌20分鐘，置搖床中混合30分鐘后，靜置，吸取上層懸浮液轉接到營養(yǎng)培養(yǎng)基(營養(yǎng)培養(yǎng)基組成g/gNaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰膏蛋白凍1％)中，高壓滅菌20分鐘，置搖床中以150轉/分培養(yǎng)24小時；吸取5ml菌液加入100ml滅菌基礎培養(yǎng)基中，再在其中加入二苯并噻吩(DBT)-乙醇溶液使培養(yǎng)液中DBT濃度為0.1mM。在搖床中以150轉/分培養(yǎng)2-3天后，在噴有DBT的瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離；分離得到的單菌落分別接種于含DBT濃度為0.2mM的基礎培養(yǎng)基中，在搖床中以150轉/分30℃作用2-3天；經(jīng)生物作用后的樣品用1N鹽酸調節(jié)pH為1.0，在5000轉/分下離心20分鐘，上清液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃??；萃取有機相回流濃縮至1ml，進行GC-MS分析；挑選產(chǎn)物中有二苯并噻吩砜DBTO2及羥基聯(lián)苯HBP的菌株進行優(yōu)良菌株的逐步馴化，得到Pseudomonas delafildii R-8菌株；該Pseudomonas delafildii R-8菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質中常溫培養(yǎng)，其細菌學形態(tài)特征為革蘭氏陰性直桿菌，長度為0.6-0.8×1.4-1.6mm.，不產(chǎn)生芽孢，不形成孢子鏈或螺旋型，能運動、不產(chǎn)生鞘和突起物，專性好氧，抗酸染色陰性，細胞壁不含二氨基庚二酸，無特征性糖，菌落淡黃色，單極生鞭毛，沒有反硝化作用，能以聚-β-羥基丁酸鹽為唯一碳源生長。
該Pseudomonas delafildii R-8菌株培養(yǎng)特征在LB瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、桑塔斯瓊脂、牛肉浸汁瓊脂、無機鹽瓊脂五種培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3-5天后，不產(chǎn)生類胡蘿卜素和熒光，其它特征見表1；表1
依照Hasegawa T.等快速薄層層析法進行全細胞水解液分析的結果表明該Pseudomonas delafildii R-8菌株細胞壁化學組份為菌株Pseudomonasdelafildii R-8不含有meso-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelicacicl acid)，含甘氨酸，無特征性糖(糖型C)。；該Pseudomonas delafildii R-8菌株生理生化特征，見表2表2
參照《Bergy’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的內容，根據(jù)形態(tài)特征與細胞壁化學組份定屬的原則，證明菌株Pseudomonas delafildii R-8為革蘭氏陰性直桿菌，其長度為0.6-0.8×1.4-1.6mm，不產(chǎn)生芽孢，不形成孢子鏈或螺旋型；能運動，不產(chǎn)生鞘和突起物；專性好氧，抗酸染色陰性；細胞壁不含有DAP(二氨基庚二酸)；無特征性糖；屬于假單孢菌屬(Pseudomonas)，其菌落淡黃色、單極生鞭毛、沒有反硝化作用、能以聚-β-羥基丁酸鹽為唯一碳源生長，結合其他各項生理生化特征，均與德氏假單胞菌相似。故該R-8菌株定名為德氏假單胞菌(Pseudomonas delafildii)。與Pseudomonas sp.CB1(ATCC #39381)不同，菌株R-8不產(chǎn)生色素。
本發(fā)明的Pseudomonas delafildiiR-8菌株既可以在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可在含硫源(MgSO4，二甲基亞砜，DBT或其他有機硫化合物)的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。應用前需在有機硫源存在的條件下馴化，菌株在25-35℃之間的一適當溫度下，進行中性好氧培養(yǎng)。
該Pseudomonas delafildii R-8菌株脫硫能力強，脫硫底物范圍廣。
本發(fā)明的Pseudomonas delafildii R-8菌株，可以用新鮮培養(yǎng)的生長期菌種或有脫硫活性的冷凍非生長期靜止細胞及其變異菌株作脫硫生物催化劑，也可用該菌株或其變異菌株的細胞中得到的有脫硫活性的一個或幾個酶作脫硫生物催化劑，還可用吸附或包埋在載體上的固定化細胞作脫硫生物催化劑。
本發(fā)明提供的Pseudomonas delafildii R-8菌株可作為催化劑選擇性斷裂含硫有機化合物中C-S鍵，脫除硫原子，尤其適用于化石燃料(如煤炭，石油及其產(chǎn)品)中有機雜環(huán)硫的脫除；解決了已有石油加氫工藝處理成本高、不易于脫除雜環(huán)化合物中硫等缺點；該菌株通過專一性‘4S’途徑脫除燃料中有機化合物中的雜環(huán)硫，而不破壞有機化合物的C-C骨架，不降低燃料的燃燒熱值。目前的專利及文獻報道中，Pseudomonas sp.多采用C-C鍵斷裂途徑降解燃料中含硫化合物，而本發(fā)明的Pseudomonas delafildii R-8菌株能通過C-S鍵斷裂途徑專一性脫硫，該菌廣泛存在于原油中，具有許多作為工業(yè)應用菌株的優(yōu)良特性，耐有機溶劑的能力強，生長細胞脫硫過程中未檢測到無機硫的存在，產(chǎn)生的硫被認為結合或融合于生長細胞的細胞內，因此不會發(fā)生因硫酸根離子累積而抑制菌種脫硫活性的現(xiàn)象，菌株具有廣闊的工業(yè)應用潛力。
下面結合附圖及實施例進一步描述本發(fā)明。
附

圖1為多通道輕重相反應器的結構圖；附圖2為十六烷、乙醇及二甲基酰胺中二苯并噻吩生物降解速率圖；附圖3反應器中十六烷模擬體系二苯并噻吩生物降解速率圖；附圖4-1為加氫脫硫柴油中硫含量的GC-AED檢測譜圖；附圖4-2為加氫脫硫柴油經(jīng)本發(fā)明生物脫硫后硫含量的GC-AED檢測譜圖；其中反應器上端蓋1進氣孔2進樣孔3電加熱管4反應器外筒5輕相取樣孔6
進氣管7 重相取樣孔8 墊圈9螺桿10 螺母11法蘭12測溫孔13 溫度計14 圓形環(huán)15輕相分布管16 -+-細胞光密度(OD600) -×-DBT濃度-●-分散劑為二甲基酰胺 -▲-分散劑為乙醇-■-分散劑為十六烷實施例1本發(fā)明提供的Pseudomonas delafildii R8菌株的篩選步驟如下從中國大港石油化工公司煉油廠污水處理池中采集好氧活性污泥樣品，取樣品5克懸浮于無硫基礎培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成1000ml水中含2.44g的KH2PO4，14.03g的Na2HPO4·12H2O，2.00g的NH4Cl，0.36g的MgCl2·6H2O，1g的CaCl2·2H2O，1mg的FeCl3，4mg的MnCl2·4 H2O，0.755mg的CuCl2，0.8ml的丙三醇或1-3g葡萄糖)中，在121℃下，高壓滅菌20分鐘，置搖床中混合30分鐘后，靜置，吸取上層懸浮液轉接到營養(yǎng)培養(yǎng)基(營養(yǎng)培養(yǎng)基組成g/gNaCl 1.0％；酵母浸膏粉0.5％，胰膏蛋白凍1％)中，高壓滅菌20分鐘，置搖床中以150轉/分培養(yǎng)24小時；吸取5ml菌液加入100ml滅菌基礎培養(yǎng)基中，再在其中加入二苯并噻吩(DBT)-乙醇溶液使培養(yǎng)液中DBT濃度為0.1mM。在搖床中以150轉/分培養(yǎng)2-3天后，在噴有DBT的瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離；分離得到的單菌落分別接種于含DBT濃度為0.2mM的基礎培養(yǎng)基中，在搖床中以150轉/分30℃作用2-3天；經(jīng)生物作用后的樣品用1N鹽酸調節(jié)pH為1.0，在5000轉/分下離心20分鐘，上清液用等體積的乙酸乙酯振蕩萃取；萃取有機相回流濃縮至1ml，進行GC-MS分析；挑選產(chǎn)物中有二苯并噻吩砜DBTO2及羥基聯(lián)苯HBP的菌株進行優(yōu)良菌株的逐步馴化，得到Pseudomonas delafildii R-8菌株；并將該菌株于2001年4月29日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO.0570；該Pseudomonas delafildii R-8菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質中常溫培養(yǎng)，其細菌學形態(tài)特征為革蘭氏陰性直桿菌，長度為0.6-0.8×1.4-1.6mm.，不產(chǎn)生芽孢，不形成孢子鏈或螺旋型，能運動、不產(chǎn)生鞘和突起物，專性好氧，抗酸染色陰性，細胞壁不含二氨基庚二酸，無特征性糖，菌落淡黃色，單極生鞭毛，沒有反硝化作用，能以聚-β-羥基丁酸鹽為唯一碳源生長。
實施例2制備Pseudomonas delafildii R-8菌株的細胞液體培養(yǎng)物挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)的德氏假單胞菌菌株Pseudomonas delafildii R-8菌株一鉑環(huán)接種在裝有滅菌的試管中，加入已滅菌的DBT-乙醇溶液，使DBT濃度為0.1mmol，于30℃，150轉/分下在生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時；吸取培養(yǎng)獲得的菌液1ml接種在裝有100ml基礎無機鹽培養(yǎng)基(pH＝7.0)的300ml錐形瓶中，再加入已滅菌的DBT-乙醇溶液，使DBT濃度為0.1-0.5mmol；將該錐形瓶放置在生物培養(yǎng)箱中于30℃，150轉/分培養(yǎng)48小時，即制得Pseudomonas delafildii R-8菌株的細胞液體培養(yǎng)物。
實施例3制備Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生長期靜止細胞液將實施例2的Pseudomonas delafildii R-8菌株的細胞液體培養(yǎng)物離心(8000轉/分)10分鐘，倒去上層懸浮液；用適量生理鹽水洗滌離心沉淀3次，將所得離心沉淀物懸浮于生理鹽水中，然后冷凍保藏在冰箱中，即制得Pseudomonasdelafildii R-8菌株的非生長期靜止細胞液。
實施例4制備Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液將實施例3的Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生長期靜止細胞液冷凍干燥，冷凍干燥后的細胞先在勻漿器中研磨，然后在20Hz下超聲破碎，加入適量生理鹽水后以8000轉/分離心30分鐘，棄去離心沉淀的固體殘渣，其上層粗酶離心萃取液即為制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶離心萃取液。
實施例5制備Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化細胞物理吸附的方法制備固定化細胞將清洗、干燥、滅菌后的硅藻土加入滅菌培養(yǎng)介質，接種新鮮培養(yǎng)的Pseudomonas delafildii R-8菌株，常溫培養(yǎng)，菌種生長過程中附著在載體之上，而形成Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化細胞；凝膠包埋的方法制備固定化細胞(1)聚丙烯酰胺凝膠包埋取3ml新鮮培養(yǎng)的Pseudomonas delafildii R-8菌株細胞懸液，加入12ml生理鹽水，再加入聚丙烯酰胺2.25g，N，N’-甲叉雙丙烯酰胺0.12g，5％濃度的二甲氨基丙晴1.5ml和2.5％濃度的過硫酸1.5ml，完成聚合后，得到15％濃度的聚丙烯酰胺凝膠，切成小塊，用蒸餾水和生理鹽水各洗滌兩次，抽干，即制得Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化細胞。
(2)海藻酸包埋取3ml新鮮培養(yǎng)的Pseudomonas delafildii R-8菌株的細胞懸液，加入20ml制備好的2％濃度的海藻酸鈉溶液，混合物攪勻；用粗針頭擠入到2％的反離子溶液(鈣鹽或鋁鹽)中，放置冰箱10小時，用蒸餾水和生理鹽水各洗滌兩次，形成包有Pseudomonas delafildii R-8菌株固定化細胞的均勻、球形、有高度微孔結構的凝膠。
實施例6本發(fā)明在脫除二苯并噻吩(DBT)中有機硫的應用(1)將已滅菌的DBT配成100mmol/L的DBT-二甲基酰胺(也可以是乙醇)儲液；(2)在100ml錐形瓶中依次加入滅菌培養(yǎng)基30ml、DBT-二甲基酰胺儲液0.06ml，使錐形瓶中DBT的濃度為0.2mmol/L；(3)將實施例2制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的細胞液體培養(yǎng)物，或實施例3制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生長期靜止細胞液，或實施例4制得的Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液(粗酶萃取液中加有NADH)3ml加入上述步驟(2)錐形瓶中，將錐形瓶放置在生物培養(yǎng)箱中，于30℃，150轉/分培養(yǎng)，每隔12小時取樣測定，生長細胞懸浮液對DBT降解的測定結果見圖2，其結果表明，在不同的DBT分散劑存在的情況下，菌株R-8都可以較好地脫除DBT中的硫，十六烷作為分散劑時，脫硫速率最快，為0.0037mM/h·g細胞干重，二甲基酰胺與乙醇作為分散劑時，脫硫效果相近。這是因為十六烷的存在會在DBT表面形成一層膜，有利于與微生物作用。
實施例7本發(fā)明在脫除模擬燃油體系中DBT硫的應用其步驟如下(1)將要處理的液體油品(十二烷或十六烷加二苯并噻吩，DBT濃度為0.22mM)過濾滅菌，通滅菌空氣(或氧氣)使油品氧張力增加；(2)將30ml含氧液體油品從如圖1所示的反應器進樣孔3引入多通道輕重相反應器，同時加入270ml滅菌水相(無機鹽培養(yǎng)基)和30ml脫硫生物催化劑；生物催化劑可以是該Pseudomonas delafildii R-8菌株的生長期細菌液，也可以是該Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生長期細胞液或從細胞中萃取得到的粗酶萃取液；反應器內徑為75mm，高120mm，體積529.9ml，有效容積300ml；多通道輕相分布器高30mm，上端圓形環(huán)16外徑73mm，內徑58mm，圓形環(huán)上凹槽14外徑70mm，內徑61mm，多通道輕相分布管17管徑為30mm；(3)將進樣孔3密封，反應器置于搖床培養(yǎng)箱中，空氣經(jīng)過濾滅菌后由上部通氣管2引入，搖床溫度控制為30℃，調節(jié)搖床轉速使多通道輕重相反應器的上層輕油相高于圓形環(huán)16，溢于凹槽14中，通過輕重相分布管17到達反應器底部，呈油珠冒出，由于比重小，又會由反應器底部浮至反應器上方，從而完成輕油相與重相中微生物發(fā)生反應的過程；(4)液體油品經(jīng)本發(fā)明的生物脫硫作用后，從反應器外管上部輕相取樣孔6吸取脫硫后的液體油品，從下部重相取樣孔8放出剩余的生物催化劑及培養(yǎng)液。
(5)反應后剩余的含有生物催化劑的液體產(chǎn)物經(jīng)離心分離、洗滌，在適宜的條件下再生。反應器中十六烷模擬體系二苯并噻吩生物降解速率如圖3所示，由圖可知，在反應器中，菌株可以更快地脫除DBT中的硫，其脫硫速率為0.0055mM/h·g細胞干重，約為錐形瓶中脫硫速率的1.5倍。
實施例8本發(fā)明在脫除加氫脫硫柴油中的硫的應用將實施例7中的模擬油系換為過濾滅菌的加氫脫硫后的柴油，其他操作步驟和方法同實施例7，經(jīng)本發(fā)明的脫硫前后柴油中硫含量的GC-AED檢測譜圖見圖4-1和圖4-2，由圖中結果可以看出，經(jīng)本發(fā)明生物脫硫后加氫脫硫柴油中的硫含量從111ppm降到63ppm脫硫率為43％。
權利要求
1.一株德氏假單胞菌菌株，其特征在于該菌株為Pseudomonas delafildiiR-8，于2001年4月29日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC NO.0570。
2.按權利要求1所述的德氏假單胞菌菌株，其特征在于從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到；該菌株適宜在中性及極弱酸性培養(yǎng)介質中常溫培養(yǎng)；其細菌學形態(tài)特征為革蘭氏陰性直桿菌，長度為0.6-0.8×1.4-1.6mm.，不產(chǎn)生芽孢，不形成孢子鏈或螺旋型，能運動、不產(chǎn)生鞘和突起物，專性好氧，抗酸染色陰性，細胞壁不含二氨基庚二酸，無特征性糖，菌落淡黃色，單極生鞭毛，沒有反硝化作用，能以聚-β-羥基丁酸鹽為唯一碳源生長。
3.權利要求1所述的德氏假單胞菌菌株在脫除化石燃料中有機硫的應用，其特征在于該Pseudomonas delafildii R-8菌株通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機化合物中的硫。
4.按權利要求3所述的德氏假單胞菌菌株的脫除化石燃料中有機硫的應用，其特征在于該Pseudomonas delafildii R-8菌株的非生長期靜止細胞液通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機化合物中的硫。
5.按權利要求3所述的德氏假單胞菌菌株的脫除化石燃料中有機硫的應用，其特征在于該Pseudomonas delafildii R-8菌株的固定化細胞通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機化合物中的硫。
6.按權利要求3所述的德氏假單胞菌菌株的脫除化石燃料中有機硫的應用，其特征在于該Pseudomonas delafildii R-8菌株的細胞液體培養(yǎng)物通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機化合物中的硫。
7.按權利要求3所述的德氏假單胞菌菌株的脫除化石燃料中有機硫的應用，其特征在于該Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液通過氧化斷裂C-S鍵途徑脫除含硫有機化合物中的硫，Pseudomonas delafildii R-8菌株的粗酶萃取液中含有NADH。
全文摘要
本發(fā)明涉及的德氏假單胞菌菌株,為Pseudomonas delafildii R－8,于2001年4月29日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”,其保藏號CGMCC NO.0570;是從含油污水處理池中的耗氧活性污泥、油井周圍被油污染的土壤以及含硫量較高的煤礦礦坑周圍土樣中分離得到;該菌株的細胞液體培養(yǎng)、固定化細胞、非生長期靜止細胞液和粗酶萃取液均可通過氧化斷裂C－S鍵途徑脫除含硫有機化合物中的硫。
文檔編號C12S1/00GK1386847SQ0111592
公開日2002年12月25日 申請日期2001年5月22日 優(yōu)先權日2001年5月22日
發(fā)明者姜成英, 劉會洲, 邢建民, 安震濤, 陳家鏞, 李珊, 緱仲軒, 羅明芳 申請人:中國科學院化工冶金研究所