一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法。該方法包括如下步驟：1）裂解含有rhBMP-2蛋白的包涵體，得到包涵體裂解液；2）對(duì)所述包涵體裂解液依次進(jìn)行親和層析和陽(yáng)離子交換層析，分離純化得到變性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液；3）對(duì)所述變性rhBMP-2蛋白進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性rhBMP-2蛋白粗品；4）對(duì)所述復(fù)性rhBMP-2蛋白粗品依次進(jìn)行親和層析和凝膠過(guò)濾層析分離純化，得到復(fù)性rhBMP-2蛋白純品。利用本發(fā)明所提供的方法純化rhBMP-2蛋白，制備的產(chǎn)品純度達(dá)95%以上，蛋白收率為9.4%，內(nèi)毒素和DNA殘留均符合生物藥物質(zhì)量要求，本發(fā)明方法適于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)；同時(shí)也為同類(lèi)重組蛋白藥物的研發(fā)生產(chǎn)提供參考。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白純化領(lǐng)域，涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)是由骨基質(zhì)分泌的一種疏水性蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF-目）超家族成員，由等化ist等人于1965年首次提出，1972年定義，并于1982年首次 從脫巧骨基質(zhì)提取物中分離得到的一種活性蛋白質(zhì)。BMP家族包括BMP-1、2、4、6、7、9、12、 14等，其中BMP-2具有明顯誘導(dǎo)未分化成纖維細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的作用，并能調(diào)節(jié) 成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)異位骨形成和促進(jìn)骨折愈合的功能。BMP-2是骨生成的 啟動(dòng)因子，可W加速骨的重建，是骨修復(fù)基因治療的理想目的基因，是目前唯一能誘導(dǎo)異位 成骨的細(xì)胞因子，因而成為骨組織工程學(xué)研究中最重要的生長(zhǎng)因子。目前，BMP-2已成功地 用于治療骨不連和骨缺損的修復(fù)。BMP -般無(wú)種屬特異性，具有跨種屬誘導(dǎo)成骨能力，因而 其臨床應(yīng)用前景十分廣闊。
[0003] BMP-2可W通過(guò)天然牛骨提取純化和基因重組誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化兩種方法制 備。其中天然提取法成本高，產(chǎn)率低，易失活，不適于工業(yè)化生產(chǎn)，逐漸被基因重組法代 替。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)憑借技術(shù)成熟、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為目前基因重組法生產(chǎn) BMP-2的一個(gè)熱點(diǎn)技術(shù)。然而，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的BMP-2 W無(wú)活性的包涵體形式存在于胞 內(nèi)，如何將包涵體通過(guò)復(fù)性得到具有生物活性的BMP-2二聚體，是重組蛋白藥物研發(fā)生產(chǎn) 中的關(guān)鍵步驟。
[0004] 國(guó)內(nèi)研究者孫奮勇等于2004年進(jìn)行了重組BMP-2復(fù)性工藝研究；姚少華等也于 2005年研究了用輕基磯灰石純化及復(fù)性工藝；2006年徐放研究了離子交換和疏水層析的 純化工藝；2007年劉國(guó)安等研究了兩步離子交換層析純化工藝。W上生產(chǎn)工藝均存在復(fù)性 率低、蛋白易沉淀收率低下等問(wèn)題，并不適于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法，是在經(jīng)原核表達(dá)得 到含有重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的包涵體的基礎(chǔ)上完成的，具體而言，可包括如下步驟：
[0007] 1)裂解含有重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的包涵體，得到包涵體裂解液；
[0008] 2)按照如下al)和a2)的步驟對(duì)所述包涵體裂解液進(jìn)行分離純化，得到變性重組 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液：
[0009] al)將步驟1)中得到的包涵體裂解液進(jìn)行親和層析，收集洗脫峰；
[0010] 所述親和層析中所采用的配基為肝素，所采用的洗脫程序?yàn)榛疌1 一步洗脫；所述 收集洗脫峰為收集進(jìn)行所述化C1 一步洗脫過(guò)程中所產(chǎn)生的洗脫峰；
[0011] a2)將從步驟al)中收集的洗脫峰進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，收集洗脫峰，即為所述變 性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液；
[0012] 所述陽(yáng)離子交換層析中所采用的陽(yáng)離子交換基團(tuán)是SP(Sul地opropy，賴(lài)丙基)，為 強(qiáng)陽(yáng)離子交換基團(tuán)，所采用的洗脫程序?yàn)榛疌1 一步洗脫；所述收集洗脫峰為收集進(jìn)行所述 化C1 一步洗脫過(guò)程中所產(chǎn)生的洗脫峰；
[0013] 3)對(duì)步驟2)中得到的變性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性重 組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2粗品溶液；
[0014] 4)按照如下bl)和b2)的步驟，對(duì)步驟3)中得到的復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 粗品溶液進(jìn)行分離純化，得到復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2純品溶液，從中可得到純化后 的復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2純品：
[0015] bl)將步驟3)中得到的復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2粗品溶液進(jìn)行親和層析，收 集洗脫峰；
[0016] 所述親和層析中所采用的配基為肝素，所采用的洗脫程序?yàn)榛疌1線(xiàn)性洗脫；所述 洗脫峰為化C1在洗脫液中的濃度線(xiàn)性增至0. 45M時(shí)開(kāi)始起峰的紫外吸收峰；
[0017] b2)將從步驟bl)中收集的洗脫峰進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，收集洗脫峰，即為所述復(fù)性 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2純品溶液。
[0018] 在上述方法中，步驟al)中，進(jìn)行所述化C1 一步洗脫所用的洗脫液的溶劑為水，溶 質(zhì)及其濃度如下：化CIO. 35mol/L，Tris-肥150mmol/L，尿素8mol/L ;抑值為8. 5 ;
[0019] 步驟a2)中，進(jìn)行所述化Cl 一步洗脫所用的洗脫液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為 化CIO. 75mol/L，磯酸二氨軸 50mmol/L，尿素 8mol/L ;抑值為 5. 5 ;
[0020] 步驟bl)中，進(jìn)行所述化C1線(xiàn)性洗脫所用的洗脫液的抑值為8. 5,溶質(zhì)為化C1， 溶劑由終濃度為50mmol/L的Tris-HCl，W及終濃度為3mol/L的尿素和水組成；所述線(xiàn)性 洗脫的體積為10個(gè)層析柱柱體積；在進(jìn)行的所述10個(gè)層析柱柱體積洗脫過(guò)程中，NaCl在 所述洗脫液中的濃度由0. 4M線(xiàn)性升至0. 7M ;
[0021] 步驟b2)中，所述凝膠過(guò)濾層析中所采用的層析介質(zhì)的分離范圍包括所述重組人 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的分子量大小(復(fù)性后蛋白，30KD)。所用的層析柱的柱長(zhǎng)度和柱內(nèi)徑比 為 100:26。
[0022] 在上述方法中，步驟al)中所述親和層析的介質(zhì)載體為Se地arose ;步驟a2) 中所述陽(yáng)離子交換層析的介質(zhì)載體為Se地arose ;步驟bl)中所述親和層析的介質(zhì)載體 為Se地arose;步驟b2)中所述凝膠過(guò)濾層析的介質(zhì)為Se地aarl S-100 (分離范圍為 1-100?。?。
[0023] 在上述方法中，步驟3)中，所述對(duì)步驟2)中得到的變性重組人骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-2溶液進(jìn)行復(fù)性，采用的復(fù)性液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下；0. 05-0. 2mol/L Tris-HCl，0. 5-2. Omol/L 尿素，0. 05-0. lmol/L2-環(huán)己氨基己賴(lài)酸，0. 2-0. 5mol/L 精氨酸， 0. 1-1. Ommol/L氧化型谷脫甘膚，1. 0-10mmol/L還原型谷脫甘膚，P服.5-9. 0。
[0024] 在上述方法中，步驟3)中，所述對(duì)步驟2)中得到的變性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 溶液進(jìn)行復(fù)性，采用的是一步直接稀釋法，具體為如下：向步驟2)中得到的變性重組人骨 形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液加入9倍體積的所述復(fù)性液對(duì)其進(jìn)行十倍稀釋?zhuān)?-1CTC (如4C ) 震蕩培養(yǎng)4-7天巧n 4天)，完成蛋白復(fù)性；
[0025] 所述震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速可為120-180轉(zhuǎn)/分鐘，具體為150轉(zhuǎn)/分鐘；其旋轉(zhuǎn)半徑與 上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)的ZWY-211B型號(hào)搖床的旋轉(zhuǎn)半徑相同。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)性液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下；0. Imol/L Tris-HCl，0. 5mol/L 尿素，0. lmol/L2-環(huán)己氨基己賴(lài)酸，0. 2mol/L 精氨酸，0. 5mmol/L 氧化 型谷脫甘膚，Immol/L還原型谷脫甘膚，P服.5-9. 0。
[0027] 在上述方法中，步驟b2)中，所述收集洗脫峰是用如下溶液洗脫得到的；20mmol/L 磯酸二氨軸，0. 15mol/L氯化軸，P冊(cè).5。各濃度為相應(yīng)組分在溶解液中的終濃度。
[0028] 在上述方法中，步驟al)中所述親和層析的介質(zhì)具體為化parin Se地arose (如 GE公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0998-03);步驟a2)中所述陽(yáng)離子交換層析的介質(zhì)具體 為SP Se地arose巧日GE公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0729-04 ;步驟bl)中所述親和層析 的介質(zhì)具體為化parin Se地arose (如GE公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0998-03);步驟 b2)中所述凝膠過(guò)濾層析的介質(zhì)具體為Se地aarl S-100 (如GE公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào) 為17-0612-05)。當(dāng)然，除了 W上列舉的GE公司生產(chǎn)的各層析柱外，具有等同或類(lèi)似功能的 其他公司生產(chǎn)的層析柱也均可用于完成本發(fā)明。
[0029] 在上述方法中，步驟31)中，上樣量可為300±30111以洗脫時(shí)的流速可為80±2011117 min,洗脫體積可為化；步驟a2)中，上樣量可為500 + 50血，洗脫時(shí)的流速可為80 + 20血/ min,洗脫體積可為6L ;步驟bl)中，上樣量可為1000 +100血，洗脫時(shí)的流速可為10 + 2血/ min,洗脫體積可為10個(gè)柱體積；步驟b2)中，上樣量可為15mU洗脫時(shí)的流速可為 2. 5 + 0. 5血/min,洗脫體積可為900血。
[0030] 在上述方法的步驟al)中，所述收集洗脫峰具體為收集如下洗脫峰；在步驟al)的 所述親和層析中，洗柱后用洗脫液進(jìn)行洗脫所得的第1個(gè)峰。
[0031] 在上述方法的步驟a2)中，所述收集洗脫峰具體為收集如下洗脫峰；在步驟a2)的 所述陽(yáng)離子交換層析中，洗柱后用洗脫液進(jìn)行洗脫所得的第1個(gè)峰。
[0032] 在上述方法的步驟bl)中，所述收集洗脫峰為收集進(jìn)行所述化C1線(xiàn)性洗脫過(guò)程中 所產(chǎn)生的第二個(gè)洗脫峰；進(jìn)一步，所述收集洗脫峰具體為收集如下洗脫峰；在步驟bl)的所 述親和層析中，洗柱后用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫化C1在洗脫液中的濃度線(xiàn)性增至0. 45M時(shí)開(kāi) 始起峰的紫外吸收峰。
[0033] 在上述方法的步驟b2)中，所述收集洗脫峰為：當(dāng)紫外檢測(cè)起峰時(shí)繼續(xù)沖洗排廢 20mL (W去除與分子量較大的多聚體雜質(zhì))，然后開(kāi)始收集洗脫峰，待檢測(cè)峰回落至基線(xiàn)附 近時(shí)停止收集。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述收集洗脫峰具體為收集如下洗脫峰；在步驟 b2)的所述凝膠過(guò)濾層析中，洗柱后用洗脫液進(jìn)行洗脫所得的第1個(gè)峰。
[0034] 在上述方法的步驟al)、步驟a2)和步驟bl)的所述層析中，在洗脫前還包括洗柱 的步驟，具體如下：
[00巧]步驟al)中，進(jìn)行所述化C1 一步洗脫前還包括如下步驟：用緩沖液H-AB對(duì)上樣后 的所述步驟1)中得到的包涵體裂解液進(jìn)行洗涂(流速可為80 +20mL/min)，洗3個(gè)親和層析 柱柱體積；所述緩沖液H-AB的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下；Tris-HC150mmol/L，尿素8mol/ L,化〔10. Imol/L ;p服.5 ;
[0036] 步驟a2)中，進(jìn)行所述化Cl 一步洗脫前還包括如下步驟：用緩沖液SP-AB對(duì)上 樣后的所述從步驟al)中收集的洗脫峰樣品進(jìn)行洗涂(流速可為80±20mL/min)，洗3個(gè) 陽(yáng)離子交換層析柱柱體積；所述緩沖液SP-AB的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下；磯酸二氨軸 50mmol/L，尿素 8mol/L, NaClO. Imol/L ;pH5. 5 ;
[0037] 步驟bl)中，進(jìn)行所述化Cl線(xiàn)性洗脫前還包括如下步驟：用平衡緩沖液為HF-A對(duì) 上樣后的所述步驟3)中得到的復(fù)性的所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2進(jìn)行洗涂(流速可為 10 +2mL/min)，洗2個(gè)親和層析柱柱體積；所述平衡緩沖液HF-A的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如 下：Tris-肥 150mmol/L，尿素 3mol/L ;抑8. 5。
[0038] 在上述方法中，所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的氨基酸序列具體如序列表中序 列1所示。
[0039] 在上述方法的步驟1)中，所述裂解含有重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的包涵體，所用 的裂解液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下；Tris-HClO. Imol/L，鹽酸脈8mol/L，孤TlOmmol/L， pH9. 0。裂解所述包涵體時(shí)，所述包涵體與所述裂解液的配比為1克所述包涵體；30mL所述 裂解液。
[0040] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種蛋白復(fù)性液。
[0041] 本發(fā)明所提供的蛋白復(fù)性液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下；〇. 05-0. 2mol/L Tris-HCl，0. 5-2. Omol/L 尿素，0. 05-0. lmol/L2-環(huán)己氨基己賴(lài)酸，0. 2-0. 5mol/L 精氨酸， 0. 1-1. Ommol/L氧化型谷脫甘膚，1. O-lOmmol/L還原型谷脫甘膚，P服.5-9. 0。
[0042] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述復(fù)性液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下；0. Imol/L Tris-HCl，0. 5mol/L 尿素，0. lmol/L2-環(huán)己氨基己賴(lài)酸，0. 2mol/L 精氨酸，0. 5mmol/L 氧化 型谷脫甘膚，Immol/L還原型谷脫甘膚，P服.5-9. 0。
[0043] 所述蛋白復(fù)性液在對(duì)原核表達(dá)得到的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2進(jìn)行復(fù)性中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0044] 在上述應(yīng)用中，所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的氨基酸序列如序列表中序列1所 示。更加具體的，所述原核表達(dá)得到的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2為利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)得到的氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)。
[0045] 本發(fā)明提供的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化方法，與現(xiàn)有方法相比，其優(yōu)勢(shì)在 于；1、在包涵體復(fù)性前增加了親和層析與離子交換層析，進(jìn)行初步純化，去除大部分的多聚 體、雜蛋白與核酸等雜質(zhì)，可W減少?gòu)?fù)性時(shí)的蛋白沉淀，從而大大提高復(fù)性率；2、特殊的復(fù) 性工藝，所用蛋白復(fù)性液中谷脫甘膚的用量減少，使工藝成本降低，同時(shí)復(fù)性操作工序更加 簡(jiǎn)單，但復(fù)性率仍能達(dá)50% W上；3、整個(gè)純化工藝銜接合理，制備的產(chǎn)品純度達(dá)95% W上，蛋 白收率較高，內(nèi)毒素和DNA殘留均符合生物藥物質(zhì)量要求?？傊?，利用本發(fā)明所提供的方法 對(duì)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2進(jìn)行純化，所得蛋白收率高、成本低廉，適于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)； 同時(shí)該純化生產(chǎn)方法也為同類(lèi)重組蛋白藥物的研發(fā)生產(chǎn)提供參考。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1為rhBMP-2蛋白復(fù)性前親和層析圖譜。其中，A峰為上樣及洗柱時(shí)的紫外吸 收峰，主要組分為菌體核酸和雜蛋白；B峰為rhBMP-2變性蛋白洗脫峰。
[0047] 圖2為rhBMP-2蛋白復(fù)性前陽(yáng)離子交換層析圖譜。其中，D峰為上樣及洗柱時(shí)的 紫外吸收峰，主要組分為菌體核酸；E峰為rhBMP-2變性蛋白洗脫峰。
[004引圖3為rhBMP-2蛋白復(fù)性前親和層析所得洗脫峰的SDS-PAGE圖譜和rhBMP-2蛋 白復(fù)性前陽(yáng)離子交換層析所得洗脫峰SDS-PAGE圖譜。其中，泳道M為分子量Marker,其中 兩個(gè)Marker條帶的分子量分別為30kd和15kd ;泳道1和2為rhBMP-2蛋白復(fù)性前親和層 析所得洗脫峰的SDS-PAGE圖譜，泳道3為rhBMP-2蛋白復(fù)性前陽(yáng)離子交換層析所得洗脫峰 的SDS-PAGE圖譜，目的蛋白條帶位于分子量15kd處。
[0049] 圖4為rhBMP-2蛋白復(fù)性后親和層析圖譜。其中，el峰為上樣及洗柱時(shí)的紫外吸收 峰，主要組分為小分子鹽分；e2峰為用線(xiàn)性洗脫的第一個(gè)紫外吸收峰，主要組分為rhBMP-2 單體分子；e3峰為rhBMP-2二聚體洗脫峰。
[0050] 圖5為rhBMP-2蛋白復(fù)性后SDS-PAGE圖譜和rhBMP-2蛋白復(fù)性后親和層析所得 第二個(gè)洗脫峰（目標(biāo)峰)SDS-PAGE圖譜。其中，泳道M為分子量Marker,其中兩個(gè)Marker條 帶的分子量分別為30kd和巧kd ;泳道1為rhBMP-2蛋白復(fù)性后SDS-PAGE圖譜；泳道2為 rhBMP-2變性蛋白不經(jīng)預(yù)純化直接稀釋復(fù)性后SDS-PAGE圖譜；泳道3為rhBMP-2蛋白復(fù)性 后親和層析所得第二個(gè)洗脫峰（目標(biāo)峰)SDS-PAGE圖譜，復(fù)性后的二聚體蛋白條帶位于分子 量30kd處；
[0051] 圖6為rhBMP-2蛋白復(fù)性后凝膠過(guò)濾層析圖譜。其中，E1峰為目標(biāo)洗脫蛋白峰； E2峰為鹽峰（電導(dǎo)峰)。
[0052] 圖7為rhBMP-2蛋白復(fù)性后凝膠過(guò)濾層析所得洗脫峰的SDS-PAGE圖譜。其中， 泳道M為分子量Marker,其中兩個(gè)Marker條帶的分子量分別為30kd和15kd ;泳道E為 rhBMP-2蛋白復(fù)性后凝膠過(guò)濾層析所得洗脫峰的SDS-PAGE圖譜，目的蛋白條帶位于分子量 30kd 處。
[0053] 圖8為rhBMP-2蛋白復(fù)性后疏水作用層析圖譜。其中，B1、B2、B3階段沒(méi)有明顯紫 外吸收峰，B4階段為0. 1M氨氧化軸洗脫峰，表明蛋白樣品可能沉淀在層析填料中。
[0054] 圖9為rhBMP-2蛋白復(fù)性后疏水作用層析所得洗脫峰的SDS-PAGE圖譜。其中， 泳道1為30%異丙醇水溶液洗脫所得組分的SDS-PAGE圖譜，未檢測(cè)到蛋白條帶；泳道2為 0. 5M氨氧化軸洗脫所得組分的SDS-PAGE圖譜，主要蛋白條帶位于分子量15kd處，另有大量 雜條帶，推測(cè)蛋白樣品可能在疏水填料上發(fā)生聚集沉淀；泳道3為NaCl線(xiàn)性線(xiàn)性洗脫所得 組分的SDS-PAGE圖譜，未檢測(cè)到蛋白條帶；泳道4為rhBMP-2蛋白復(fù)性后SDS-PAGE圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[00巧]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0056] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057] 下述實(shí)施例中所述的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)的基因工程菌構(gòu)建方 法已在專(zhuān)利CN200510132792. 9中公開(kāi)，本發(fā)明的純化方法即是在專(zhuān)利CN200510132792. 9 中公開(kāi)的經(jīng)大腸桿菌原核表達(dá)得到含有所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)的包涵 體的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。具體的，所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)的氨基酸序列如序 列表中序列1所W。
[0058] 實(shí)施例1、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化 [005引一、包涵體的溶解
[0060] 包涵體；在專(zhuān)利CN200510132792. 9中公開(kāi)的經(jīng)大腸桿菌原核表達(dá)得到含有所述 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2，序列1)的包涵體。
[0061] 包涵體溶解液；0. Imol/L Tris-HCl，8mol/L 鹽酸脈，lOmmol/L 孤T，pH9. 0。各濃 度為相應(yīng)組分在溶解液中的終濃度。
[006引 W 1克包涵體；30血包涵體溶解液的比例將包涵體溶解，于4°C、150r/min振蕩18 小時(shí)后，lOOOOg高速離也lOmin，收集上清液即為包涵體裂解液。
[0063] 二、復(fù)性前純化
[0064] 在進(jìn)行蛋白復(fù)性前依次進(jìn)行親和層析和陽(yáng)離子交換層析。
[0065] 1、變性蛋白的肝素親和層析純化
[0066] 層析介質(zhì)；Heparin Se地arose (GE 公司，17-0998-03)。
[0067] 平衡緩沖液H-A ;50mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素袖8. 5。各濃度為相應(yīng)組分在 溶解液中的終濃度。
[0068] 洗脫緩沖液 H-B ;50mmol/L Tris-HCl，8mol/L 尿素，Imol/L 化C1 ;p服.5。各濃度 為相應(yīng)組分在溶解液中的終濃度。
[0069] 對(duì)步驟一得到的包涵體裂解液進(jìn)行肝素親和層析進(jìn)行純化，親和層析柱裝填規(guī) 格：柱床體積柱內(nèi)徑100mm，具體操作如下：
[0070] (1)柱平衡；用平衡緩沖液H-A W 80 +20血/min的流速平衡層析柱，平衡至流出 液的基線(xiàn)平穩(wěn)。
[0071] (2)上樣及洗柱；將步驟一得到的包涵體裂解液直接上樣，上樣量為300 + 30血， 然后用90% (體積分?jǐn)?shù)）平衡緩沖液H-A+10% (體積分?jǐn)?shù)）洗脫緩沖液H-B的混合液(其中 化C1的含量為0. 1M) W 80±20mL/min的流速對(duì)層析柱沖洗3個(gè)柱體積，W去除與填料吸附 不緊密的大部分核酸和菌體雜蛋白。
[007引（3 )洗脫；用65% (體積分?jǐn)?shù)）平衡緩沖液H-A+35% (體積分?jǐn)?shù)）洗脫緩沖液H-B的 混合液(其中化C1的含量為0. 35M)進(jìn)行一步洗脫，流速80±20mL/min，洗脫體積是化，紫 外檢測(cè)起峰時(shí)開(kāi)始收集，待檢測(cè)峰回落至基線(xiàn)附近時(shí)停止收集（圖1所示洗脫峰B)。
[0073] W上所述變性蛋白的肝素親和層析純化所得圖譜（圖1)中的兩個(gè)峰，A峰為上樣 及洗柱時(shí)的紫外吸收峰，主要組分為菌體核酸和雜蛋白；B峰為rhBMP-2變性蛋白洗脫峰。
[0074] 將收集的檢測(cè)峰（圖1所示洗脫峰B)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖3所 示，經(jīng)該步驟的純化后，rhBMP-2單體的純度達(dá)81%。
[00巧]2、變性蛋白的陽(yáng)離子交換層析純化
[0076] 層析介質(zhì)；SP Se地arose (GE 公司，17-0729-04)。
[0077] 平衡緩沖液為SP-A ;50mmol/L磯酸二氨軸，8mol/L尿素；P冊(cè).5。各濃度為相應(yīng)組 分在溶解液中的終濃度。
[0078] 洗脫緩沖液為SP-B ;50mmol/L磯酸二氨軸，8mol/L尿素，Imol/L化C1 ;p冊(cè).5。各 濃度為相應(yīng)組分在溶解液中的終濃度。
[0079] 為了進(jìn)一步提高蛋白的純度、降低核酸等雜質(zhì)的含量，將步驟1得到的洗脫峰樣 品使用陽(yáng)離子交換層析進(jìn)一步純化，層析柱規(guī)格：柱床體積1.化，柱內(nèi)徑100mm。具體操作 如下：
[0080] (1)柱平衡；用平衡緩沖液SP-A W 80 ±20血/min的流速平衡層析柱，平衡至流出 液的基線(xiàn)平穩(wěn)。
[0081] (2)上樣及洗柱；將步驟1得到的得到的洗脫峰樣品用平衡緩沖液SP-A稀釋15倍 后上樣，上樣量為500 + 50血，然后用90% (體積分?jǐn)?shù)）平衡緩沖液SP-A+10% (體積分?jǐn)?shù)）洗 脫緩沖液SP-B的混合液(其中化C1的含量為0. 1M)W 80±20mL/min的流速對(duì)層析柱沖洗 3個(gè)柱體積，W去除與填料吸附不緊密的大部分核酸和菌體雜蛋白。
[00的](3)洗脫；用25% (體積分?jǐn)?shù)）平衡緩沖液SP-A巧5% (體積分?jǐn)?shù)）洗脫緩沖液SP-B 的混合液(其中化C1的含量為0. 75M)進(jìn)行一步洗脫，流速80 + 20血/min,洗脫體積是化， 紫外檢測(cè)起峰時(shí)開(kāi)始收集，待檢測(cè)峰回落至基線(xiàn)附近時(shí)停止收集（圖2所示洗脫峰E)。
[0083] W上所述變性蛋白的陽(yáng)離子交換層析純化所得圖譜（圖2)中的兩個(gè)峰，D峰為上 樣及洗柱時(shí)的紫外吸收峰，主要組分為菌體核酸；E峰為rhBMP-2變性蛋白洗脫峰。
[0084] 進(jìn)一步將經(jīng)上述洗脫獲得的檢測(cè)峰（圖2所示洗脫峰E)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳 分析，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)該步驟的純化后，rhBMP-2單體的純度達(dá)94%。另外，采用實(shí)施例 2步驟五所述方法檢測(cè)外源DNA殘為lOng/250 y g W下。
[00財(cái) S、蛋白復(fù)性
[0086] 包涵體復(fù)性液；0. Imol/L Tris-HCl，0. 5mol/L 尿素，0. lmol/L2-環(huán)己氨基己 賴(lài)酸（C肥S)，0. 2mol/L精氨酸，0. 5mmol/L氧化型谷脫甘膚，Immol/L還原型谷脫甘膚， pH8. 5-9. 0。
[0087] 采用一步直接稀釋法復(fù)性，首先向待復(fù)性蛋白（步驟二2中收集得到的洗脫峰樣 品）加入9倍體積的包涵體復(fù)性液對(duì)其進(jìn)行十倍稀釋?zhuān)缓笾糜诤銣負(fù)u床上振蕩，設(shè)定溫度 4°C、轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘(所用搖床為上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)的ZWY-211B型號(hào) 搖床)，進(jìn)行復(fù)性4天。
[0088] 復(fù)性結(jié)束后，按下述公式進(jìn)行蛋白復(fù)性率的計(jì)算：
[0089] 復(fù)性率=復(fù)性后riiBMP-2二聚體純度X復(fù)性后蛋白濃度/復(fù)性前蛋白濃度，其中 復(fù)性后rhBMP-2二聚體純度通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，SDS電泳結(jié)果如圖5所示，rhBMP-2二 聚體的純度為55%，復(fù)性后蛋白濃度通過(guò)lowrry法測(cè)得為0. 19mg/mU復(fù)性前蛋白濃度通過(guò) lowrry法測(cè)得為0. 20mg/mL。計(jì)算得到rhBMP-2蛋白復(fù)性率達(dá)52. 2%。
[0090] 四、復(fù)性后純化
[0091] 1、復(fù)性蛋白的肝素親和層析純化
[0092] 層析介質(zhì)：化parin Se地arose Fast Flow (GE 公司，17-0998-03)。
[009引平衡緩沖液HF-A ;50mmol/L Tris-HCl，3mol/L尿素；p服.5。各濃度為相應(yīng)組分在 溶解液中的終濃度。
[0094] 洗脫緩沖液為 HF-B ;50mmol/L Tris-肥l，3mol/L尿素，Imol/L 化C1 ;p服.5。各濃 度為相應(yīng)組分在溶解液中的終濃度。
[0095] 對(duì)步驟H得到的蛋白復(fù)性液進(jìn)行肝素親和層析，親和層析柱裝填規(guī)格：柱床體積 50mL，柱內(nèi)徑26mm。具體操作如下：
[0096] (1)柱平衡；用平衡緩沖液HF-A W 10 + 2血/min的流速平衡層析柱，平衡至流出 液的基線(xiàn)平穩(wěn)。
[0097] (2)上樣及洗柱；將步驟H得到的蛋白復(fù)性液直接上樣，上樣量為1000 + 100血， 然后用平衡緩沖液HF-A W l〇±2mL/min的流速對(duì)層析柱沖洗2個(gè)柱體積，W去除與上樣時(shí) 殘留層析柱中的尿素及復(fù)性液中的小分子試劑。
[009引（3)洗脫；用平衡緩沖液HF-A和洗脫緩沖液HF-B的混合液進(jìn)行化C1線(xiàn)性洗脫， 共洗脫10個(gè)柱體積，在10個(gè)柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液HF-B在混合液中的體積含量由40%線(xiàn) 性變化至70%，即化C1在洗脫液中的濃度由0. 4M線(xiàn)性升至0. 7M，洗脫時(shí)的流速為10 ± 2mL/ min。當(dāng)化Cl在洗脫液中的濃度線(xiàn)性增至0. 45M時(shí)，紫外檢測(cè)的第二個(gè)洗脫峰開(kāi)始起峰，此 時(shí)收集洗脫峰，至檢測(cè)峰回落至基線(xiàn)附近時(shí)停止收集（圖4所示洗脫峰63)。
[0099] W上所述復(fù)性蛋白的肝素親和層析純化所得圖譜（圖4)中的3個(gè)峰，el峰為上樣 及洗柱時(shí)的紫外吸收峰，主要組分為小分子鹽分；e2峰為用線(xiàn)性洗脫的第一個(gè)紫外吸收 峰，主要組分為rhBMP-2單體分子；e3峰為rhBMP-2二聚體洗脫峰。
[0100] 進(jìn)一步將經(jīng)上述洗脫獲得的第二個(gè)洗脫峰（圖4所示洗脫峰e(cuò)3)樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖5所示，經(jīng)該步驟的純化后，rhBMP-2二聚體(復(fù)性前是沒(méi)有活 性的單體，復(fù)性后單體聚合為具有生物活性的二聚體）的純度達(dá)95%。
[0101] 2、復(fù)性蛋白的凝膠過(guò)濾層析純化
[0102] 層析介質(zhì)；S巧hac巧 1 S-100 (GE 公司，17-0612-05)。
[0103] 洗脫緩沖液；20mmol/L磯酸二氨軸，0. 15mol/L氯化軸，P冊(cè).5。各濃度為相應(yīng)組分 在溶解液中的終濃度。
[0104] 對(duì)步驟1收集的洗脫峰樣品進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析純化，層析柱裝填規(guī)格；柱床體積 450mL，柱內(nèi)徑26mm。具體操作如下：
[010引（1)柱平衡；用洗脫緩沖液W 2. 5 + 0. 5血/min的流速平衡層析柱，平衡至流出液 的基線(xiàn)平穩(wěn)。
[0106] (2)上樣；將步驟1收集的洗脫峰樣品直接上樣，上樣量為15血。
[0107] (3)洗脫；用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫體積900mL，洗脫時(shí)的流速為2. 5 + 0. 5mL/ min。紫外檢測(cè)起峰時(shí)繼續(xù)沖洗排廢20mL，W去除與分子量較大的多聚體雜質(zhì)，然后開(kāi)始收 集洗脫峰，待檢測(cè)峰回落至基線(xiàn)附近時(shí)停止收集（圖6所示洗脫峰E1)，得到純化后且具有 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)活性的rhBMP-2原液。
[0108] W上所述復(fù)性蛋白的凝膠過(guò)濾層析圖譜（圖6)中，共有2個(gè)峰。其中，E1峰為目 標(biāo)洗脫蛋白峰，E2峰為鹽峰（電導(dǎo)峰)。
[0109] 實(shí)施例2、實(shí)施例1所得蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)
[0110] 一、蛋白純度的檢測(cè)
[0111] 參考2010年《中國(guó)藥典》第H部附錄IV C，采用非還原型SDS-聚丙帰醜胺凝膠電 泳法對(duì)實(shí)施例1所得蛋白原液進(jìn)行純度檢測(cè)，分離膠濃度為15%，加樣量不低于10 y g (考 馬斯亮藍(lán)R250染色法)。
[0112] 結(jié)果顯示；經(jīng)掃描儀掃描，實(shí)施例1最終收集的洗脫峰中rhBMP-2二聚體的純度為 98. 3%。如圖7所示。
[0113] 二、蛋白收率的測(cè)算
[0114] 參考2010年《中國(guó)藥典》第H部附錄VI B，采用lownr法測(cè)得實(shí)施例1所得蛋白 原液的蛋白濃度為0. 75mg/mU且每克包涵體通過(guò)實(shí)施例1純化方法可得到rhBMP-2原液 126mU根據(jù)公式蛋白收率=rhBMP-2原液蛋白濃度*蛋白原液體積/包涵體質(zhì)量，可計(jì)算得 到采用實(shí)施例1的方法的蛋白收率為9. 4%，整個(gè)生產(chǎn)工藝的蛋白收率較高，適于工業(yè)化放 大生產(chǎn)。
[0115] H、蛋白生物學(xué)活性測(cè)定
[0116] 采用小鼠成肌細(xì)胞C2C12(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，GNM26)堿性 磯酸酶法測(cè)定實(shí)施例1最終收集的洗脫峰中rhBMP-2的生物學(xué)活性，原理如下；經(jīng)rhBMP-2 刺激，小鼠成肌細(xì)胞C2C12內(nèi)的堿性磯酸酶活性會(huì)增強(qiáng)，且riiBMP-2濃度越高，小鼠成肌細(xì) 胞C2C12內(nèi)的堿性磯酸酶活性越強(qiáng)。具體方法如下：將小鼠成肌細(xì)胞C2C12接種到含10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)1 X 105個(gè)/mL時(shí)，移走培 養(yǎng)基，加入含有不同濃度的rhBMP-2標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)sigma-al化ich公司，B3555)的DMEM培 養(yǎng)基培養(yǎng)，并將未添加標(biāo)準(zhǔn)品的空白DMEM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。
[0117] 細(xì)胞培養(yǎng)6天后采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，然后采用堿性磯酸酶檢測(cè)試劑盒測(cè) 定堿性磯酸酶活性，所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)sigma-al化ich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)AP0100-化T。 rhBMP-2生物活性（U/mg)計(jì)算公式為；生物活性=樣品堿性磯酸酶活性/蛋白含量，其中樣 品蛋白含量由lowrry法測(cè)得，活性單位（U)的定義參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō) 明書(shū)操作，測(cè)得rhBMP-2標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性為502U/mg，實(shí)施例1制備的riiBMP-2原液生物 活性為514U/mg，兩者數(shù)值相當(dāng)，表明本發(fā)明所生產(chǎn)的rhBMP-2生物活性良好。
[011引四、內(nèi)毒素殘留測(cè)定
[0119] 參考2010年《中國(guó)藥典》第H部附錄W E凝膠限量試驗(yàn)所述方法，對(duì)實(shí)施例1制 備的rhBMP-2產(chǎn)品的內(nèi)毒素殘留量進(jìn)行測(cè)定。
[0120] 結(jié)果顯示，實(shí)施例1制備得到的rhBMP-2原液的內(nèi)毒素殘留量<10EU/250y g，符合 常見(jiàn)生物藥物的質(zhì)量要求。
[0121] 五、菌體DNA殘留測(cè)定
[0122] 采用DNA探針雜交法測(cè)定菌體DNA殘留量，供試品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈 后吸附于固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA，稱(chēng) 為雜交。將特異性單鏈DNA探針標(biāo)記后，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用 與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽(yáng)性DNA對(duì)照比對(duì)后，可測(cè)定供試 品中外源性DNA的含量。用于探針標(biāo)記和陽(yáng)性對(duì)照的DNA，由本發(fā)明所用工程菌提取純化 獲得，提取方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社， 2002);探針的標(biāo)記及顯色反應(yīng)按DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自研域 (上海）化學(xué)試劑有限公司公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為90603-5。
[0123] 結(jié)果顯示，實(shí)施例1制備得到的rhBMP-2原液的菌體DNA殘留量為0.化g/250 y g， 符合常見(jiàn)生物藥物的質(zhì)量要求。
[0124] 對(duì)比例1、復(fù)性后蛋白的疏水作用層析
[0125] 本發(fā)明的發(fā)明人在進(jìn)行重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化過(guò)程中，按照實(shí)施例1的 方法進(jìn)行操作，在進(jìn)行完實(shí)施例1的步驟H (完成蛋白復(fù)性)后，還采用了疏水作用層析替代 了步驟四的親和層析和凝膠過(guò)濾層析，結(jié)果顯示，疏水作用層析不適于重組人骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-2的純化。具體如下：
[0126] 一、包涵體的溶解
[0127] 同實(shí)施例1。
[012引二、復(fù)性前純化
[0129] 同實(shí)施例1。
[0130] S、蛋白復(fù)性
[0131] 同實(shí)施例1。
[0132] 四、復(fù)性后純化一疏水作用層析
[0133] 層析介質(zhì)；Phenyl Se地arose Fast Flow (GE 公司，17-0965-03)。
[0134] 平衡緩沖液PF-A ;15mmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L尿素；25mM環(huán)己氨己焼賴(lài)酸 (C肥S)，lmol/L化Cl，5% (v/v)N，N-二甲基甲醜胺，p服.5。各濃度為相應(yīng)組分在溶解液 中的終濃度。
[013引洗脫緩沖液為PF-B ;15mmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L尿素；25mM環(huán)己氨己焼賴(lài)酸 (CHES)，5% (v/v) N，N-二甲基甲醜胺，P服.5。各濃度為相應(yīng)組分在溶解液中的終濃度。
[0136] 對(duì)步驟H得到的蛋白復(fù)性液進(jìn)行疏水作用層析，親和層析柱裝填規(guī)格：柱床體積 50mL，柱內(nèi)徑26mm。具體操作如下：
[0137] (1)柱平衡；用平衡緩沖液PF-A W 10±2血/min的流速對(duì)層析柱平衡，平衡至流 出液的基線(xiàn)平穩(wěn)。
[0138] (2)上樣及洗柱；將實(shí)施例1步驟H得到的蛋白復(fù)性液直接上樣，上樣量為 100±10111以然后用平衡緩沖液？。-4^10±211117111111的流速對(duì)層析柱沖洗2個(gè)柱體積，^去 除與上樣時(shí)殘留層析柱中的尿素及復(fù)性液中的小分子試劑。
[0139] (3)洗脫；用平衡緩沖液PF-A和洗脫緩沖液PF-B的混合液進(jìn)行化C1線(xiàn)性洗脫， 在10個(gè)柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液PF-B在混合液中的體積含量由0%線(xiàn)性變化至100%，即化C1 在洗脫液中的濃度由1M線(xiàn)性升至0M，洗脫時(shí)的流速為10±2mL/min。
[0140] 結(jié)果顯示，層析圖譜沒(méi)有洗脫出蛋白峰（圖8所示親和層析圖譜)，推測(cè)蛋白與填料 結(jié)合過(guò)于緊密，故采用30%(巾八)異丙醇水溶液^1〇11117111111的流速洗脫10〇111以但仍未有洗 脫峰，故進(jìn)一步推測(cè)蛋白沉淀在柱子上，采用0. 5M化0H W 3mL/min的流速洗柱lOOmL，從而 得到一個(gè)洗脫峰，收集該洗脫峰采用SDS-PAGE電泳分析，電泳結(jié)果如圖9所示，顯示樣品中 含有大量多聚體，表明樣品上樣時(shí)產(chǎn)生了蛋白聚集，并沉淀在填料上，故疏水作用層析柱不 適于本技術(shù)所述riiBMP-2的純化。
[0141] 對(duì)比例2、不經(jīng)預(yù)純化直接稀釋復(fù)性
[0142] 本發(fā)明的發(fā)明人在進(jìn)行重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化過(guò)程中，按照實(shí)施例1的 方法進(jìn)行操作，在進(jìn)行完實(shí)施例1的步驟一(包涵體的溶解)后，還進(jìn)行了不經(jīng)層析純化直接 稀釋復(fù)性的對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果顯示，直接稀釋復(fù)性會(huì)產(chǎn)生大量蛋白沉淀，復(fù)性率極低，不適于 本發(fā)明中重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的復(fù)性。具體如下：
[0143] 一、包涵體的溶解
[0144] 同實(shí)施例1。
[0145] 二、蛋白復(fù)性
[0146] 包涵體溶解液與包涵體復(fù)性液同實(shí)施例1。
[0147] 采用一步直接稀釋法復(fù)性，首先向待復(fù)性蛋白（步驟一中收集得到的包涵體裂解 液）加入9倍體積的包涵體復(fù)性液對(duì)其進(jìn)行十倍稀釋?zhuān)缓笾糜诤銣負(fù)u床上振蕩，設(shè)定溫度 4°C、轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘(所用搖床為上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)的ZWY-211B型號(hào) 搖床)，進(jìn)行復(fù)性4天。復(fù)性后液體出現(xiàn)大量蛋白沉淀，將其離也后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電 泳分析，SDS電泳結(jié)果如圖5中的泳道2所示，riiBMP-2二聚體的純度為28%。
[014引然后按下述公式進(jìn)行蛋白復(fù)性率的計(jì)算：
[0149] 復(fù)性率=復(fù)性后riiBMP-2二聚體純度X復(fù)性后蛋白濃度/復(fù)性前蛋白濃度，其中 復(fù)性后riiBMP-2二聚體純度為28%，復(fù)性后蛋白濃度通過(guò)lownr法測(cè)得為0. 03mg/mU復(fù)性 前蛋白濃度通過(guò)lowiry法測(cè)得為0. 20mg/mL。計(jì)算得到rhBMP-2蛋白復(fù)性率為4. 2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn) 低于本發(fā)明所述復(fù)性工藝的復(fù)性率52. 2%。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的純化生產(chǎn)方法，包括如下步驟： 1) 裂解含有重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的包涵體，得到包涵體裂解液； 2) 按照如下al)和a2)的步驟對(duì)所述包涵體裂解液進(jìn)行分離純化，得到變性重組人骨 形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液： al)將所述包涵體裂解液進(jìn)行親和層析，收集洗脫峰；所述親和層析中所采用的配基為 肝素，所采用的洗脫程序?yàn)镹aCl-步洗脫；所述收集洗脫峰為收集進(jìn)行所述NaCl -步洗脫 過(guò)程中所產(chǎn)生的洗脫峰； a2)將從步驟al)中收集的洗脫峰進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，收集洗脫峰，即為所述變性重 組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液；所述陽(yáng)離子交換層析中所采用的陽(yáng)離子交換基團(tuán)是SP，所采 用的洗脫程序?yàn)镹aCl -步洗脫；所述收集洗脫峰為收集進(jìn)行所述NaCl -步洗脫過(guò)程中所 產(chǎn)生的洗脫峰； 3) 對(duì)步驟2)中得到的變性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性重組人 骨形態(tài)發(fā)生蛋白_2粗品溶液； 4) 按照如下bl)和b2)的步驟，對(duì)步驟3)中得到的復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2粗 品溶液進(jìn)行分離純化，得到復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2純品溶液： bl)將步驟3)中得到的復(fù)性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2粗品進(jìn)行親和層析，收集洗脫 峰；所述親和層析中所采用的配基為肝素，所采用的洗脫程序?yàn)镹aCl線(xiàn)性洗脫；所述洗脫 峰為NaCl在洗脫液中的濃度線(xiàn)性增至0. 45M時(shí)開(kāi)始起峰的紫外吸收峰； b2)將從步驟bl)中收集的洗脫峰進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，收集洗脫峰，即為所述復(fù)性重組 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2純品溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟al)中，進(jìn)行所述NaCl-步洗脫所用 的洗脫液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：NaC10. 35mol/L，Tris-HC150mm〇l/L，尿素8mol/ L;pH 值為 8. 5 ; 步驟a2)中，進(jìn)行所述NaCl -步洗脫所用的洗脫液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為 NaClO. 75mol/L，憐酸二氧納 50mmol/L，尿素 8mol/L ;pH 值為 5. 5 ; 步驟bl)中，進(jìn)行所述NaCl線(xiàn)性洗脫所用的洗脫液的pH值為8. 5,溶質(zhì)為NaCl，溶劑 由終濃度為50mmol/L的Tris-HCl，以及終濃度為3mol/L的尿素和水組成；所述線(xiàn)性洗脫 的體積為10個(gè)層析柱柱體積；在進(jìn)行的所述10個(gè)層析柱柱體積洗脫過(guò)程中，NaCl在所述 洗脫液中的濃度由〇. 4M線(xiàn)性升至0. 7M ; 步驟b2)中，所述凝膠過(guò)濾層析中所采用的層析介質(zhì)的分離范圍包括所述重組人骨形 態(tài)發(fā)生蛋白-2的分子量大小。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟al)中所述親和層析的介質(zhì)載 體為Sepharose ;步驟a2)中所述陽(yáng)離子交換層析的介質(zhì)載體為Sepharose ;步驟bl)中所 述親和層析的介質(zhì)載體為Sepharose ;步驟b2)中所述凝膠過(guò)濾層析的介質(zhì)為Sephacryl S-100。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟3)中，所述對(duì)步驟2)中得到 的變性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液進(jìn)行復(fù)性，采用的復(fù)性液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度 如下：0? 05-0. 2mol/L Tris-HCl，0. 5-2. Omol/L 尿素，0? 05-0. lmol/L2-環(huán)己氨基乙磺酸， 0. 2-0. 5mol/L精氨酸，0. 1-1. 0mmol/L氧化型谷胱甘肽，1. 0-10mmol/L還原型谷胱甘肽， pH8. 5-9. 0〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步驟3)中，所述對(duì)步驟2)中得 到的變性重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液進(jìn)行復(fù)性，具體為如下：向步驟2)中得到的變性重 組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶液加入9倍體積的所述復(fù)性液對(duì)其進(jìn)行十倍稀釋?zhuān)?-10°C震蕩 培養(yǎng)4-7天，完成蛋白復(fù)性； 所述震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速具體為120-180轉(zhuǎn)/分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步驟b2)中，所述收集洗脫峰是 用如下溶液洗脫得到的20mmol/L磷酸二氫鈉，0. 15mol/L氯化鈉，pH5. 5。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步驟al)中，進(jìn)行所述NaCl - 步洗脫前還包括如下步驟：用緩沖液H-AB對(duì)上樣后的所述步驟1)中得到的包涵體裂解 液進(jìn)行洗滌，洗3個(gè)親和層析柱柱體積；所述緩沖液H-AB的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下： Tris-HC150mmol/L，尿素 8mol/L，NaClO. lmol/L ;pH8. 5 ; 步驟a2)中，進(jìn)行所述NaCl -步洗脫前還包括如下步驟：用緩沖液SP-AB對(duì)上樣后的 所述從步驟al)中收集的洗脫峰樣品進(jìn)行洗滌，洗3個(gè)陽(yáng)離子交換層析柱柱體積；所述緩沖 液SP-AB的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：磷酸二氫鈉50mmol/L，尿素8mol/L，NaC10. lmol/L ; pH5. 5 ； 步驟bl)中，進(jìn)行所述NaCl線(xiàn)性洗脫前還包括如下步驟：用平衡緩沖液為HF-A對(duì)上樣 后的所述步驟3)中得到的復(fù)性的所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2進(jìn)行洗滌，洗2個(gè)親和層 析柱柱體積；所述平衡緩沖液HF-A的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：Tris-HC150mm〇l/L，尿素 3mol/L ;pH8. 5〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
9. 蛋白復(fù)性液，其特征在于：所述蛋白復(fù)性液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下： 0? 05-0. 2mol/L Tris-HCl，0. 5-2. Omol/L 尿素，0? 05-0. lmol/L2-環(huán)己氨基乙磺酸， 0. 2-0. 5mol/L精氨酸，0. 1-1. 0mmol/L氧化型谷胱甘肽，1. 0-10mmol/L還原型谷胱甘肽， pH8. 5-9. 0〇
10. 權(quán)利要求9所述蛋白復(fù)性液在對(duì)原核表達(dá)得到的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2進(jìn)行復(fù) 性中的應(yīng)用； 所述重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的氨基酸序列具體如序列表中序列1所示。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK104447977SQ201310432794
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】張東剛, 李東升 申請(qǐng)人:煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司