專利名稱：一種纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織再生支架的制備方法，尤其是纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法。
背景技術(shù)：
軟骨損傷是目前常見(jiàn)的疾病，由于關(guān)節(jié)炎或運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷所造成的關(guān)節(jié)軟骨損傷給許多病人帶來(lái)痛苦。軟骨的代謝活躍而修復(fù)能力有限，沒(méi)有血管，在損傷之后不能形成纖維凝塊，沒(méi)有炎性細(xì)胞遷移進(jìn)入，也沒(méi)有血管未分化細(xì)胞進(jìn)入損傷的部位，所以不易自行進(jìn)行修復(fù)。另外，軟骨本身在損傷部位缺乏未分化的細(xì)胞，損傷之后沒(méi)有軟骨細(xì)胞遷移生長(zhǎng)到損傷的軟骨之中。而且，隨著年齡的增長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞的分裂能力逐漸降低，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的能力也隨之降低。迄今為止，臨床上仍然缺少有效的方法修復(fù)受損的軟骨組織。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)的方法和原理來(lái)進(jìn)行軟骨組織的修復(fù)是目前的一個(gè)重要手段，且取得了良好的效果。其中，軟骨修復(fù)支架在軟骨再生中起著十分重要的作用。
人體的軟骨屬于結(jié)締組織，其中含有少量的軟骨細(xì)胞和大量細(xì)胞間質(zhì)。軟骨細(xì)胞散在于軟骨基質(zhì)內(nèi)的軟骨陷窩內(nèi)，陷窩周圍的基質(zhì)染色較深稱為軟骨囊。幼稚的軟骨細(xì)胞較小，常單個(gè)分布于關(guān)節(jié)軟骨的邊緣區(qū)，呈扁圓形。由邊緣向中央軟骨細(xì)胞的體積逐漸增大，呈橢圓形或圓形，具有較明顯的軟骨囊。幼小的軟骨細(xì)胞可分裂，深部成熟的軟骨細(xì)胞常2～8個(gè)成群分布。軟骨細(xì)胞間質(zhì)的化學(xué)成分主要包括膠原蛋白、蛋白多糖和少量的非膠原蛋白。軟骨組織中的膠原主要為II型膠原，占膠原總量的90％以上。II型膠原纖維在軟骨內(nèi)呈三維網(wǎng)狀分布，為關(guān)節(jié)軟骨提供抗張強(qiáng)度。蛋白多糖通過(guò)連接蛋白以非共價(jià)鍵形式與透明質(zhì)酸結(jié)合形成巨大的蛋白多糖聚合體。蛋白多糖聚合體分子鏈上含有豐富的負(fù)酸根離子，可以結(jié)合大量的水形成水凝膠，為軟骨提供抗壓強(qiáng)度和彈性。水分占軟骨組織全重的75％，其中含有大量正離子以平衡蛋白多糖分子中的負(fù)電荷，并含有許多軟骨細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物。軟骨組織內(nèi)無(wú)血管，但由于軟骨基質(zhì)富含水分，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于滲透，故軟骨細(xì)胞仍能獲得必要的營(yíng)養(yǎng)。
軟骨組織中的其它非膠原蛋白如錨著蛋白、纖維粘連蛋白等通過(guò)與細(xì)胞表面受體和其它大分子之間的相互作用將軟骨細(xì)胞粘連在軟骨基質(zhì)上，并穩(wěn)定軟骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)軟骨基質(zhì)成分和組織結(jié)構(gòu)的不同，軟骨分為透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，它的特點(diǎn)是纖維含量比纖維軟骨和彈性軟骨少，而蛋白多糖水凝膠含量相對(duì)較多，軟骨基質(zhì)為透明狀。成熟的關(guān)節(jié)軟骨根據(jù)其細(xì)胞和基質(zhì)的變化可分為淺表層、中層、深層和鈣化層。其中中層和深層中的蛋白多糖含量較高。
人體內(nèi)的軟骨具有極特殊的力學(xué)性能。例如關(guān)節(jié)軟骨具有很好的彈性和韌性，可承受較大的負(fù)荷，同時(shí)具有光滑的表面，使關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)的摩擦力極小。軟骨組織一旦缺損，將給患者帶來(lái)巨大的痛苦和不便。
在正常軟骨中，成熟的軟骨細(xì)胞四周包圍著由大量膠原和蛋白多糖組成的、高含水高交聯(lián)度的細(xì)胞外基質(zhì)，軟骨細(xì)胞呈球形。然而，當(dāng)軟骨細(xì)胞被培養(yǎng)在聚合物多孔支架上時(shí)，軟骨細(xì)胞呈扁平形粘附在支架孔壁上。以往的研究表明異常的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)于軟骨細(xì)胞的正常分化和表型是不利的。另一方面，軟骨細(xì)胞可以在水凝膠材料中維持正常的球形，同時(shí)維持正常的軟骨細(xì)胞表型。但是水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度普遍不高，在體內(nèi)外培養(yǎng)和植入手術(shù)中，非常容易因受力而破損或碎裂。因此，在軟骨修復(fù)材料的設(shè)計(jì)中，應(yīng)模擬軟骨細(xì)胞的天然生長(zhǎng)環(huán)境，構(gòu)建具有可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞正常生長(zhǎng)和功能表達(dá)的修復(fù)支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以模擬人體天然軟骨的纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法。
本發(fā)明的纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法，包括以下步驟1)將纖維蛋白原粉末溶解于生理鹽水中，配制濃度為10～40mg/ml的纖維蛋白原溶液；將凝血酶溶解于氯化鈣溶液中，配制濃度為1～20U/ml的凝血酶氯化鈣溶液；2)將聚合物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢復(fù)壓力的方法，將乙醇導(dǎo)入到聚合物多孔支架中；將導(dǎo)入乙醇的支架浸入到三蒸水中，反復(fù)進(jìn)行先抽真空，后恢復(fù)壓力的方法，將乙醇置換成水，直至無(wú)乙醇?xì)埩簦?)將等體積的纖維蛋白原溶液和凝血酶的溶液同時(shí)注入到聚合物多孔支架中，將支架置于37℃恒溫烘箱中孵育5～10分鐘，使纖維蛋白原完全凝膠，即獲得纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架。
本發(fā)明中，所說(shuō)的聚合物多孔支架可以是聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚氨酯或膠原多孔支架。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明制備的纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架具有復(fù)合結(jié)構(gòu)特征，其中聚合物多孔支架可以提供一定的力學(xué)強(qiáng)度和軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的空間，而纖維蛋白凝膠是來(lái)源于血液的制品，具有良好的生物相容性和降解性能，其中含有大量的活性因子，具有更好的促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移、增殖及分化性能，加速軟骨組織的修復(fù)。因此，該復(fù)合體系具有很強(qiáng)的修復(fù)組織缺損的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、材料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)效率高。


圖1是纖維蛋白凝膠填充聚乳酸多孔支架的激光共聚焦顯微鏡照片，其中纖維蛋白凝膠用熒光素染色；圖2是不同濃度的纖維蛋白原的凝膠化曲線；圖3是不同濃度的纖維蛋白原填充聚乳酸支架的填充率；圖4是純聚乳酸多孔支架和纖維蛋白凝膠填充支架的力學(xué)性能；圖5是軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充支架中的活性；圖6是軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充聚乳酸支架中的GAG的分泌；圖7是激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充聚乳酸支架中的分布及形態(tài)(一周)，其中細(xì)胞采用熒光素二乙酸酯的方法進(jìn)行染色；圖8是掃描電鏡觀測(cè)軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充聚乳酸支架中的分布及形態(tài)(一周)。
具體實(shí)施方法以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來(lái)限制本發(fā)明。
實(shí)例11)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，于37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，使纖維蛋白原充分溶解，纖維蛋白原溶液的濃度為10mg/ml；將凝血酶溶解于40mM氯化鈣溶液中，放入37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，配制成1U/ml的溶液；2)將聚乳酸多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢復(fù)壓力的方法，將乙醇導(dǎo)入到聚合物多孔支架中，直到支架完全地浸入到乙醇中；將導(dǎo)入乙醇的支架浸入到三蒸水中，采用先抽真空，后恢復(fù)壓力的方法，將乙醇置換成水，反復(fù)進(jìn)行置換10次，每次10分鐘，至無(wú)乙醇?xì)埩簦?)將步驟1)配制的等體積的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液同時(shí)注入到聚乳酸多孔支架中，將支架置于37℃恒溫烘箱中孵育10分鐘，使纖維蛋白原完全凝膠，即獲得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。凝膠在聚乳酸支架中的分布見(jiàn)圖1。
實(shí)例21)用實(shí)例1步驟1)的方法配制纖維蛋白原和凝血酶溶液，但纖維蛋白原溶液的濃度為40mg/ml。
步驟2)和3)同實(shí)例1的步驟2)和3)，得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。
實(shí)例31)用實(shí)例1步驟1)的方法配制纖維蛋白原和凝血酶溶液。但凝血酶溶液的濃度為20U/ml。
步驟2)和3)同實(shí)例1的步驟2)和3)，得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。
實(shí)例4步驟1)同實(shí)例1步驟1)。
步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，但采用的是聚乳酸-乙醇酸共聚物多孔支架。
步驟3)同實(shí)例1步驟3)，得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。
實(shí)例5步驟1)同實(shí)例1步驟1)。
步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，但采用的是聚氨酯多孔支架。
步驟3)同實(shí)例1步驟3)，得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。
實(shí)例6步驟1)同實(shí)例1步驟1)。
步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，但采用的是膠原多孔支架。
步驟3)同實(shí)例1步驟3)，得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。
實(shí)例7步驟1)和2)同實(shí)例1步驟1)和2)。
步驟3)同實(shí)例1步驟3)，但孵育時(shí)間為5分鐘，得纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架。
實(shí)例81)用實(shí)例1步驟1)的方法配制纖維蛋白原和凝血酶溶液，纖維蛋白原的濃度分別為10mg/ml，20mg/ml和40mg/ml，凝血酶溶液的濃度為10U/ml。
2)將等體積的纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液混合，利用紫外光譜測(cè)定了不同纖維蛋白原濃度時(shí)的凝膠時(shí)間，見(jiàn)圖2。
實(shí)例91)用實(shí)例8步驟1)的方法配制各種濃度的纖維蛋白原和凝血酶溶液。
步驟2)和3)同實(shí)例1的步驟2)和3)。
4)利用稱重的方法計(jì)算纖維蛋白凝膠在聚乳酸支架中的填充率。圖3為不同濃度(纖維蛋白原凝膠后的最終濃度)的纖維蛋白原填充聚乳酸支架的填充率。
實(shí)例101)步驟1)同實(shí)例1步驟1)，但纖維蛋白原溶液的濃度為40mg/ml，凝血酶溶液的濃度為10U/ml。
步驟2)和3)同實(shí)例1步驟2)和3)。利用力學(xué)測(cè)試儀測(cè)定無(wú)凝膠填充聚乳酸支架和纖維蛋白凝膠填充聚乳酸支架的力學(xué)性能，結(jié)果見(jiàn)圖4，可見(jiàn)填充后支架的力學(xué)強(qiáng)度得到提高。
實(shí)例11步驟1)同實(shí)例1步驟1)，但纖維蛋白原溶液的濃度為40mg/ml，凝血酶溶液的濃度為10U/ml。纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液首先用220nm過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。然后將軟骨細(xì)胞與纖維蛋白原溶液均勻混合。軟骨細(xì)胞的最終濃度為100萬(wàn)/ml。
步驟2)和3)同實(shí)例1步驟2)和3)。
將制備的纖維蛋白凝膠填充的聚乳酸多孔支架放到24孔培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。細(xì)胞活性采用3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)方法檢測(cè)。圖5為軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充支架中的活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充的支架中具有更高的活性。采用1，9-二甲基亞藍(lán)顯色劑顯色-紫外檢測(cè)的方法測(cè)定細(xì)胞分泌的硫酸粘多糖(GAG)，結(jié)果見(jiàn)圖6，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠填充的支架中能夠分泌更多的GAG。細(xì)胞培養(yǎng)一周后的形態(tài)采用激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果分別見(jiàn)圖7和圖8。
權(quán)利要求
1.一種纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法，其步驟如下1)將纖維蛋白原粉末溶解于生理鹽水中，配制濃度為10～40mg/ml的纖維蛋白原溶液；將凝血酶溶解于氯化鈣溶液中，配制濃度為1～20U/ml的凝血酶氯化鈣溶液；2)將聚合物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢復(fù)壓力的方法，將乙醇導(dǎo)入到聚合物多孔支架中；將導(dǎo)入乙醇的支架浸入到三蒸水中，反復(fù)進(jìn)行先抽真空，后恢復(fù)壓力的方法，將乙醇置換成水，直至無(wú)乙醇?xì)埩簦?)將等體積的纖維蛋白原溶液和凝血酶的溶液同時(shí)注入到聚合物多孔支架中，將支架置于37℃恒溫烘箱中孵育5～10分鐘，使纖維蛋白原完全凝膠，即獲得纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架。
2.按權(quán)利要求1所述的纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法，其特征在于所說(shuō)的聚合物多孔支架是聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚氨酯或膠原多孔支架。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架的制備方法。其過(guò)程是將纖維蛋白原粉末溶解于生理鹽水中，配制纖維蛋白原溶液；將凝血酶溶解于氯化鈣溶液中，配制凝血酶氯化鈣溶液；將等體積的纖維蛋白原溶液和凝血酶的溶液同時(shí)注入到聚合物多孔支架中，獲得纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架。本發(fā)明制備的纖維蛋白凝膠填充的聚合物多孔支架具有復(fù)合結(jié)構(gòu)特征，其中聚合物多孔支架可以提供一定的力學(xué)強(qiáng)度和軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的空間，而纖維蛋白凝膠可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移、增殖及分化，加速軟骨組織的修復(fù)，具有很強(qiáng)的修復(fù)組織缺損的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、材料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)效率高。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101053679SQ200710068119
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者高長(zhǎng)有, 馬列, 趙海光, 沈家驄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)