專(zhuān)利名稱(chēng)：注射型藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)的交叉領(lǐng)域，具體涉及注射性藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料及制備方法，該復(fù)合物可用作充填、修復(fù)、替換人體骨組織的材料。
背景技術(shù)：
藻酸是一種海藻膠質(zhì)的酸，藻酸鹽是藻酸的鹽類(lèi)，是無(wú)水D-甘露糖醛酸的聚合體。藻酸鹽在二價(jià)離子如鈣離子存在時(shí)可通過(guò)離子交聯(lián)作用形成開(kāi)放晶格的水凝膠。藻酸鈣凝膠以其良好的生物相容性在組織工程骨(軟骨)、藥物緩釋系統(tǒng)和細(xì)胞三維培養(yǎng)等方面得到了廣泛應(yīng)用。藻酸鹽擁有良好的生物相容性，是較理想的組織工程支架材料。有學(xué)者利用藻酸鹽制作微囊，并通過(guò)研究微囊對(duì)不同細(xì)胞的生存和蛋白質(zhì)分泌影響，證明藻酸鈣微囊是理想的細(xì)胞生存和蛋白質(zhì)分泌載體。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenticproteins，BMPs)是唯一一類(lèi)能夠啟動(dòng)成骨分化，并作用于成骨整個(gè)過(guò)程的細(xì)胞因子。BMP-2是第一個(gè)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明具有骨誘導(dǎo)活性的BMP分子，并且可作為誘導(dǎo)骨形成的充分條件，即在只有單獨(dú)BMP-2存在的情況下即可誘導(dǎo)軟骨和骨組織的形成，并作用于成骨的全過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供注射型藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)復(fù)合材料，該復(fù)合材料由藻酸鈣和骨形態(tài)發(fā)生蛋白組成，復(fù)合的BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)為人基因重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human BMP-2，rhBMP-2)，每10ml復(fù)合材料中rhBMP-2的含量為0.1mg，為凝珠狀。復(fù)合材料制劑形式為注射劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)分析純低粘度藻酸鈉購(gòu)于Sigama公司，rhBMP-2購(gòu)于華東制藥集團(tuán)基因研究所。藻酸鈉溶于含有0.15M NaCl的溶液中，使藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2％，磁力攪拌機(jī)攪拌，PH值調(diào)為7.4，高壓蒸汽滅菌備用。1.2％的藻酸鈉溶液10ml加入rhBMP-2 0.1mg，混合均勻后緩慢滴入40ml 102mM CaCl2溶液中，交聯(lián)形成凝珠，吸去CaCl2溶液，即制得藻酸鈣/BMP復(fù)合材料。
本發(fā)明的有益之處是(1)藻酸鈣微囊是理想的細(xì)胞生存和蛋白質(zhì)分泌載體。藻酸是一種海藻膠質(zhì)的酸，藻酸鹽是藻酸的鹽類(lèi)，是無(wú)水D-甘露糖醛酸的聚合體。藻酸鹽在二價(jià)離子如鈣離子存在時(shí)可通過(guò)離子交聯(lián)作用形成開(kāi)放晶格的水凝膠。藻酸鈣凝膠以其良好的生物相容性在組織工程骨(軟骨)、藥物緩釋系統(tǒng)和細(xì)胞三維培養(yǎng)等方面得到了廣泛應(yīng)用。藻酸鹽擁有良好的生物相容性，是較理想的組織工程支架材料。有學(xué)者利用藻酸鹽制作微囊，并通過(guò)研究微囊對(duì)不同細(xì)胞的生存和蛋白質(zhì)分泌影響，證明藻酸鈣微囊是理想的細(xì)胞生存和蛋白質(zhì)分泌載體。
(2)BMP-2是誘導(dǎo)骨形成的充分條件。在眾多的骨生長(zhǎng)因子中，BMP-2是最穩(wěn)定的局部誘導(dǎo)骨形成的生長(zhǎng)因子，其高效誘導(dǎo)成骨活性已經(jīng)被許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，但單純的BMP在體內(nèi)擴(kuò)散太快，也易被蛋白酶分解，在有效的時(shí)間內(nèi)不能作用于更多的靶細(xì)胞，其誘導(dǎo)活性難以充分發(fā)揮；另外，對(duì)于較大的骨缺損，BMP不能發(fā)揮支架作用，因此在獲得高活性和純度的BMP后，須選用合適的生物材料為載體，使其免受蛋白水解。本發(fā)明采用藻酸鈣作為rhBMP-2的載體，取得良好的成骨效果。
(3)成骨方式和過(guò)程簡(jiǎn)易。材料支架+生長(zhǎng)因子的成骨方式和材料支架+成骨細(xì)胞+生長(zhǎng)因子的方式同樣可以構(gòu)建新生骨組織。從臨床實(shí)用的層面來(lái)看，成骨方式和過(guò)程的簡(jiǎn)易具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)點(diǎn)。采用注射的方式，藻酸鈣/BMP-2復(fù)合材料即可以簡(jiǎn)易有效地形成一定體積的新生骨組織。應(yīng)用骨骼肌異位誘導(dǎo)成骨原理，該復(fù)合材料在成骨過(guò)程中無(wú)需加入外源性的種子細(xì)胞。
(4)本發(fā)明制備的注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料，可以簡(jiǎn)易有效地形成一定體積的新生骨組織，不僅具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性，且具有良好生物相容性和可降解性，可用于充填、修復(fù)、替換人體骨組織。


圖1為復(fù)合材料間隙的種子細(xì)胞(HE，40×)。
圖2為復(fù)合材料間隙的種子細(xì)胞可見(jiàn)核分裂相(透射電鏡，2000×)。
圖3為復(fù)合材料組4周時(shí)的大體標(biāo)本。
圖4為復(fù)合材料組4周時(shí)的組織學(xué)照片(HE，40×)。
圖5為復(fù)合材料組6周時(shí)的大體標(biāo)本。
圖6為復(fù)合材料組6周時(shí)的組織學(xué)照片(HE，40×)。
圖7為復(fù)合材料/BMSC組4周時(shí)的大體標(biāo)本。
圖8為空復(fù)合材料/BMSC組4周時(shí)的組織學(xué)照片(HE，40×)。
圖9為復(fù)合材料/BMSC組6周時(shí)的大體標(biāo)本。
圖10為復(fù)合材料/BMSC組6周時(shí)的組織學(xué)照片(HE，40×)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料的制備分析純低粘度藻酸鈉購(gòu)于Sigama公司，rhBMP-2購(gòu)于華東制藥集團(tuán)基因研究所。藻酸鈉溶于含有0.15M NaCl的溶液中，使藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2％，磁力攪拌機(jī)攪拌，PH值調(diào)為7.4，高壓蒸汽滅菌備用。1.2％的藻酸鈉溶液10ml加入rhBMP-2 0.1mg，混合均勻后緩慢滴入40ml 102mM CaCl2溶液中，交聯(lián)形成凝珠，吸去CaCl2溶液，即制得藻酸鈣/BMP復(fù)合材料。
實(shí)施例二含有骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料的制備將新西蘭白兔以速眠新(0.1ml/kg)肌注麻醉，以肝素抗凝處理過(guò)的16號(hào)穿刺針于兔股骨第三轉(zhuǎn)子下抽取骨髓1～2ml，置于含10mlα-MEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)的離心管中，2000轉(zhuǎn)/min離心，去除脂肪成分后接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，第5日首次全量換液，以后隔日換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％匯合時(shí)，用0.1％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化(37℃、3～5min)，按1∶3傳代培養(yǎng)，收集第二代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
第二代骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell，BMSC)消化后，1000轉(zhuǎn)/min離心10min濃集，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后加入預(yù)先制備好的1.2％藻酸鈉溶液使細(xì)胞密度為4.0×106/ml，吸入10ml注射器中，加入1.0mg rhBMP-2混合均勻。再將此混合溶液緩慢滴入40ml的102mM CaCl2溶液中，立即交聯(lián)形成凝珠，室溫下反應(yīng)10min以達(dá)到最佳交聯(lián)效果。吸出CaCl2溶液，用0.15M NaCl溶液反復(fù)沖洗4次，α-MEM完全培養(yǎng)液沖洗1次，既得復(fù)合材料/BMSC的混合物。將凝珠移入培養(yǎng)皿中，加入α-MEM完全培養(yǎng)液，37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每三天換液一次，共計(jì)4周。
4周時(shí)擠破凝珠行臺(tái)盼藍(lán)染色，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞活力。另取藻酸鈣凝珠置于2％戊二醛固定液中前固定，1％鋨酸固定液后固定，醇逐級(jí)脫水，618包埋液包埋，超薄切片，透射電鏡下觀(guān)察。
觀(guān)察結(jié)果藻酸鈣凝珠復(fù)合細(xì)胞后呈淡黃色，置入培養(yǎng)液后立即變?yōu)榈t色。4周時(shí)將復(fù)合BMSC的藻酸鈣凝珠取出，大體觀(guān)可見(jiàn)凝珠體積增大，但仍能保持良好形態(tài)。外力將凝珠擠破后可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)流出，用0.02％臺(tái)盼藍(lán)染色此細(xì)胞團(tuán)，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞為圓形，大小不一，部分細(xì)胞呈團(tuán)狀分布，胞核清楚，個(gè)別為雙核細(xì)胞，幾乎無(wú)藍(lán)染細(xì)胞。
HE染色顯示，細(xì)胞均勻分布于材料交聯(lián)形成的間隙(參見(jiàn)圖1)。甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞均勻著色，大小不一，核大漿少，個(gè)別為雙核或多核細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞分裂相，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、輪廓清楚，周?chē)猩倭康漠惾拘苑磻?yīng)。透射電鏡觀(guān)察顯示細(xì)胞呈圓形或橢圓形，有不規(guī)則突起及微絨毛存在，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，無(wú)線(xiàn)粒體腫大及核糖體脫顆?，F(xiàn)象發(fā)生；胞核完整，形態(tài)幼稚且較大，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，可見(jiàn)雙核；胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體發(fā)達(dá)，可見(jiàn)較多的無(wú)界膜空泡，空泡邊緣可見(jiàn)高電子密度小顆粒；細(xì)胞質(zhì)分布均勻，內(nèi)含大量形狀類(lèi)似次級(jí)溶酶體的顆粒狀包涵體，有些細(xì)胞內(nèi)有大的脂質(zhì)包涵體或含強(qiáng)異染性物質(zhì)的囊泡(參見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例三肌袋試驗(yàn)新西蘭白兔14只，4～6周齡，體重2.0～2.5KG，雌雄不限。隨機(jī)分成兩組，注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料組(簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)合材料組)6只，含有BMSC注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料組(簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)合材料/BMSC組)8只。復(fù)合材料組共制作6份，復(fù)合材料/BMSC組共制備8份，制備方法分別見(jiàn)實(shí)施例一和二。
6份單純復(fù)合材料分成共分成12小份，每份5ml；每份復(fù)合材料/BMSC混合物(共8份)分別均勻分成兩份，每份5m1，分別用于相應(yīng)白兔的注射(即各白兔注射的BMSC均來(lái)源于自體)。各新西蘭白兔分別以速眠新麻醉后，在雙側(cè)下肢股四頭肌肌袋中置入。4W進(jìn)行X線(xiàn)檢查，2、4、6周取材后標(biāo)本進(jìn)行ALP染色(鈣鈷法)和Von Kossa染色，分別觀(guān)察成骨細(xì)胞活性和鈣沉著情況。各標(biāo)本均以10％中性醛固定，HE染色，切片，進(jìn)行組織學(xué)觀(guān)察。對(duì)兩組織學(xué)切片以O(shè)lympus HA-2CCD讀取圖像，平均選定4-6視野/張，采用Leica Qwin(Ver1.0)骨形態(tài)分析軟件進(jìn)行新骨面積計(jì)量，并以SPSS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析兩組標(biāo)本新生骨面積的差異。
1.ALP染色、Von kossa染色和X線(xiàn)檢查ALP染色單純復(fù)合材料組和復(fù)合材料/BMSC組在2周時(shí)，均呈現(xiàn)環(huán)形黑染(++～+++)，表明細(xì)胞均有成骨活性。
Von kossa染色單純復(fù)合材料組和復(fù)合材料/BMSC組在4周時(shí)，均呈現(xiàn)棕黑染色(++～+++)，表明標(biāo)本鈣鹽沉著礦化。
X線(xiàn)檢查單純復(fù)合材料組和復(fù)合材料/BMSC組在4周時(shí)均顯示股四頭肌內(nèi)形成高密度骨組織陰影，提示鈣化的骨組織。
2.大體檢查和HE染色單純復(fù)合材料組2周時(shí)，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)材料開(kāi)始降解，可見(jiàn)軟骨、類(lèi)骨質(zhì)及少量的新生編織骨形成，其表面見(jiàn)大量成纖維樣細(xì)胞貼附；4周時(shí)，標(biāo)本大體觀(guān)見(jiàn)部分表面呈軟骨形態(tài)，體積與植入材料相當(dāng)(參見(jiàn)圖3)，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)材料進(jìn)一步降解，大量編織骨形成，細(xì)胞數(shù)量明顯減少(參見(jiàn)圖4)；6周時(shí)，大體觀(guān)見(jiàn)標(biāo)本體積輕微縮小，表面軟骨形態(tài)不明顯(參見(jiàn)圖5)，HE染色見(jiàn)新生編織骨數(shù)量未見(jiàn)顯著增加，但骨陷窩增多，材料吸收較多，但仍未完全吸收(參見(jiàn)圖6)。
復(fù)合材料/BMSC組2周時(shí)，亦可見(jiàn)材料開(kāi)始降解，可見(jiàn)軟骨、類(lèi)骨質(zhì)及少量的新生編織骨形成，其表面細(xì)胞數(shù)目少于單純復(fù)合材料組；4周時(shí)標(biāo)本大體觀(guān)見(jiàn)部分表面呈軟骨形態(tài)，體積與植入材料相當(dāng)(參見(jiàn)圖7)，組織學(xué)觀(guān)察見(jiàn)編織骨大量形成(參見(jiàn)圖8)；6周時(shí)大體觀(guān)見(jiàn)標(biāo)本體積輕微縮小，表面軟骨形態(tài)不明顯(參見(jiàn)圖9)，新生骨數(shù)量也未見(jiàn)顯著增多，材料仍未完全吸收(參見(jiàn)圖10)。
3.新生骨計(jì)量對(duì)單純復(fù)合材料組和復(fù)合材料/BMSC組6周的標(biāo)本進(jìn)行新生骨面積計(jì)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表1，表明兩組標(biāo)本在新生骨數(shù)量上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。
表1兩組材料新生骨計(jì)量(x±s)

成骨量p＝0.9權(quán)利要求
1.一種注射型藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料，其特征是復(fù)合材料由藻酸鈣和骨形態(tài)發(fā)生蛋白組成，復(fù)合的骨形態(tài)發(fā)生蛋白為人基因重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，每10ml復(fù)合材料中人基因重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的含量為0.1mg，復(fù)合材料為凝珠狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射型藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料，其特征是復(fù)合材料的制劑形式為注射型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的注射型藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料的制備方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)將藻酸鈉溶于含有0.15M NaCl的溶液中，使藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2％，磁力攪拌機(jī)攪拌，PH值調(diào)為7.4，高壓蒸汽滅菌備用，將10ml 1.2％的藻酸鈉溶液加入0.1mg的人基因重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，混合均勻后緩慢滴入40ml 102mM CaCl2溶液中，交聯(lián)形成凝珠，吸去CaCl2溶液，即制得藻酸鈣/骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合材料。
全文摘要
本發(fā)明提供一種注射型藻酸鈣/BMP復(fù)合材料，復(fù)合的BMP為rhBMP－2，每10ml復(fù)合材料中rhBMP－2的含量為0.1mg。該復(fù)合材料為凝珠狀、可注射型。通過(guò)將藻酸鈉溶于含有NaCl的溶液中，攪拌，pH值調(diào)為7.4，滅菌后在藻酸鈉溶液中加入rhBMP－2，混合均勻后緩慢滴入102mM CaCl
文檔編號(hào)A61L27/54GK101036807SQ20071006822
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月24日
發(fā)明者徐靖宏, 談偉強(qiáng), 林軍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)