專利名稱：樟芝菌絲體生物活性物質其制備法及含其組成物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是有關于樟芝菌絲體生理活性物質，該活性物質的制法及含活性物質的組成物。
樟芝的形態(tài)樟芝(Antrodia camphorata或Antrodia cinnamomea)又名牛樟菇、樟菰、樟窟內菰，臺灣有稱陰陽對口菇。樟芝子實體屬多年生，具有強烈沖鼻的樟樹香氣，此與一般靈芝類有很大的差異，其外型呈板狀或鐘狀。板狀型態(tài)者，面為橘紅(黃)色，整面全有菌孔，板底層有淺黃白色的木栓質，藉此木栓質附著在牛樟樹中空心材內壁上生長。鐘狀形態(tài)者，子實層(鐘面)亦呈橘紅(黃)色，充滿菌孔(4-5個菌孔/毫米)，內有孢子味極苦，新鮮時為橘紅色，之后會成為橘褐色或褐色，鐘體則呈暗綠褐色的皮殼。以顯微鏡觀察其擔孢子，其型態(tài)為平滑無色的透明微彎柱形。樟芝的生物特性野生的樟芝是生長在牛樟樹(Cinnamomum Kanehirae)樹干中空內壁上的蘑菇類，因為這個特性，造成很多牛樟樹倒伏。文獻記載，樟芝是在牛樟樹上目前唯一發(fā)現(xiàn)的木材腐杉菌，病征為褐色腐朽，故為褐腐菌。但是樟芝的病原性并不強，因此牛樟樹很少因此死亡。雖然樟芝對牛樟樹而言是病原菌，但因樟芝價格昂貴，超過牛樟樹的經濟價值，因此是不是牛樟樹的病原菌已經不重要了。樟芝的培養(yǎng)技術樟芝的培養(yǎng)，人工栽培的技術，仍有待努力。所以，目前仍是以深山采集的方式來獲得。但是采集樟芝不是件容易的事，因為首先要尋找牛樟樹的產地。常有的困難是牛樟樹與 樟，兩者極為相似，不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出， 樟樹干油是以黃樟油(safrole)與十五燒醛為主，因而有沙士中黃樟素的味道。牛樟干油則以松油醇(d-terpinenol)為主，而有樟腦油的味道，藉此即可區(qū)別牛樟與 樟。第二個困難是要從大片樹林中找到有中空洞的樹干才行，此相當不易。空洞中若有樟芝，則可定期采集。
由于找尋中空洞的牛樟樹干不易，不肖商人干脆將牛樟樹砍倒，以期日后能長出樟芝，進而收集販售。因此，為環(huán)保及經濟上的考量，發(fā)展人工栽培樟芝是必要進行的方向?？上У氖侨斯ぴ耘嗾林ゼ夹g一直無法突破。樟芝在牛樟木屑上生長極為緩慢，甚至停滯。因此，若能改以現(xiàn)代生物技術，來培養(yǎng)樟芝菌絲體，將是最經濟、最符合環(huán)保的人工培育法。樟芝的藥效及其活性成分早期的傳說是臺灣原住民在采伐時，無意間發(fā)現(xiàn)了牛樟樹上的樟芝，原住民因生活型態(tài)之故，體能消耗量較大，肝的病變對原住民來說，是最大的威脅，民族習性原故，原住民較喜歡喝酒、宿醉在所難免，因喝酒過多導致肝病變的比率亦是居高不下。但在喝過樟芝的烹煮液，竟可不藥而愈、強身健體、解酒效力更是一流，至此原住民便將樟芝奉為上品，成為原住民的傳統(tǒng)珍貴藥材。民間傳說對肝癌及子宮癌特別有效，也有人認為可治急性腹痛。
科學性的研究則不多，依臺大藥學系的研究，對鼠類淋巴血癌細胞P-388有明顯的毒殺性。師范大學的研究則指出其具有抗膽堿、腸弛緩及血小板凝集作用，另可抑制金黃色葡萄球菌及須瘡小芽癬菌的生長。
因此有鑒于1.樟芝唯一寄生物種為牛樟樹，屬于一級保護類樹木種類，且有空心的牛樟樹的不易取得；2.樟芝子實體的試管內(in vitro)及離牛樟樹心空洞外的培育的困難性；及3.樟芝菌絲體亦有相似生物功能，且菌絲體的培養(yǎng)和擴大生產較可行；本案發(fā)明人乃經精深研究，發(fā)現(xiàn)樟芝菌絲體液體培養(yǎng)所得培養(yǎng)液與菌絲體皆含有生物活性物質，因而完成了本發(fā)明。
附圖簡略說明

圖1為顯示出根據本發(fā)明樟芝菌絲體CCRC 35398培養(yǎng)及從樟芝菌絲體生產生物活性物的方法所得樟芝菌絲體干重與所得生物活性物質，亦即多糖體，的產率相對于培養(yǎng)時間的結果的圖形；圖2為顯示出根據本發(fā)明樟芝菌絲體CCRC 35396培養(yǎng)及從樟芝菌絲體生產生物活性物質的方法所得樟芝菌絲體干重與所得生物活性物質，亦即多糖體，的產率相對于培養(yǎng)時間的結果的圖形；圖3為凝膠過濾層析的蛋白質標準品曲線；圖4為樟芝菌絲體所含多糖體的分子量測定圖解；圖5為樟芝菌絲體水萃取多糖體的Sepharose 6B分子量測定層析圖；圖6為樟芝菌絲體堿萃取多糖體的Sepharose 6B分子量測定層析圖；圖7為樟芝菌絲體水萃取多糖體的1H-NMR光譜；圖8為樟芝菌絲體水萃取多糖體的13H-NMR光譜；圖9為樟芝菌絲體多糖體的HF-IR光譜；圖10為樟芝菌絲體多糖體的X光衍射圖；圖11為顯示出用本發(fā)明樟芝菌絲體水萃取物，堿萃取物和發(fā)酵液進行巨噬細胞激活試驗時，以ELISA分析巨噬細胞所分泌的TNF-α濃度的圖形；以及圖12為顯示出以C57BL/6及BALB/c小鼠喂食樟芝不同周數及劑量后的免疫反應(細胞激素IL-2、TNF-α、INF-γ)結果的圖形。
綜上所述，本發(fā)明提出一種樟芝生物活性物質，其系經由樟芝菌絲體液體培養(yǎng)后，從其培養(yǎng)液及/或菌絲體分離出者；其為以多糖體為主的樟芝成分混合物；本發(fā)明也提出一種從樟芝菌絲體生產生物活性物質的方法，其包括以特殊液體培養(yǎng)基培養(yǎng)樟芝菌絲體及分離出該活性物質；且更提出一種組成物，其含有上述活性物質。
綜上所述，本發(fā)明提出一種以樟芝菌絲體生產生物活性物質的方法，其包括以特殊液體培養(yǎng)基培養(yǎng)樟芝菌絲體及分離出活性物質的步驟。
本發(fā)明所用樟芝菌絲體是得自寄存于中國臺彎省新竹市食品工業(yè)研究所菌種保存中心的樟芝菌絲體CCRC35398和CCRC35396。
本發(fā)明所用樟芝(Antrodia Camphorata)菌絲體CCRC35398和CCRC35396的存活微生物(株)菌種已分別于2001年3月5日和2001年5月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國·北京·中關村)；這兩種菌種在保藏中心登記入冊的編號分別為CGMCC No.0543和CGMCC No.0575。
樟芝菌絲體的液體培養(yǎng)，基本上是采習用技術來進行。其中包括將菌絲體接種于平板上，于適當溫度如15-35℃，(較佳者周溫約25℃)下培養(yǎng)約2周后，刮取菌絲接種于燒瓶內，用實施例中所列培養(yǎng)基，在約30℃，pH 2-8，較佳者pH 4-7，更佳者約pH 4.5，及振蕩速率50-250 rpm之下振蕩培養(yǎng)到log期初期，亦即，約5-7天；最后，將燒瓶培養(yǎng)物接種于發(fā)酵槽培養(yǎng)基(同燒瓶培養(yǎng)基)內，在15-30℃，(較佳者周溫約25℃)，槽壓0.1-1.5公斤/平方厘米，及pH約4.5下，以0.5-1vvm通氣速率通入空氣，或空氣與氧氣，二氧化碳或氮氣的混合物，較佳者空氣，在50-300 rpm攪拌速率下培養(yǎng)約8-16天。即得樟芝菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液，包括菌絲體與澄清液。
接著為從樟芝液體培養(yǎng)懸浮液分離樟芝活性物質的步驟。
于本發(fā)明方法中包括兩種分離方式，其一為先將樟芝液體培養(yǎng)懸浮液分離成菌絲體本身與澄清液，再分別分離出活性物質；其二為直接用樟芝液體培養(yǎng)懸浮液，包括菌絲體和液體培養(yǎng)基，分離出活性物質。
于本發(fā)明方法的第一種分離活性物質的方式中，包括將樟芝菌絲體與液體分離開的步驟及分別從菌絲體和澄清液分離出活性物質的步驟。
將菌絲體與液體分開的方法可采用習知技術，例如離心，過濾，沉淀(Settling)，傾析(decantation)，等。于本發(fā)明一較佳實施例中，系采用離心法，使用習用的離心機，例如歐式離心脫水機，如可得自瑞典ALFALAVAL公司的Decater NX418S 以3200 rpm(4000xg)離心即分離出菌絲體和澄清液。
接著為分別從菌絲體和澄清液分離出活性物質的步驟。從菌絲體分離出活性物質的方法包括用溶劑萃取，將菌絲體溶裂再分離，等。依樟芝活性物質特性，及方便性與工業(yè)上較佳經濟可行性而言，較佳者為采用溶劑萃取法。所用溶劑較佳者為水，溶劑如堿水或酸水溶液，或它們的混合物。于一較佳實施例中，系使用水來萃取。萃取溫度可為121℃以下的溫度。在用水作為萃取溶劑的情況中，可用30-121℃，萃取30分鐘到2小時，然后分離出萃取液。可重復萃取數次，將萃取液合并處理。
從菌絲體萃取液及從培養(yǎng)澄清液分離出活性物質所用的方法相同，如下所述。將培養(yǎng)澄清液濃縮數倍，如5-30倍，較佳者約10倍，如將200升濃縮到20升，接著用醇，如乙醇，或乙醇/水，如95％乙醇/水，在低溫如0-30℃，較佳者約4℃下沉淀整夜，最后分離出沉淀物而得所需活性物質。
在本發(fā)明方法的另一方式中，系直接從樟芝菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液分離出活性物質。其系將包含菌絲體和培養(yǎng)基的培養(yǎng)液直接加熱到30-121℃一段適當時間，如30分鐘至2小時后分離樟芝菌絲體，再從澄清液用上述程序分離出活性物質。
在本發(fā)明第二部份中，提出從樟芝菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液依上述本發(fā)明方法分離出樟芝活性物質。用本發(fā)明方法得到的樟芝生物活性物質系以多糖體為主的物質。
從先前技藝研究中得知菇類所具生理活性成分最主要的是其所含的水溶性多糖類，以往菇類多糖體因多由子實體萃取而受到來源的限制，而由液態(tài)培養(yǎng)菌絲體可產生胞外多糖體，且有良好的產量。菌絲多糖可藉由強化宿主免疫機能抑制癌細胞增殖或將其排除。菇類多糖體的功能性成分研究如下1.結構分析由菌絲體或子實體以熱水和醇類萃取得的粗多糖，再經純化成葡聚糖、雜多糖、蛋白多糖等。其中可經凝膠過濾層析(gel filtrationchromatography)精制，再用核磁共振光譜(NMR spectra)、紅外線光譜(IR spectra)、氣體層析—質譜分析(GC-MS)儀器分析方法，針對葡聚糖、雜多糖等、進行分子量、分子間鍵結方式，分支程度、旋光度的分析，而可得知其主要結構為β-(1→3)-D-葡聚糖、半乳-β-葡聚糖、α-甘露聚糖-等，可以用X光衍射分析測知，從而與其藥力作用相關聯(lián)，例如其中β-(1→3)-D-葡聚糖呈現(xiàn)的螺旋型結構可能是引發(fā)抗腫瘤作用的重要結構。由于菇類多糖體并非皆具有抗腫瘤活性，且其活性受到水中溶解性、分子量大小、分子構型、鍵結分支程度的影響，因此預期在化學結構分析上的研究，可找到可能的抑癌作用的分子機制。
已知，由擔子菌形成的以β-1，3-葡聚糖為主鏈、β-1，6-葡聚糖側鏈的多糖體，在分子量分布上有相當大的差異，且其生理活性也有別，一般依分子量的不同可分為(A)3-5×103Da左右者具有降低血糖的功能，如靈芝多糖(ganoderan)；(B)10-1000×103Da之間者具有消炎作用；(C)30×103Da以上者則具有抗腫瘤作用，如香菇多糖、靈芝多糖及裂褶菌多糖。因此也測量本發(fā)明多糖體的分子量以期了解其生理活性。
從文獻而知，茹類多糖體具有多種生物活性，包括1.抗腫瘤活性于1968年日本Ikegawa等人以“Sarcoma 180/小白鼠腹腔內或口服給藥法”實驗證實，從多孔菌科(Polyporaceae)和食用菇類子實體萃取的熱水萃取物，確實有相當高的腫瘤抑制率和腫瘤完全退縮率。日后許多研究者證實其萃取物即為以多糖體為主者且經證實有相當高的腫瘤抑制率、完全退縮率和低死亡率。
菇類除了水溶性β-(1-3)-D-葡聚糖外，亦含有以鹽類或堿萃取的木糖、甘露糖、半乳糖及醛糖等雜糖鏈的β-多糖及其蛋白質復合體，此類雜多糖以注射或口服給藥亦有明顯抗癌效果。
2.其它生體機能調節(jié)物質降血壓，降低膽固醇，免疫機能調節(jié)，降低血糖活性，抑制血小板凝集能力等皆為重要的發(fā)現(xiàn)。
在本發(fā)明第三部份中，提出一種組成物，其含有本發(fā)明樟芝活性物質及恰當的稀釋劑，賦形劑或載體。
在本發(fā)明組成物中，通用的稀釋劑為，例如，極性溶劑，如水，醇類，酮類，酯類和它們的組合，較佳者為水，醇，水/醇混合物。于較佳實施例中，該稀釋劑較佳者為水，生理食鹽水，緩沖水溶液，緩沖食鹽水，等。
適用于本發(fā)明組成物中有或無皆可的賦形劑或載體可為液體或固體形式，如乳糖、糊精、淀粉、硬脂酸納。液體賦形劑或載體包括水、沙拉油、酒、果汁等。
本發(fā)明要以下面的實施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受這些實施例所限制。實施例1以樟芝菌絲體CCRC 35398所作試驗樟芝菌絲體的培養(yǎng)菌絲體菌株為于2001年3月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京)的CCRC35398菌株。
平板培養(yǎng)將菌絲體接種于平板上，于30℃下培養(yǎng)約2周。
燒瓶培養(yǎng)刮取平板上的菌絲接種于燒瓶內，用下列培養(yǎng)基，在約30℃，pH 4.5下，于搖動機上以振蕩速率50-250rpm振蕩培養(yǎng)到log期初期，亦即，約5-7天；培養(yǎng)基配方成分 含量(重量％)谷類(如麥粉類) 1蛋白胨 0.1硫酸鎂 0.05磷酸氫二鉀 0.05硫酸鐵 0.05蔗糖 2酵母抽出物、粉、膏 0.5豆類(如黃豆粉、綠豆粉、大豆粉等) 0.2發(fā)酵槽培養(yǎng)培養(yǎng)基同上，將燒瓶培養(yǎng)物接種于發(fā)酵槽培養(yǎng)基內，在30℃，槽壓0.5-1.0公斤/平方厘米，及pH約4.5下，以150升/分通氣速率通入空氣，在200 rpm攪拌速率下培養(yǎng)約10天，即得樟芝菌絲體液體培養(yǎng)懸浮液，包括菌絲體與澄清液。
結果100升發(fā)酵液發(fā)酵完畢可得2公斤菌絲體(干重)及90升的濾液。
結果活性物質產量如圖1所示?？梢钥闯鲈谂囵B(yǎng)6天以后，干重與多糖體產率皆顯著增加，而于約10天后達到穩(wěn)定狀態(tài)。實施例3以樟芝菌絲體(CCRC 35396)所作的試驗用實施例1和2的相同程序對另一樟芝菌絲體(CCRC 35396)進行試驗。在干重及多糖體方面得到的結果與另一菌株(CCRC 35398)相似，如圖2所示。干重方面100升發(fā)酵液發(fā)酵完畢可得2±0.2公斤菌絲體(干重)及90升的濾液；多糖體方面如圖2所示，可以看出在培養(yǎng)6天以后，干重與多糖體產率皆顯著增加，而于約10天后達到穩(wěn)定狀態(tài)。實施例4活性物質分析一、材料與方法1.生產菌株樟芝(Antrodia camphorata)CCRC 35398是購自新竹食品工業(yè)發(fā)展研究所菌種中心，以potato dextrose agar(PDA)(購自美國Difco公司)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)及保存。
2.菌絲體的培養(yǎng)利用液態(tài)深層培養(yǎng)方法連續(xù)培養(yǎng)七天，溫度為30，接種的菌數為培養(yǎng)基含量的1.0％，培養(yǎng)基的組成如下每公斤去離子水中含有蔗糖20克；(NH4)SO43克；MgSO43克；KH2PO43克；檸檬酸0.5克；酵母菌萃取物5克，培養(yǎng)液的pH值調整在5.5。
3.化學藥品甲醇、正己烷及乙酸乙酯(GR級，購自德國Merck公司)，無水硫酸鈉亦購自德國Merck公司。
4.菌絲體成分的萃取與區(qū)分(1)萃取將200克經冷凍干燥的樟芝菌絲體粉末用2升甲醇加熱攪拌回流萃取5小時后，過濾。將殘渣重復上述的步驟2次。合并收集濾液，減壓濃縮(40℃，50mTorr)得到濃縮物(60.67克)。(2)區(qū)分將濃縮物(60.0克)與硅膠(200克)*置于減壓濃縮機中旋轉混合。取20克混合物，裝載于硅膠管柱(管內充填550克的硅膠)*內。
分別以下述溶劑各1000毫升進行區(qū)分
二、多糖體的成分分析樟芝多糖體萃取率樟芝菌絲體多糖萃取以發(fā)酵濾液者萃取率(14.33％)最高，其次是菌絲體水萃取物者(2.98％)，而菌絲體堿萃取物者(1.29％)最低，且菌絲濾液多糖萃取量顯著高于水萃取者及堿萃取者，表示樟芝菌絲多糖體產于細胞外多糖含量較細胞內含量高(表1)。
樟芝菌絲體多糖部分，由于發(fā)酵濾液抽出的多糖含有9.55％的水份含量，而由菌絲體水萃取及堿萃取的多糖體分別含有10.75％及4.35％水分含量。以酚-硫酸法測定其總糖含量，可得濾液多糖體含量(87.15％)最高，且顯著地高于菌絲體水萃取多糖者(72.86％)及堿萃取多糖者(40.65％)，顯示堿萃取物含有較多雜質，因為堿性多糖萃取過程中，一些堿溶性無機鹽及蛋白質溶于其中而使其含有較高量的灰分(4.86％)及微量蛋白質(14.18％)之故。
表1. 樟芝菌絲體多糖的萃取率
1平均值(p＜0.05).樟芝中性單糖組成分分析樟芝菌絲體多糖萃取以2M三氟醋酸水解后再以1N NaOH中和至pH為中性，由多糖分解而得知其單糖組成(表2)。發(fā)酵濾液多糖主要由甘露糖(188.54毫克/克)、葡萄糖(150.11毫克/克)及木糖(112.75毫克/克)組成，而水萃取多糖則以葡萄糖(355.77毫克/克)、木糖(205.30毫克/克)及半乳糖(121.39毫克/克)為主要單糖，其堿萃取多糖則由葡萄糖(177.11毫克/克)及木糖(147.23毫克/克)所組成，但其仍含有一些微量的單糖及醛糖酸。而醛糖酸于水萃取多糖中含量(102.40毫克/克)最高，其次是堿萃取多糖(68.56毫克/克)及發(fā)酵濾液多糖(54.72毫克/克)。
表2.樟芝菌絲體發(fā)酵液多糖萃取物的單糖組成
1相同欄內的值以不同數字表示不同統(tǒng)計意義值(p＜0.05)。2N.D.未測得。多糖分子量測定凝膠過濾層析蛋白質標準品曲線的制備凝膠過濾層析條件下制備凝膠過濾層析蛋白質標準品曲線管柱Sepctra/chrom LC管柱(1.6×70公分)凝膠Sepharose6B移動相0.15M NaCl流速0.5毫升/分，3.0毫升/管多糖體酚-H2SO4法與UV 480nm蛋白質在254nm測量
Sepharos6B為以6％Agarose形成膠體的商品，適合分析分子量為104-106Da多糖分子及104-4×106Da蛋白質分子，以Blue dextran測定其柱床體積為45毫升，再以不同分子量的蛋白質標準品[鐵蛋白(ferritin)(MW 4.4×105Da)、醇脫氫酶(MW 1.5×105Da)、白蛋白(MW 4.7×104Da)、碳酸脫水酶(carbonic anhydrase)(MW 2.9×104Da)及細胞色素C(MW 1.24×104Da)]經Sepharose6B管柱溶析后，將標準品的分子量對數值與溶析管數(tube numbers)作圖，并求初期回歸曲線而得圖3所示的凝膠過濾層析的蛋白質標準品曲線。多糖體分子量測定將樣品以同一條件進行凝膠過濾層析，在蛋白質最大吸收波長254nm偵測析光值而得知樣品層析出來的管數，利用酚-硫酸法水解多糖進行顯色，將顯色的管數代入回歸曲線而得知溶析樣品的多糖分子量、如圖4中所示。
分離及酚-酸法顯色后，得知發(fā)酵濾液多糖于管數17及35皆有吸收波峰(圖4)，經與標準品(圖3)比對得知其多糖分子量分別為106Da以上及1.1×104Da，而以水萃取及堿萃取多糖皆于管數11及22處有吸收波峰(圖5及圖6)，其經比對后得知含有106Da以上及7.6×105Da的多糖分子，菌絲體以凝膠層析后皆有蛋白質的吸收波峰，表示菌絲體多糖中可能含有與多糖鍵結的微量蛋白，且其多糖體皆含大于106Da的分子，表示其可能含有平均分子量為50-200萬的β-(1→6)-葡萄糖基支鏈的β-(1→3)-喃葡聚糖。樟芝多糖體的構造分析自然界多糖為醛糖或酮糖以糖鍵鍵結合的聚合物，是生命有機體不可缺的成分，其存于真菌體中則具有抗腫瘤的活性。而多糖常與蛋白質鍵結成糖蛋白質，其抗腫瘤活性也成為研究的焦點。已有學者自姬松茸子實體分離出β-(1→6)-D-葡聚糖蛋白質復合體(多糖∶蛋白質＝50∶40)，此外由金針菇菌絲體分離出的活性糖蛋白質金針菇素(proflamin)為10％糖類與90％蛋白質而成的，其分子量為13000±4000Da，對于同系腫瘤B-6或腺癌755有明顯抑制效果，由其子實體萃出具抗腫瘤活性的β-多糖EA6(糖∶蛋白質＝70∶30)，被證實與寄主仲介性抗癌作用有一定相關的抗補體活性，因此多糖與蛋白質的比率對于在抗腫瘤活性及其結構判定則為必須探討的。1.核磁共振光譜(NMR)的測定樟芝菌絲體β-D-葡聚糖的1H-核磁共振光譜化學位移在3-4ppm之間的糖類碳上鍵結的氫，發(fā)酵濾液的氫光譜化學位移為4.570(H-1)、4.063(H-6a)、3.866((H-6b)、3.687(H-5)、3.496(H-4)、3.486(H-3)及3.3.3(H-2)(圖7)，而水萃取物及堿萃取物的氫光譜的結果相似，化學位移分別為4.570、4.598(H-1)、4.034、4.036(H-6a)、3.837(H-6b)、3.662、3.660(H-5)、3.454、3.473(H-3，4)及3.336、3.337(H-2)，其對應的13C光譜化學位移為103.087(C-1)、78.775(C-3)、77.978(C-5)、76.092(C-2)、73.224(C-4)及75.505(C-6)(圖8)，結果與Mizuno等人研究菇類子實體水溶性多糖的一維碳氫光譜化學位移相似。2.紅外線光譜(IR)的測定樟芝絲體多糖粉末以紅外線光譜分析，在發(fā)酵濾液于3375cm-1處有OH基、1557cm-1處有W型波峰，表示有C-C-C鏈存在、2938cm-1處有C-H基及1063cm-1處有-CH-O-CH-基的吸收帶出現(xiàn)(圖9)；其水萃取及堿萃取多糖則分別于3419、3390cm-1處(OH基)、1557、1539cm-1處有W型波峰(C-C-C)、2922、2919cm-1處(C-H)及1080、1069cm-1處(-CH-O-CH-)皆有吸收帶出現(xiàn)，顯示菌絲體多糖含有多糖官能基特性。3.X光衍射(X-ray)的測定樟芝菌絲體多糖萃取物的X光衍射圖，2θ角于發(fā)酵濾液為19.43o，而于水萃取及堿萃取則分別為19.48o、19.37o(圖10)，由圖中可看出經堿萃取的多糖較水萃取或濾液萃取者有更佳的結晶度。實施例5活性分析增強免疫效能A.巨噬細胞激活試驗實驗菌株樟芝(Antrodia camphorata)CCRC 35398及CCRC 35396實驗方法供試樣品制備按上述實施例1，2和3所述將樟芝發(fā)酵后，利用離心分別取得菌絲體及發(fā)酵液，菌絲體分別再以熱水(100℃以上)及堿液(NaOH)進行萃取，將所得的三種樟芝萃取物(菌絲體水萃取、菌絲體堿萃取、發(fā)酵液)再分別以酒精萃取多糖體，最后將萃取的多糖體進行凍干。三種樟芝凍干品皆以二次蒸餾的無菌水回溶并定量濃度至10毫克/毫升，而形成樟芝多糖萃取液。激活試驗將制備好的三種樟芝多糖萃取液分別加入1×105細胞/洞的J774A.1巨噬細胞(CCRC 60140)中進行刺激激化，終濃度為100微克/毫升，每個樣品皆作三重復，隔液刺激培養(yǎng)后取出細胞培養(yǎng)液，以ELISA方法分析巨噬細胞所分泌的TNF-α濃度。組別(a)陰性對照組一加入2微升磷酸鹽緩沖溶液于巨噬細胞中進行刺激；(b)陽性對照組一加入2微升脂多糖(Lipopolysaccharide)(簡稱LPS，終濃度10微克/毫升)于巨噬細胞中進行刺激；(c)實驗組一加入不同樟芝菌株的不同萃取物(菌絲體水萃取物、堿萃取物、發(fā)酵液)2微升于巨噬細胞中進行刺激，終濃度為100微克/毫升。結果腫瘤壞死因子(TNF-α)具有破壞腫瘤細胞與活化免疫細胞的功能，因此在免疫系統(tǒng)中占有重要的角色。本實驗結果如圖3所示。三組實驗組所測得的TNF-α濃度皆明顯比陰性對照組高，其中又以樟芝菌絲體堿萃取物為最高，但略低于陽性控制組。因此由此實驗結果可知，樟芝萃取物皆具有刺激活化巨噬細胞的能力，且以堿萃取物為最有效。B.活體動物實驗模式對樟芝活性物質的免疫功能的分析和評估。
本實驗是以BALB/cByJ小鼠為實驗動物，以喂管方式連續(xù)飼喂五周，藉以分析脾臟細胞的各項免疫功能以評估樟芝菌絲體對于免疫調節(jié)反應的功效。
經喂食五周后，對小鼠的生長無影響。以MTT法進行淋巴細胞增生反應分析，發(fā)現(xiàn)于ConA及PHA處理下，均可促進淋巴細胞增生。于ConA刺激下，可刺激脾臟細胞產生Th1細胞激素IL-2，抑制Th2細胞激素IL-4的生成。材料與方法1.實驗動物6周齡BALB/cByJ雌性小鼠，SPF等級，購自臺灣國科會國家實驗動物繁殖及研究中心。
動物購進后觀察一周，以了解其健康情形及生長狀況。若有任何小鼠顯現(xiàn)不正常情形(如畏光、脫水等)，即淘汰不用。
實驗前秤重，去除體重落在(平均體重±2標準差)以外者。符合標準者以隨機方式分為三組。每組為單一性別12只。以耳標標記各組小鼠，并于每周秤重一次，觀測小鼠生長狀況。2.飼養(yǎng)管理按一般(conventional)實驗動物飼養(yǎng)管理辦法進行動物飼養(yǎng)室的環(huán)境設定為23±2℃、50±10％相對濕度、12小時光照/黑暗交替、飼料飲水不限制。3.實驗樣品樟芝菌絲體(CCRC 35396)經如實施例1所述發(fā)酵培養(yǎng)后經加工干燥制成樣品(樣品生產批號20020315A9B)。4.劑量設計實驗進行分成對照組及兩個受試物組。受試物劑量根據人類每日最適攝取量換算成小鼠的每日攝取量作為低劑量組，另將此劑量放大10倍后作為高劑量組。I.對照組—等體積二次水II.低劑量組—每日建議攝食量III.高劑量組—10倍的每日建議攝食量劑量計算如下一般保健者(人)建議食用量420毫克/?！?粒/次×3次/天＝2520毫克/天；因此，換算小鼠劑量為2520毫克/天×0.0026＝6.552毫克/天—即低劑量組；高劑量組劑量為65.52毫克/天(6.552毫克/天×10)。5.受試物給予途徑及天數采用胃管口服給予喂食，每日一次，每周六日，連續(xù)五周。6.實驗步驟6.1動物采血與犧牲實驗老鼠以二氧化碳迷安樂死后，全身噴酒精消毒移至Laminar flow中無菌操作，繼續(xù)采取脾臟的步驟。6.2脾臟細胞懸浮液的制備在無菌狀態(tài)下取出老鼠的脾臟，置于裝有5毫升培養(yǎng)基的30毫米培養(yǎng)皿(petri dish)中。利用5毫升針筒推進器的平尾端輕輕壓住脾臟、磨動，磨到整顆脾臟變白色，使結締組織間的脾臟細胞盡量游離出來。
用無菌吸管將含有細胞的培養(yǎng)基吸至15毫升離心管，靜置5-10分鐘。吸取細胞懸浮液至另一離心管中，600×g離心5分鐘，吸棄上清液。輕拍管壁，使細胞均勻散開。加入5毫升冰冷的ACK RBC溶裂緩沖液(lysis buffer)與細胞混合，作用1分鐘。立即加入5毫升已回溫的培養(yǎng)基。600×g離心5分鐘，吸棄上清液。輕拍管壁，使細胞均勻散開。以10毫升的HBSS緩沖液清洗2次。將細胞懸浮于10毫升培養(yǎng)基中。以錐藍(Trypan Blue)稀釋(大約為10倍稀釋)計算細胞總數。將細胞以培養(yǎng)基調成1×107細胞/毫升的濃度。6.3淋巴細胞增生反應(MTT法)先于96孔培養(yǎng)盤培養(yǎng)內分別加入100微升/孔的培養(yǎng)基或含有裂殖素(mitogen)的培養(yǎng)基(分別為10微克/毫升ConA、20微克/毫升PHA及50微克/毫升LPS)。然后加入100微升/孔的4×106細胞/毫升的脾臟細胞懸浮液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)72小時。
于培養(yǎng)后，加入20微升/孔的MTT(5毫克/毫升)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，離心250×g 10分鐘。吸棄200微升/孔的上澄液。加入200微升/孔的DMSO，震蕩5分鐘后，用ELISA reader測A570nm。6.4細胞激素分泌試驗24孔培養(yǎng)盤上分別標示“唯細胞(cell only)”及ConA處理。唯細胞處理孔中加入0.6毫升的培養(yǎng)基；ConA處理孔中加入0.5毫升ConA(10微克/毫升)及0.1毫升的培養(yǎng)基。于每孔內加入0.4毫升107細胞/毫升的老鼠脾臟細胞。24小時后收集細胞培養(yǎng)上清液置于-20℃冰箱。以夾層式(sandwich)-ELISA(酵素—聯(lián)結免疫吸附檢定(enzyme-linked immunosorbent assay))測試細胞培養(yǎng)上清液中IL-2及IL-4含量。7.數據整理及結果判定實驗結果以平均值±標準誤差(Mean±SD)表示。所有結果均以單向變方分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計，以Duncan’s multiple range test進行各處理組間的比較，并以Dunnett’s t-test進行各處理組與對照組間的比較。結果在經五周灌食樟芝菌絲體樣品之后，比較對照組與低劑量組、高劑量組小鼠的體重，各組小鼠的生長無明顯差異(表3)，顯示樟芝菌絲體對小鼠生長無不良影響。
脾臟細胞以ConA、PHA及LPS裂殖素(mitogen)處理，于5％CO2、37℃下培養(yǎng)三天，以MTT法進行淋巴細胞增生反應分析，結果發(fā)現(xiàn)于ConA及PHA刺激下，樟芝菌絲體可明顯地刺激淋巴細胞增生(P分別為＜0.05及＜0.1)(表4)。
脾臟細胞于自發(fā)情況(即cellonly)及ConA裂殖素刺激下，于5％CO2、37℃培養(yǎng)24小時，收集其上澄液，分別檢測IL-2及IL-4的生成量，以了解樟芝菌絲體對細胞激素生成的影響。結果發(fā)現(xiàn)樟芝菌絲體可刺激Th1-type細胞激素IL-2的生成(ConA-stimulated)；對Th2-type細胞激素IL-4的生成則有抑制作用(ConA-stimulated)(表5)。結論經過五周的灌食樟芝菌絲體，低劑量組、高劑量組與對照組小鼠的生長皆無明顯差異。樟芝菌絲體于ConA及PHA刺激下，可增加淋巴細胞增生；于ConA刺激下，可促進脾臟細胞增加Th1-type細胞激素IL-2的生成，抑制Th2-type細胞激素IL-4的生成。
表3實驗期間小鼠的平均體重
1.灌食五周樟芝菌絲體，其是由樟芝(CCRC 35396)發(fā)酵培養(yǎng)加工干燥制成。2.結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。體重單位為克(gm)
表4樟芝菌絲體對淋巴細胞增生的影響
1.灌食五周樟芝菌絲體，其是由樟芝(CCRC 35396)發(fā)酵培養(yǎng)加工干燥制成。2.結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。3.*P＜0.05，**P＜0.01表5 “樟芝王”對脾臟細胞細生成胞激素的影響
1.灌食五周樟芝菌絲體，其是由樟芝(CCRC 35396)發(fā)酵培養(yǎng)加工干燥制成。2.結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。3.*P＜0.05，**P＜0.01
表6.樟芝的實體及菌絲體熱水可溶多糖對人類淋巴癌細胞的抑制作用
表7.樟芝菌絲體活性物質對人類巨噬細胞*吞噬能力的作用
*.巨噬細胞株(J774A.1)本研究顯示服用不同劑量及周數的樟芝后，能激發(fā)且增強體內細胞激素的表現(xiàn)及活性。由活體動物的實驗中進一步證實經由樟芝刺激而得的細胞激素免疫活性能在生物體內發(fā)揮其療效。
請參閱圖2，為顯示出以C57BL/6及BALB/c小鼠喂食樟芝不同周數及劑量后的免疫反應(細胞激素IL-2、TNF-α、INF-γ)結果的圖形，在活體動物評估模式中，我們使用兩種近親交配小鼠(C57/BL6及BALB/c)作實驗，將8周齡的C57/BL6及BALB/c小鼠分成多組，每組為10只小鼠，分別給予口服樟芝一周、二周或四周，每組口服劑量分別為喂食樟芝1.0毫克、2.5毫克或5.0毫克。每組小鼠在服完藥后的24小時，經由尾部自然感染約150±10只曼氏血吸蟲只尾動幼蟲，未服用藥材各只小鼠亦同時感染相同數目的幼蟲作為對照組，6-8星期后利用門脈灌流法(portal perfusion method)犧牲動物，沖出肛門靜脈及腸系膜靜脈中的成蟲，實驗結果顯示，兩種小鼠在服用樟芝2.5毫克或5.0毫克一周后，其產生的成蟲數目和對照組比較無明顯差別，口服樟芝1.0毫克二周后，所得的結果與前述相似。當兩種小鼠口服2.5毫克二周后，其幼蟲在小鼠內發(fā)育為成蟲數目和對照組比較呈現(xiàn)明顯降低的趨勢，其減蟲率介于20％-45％。若口服5.0毫克，二周后則BALB/c小鼠出現(xiàn)比服用同劑量一周的小鼠較明顯的效果(減蟲率為40％對26％)，但C57BL/6小鼠則與服用一周的效果類似，然而當兩種小鼠口服樟芝活性物質1.0毫克或2.5毫克四周后其所得的成蟲數目較對照組顯著減少，尤其是服用2.5毫克后，其減蟲率達到60％和49％。此研究結果顯示經服用樟芝活性物質2.5毫克四周后，其所增強的免疫效能在生體內發(fā)揮明顯的功能(顯示減少了約一半的感染率)。(如表8所示)表8.C57BL/6及BALB/c小鼠服用不同劑量的樟芝一周、二周或四周后感染血吸蟲所得的減蟲效果 *表示未測試上列詳細說明系針對本發(fā)明的一可行實施例的具體說明，惟該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實施或變更，均應包含于本案的權利要求范圍中。
權利要求
1.一種樟芝菌絲體生物活性物質，其特征是經樟芝菌絲體液體培養(yǎng)后產生者。
2.按照權利要求1所述的樟芝菌絲體生物活性物質，其特征在于其該菌絲體為分別于2001年3月5日和2001年5月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的CCRC 35398和CCRC35396，保藏號分別為CGMCC No.0543和CGMCC No.0575。
3.按照權利要求1所述的樟芝菌絲體生物活性物質，其特征在于其該菌絲體為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的CCRC 35396的菌株。
4.按照權利要求1所述的樟芝菌絲體生物活性物質，其特征在于其中該生物活性物質是源自樟芝菌絲體液體培養(yǎng)所得整個懸浮液。
5.按照權利要求1所述的樟芝菌絲體生物活性物質，其特征在于其該生物活性物質是源自樟芝菌絲體液體培養(yǎng)所得整個懸浮液中的澄清培養(yǎng)液。
6.按照權利要求1所述的樟芝菌絲體生物活性物質，其特征在于其該生物活性物質是源自樟芝菌絲體液體培養(yǎng)所得整個懸浮液中的菌絲體經萃取所得者。
6.一種樟芝菌絲體生物活性物質的制備方法，其特征在于包括以特殊液體培養(yǎng)基培養(yǎng)樟芝菌絲體及分離出活性物質的步驟。
7.按照權利要求7所述的方法，其特征在于分離步驟包括將該培養(yǎng)懸浮液分離成固體菌絲體與澄清培養(yǎng)液，接著用溶劑萃取該菌絲體，及將該萃取液與該澄清液合并將該活性物質沉淀分離出。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于該分離步驟包括將該培養(yǎng)懸浮液分離成固體菌絲體與澄清培養(yǎng)液，接著用溶劑萃取該菌絲體，及將該萃取液與該澄清液合并，并將該活性物質沉淀分離出。
9.按照權利要求7所述的方法，其特征在于萃取溶劑為水且萃取溫度為30至121℃。
10.按照權利要求7所述的方法，其特征在于分離步驟包括將該培養(yǎng)懸浮液直接于30至121℃加熱后，將該活性物質沉淀分離出。
11.一種組成物，其特征在于包括如權利要求1至6項中任何一項所述的樟芝菌絲體生物活性物質。
12.根據權利要求1至6項中任何一項所述的樟芝菌絲體生物活性物質，其特征在于可刺激淋巴細胞增生，刺激Th1-type細胞激素IL-2的生成，對Th2-型細胞激素IL-4的生成有抑制作用，且具有刺激活化巨噬細胞的能力。
全文摘要
本發(fā)明是有關以僅生長于臺灣特有物種牛樟樹樹心內的菇類一樟芝的菌絲體進行液體培養(yǎng)后產生以多糖體為主的生物活性物質,其具有增強免疫功能,抗腫瘤和抗寄生蟲性;且有關該活性物質的制備方法及含該活性物質的組成物。
文檔編號C12P19/04GK1352990SQ01115869
公開日2002年6月12日 申請日期2001年5月11日 優(yōu)先權日2000年11月13日
發(fā)明者陳勁初, 陳清農, 許勝杰 申請人:葡萄王企業(yè)股份有限公司