專利名稱：注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備方法。
背景技術(shù)：
軟骨損傷是目前常見的疾病，由于關(guān)節(jié)炎或運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷所造成的關(guān)節(jié)軟骨損傷給許多病人帶來痛苦。軟骨的代謝活躍而修復(fù)能力有限，沒有血管，在損傷之后不能形成纖維凝塊，沒有炎性細(xì)胞遷移進(jìn)入，也沒有血管未分化細(xì)胞進(jìn)入損傷的部位，所以不易自行進(jìn)行修復(fù)。另外，軟骨本身在損傷部位缺乏未分化的細(xì)胞，損傷之后沒有軟骨細(xì)胞遷移生長(zhǎng)到損傷的軟骨之中。而且，隨著年齡的增長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞的分裂能力逐漸降低，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的能力也隨之降低。迄今為止，臨床上仍然缺少有效的方法修復(fù)受損的軟骨組織。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)的方法和原理來進(jìn)行軟骨組織的修復(fù)是目前的一個(gè)重要手段，且取得了良好的效果。其中，軟骨修復(fù)支架在軟骨再生中起著十分重要的作用。
人體的軟骨屬于結(jié)締組織，其中含有少量的軟骨細(xì)胞和大量細(xì)胞間質(zhì)。軟骨細(xì)胞散在于軟骨基質(zhì)內(nèi)的軟骨陷窩內(nèi)，陷窩周圍的基質(zhì)染色較深稱為軟骨囊。幼稚的軟骨細(xì)胞較小，常單個(gè)分布于關(guān)節(jié)軟骨的邊緣區(qū)，呈扁圓形。由邊緣向中央軟骨細(xì)胞的體積逐漸增大，呈橢圓形或圓形，具有較明顯的軟骨囊。幼小的軟骨細(xì)胞可分裂，深部成熟的軟骨細(xì)胞常2～8個(gè)成群分布。軟骨細(xì)胞間質(zhì)的化學(xué)成分主要包括膠原蛋白、蛋白多糖和少量的非膠原蛋白。軟骨組織中的膠原主要為II型膠原，占膠原總量的90％以上。II型膠原纖維在軟骨內(nèi)呈三維網(wǎng)狀分布，為關(guān)節(jié)軟骨提供抗張強(qiáng)度。蛋白多糖通過連接蛋白以非共價(jià)鍵形式與透明質(zhì)酸結(jié)合形成巨大的蛋白多糖聚合體。蛋白多糖聚合體分子鏈上含有豐富的負(fù)酸根離子，可以結(jié)合大量的水形成水凝膠，為軟骨提供抗壓強(qiáng)度和彈性。水分占軟骨組織全重的75％，其中含有大量正離子以平衡蛋白多糖分子中的負(fù)電荷，并含有許多軟骨細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物。軟骨組織內(nèi)無血管，但由于軟骨基質(zhì)富含水分，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于滲透，故軟骨細(xì)胞仍能獲得必要的營(yíng)養(yǎng)。
軟骨組織中的其它非膠原蛋白如錨著蛋白、纖維粘連蛋白等通過與細(xì)胞表面受體和其它大分子之間的相互作用將軟骨細(xì)胞粘連在軟骨基質(zhì)上，并穩(wěn)定軟骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)軟骨基質(zhì)成分和組織結(jié)構(gòu)的不同，軟骨分為透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，它的特點(diǎn)是纖維含量比纖維軟骨和彈性軟骨少，而蛋白多糖水凝膠含量相對(duì)較多，軟骨基質(zhì)為透明狀。成熟的關(guān)節(jié)軟骨根據(jù)其細(xì)胞和基質(zhì)的變化可分為淺表層、中層、深層和鈣化層。其中中層和深層中的蛋白多糖含量較高。
人體內(nèi)的軟骨具有極特殊的力學(xué)性能。例如關(guān)節(jié)軟骨具有很好的彈性和韌性，可承受較大的負(fù)荷，同時(shí)具有光滑的表面，使關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)的摩擦力極小。軟骨組織一旦缺損，將給患者帶來巨大的痛苦和不便。
近年來，可注射型細(xì)胞微載體和注射型水凝膠材料由于其體內(nèi)培養(yǎng)和微創(chuàng)修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注。注射型細(xì)胞微載體需要液態(tài)載體進(jìn)行輸運(yùn)。傳統(tǒng)的液態(tài)載體包括甘油、明膠等。由于可注射微載體一般采用生物降解聚酯類聚合物為基材，密度較大，因此在注射過程中易發(fā)生沉淀而影響使用。因此，液態(tài)載體的性能仍需提高，如應(yīng)具有足夠的粘度或密度以確保細(xì)胞微載體在溶液中的懸浮，并保證一定時(shí)間內(nèi)不會(huì)發(fā)生沉淀。此外，單純的細(xì)胞微載體即便能夠注射并在體內(nèi)無規(guī)堆砌成型，但支架的結(jié)構(gòu)松散、機(jī)械強(qiáng)度較低，微載體在體內(nèi)可能遷移或游走而失去形狀。水凝膠是另外一類可以注射的細(xì)胞支架，且水凝膠的前驅(qū)物均為溶液狀態(tài)，極易注射，在物理或者化學(xué)刺激下在體內(nèi)能夠快速成型。但水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度較低，降解速度較快，導(dǎo)致破碎或坍塌，從而失去應(yīng)有的形狀而不能繼續(xù)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)空間。
將可注射細(xì)胞微載體與可注射水凝膠進(jìn)行復(fù)合，利用液態(tài)的水凝膠前驅(qū)物為輸運(yùn)載體注射到體內(nèi)受損部位后，前驅(qū)物在體內(nèi)快速固化形成凝膠。凝膠與微載體形成具有一定形狀和強(qiáng)度的復(fù)合支架。微載體被包裹在水凝膠中，從而限制了其遷移或游走；同時(shí)，微載體與凝膠復(fù)合，相當(dāng)于粒子填充復(fù)合材料，能大大提高水凝膠的強(qiáng)度。此外，微載體的降解速度較慢，當(dāng)水凝膠降解完全后，微載體的堆砌仍然能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)的空間，球與球之間的連通孔隙便于細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的交換。因此，二者的復(fù)合可以互相彌補(bǔ)其缺點(diǎn)，具有一定的協(xié)同作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以有效地負(fù)載微載體，防止微載體在體內(nèi)游走，同時(shí)防止細(xì)胞在種植過程中流失，生物相容性好的注射型微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備方法。
本發(fā)明的注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟
1)將聚酯類聚合物溶解在二氯甲烷中，配制成濃度為50mg/ml的均勻溶液；將此溶液加入到質(zhì)量濃度為0.1～0.5％的聚乙烯醇的水溶液中，聚乙烯醇的水溶液和二氯甲烷的體積比為5∶1，攪拌下?lián)]發(fā)去除二氯甲烷，過濾分離出聚酯類微球，干燥；2)將步驟1)獲得的聚酯類微球浸泡在質(zhì)量濃度為6％的己二胺正丙醇溶液中，在40℃水浴中反應(yīng)3～15分鐘，用去離子水充分洗滌以除去未反應(yīng)的己二胺，然后在35℃真空干燥至恒重，獲得表面含有氨基的聚酯類微球；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，配制濃度為10～40mg/ml的纖維蛋白原溶液；將凝血酶溶解于氯化鈣溶液中，配制濃度為20～40U/ml的凝血酶氯化鈣溶液；4)將步驟2)獲得的表面含有氨基的聚酯類微球浸入質(zhì)量濃度為1％戊二醛溶液中，4℃下反應(yīng)至少3h，用去離子水沖洗去除未反應(yīng)的戊二醛，獲得表面含有醛基的聚酯類微球；然后將此表面含有醛基的聚酯類微球浸入10mg/ml的纖維蛋白原溶液中，4℃下反應(yīng)至少24h，冷凍-凍干，獲得表面含有纖維蛋白原的聚酯類微載體；5)將聚酯類微載體與纖維蛋白原溶液按質(zhì)量比為3％～15％混合，在振蕩器上震蕩使聚酯類微載體均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有聚酯類微載體的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積均勻混合，37℃下形成凝膠，獲得注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架。
本發(fā)明中，所說的聚酯類聚合物可以是聚乳酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的注射型微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架具有復(fù)合結(jié)構(gòu)特征，其中微載體可以為細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增提供一定的力學(xué)強(qiáng)度和空間；纖維蛋白凝膠則有利于實(shí)現(xiàn)微載體的輸送和原位注射成型。纖維蛋白凝膠是來源于血液的制品，具有良好的生物相容性和降解性能，其中含有大量的活性因子，具有更好的促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移、增殖及分化性能，加快修復(fù)受損的軟骨組織。該復(fù)合支架可以有效地負(fù)載微載體，防止微載體在體內(nèi)游走，防止細(xì)胞在種植過程中流失，生物相容性好，制備方法簡(jiǎn)單、材料來源廣泛、生產(chǎn)效率高，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的掃描電鏡照片。
圖2是表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的掃描電鏡照片。
圖3是表面含有纖維蛋白原的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的掃描電鏡片。
圖4是表面含有纖維蛋白原的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的激光共聚焦顯微鏡照片。纖維蛋白原首先用熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記。
圖5是纖維蛋白凝膠復(fù)合聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體支架的掃描電鏡照片。
圖6是纖維蛋白凝膠復(fù)合聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體支架的激光共聚焦顯微鏡照片。纖維蛋白原首先用熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記。
圖7是體外培養(yǎng)一周后，軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠復(fù)合微載體支架中的形態(tài)及分布的激光共聚焦顯微鏡照片。其中細(xì)胞采用熒光素二乙酸酯的方法進(jìn)行染色。
具體實(shí)施方法以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來限制本發(fā)明。
實(shí)例11)將聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氯甲烷中，配制成濃度為50mg/ml的均勻溶液；將此溶液加入到質(zhì)量濃度為0.1％的聚乙烯醇溶液中，聚乙烯醇的水溶液和二氯甲烷的體積比為5∶1。在機(jī)械攪拌下?lián)]發(fā)8小時(shí)去除二氯甲烷；過濾分離出聚乳酸-乙醇酸共聚物微球，干燥；2)將步驟1)獲得的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球浸泡在質(zhì)量濃度為6％的己二胺正丙醇溶液中，在40℃水浴中反應(yīng)3分鐘，用去離子水充分洗滌以除去未反應(yīng)的己二胺，然后在35℃真空干燥箱中干燥至恒重，即獲得表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球。圖2是表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的掃描電鏡照片。
3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，于37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，使纖維蛋白原充分溶解，纖維蛋白原溶液的濃度為10mg/ml；將凝血酶溶解于40mM氯化鈣溶液中，于37℃恒溫水浴中孵育10分鐘，配制成20U/ml的溶液。
4)將步驟2)獲得的表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球浸入質(zhì)量濃度為1％戊二醛溶液中，4℃下反應(yīng)3h，用大量去離子水沖洗去除未反應(yīng)的戊二醛，獲得表面含有醛基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球；然后將此表面含有醛基的聚乳酸-乙醇酸微球浸入10mg/ml的纖維蛋白原溶液中，4℃下反應(yīng)24h，隔2小時(shí)振蕩一次。冷凍-凍干后，獲得表面含有纖維蛋白原的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球，即聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體，如圖3的掃描電鏡照片和圖4的激光共聚焦顯微鏡照片所示。
5)將聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體與纖維蛋白原溶液按質(zhì)量比為3％混合，在振蕩器上震蕩使聚酯類微載體均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積混合均勻，放入37℃恒溫烘箱中孵育10分鐘，使纖維蛋白原交聯(lián)，形成凝膠，即獲得注射型聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體與纖維蛋白凝膠的復(fù)合支架。圖5和圖6分別是纖維蛋白凝膠復(fù)合聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體支架的掃描電鏡照片和激光共聚焦顯微鏡照片。
實(shí)例2同實(shí)例1的步驟1)制備聚合物微球，但使用的聚合物為聚乳酸，其余步驟同實(shí)例1，得到注射型聚乳酸微載體與纖維蛋白凝膠的復(fù)合支架。
實(shí)例3同實(shí)例1的步驟1)制備聚乳酸-乙醇酸共聚物微球，但聚乙烯醇溶液的質(zhì)量濃度為0.5％，其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例4步驟1)同實(shí)例1的步驟1)。
步驟2)同實(shí)例1的步驟2)，但氨解的時(shí)間為15分鐘，得表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球。其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例5步驟1)～3)同實(shí)例1的步驟1)～3)，但在步驟3)中同時(shí)配制纖維蛋白原濃度為40mg/ml的溶液。
步驟4)同實(shí)例1的步驟4)，但纖維蛋白原溶液的濃度為40mg/ml。其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例6步驟1)～3)同實(shí)例1的步驟1)～3)，但在步驟3)中同時(shí)配制凝血酶濃度為40U/ml的氯化鈣溶液。
步驟4)同實(shí)例1的步驟4)，但凝血酶溶液的濃度為40U/ml。其余步驟同實(shí)例1。
實(shí)例7步驟1)～4)同實(shí)例1的步驟1)～4)。
步驟5)同實(shí)例1的步驟5)，但聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體與纖維蛋白原溶液的質(zhì)量比為15％。
實(shí)例8
步驟1)～2)同實(shí)例1的步驟1)～2)。
步驟3)同實(shí)例1步驟3)，但同時(shí)配制纖維蛋白原濃度為40mg/ml的溶液，凝血酶濃度為30U/ml的溶液。
步驟4)同實(shí)例1的步驟4)。
纖維蛋白原溶液(40mg/ml)和凝血酶(30U/ml)溶液首先用孔徑為220nm的過濾膜過濾滅菌。然后將即實(shí)例1制備的聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體與纖維蛋白原溶液均勻混合，其中聚乳酸-乙醇酸共聚物微載體的質(zhì)量百分濃度為15％，然后再將該混合物與軟骨細(xì)胞混合，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育10分鐘，得到含有軟骨細(xì)胞的纖維蛋白凝膠復(fù)合微載體支架。軟骨細(xì)胞的最終濃度為300萬/ml。將此含有軟骨細(xì)胞的復(fù)合支架放到24孔培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。圖7是體外培養(yǎng)7天后，軟骨細(xì)胞在纖維蛋白凝膠復(fù)合微載體支架中的形態(tài)及分布的激光共聚焦顯微鏡照片。
權(quán)利要求
1.注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備方法，其制備過程包括以下步驟1)將聚酯類聚合物溶解在二氯甲烷中，配制成濃度為50mg/ml的均勻溶液；將此溶液加入到質(zhì)量濃度為0.1～0.5％的聚乙烯醇的水溶液中，聚乙烯醇的水溶液和二氯甲烷的體積比為5∶1，攪拌下?lián)]發(fā)去除二氯甲烷，過濾分離出聚酯類微球，干燥；2)將步驟1)獲得的聚酯類微球浸泡在質(zhì)量濃度為6％的己二胺正丙醇溶液中，在40℃水浴中反應(yīng)3～15分鐘，用去離子水充分洗滌以除去未反應(yīng)的己二胺，然后在35℃真空干燥至恒重，獲得表面含有氨基的聚酯類微球；3)將纖維蛋白原粉末溶于生理鹽水中，配制濃度為10～40mg/ml的纖維蛋白原溶液；將凝血酶溶解于氯化鈣溶液中，配制濃度為20～40U/ml的凝血酶氯化鈣溶液；4)將步驟2)獲得的表面含有氨基的聚酯類微球浸入質(zhì)量濃度為1％戊二醛溶液中，4℃下反應(yīng)至少3h，用去離子水沖洗去除未反應(yīng)的戊二醛，獲得表面含有醛基的聚酯類微球；然后將此表面含有醛基的聚酯類微球浸入10mg/ml的纖維蛋白原溶液中，4℃下反應(yīng)至少24h，冷凍—凍干，獲得表面含有纖維蛋白原的聚酯類微載體；5)將聚酯類微載體與纖維蛋白原溶液按質(zhì)量比為3％～15％混合，在振蕩器上震蕩使聚酯類微載體均勻分散在纖維蛋白原溶液中，然后將分散有聚酯類微載體的纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液等體積均勻混合，37℃下形成凝膠，獲得注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架。
2.按權(quán)利要求1所述的一種注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的制備方法，其特征在于所說的聚酯類聚合物是聚乳酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備可注射型聚酯類微載體與纖維蛋白凝膠復(fù)合支架的方法。該復(fù)合支架由纖維蛋白凝膠和聚酯類微載體復(fù)合而成。其中微載體為細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增提供一定的力學(xué)強(qiáng)度和空間；纖維蛋白凝膠模擬軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，有利于實(shí)現(xiàn)微載體的輸送和原位注射成型，并且可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移、增殖及分化，加快修復(fù)受損的軟骨組織。該復(fù)合支架可以有效地負(fù)載微載體，防止微載體在體內(nèi)游走，防止細(xì)胞在種植過程中流失，生物相容性好，制備方法簡(jiǎn)單、材料來源廣泛、生產(chǎn)效率高，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/22GK101041088SQ200710068118
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者高長(zhǎng)有, 馬列, 趙海光, 沈家驄 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)