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一種水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑及其制備方法

文檔序號:1178470閱讀:295來源:國知局
專利名稱:一種水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑及其制備方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種水不溶性的蛋白類生物生長因子的水分散納米微粒制劑及其制備方法,尤其是一種以蛋白、多糖類材料及其混合物為包覆材料,磷脂為分散劑的骨形態(tài)發(fā)生蛋白的水分散納米微粒注射制劑及其制備方法。
背景技術
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是轉化生長因子β超家族中的一員,具有高效的骨誘導活性。它可對成骨細胞系中的不同細胞發(fā)揮階段特異性調控作用,誘導新骨形成;在許多器官與組織的生長過程中起著極為重要的調控功能。特別在促進骨生長、骨折愈合等醫(yī)學臨床方面顯示出良好的應用前景。已有的研究主要是通過將BMP直接包埋在骨架材料中,并用于動物活體培養(yǎng)來考察BMP的生理活性與緩釋效果。但是骨形態(tài)發(fā)生蛋白在人體內的存活周期短,僅數分鐘到幾個小時,需要大劑量使用BMP才能維持藥效,藥物利用率低;而且BMP水溶性差,這種骨架材料使用中的后處理過程復雜。因此,制備一種具有不同緩釋性能、水分散的骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑對于BMP的相關研究以及臨床應用具有極其重要的價值。
蛋白與多糖類材料是常用的兩類生物材料,無毒性,具有良好的生物相容性和組織相容性;而且與骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有很好的相親性。此外,它們具有良好的組織相容性。如果以蛋白、多糖或它們的混合體來包覆BMP,制備水分散、納米級的BMP復合粒子分散體,不僅易于通過組織吸收到血液循環(huán)系統(tǒng),從而很好的提高藥物的利用率;而且通過控制各組分間的比例,使得這種納米復合粒子具有不同緩釋特性,可以延長了BMP在血液中的循環(huán)周期。此外,這種粒子由于以蛋白或多糖為包覆材料,極易與多種組織過程材料結合,這使得制備含BMP的骨架材料的后處理過程得到簡化。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供適合于多種水溶或水不溶的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑及其制備法。
本發(fā)明是利用具有良好的生物相容性與細胞相容性的磷脂類物質為分散劑,以蛋白、多糖為藥物的包覆材料,通過控制蛋白、多糖的比例以及他們的混合體與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的比例,采用共凝聚技術,獲得粒徑40~2000nm的水分散的骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑。
發(fā)明的這種注射制劑包括分散在蒸餾水中的納米顆粒的蛋白類骨誘導生長因子,包覆納米顆粒的蛋白類骨誘導生長因子的蛋白質類生物大分子材料或多糖類生物大分子材料或蛋白類與多糖類混合的生物大分子材料及作為分散劑的磷脂類物質。
發(fā)明的注射制劑的制備方法,包括以下步驟(1)在0~50℃溫度下,將蛋白類骨誘導生長因子溶解在蛋白或多糖或蛋白和多糖的混合體的尿素或鹽酸胍水溶液中,骨誘導生長因子重量體積濃度為0.01~100mg/ml,調節(jié)溶液的pH值為2~11,骨誘導生長因子與蛋白或多糖或蛋白-多糖混合體的重量比為1∶0.1~1∶20。
(2)將步驟(1)所得溶液逐滴滴加到pH值為3~9的含有0.1-10mg/ml的磷脂類物質的分散水溶液中,同時機械攪拌或超聲波分散。
(3)將步驟(2)獲得的分散體在去離子水中反復透析,或者以納濾膜反復用去離子水過濾清洗,4℃下保存。
本發(fā)明中,所說的磷脂類物質為卵磷脂、腦磷脂。蛋白類骨誘導生長因子為骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白,或者是基因重組的BMP-2型、BMP-4、BMP-7型骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
本發(fā)明中,包覆蛋白類骨誘導生長因子的蛋白質類生物大分子材料為白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白以及它們的混合體。包覆蛋白類骨誘導生長因子的多糖類生物大分子材料為葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素。包覆蛋白類骨誘導生長因子的蛋白類與多糖類混合的生物大分子材料是白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白中的一種或多種和葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素中的一種或多種的混合物。
發(fā)明制備過程中,所說的蛋白類骨誘導生長因子是從骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白,或者是基因重組的BMP-2型、BMP-4、BMP-7型等骨形態(tài)發(fā)生蛋白。所說的蛋白為白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白以及它們的混合體,多糖為葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素。蛋白-多糖混合體是白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白中的一種或多種和葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素中的一種或多種的混合物本發(fā)明的優(yōu)點在于
(1)無毒性 本發(fā)明采用的材料沒有任何生理毒性,且制備過程無環(huán)境污染的隱患。
(2)良好的生理相容性 本發(fā)明以生物相容性良好的蛋白、多糖和磷脂為包覆材料與分散劑,與骨形態(tài)發(fā)生蛋白有良好相親性,并具有良好的組織相容性,不會造成組織的不良反應。
(3)可控性通過簡單控制各組分間的比例,可獲得不同的緩釋特性、不同粒度的BMP復合納米粒子。
(4)適用范圍廣 該水分散骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑可作為單獨制劑直接應用,也可與其它生物材料相結合,進一步制備具有與細胞以及多種組織具有良好相容性的生物活性材料。
(5)工藝簡單,條件溫和。


圖1是以白蛋白為包覆材料,超聲波分散條件下獲得的BMP分散體的掃描電鏡(SEM)圖片,放大倍數為30000。由圖可以清晰地看出,顆粒平均大小在40納米左右,少數大的顆粒大小也不超過100納米,且顆粒分散均勻。
圖2是以白蛋白為包覆材料,機械攪拌條件下獲得的BMP分散體的粒度分布圖,由圖可以看到,顆粒大小主要集中在150納米左右,少數大的顆粒大小也不超過500納米。
圖3是以牛腱膠原為包覆材料,機械攪拌條件下獲得的BMP分散體的原子力顯微鏡(AFM),由圖可以看到,顆粒大小主要集中在200納米左右。
圖4是以二乙胺基乙基葡聚糖氯化物(DEAE-葡聚糖)為包覆材料,超聲波分散條件下獲得的BMP分散體的掃描電鏡(SEM)圖片,放大倍數為20000倍。由圖可以清晰地看出,顆粒平均大小在70納米左右,少數大的顆粒大小也不超過150納米,且顆粒分散均勻。
圖5以殼聚糖(Chitosan)為包覆材料,機械攪拌條件下獲得的BMP分散體的原子力顯微鏡(AFM)圖片,由圖可以看到,顆粒大小主要集中在300納米左右。
圖6以膠原-DEAE-葡聚糖混合物為包覆材料,機械攪拌條件下獲得的BMP分散體的原子力顯微鏡(AFM)圖片,由圖可以看到,顆粒大小在300-2000納米之間。
具體實施例方式
下面結合實例對本發(fā)明作詳細說明實例1以牛血清白蛋白為包覆材料—透析法制備在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度為0.5mg/ml),加入白蛋白(BMP與白蛋白的重量比例為1∶5),用醋酸調節(jié)溶液pH值為3。將此溶液逐滴滴加到溶有3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=5),同時在超聲波清洗器中震蕩,將獲得的分散體在去離子水中反復透析3晝夜。所得的結果見圖1。實例2以牛血清白蛋白為包覆材料—納濾法制備在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度為0.5mg/ml),加入白蛋白(BMP與白蛋白的重量比例為1∶5),用醋酸調節(jié)溶液pH值為3。將此溶液逐滴滴加到溶有3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=5),同時機械攪拌上述水溶液,將獲得的分散體在孔徑為50nm的納濾膜上反復用去離子水清洗。所得的結果見圖2。實例3以牛腱膠原為包覆材料在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度1mg/ml),加入膠原(BMP與膠原的重量比例為1∶4),用醋酸調節(jié)溶液pH值為3。將此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=7),同時機械攪拌上述水溶液。將獲得的分散體在50nm濾孔的納濾膜上反復用去離子水清洗。所得BMP納米粒子的形態(tài)見圖3。實例4以牛血清白蛋白-牛腱膠原混合體為包覆材料在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度0.2-4mg/ml),加入白蛋白-膠原(BMP與白蛋白-膠原的重量比例為1∶1~1∶10,白蛋白與膠原的重量比例為1∶1),用醋酸調節(jié)溶液pH值(3~7)。將此溶液逐滴滴加到溶解有1-3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=5~9),同時在超聲波清洗器中震蕩,或機械攪拌上述水溶液,將獲得的分散體在去離子水中反復透析3晝夜,或在50nm濾孔的納濾膜上反復用去離子水清洗。實例5以DEAE-葡聚糖為包覆材料在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度1mg/ml),DEAE-葡聚糖(BMP與DEAE-葡聚糖的重量比為1∶5),用醋酸或氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值為9。將此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=7),同時在超聲波清洗器中震蕩。將獲得的分散體在去離子水中反復透析3晝夜,所得的結果見圖4。實例6以殼聚糖為包覆材料在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度1mg/ml),殼聚糖(BMP與殼聚糖的重量比為1∶5),用鹽酸調節(jié)溶液pH值為3。將此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=7),同時機械攪拌上述水溶液。將獲得的分散體在50nm濾孔的納濾膜上反復用去離子水清洗,所得的結果見圖5。實例7以膠原-DEAE-葡聚糖為包覆材料在25℃下,將骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量體積濃度1mg/ml),加入膠原-DEAE-葡聚糖(BMP與膠原-DEAE葡聚糖的重量比例為1∶5,膠原與DEAE-葡聚糖的重量比為1∶2),用鹽酸調節(jié)溶液的pH值為3。將此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的緩沖水溶液中(pH=7),同時機械攪拌上述水溶液,將獲得的分散體在50nm濾孔的納濾膜上反復用去離子水清洗。所得的結果見圖6。
權利要求
1.一種水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于它包括分散在蒸餾水中的納米顆粒的蛋白類骨誘導生長因子,包覆納米顆粒的蛋白類骨誘導生長因子的蛋白質類生物大分子材料或多糖類生物大分子材料或蛋白類與多糖類混合的生物大分子材料及作為分散劑的磷脂類物質。
2.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于所說的納米顆粒的大小為40~2000納米。
3.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于所說的磷脂類物質為卵磷脂、腦磷脂。
4.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于所說的蛋白類骨誘導生長因子為骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白,或者是基因重組的BMP-2型、BMP-4、BMP-7型骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
5.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于包覆蛋白類骨誘導生長因子的蛋白質類生物大分子材料為白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白以及它們的混合體。
6.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于包覆蛋白類骨誘導生長因子的多糖類生物大分子材料為葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素。
7.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑,其特征在于包覆蛋白類骨誘導生長因子的蛋白類與多糖類混合的生物大分子材料是白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白中的一種或多種和葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素中的一種或多種的混合物。
8.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑的制備方法,其特征是包括以下步驟(1)在0~50℃溫度下,將蛋白類骨誘導生長因子溶解在蛋白或多糖或蛋白和多糖的混合體的尿素或鹽酸胍水溶液中,骨誘導生長因子重量體積濃度為0.01~100mg/ml,調節(jié)溶液的pH值為2~11,骨誘導生長因子與蛋白或多糖或蛋白-多糖混合體的重量比為1∶0.1~1∶20。(2)將步驟(1)所得溶液逐滴滴加到pH值為3~9的含有0.1-10mg/ml的磷脂類物質的分散水溶液中,同時機械攪拌或超聲波分散。(3)將步驟(2)獲得的分散體在去離子水中反復透析,或者以納濾膜反復用去離子水過濾清洗,4℃下保存。
9.按權利要求8所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑的制備方法,其特征是所說的磷脂類物質為卵磷脂、腦磷脂。所說的蛋白類骨誘導生長因子是骨頭中生化提取的骨形態(tài)發(fā)生蛋白,或者是基因重組的BMP-2型、BMP-4、BMP-7型等骨形態(tài)發(fā)生蛋白。
10.按權利要求1所述的水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑的制備方法,其特征是所說的蛋白尿素為白蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、蠶絲蛋白以及它們的混合體,多糖尿素為葡聚糖及其衍生物、硫酸軟骨素、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、纖維素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水分散性納米級骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑及其制備方法。它是利用具有良好的生物相容性與細胞相容性的磷脂類物質為分散劑,以蛋白、多糖為藥物的包覆材料,通過控制蛋白、多糖的比例以及他們的混合體與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的比例,采用共凝聚技術,獲得粒徑40~2000nm的水分散的骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑。本發(fā)明所用的包覆材料無毒、可生物降解且生物相容性好。該水分散骨形態(tài)發(fā)生蛋白注射制劑可作為單獨制劑直接應用,也可與其它生物材料相結合,進一步制備具有與細胞以及多種組織具有良好相容性的生物活性材料。本發(fā)明工藝簡單、重復性強,適用于多種水不溶性和水溶性蛋白類物質的注射制劑。
文檔編號A61K38/16GK1403153SQ0213739
公開日2003年3月19日 申請日期2002年10月9日 優(yōu)先權日2002年10月9日
發(fā)明者高長有, 江兵兵, 沈家驄, 孫福玉, 李曉光 申請人:浙江大學, 安泰科技股份有限公司
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