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一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球及其制備方法

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專利名稱::一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及藥物以及包裹生物活性因子微球
技術(shù)領(lǐng)域
,更具體地涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球及其制備方法和用途。
背景技術(shù)
:重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2是采用基因工程重組技術(shù)開(kāi)發(fā)的一種骨分化調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子,具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化的能力,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟,參與骨和軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育及其重建過(guò)程,進(jìn)而加速骨缺損的修復(fù)。但重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在體內(nèi)半衰期短,局部使用會(huì)被組織液稀釋或蛋白酶所分解,能保持有效濃度的時(shí)間有限,不能有效發(fā)揮其骨誘導(dǎo)作用。所以重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的活性發(fā)揮必須需要有合適的載體,以便長(zhǎng)時(shí)間緩慢地釋放重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,實(shí)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)保持局部較高的濃度,利于其有效發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用。微球作為一種控/緩釋給藥體系,具有保護(hù)藥物免遭破壞、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、降低用藥量等優(yōu)點(diǎn),在藥物釋放領(lǐng)域受到很大關(guān)注。目前已有一些相關(guān)制備重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微球的報(bào)道,然而它們都或多或少存在一些明顯的缺陷,例如制備步驟復(fù)雜,控釋效果難以令人滿意,以及雜質(zhì)和反應(yīng)物(如殘留的單體、低聚物、催化劑、添加劑及降解產(chǎn)物)對(duì)產(chǎn)品性能有可能產(chǎn)生不良的影響。AntoniosGMikos等(P.QuintenRuhe,ElizabethL.Hedberg,NestorTorioPadron,PaulH.M.Spauwen,JohnA.J"ansen,AntoniosG.Mikos.rhBMP-2releasefrominjectablepoly饑-lactic-co-glycolicacid)/calcium-phosphatecementcomposites.JBoneJointSurgAm2003;85-ASu卯l3:75-81.)采用復(fù)乳法制備載重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的DL-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)微粒。在該方法中,重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于磷酸緩沖鹽溶液/牛血清白蛋白溶液中,然后注入PLGA的二氯甲烷溶液中形成初乳,漩渦震蕩60秒后加入聚乙烯醇溶液形成復(fù)乳。漩渦震蕩60秒后加入PVA和異丙醇4溶液,快速攪拌1小時(shí)后加入二氯甲烷促使微粒析出,經(jīng)離心凍干后得微球。平均粒徑為17.2±1.3um,包封率為79%±8%,28天累積釋放率為18%±1.9%。胡蘊(yùn)玉等人采用復(fù)乳-溶劑蒸發(fā)技術(shù)制備載重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的聚乳酸與聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球。制備的載藥微球粒徑在100~350nm,24小時(shí)體外釋放為15.2%±0.8%,隨后呈持續(xù)緩慢釋放,28天時(shí)累積釋放率達(dá)48.6%±5.3%。金巖等(ChenFaming,ZhaoYimin,ZhangRong,JinTao,SunHaihua,WuZhifen,JinY肌Periodontalregenerationusingnovelglycidylmethacrylateddextran(Dex-GMA)/gelatinscaffoldscontainingmicrospheresloadedwithbonemorphogeneticproteins.JournalofControlledRelease.2007,121:81-90)公開(kāi)了一種制備載重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2葡聚糖-縮水甘油基丙烯酸酯(Dex-GMA)/聚乙二醇(PEG)微球的方法。首先制備Dex-GMA:葡聚糖在氮?dú)獗Wo(hù)下于6CTC溶于DMAP/DMS0,完全溶解后冷卻到3(TC加入三乙胺催化劑,攪拌15分鐘后緩慢加入GMA,在氮?dú)獗Wo(hù)下于3(TC反應(yīng)72小時(shí),采用冷的異丙醇將產(chǎn)物析出,過(guò)濾,異丙醇清洗數(shù)次,室溫真空干燥得到Dex-GMA。然后制備Dex-GMA/PEG微球?qū)EG溶液和Dex-GMA的氯化鉀在氮?dú)獗Wo(hù)下晃動(dòng)10分鐘后轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中,渦流震蕩60秒得到水-水乳液,室溫下靜置10-15分鐘后加入TEMED和KPS,在37。C孵育30分鐘,甲丙烯?;B接到Dex-GMA鏈上。Dex-GMA/PEG微球采用復(fù)乳縮聚制得,離心清洗三次,凍干后得微球。然而,這種方法制備的微球易粘連,平均粒徑為31.1±12.7um。重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2可通過(guò)兩種方式載入,其一在加入PEG前將重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2分散到Dex-GMA溶液中,包封率為87.8%±1.2%,另一是在渦流震蕩前將重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2加入到PEG/Dex-GMA中,包封率為86.6%±0,8%。然而,該方法制備的微球的暴釋現(xiàn)象明顯,近50%,此后第l-3天每天釋放5%,第6-21天每天釋放0.2%,28天累積釋放率接近65%。馮慶玲等(NiuXufeng,F(xiàn)engQingling,WangMingbo,GuoXiaodong,ZhengQixin.PreparationandcharacterizationofchitosanmicrospheresforcontrolledreleaseofsyntheticoligopeptidederivedfromBMP-2.JournalofMicroencapsulation.D01:10.1080/02652040802319742)采用乳化-離子交聯(lián)法制備載重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。將蛋白與殼聚糖的混合溶液滴入含表面活性劑司盤-80的液體石蠟中,室溫下機(jī)械攪拌2小時(shí)后滴入三聚磷酸鈉溶液繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)形成微球,采用大量石油醚、異丙醇清洗,凍干后備用。微球粒徑10-60um,平均粒徑為39nm,分布較寬,微球表面規(guī)整無(wú)裂紋,易粘連,交聯(lián)反應(yīng)持續(xù)2小時(shí)以上可保持微球的球形度,包封率在75%-90%。然而,該方法制備的微球易粘連,且釋放到第7天時(shí)累積釋放率就已達(dá)62.3%,故釋放周期較短,難以達(dá)到4周釋放周期。另外,乳化法雖然是一種較為成熟的高分子微球制備方法,通常與交聯(lián)、溶劑蒸發(fā)聯(lián)合使用,但在用于蛋白包裹的過(guò)程中,大量表面活性劑、乳化劑、化學(xué)交聯(lián)劑的使用,有機(jī)溶劑的殘留和"脫油"過(guò)程均會(huì)影響微球的生物相容性和蛋白的活性。此外,該工藝相對(duì)繁瑣,乳劑穩(wěn)定性不易控制,微球粒徑不均勻,分布較寬等。綜上所述,在目前現(xiàn)有的這些技術(shù)中,大多制備工藝復(fù)雜,并且制得的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微球性能難以令人滿意。因此,本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)工藝簡(jiǎn)便、且制備的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微球性能優(yōu)異的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球及其制備方法,以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。在本發(fā)明的第一方面,提供了一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球,微球基質(zhì)成分為殼聚糖,包裹的藥物為人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,殼聚糖通過(guò)與離子交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2包裹其中,并且所述微球的平均粒徑在501000陶,包封率在75%100%,蛋白活性90%100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天累積釋放為35%90%。在另一優(yōu)選例中,所述微球的平均粒徑為100-700微米。在另一優(yōu)選例中,90。/。以上的所述微球的粒徑在0.9M1.1M范圍內(nèi),其中M是所述微粒的平均粒徑。更佳地,95%的所述微球的粒徑為0.9M1.1M范圍內(nèi),其中M是所述微粒的平均粒徑。在另一優(yōu)選例中,所述微球中選自下組的物質(zhì)的各自含量《0.05wt。/。表面活性劑、油相、和石油醚。在另一優(yōu)選例中,微球中表面活性劑、油相、和石油醚的各自含量《0.005wt%,《0.001wt。/?;蚋?。通常,所述油相包括液體石蠟,所述的表面活性劑包括司班、吐溫。在另一優(yōu)選例中,所述殼聚糖的分子量為3100KDa,更佳地為550KDa。在另一優(yōu)選例中,所述的殼聚糖是脫乙?;臍ぞ厶牵涿撘阴6葹?0%95%。在另一優(yōu)選例中,所述微球保持了95%100%的蛋白活性。在另一優(yōu)選例中,人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與殼聚糖按重量比為1100:300,更佳地為350:300。在另一優(yōu)選例中,所述的微球是采用靜電液滴-離子交聯(lián)法制備的。在本發(fā)明的第二方面,提供了一種活性蛋白的殼聚糖微球,微球基質(zhì)成分為殼聚糖,包裹的藥物為活性蛋白,殼聚糖通過(guò)與離子交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)將活性蛋白包裹其中,微球的平均粒徑在5Q1000陶,包封率在75%100%,蛋白活性90%100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天累積釋放為35%90%。在另一優(yōu)選例中,所述殼聚糖微球的優(yōu)選特征同本發(fā)明第一方面的優(yōu)選特征。在本發(fā)明的第三方面,提供了一種制備活性蛋白的殼聚糖微球的方法,包括步驟(a)提供一含殼聚糖和所述活性蛋白的混合水溶液或水性溶液;其中,在所述混合溶液中,殼聚糖的濃度按重量體積比為0.2-6%;并且所述活性蛋白與殼聚糖的重量比1100:300;和(b)在靜電場(chǎng)下,將所述的混合溶液滴入凝膠浴中,從而形成活性蛋白的殼聚糖微球,其中所述的凝膠浴是含離子交聯(lián)劑的水溶液或水性溶液,其PH為27。在另一優(yōu)選例中,所述的離子交眹劑選自下組三聚磷酸鈉、聚磷酸、或其組合。在另一優(yōu)選例中,所述的凝膠浴的溶劑為水性溶劑,并且所述的水性溶劑是水與醇(如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其組合)構(gòu)成的混合溶劑。在另一優(yōu)選例中,按混合溶劑的總體積計(jì)算,醇的用量為5-50%。在另一優(yōu)選例中,步驟(a)的混合溶液中含有0.01-1.5M酸,并且在所述濃度的酸存在下對(duì)活性蛋白的活性無(wú)不利影響。在另一優(yōu)選例中,所述的酸為有機(jī)酸,更佳地所述的有機(jī)酸選自甲酸、乙酸、擰檬酸、乳酸或其組合。在另一優(yōu)選例中,步驟(a)還包括將殼聚糖溶于稀酸溶液中,并將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,從而形成混合溶液。更佳地,配制殼聚糖酸溶液所用的酸為甲酸、乙酸、檸檬酸、乳酸或其組合。在另一優(yōu)選例中,所述的靜電場(chǎng)是輸出電壓直流100-iooov(較佳地100-500V)的靜電場(chǎng)。在另一優(yōu)選例中,殼聚糖的分子量在550KDa,脫乙酰度在50%95%。在另一優(yōu)選例中,配制殼聚糖酸溶液所用的酸濃度按重量比約為0.1%8%,更佳地約為0.2%5%。對(duì)于甲酸、乙酸等液態(tài)酸,也可使用體積比。通常,配制殼聚糖酸溶液所用的液態(tài)酸(如甲酸、或乙酸)濃度按體積比約為0.2%5%。在另一優(yōu)選例中,在所述混合溶液中,殼聚糖的濃度按重量體積比為0.5%-50/0。在另一優(yōu)選例中,在步驟(a)的所述混合溶液中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與殼聚糖按重量比為190:300。在另一優(yōu)選例中,凝膠浴含有三聚磷酸鈉或聚磷酸或其組合作為離子交聯(lián)劑,并且溶劑是水與醇(如乙醇或丙醇)的混合溶劑。更佳地,三聚磷酸鈉或聚磷酸的濃度按重量體積比為0.5-10%;乙醇或丙醇的濃度按體積比為5-50%。在另一優(yōu)選例中,凝膠浴的pH為26.5。在另一優(yōu)選例中,所述的活性蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。在另一優(yōu)選例中,所述的活性蛋白是重組的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。在本發(fā)明的第四方面,提供了一種藥物組合物,它含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明第一方面中所述的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球或第二方面中所述的活性蛋白的殼聚糖微球。應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。例如,就殼聚糖的分子量而言,范圍3100KDa的上限100KDa可以與另一優(yōu)選范圍550KDa的下限5KDa進(jìn)行組合,從而構(gòu)成范圍5-100KDa。限于篇幅,在此不再--累述。圖1顯示了在本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球制備過(guò)程示意圖。圖2顯示了本發(fā)明的微球整體形態(tài)。圖3顯示了本發(fā)明的微球表面形態(tài)。圖4顯示了本發(fā)明重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球異位成骨活性。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究,首次意外地發(fā)現(xiàn)將殼聚糖和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的混合溶液,在高壓靜電條件下,滴加于三聚磷酸鈉或聚磷酸的水溶液中,可以制得外觀圓整,均勻度好,顆粒規(guī)則無(wú)粘連的微球。凍干后的微球不粘連,再分散性好,且控釋性能優(yōu)異,包封率為75%100%,蛋白活性90%100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天累積釋放35%90%。在此基礎(chǔ)上,本發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明的微球制備方法工藝簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,易于實(shí)施,反應(yīng)條件溫和,無(wú)須添加乳化劑、化學(xué)交聯(lián)劑,利于重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的活性保持,通過(guò)調(diào)整殼聚糖分子量、殼聚糖脫乙酰度、殼聚糖濃度、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與殼聚糖重量比、凝膠浴濃度等工藝參數(shù)可調(diào)控微球粒徑和包封率?;钚猿煞秩绫疚乃?,術(shù)語(yǔ)"活性成分"狹義上指骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2或其活性衍生物或活性片段。廣義上,術(shù)語(yǔ)"活性成分"指各種蛋白或多肽類的活性蛋白,例如BMP-2,免疫球蛋白等。適用于本發(fā)明的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2沒(méi)有特別限制,可以是人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2或其他哺乳動(dòng)物的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2可以是天然的,也可以是重組的。當(dāng)然,優(yōu)選的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2是人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,尤其是重組的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。殼聚糖殼聚糖是由甲殼類動(dòng)物提取的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖組成的多聚糖。殼聚糖是甲殼素脫乙?;漠a(chǎn)物,作為唯一的堿性氨基多糖,具有來(lái)源廣泛,成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。此外,殼聚糖具有良好的生物黏附性、生物相容性、安全性,且降解產(chǎn)物無(wú)毒、無(wú)免疫原性、無(wú)致癌性并具有促進(jìn)藥物吸收的作用。另外,殼聚糖是一種線性長(zhǎng)鏈高聚物分子,含有大量可以與其他細(xì)胞分子形成氫鍵的-0H和-則2基團(tuán),當(dāng)環(huán)境pH小于其離子解離常數(shù)(6.5)時(shí),-NH2質(zhì)子化形成-NH/使分子帶正電。上述分子特性使殼聚糖成為優(yōu)良的生物粘附材料,可以有效攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等活性成分。在本發(fā)明中,所使用的殼聚糖沒(méi)有特別限制,通常,殼聚糖分子量為3100KDa,較佳地550KDa。脫乙酰度通常為40-99%,較佳地為50%95%。可否在將殼聚糖與其他物質(zhì)(尤其是一些可生物降解的材料)混合,構(gòu)成包封材料。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球復(fù)合物本發(fā)明提供了一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球,其中微球基質(zhì)為殼聚糖,包裹的藥物為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明微球"和"本發(fā)明的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球"可互換使用,都指由骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和殼聚糖為原料,通過(guò)靜電液滴-離子交聯(lián)法所制備的微球。在本發(fā)明的微球中,殼聚糖直鏈上的NH3+通過(guò)與離子交聯(lián)劑上P30,。5一發(fā)生分子間離子交聯(lián)反應(yīng)形成緊密地"梯"狀結(jié)構(gòu)將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2包裹其中。本發(fā)明微球外觀圓整,均勻度好,顆粒規(guī)則無(wú)粘連,平均粒徑為50900Wn,包封率為75%100%,蛋白活性95%100%保持。凍干后的微球不粘連(圖2)',再分散性良好,表面多皺褶(圖3),緩釋周期達(dá)4周以上,28天累積釋放35%90%。藥物組合物本發(fā)明還包括含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球的藥物組合物。所述的藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明上述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球。本發(fā)明還包括含有活性蛋白的殼聚糖微球的藥物組合物。所述的藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及本發(fā)明上述的活性蛋白的殼聚糖微球。本發(fā)明的微球可單獨(dú)直接用于疾病治療,還可與其他治療劑聯(lián)用,例如與其他促進(jìn)骨生成的化合物一起聯(lián)用。當(dāng)本發(fā)明的微球用于治療時(shí),它可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合,如溶劑、稀釋劑等,從而形成藥物組合物。通常,本發(fā)明的藥物組合物包括以下劑型如下口服給藥片劑、膠囊、可分散的粉末、顆粒或懸浮液(混懸劑)(含有如約0.05-5%懸浮劑(助溶劑))、糖漿(含有如約10_50%糖)、和酏劑(含有約20-50%乙醇),或者以無(wú)菌可注射溶液或混懸劑形式(在等滲介質(zhì)中含有約0.05-5%助溶劑)進(jìn)行非腸胃給藥。這些藥物制劑通常可含有與載體混合的約0.5-99.5wt%,較佳地2.5-90wt%,更佳地5y。-60wty。(重量)的活性成分(本發(fā)明的微球),按組合物的總重量計(jì)。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、口服或局部給藥。一種優(yōu)選的給藥方式是將本發(fā)明微球與修補(bǔ)骨損傷的材料混合,制成與骨缺損處相吻合的形狀,從而用于促進(jìn)在骨損傷處新骨的形成。所用的活性成分的有效劑量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。通常,當(dāng)本發(fā)明微球每天以約0.05-100mg/kg動(dòng)物體重(較佳地0.1-50mg/kg體重,更佳地O.5-20mg/kg體重給藥)的劑量給予時(shí),能得到令人滿意的效果。制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明微球的方法。簡(jiǎn)而言之,本發(fā)明方法可以稱為靜電液滴-離子交聯(lián)法。參見(jiàn)圖1,制備本發(fā)明微球的靜電液滴-離子交聯(lián)法的基本制備過(guò)程如下首先,提供含殼聚糖和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的混合溶液。在所述混合溶液中,殼聚糖的濃度按重量體積比為0.2-6%,較佳地為0.5%-5%。在所述混合溶液中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與殼聚糖的重量比通常為l100:300,較佳地為190:300,更佳地為350:300。所述混合溶液的溶劑為水或水性溶劑。如本文所用,"水性溶劑"指由水和其他溶劑(如醇溶劑)構(gòu)成的混合溶劑,其中在混合溶劑中水占50wt。/。以上。一類優(yōu)選的水性溶劑是水與醇(如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其組合)構(gòu)成的混合溶劑。然后,在高壓靜電作用下,將混合溶液滴入凝膠浴中,從而形成人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。在本發(fā)明中,高壓靜電場(chǎng)通常為輸出電壓直流100-1000V的靜電場(chǎng),較佳地為輸出電壓直流100-500V的靜電場(chǎng)。可采用市售的設(shè)備來(lái)產(chǎn)生所需的高壓靜電場(chǎng)。將混合溶液滴入凝膠浴的速度沒(méi)有特別限制,通??梢允莑-500ml/h,較佳地為5-200ml/h。在本發(fā)明中,凝膠浴是含離子交聯(lián)劑的水溶液或水性溶液,其pH為27(較佳地pH3-6.5,更佳地pH4-6)。離子交聯(lián)劑宜為三聚磯酸鈉、聚磷酸、或其組合。溶劑為水或水性溶劑。在本發(fā)明中,優(yōu)選的水性溶劑是水與醇(如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其組合)構(gòu)成的混合溶劑。其中,按混合溶劑的總體積計(jì)算,醇的用量為5-50%。本發(fā)明的結(jié)果表明,在凝膠浴中添加醇有利于微球分散,不產(chǎn)生粘連。本發(fā)明的凝膠浴無(wú)毒性,可溶于水,易清洗,不易殘留。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中,首先將殼聚糖溶于稀酸溶液中,所用的殼聚糖分子量在550KDa,脫乙酰度在50%95%,所用的酸為甲酸、乙酸、檸檬酸、或乳酸,殼聚糖的溶液按重量體積比為0.5%-5%,然后將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2按其與殼聚糖重量比為1100:300溶于殼聚糖溶液中,在高壓靜電作用(輸出電壓直流100-400V)下,將混合液滴入凝膠浴中,通過(guò)離子交聯(lián)制備出重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球,然后用去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(1)微球粒徑分布均勻,可在50900Wn之間調(diào)控,分散性和球形度良好;(2)凝膠浴pH為27,殼聚糖直接與其接觸,直鏈上的NH/通過(guò)與離子交聯(lián)劑上PA。5—發(fā)生分子間離子交聯(lián)反應(yīng)形成"梯"狀結(jié)構(gòu)將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2緊密包裹其中,交聯(lián)反應(yīng)迅速,包封率可達(dá)75%100%;(3)反應(yīng)條件溫和,無(wú)剪切震蕩,無(wú)須添加乳化劑、化學(xué)交聯(lián)劑,利于保持重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的活性,蛋白活性95%100%保持;(4)凍干后微球表面多皺褶,增大比表面積,利于被緊密包裹在微球內(nèi)部的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的釋放,28天累積釋放35%90%,緩釋周期可達(dá)4周以上;(5)制備工藝簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,易于實(shí)施,可以通過(guò)調(diào)整殼聚糖分子量、殼聚糖脫乙酰度、殼聚糖濃度、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2與殼聚糖重量比、凝膠浴濃度等工藝參數(shù)達(dá)到對(duì)微球粒徑、包封率的可控。(6)與現(xiàn)有技術(shù)中表面活性劑、油相、和石油醚等物質(zhì)殘留量高相比,本發(fā)明制備工藝中所用的原料如乙酸、三聚磷酸鈉、乙醇等,均溶于水,在后處理清洗過(guò)程中可去除,基本不殘留。解決了傳統(tǒng)乳化法制備載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微球不均勻、分散性差,引入表面活性劑、乳化劑、有機(jī)溶劑或化學(xué)交聯(lián)劑影響微球的生物相容性和蛋白的活性等問(wèn)題。下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明,否則份數(shù)和百分比按重量計(jì)。通用方法(1)平均粒徑顯微鏡下隨機(jī)挑取2-3組微球,每組不少于20個(gè)微球,讀取微球的粒徑,計(jì)算平均值。(2)包封率采用Bradford蛋白檢測(cè)法,按以下公式計(jì)算包封率=(原料液中蛋白質(zhì)含量-凝膠浴中蛋白質(zhì)含量)/原料中蛋白質(zhì)含量X100(3)累積釋放率累積釋放率=蛋白累積釋放量/微球中蛋白含量X100%(4)蛋白活性率將包裹在殼聚糖微球中的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2破囊后提取出。按提取出的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2蛋白,取等量重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2為對(duì)照,采用常規(guī)小鼠異位成骨技術(shù)及甲基麝香草酚藍(lán)比色法檢測(cè)活性,按下式計(jì)算蛋白活性保持率。蛋白活性率=提取蛋白的活性/對(duì)照蛋白的活性X100%實(shí)施例1:將分子量為5KDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖溶于2%乙酸的水溶液中,配制成重量體積比為1%的溶液,按照重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為3:100將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流350V)下滴入pH為4的凝膠浴中,制備成重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。所述凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%,乙醇的濃度為10%,且溶劑為水。去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。微球外觀圓整,均勻度好,顆粒規(guī)則無(wú)粘連。凍干后的微球不粘連,再分散性良好,表面多鮍褶(圖2和圖3)。經(jīng)測(cè)試,平均粒徑為100Wii,包封率為95%,蛋白活性100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天時(shí)累積釋放85.5%±5.8%。將昆明種小白鼠按體重的3%進(jìn)行水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)板上,取右側(cè)的大腿剃毛消毒,切開(kāi)約1cm的皮膚切口,鈍性分離大腿肌袋,用手術(shù)鉗擴(kuò)充出肌袋,植入含如上制備的含100微克rhBMP-2的殼聚糖微球的樣品后,縫合肌膜和皮膚。手術(shù)后放入飼養(yǎng)盒中,進(jìn)行正常的潔凈級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。4周致死動(dòng)物,迅速取出植入材料及其周圍軟組織。異位成骨活性試驗(yàn)測(cè)試表明,4周后在肌袋內(nèi)形成新鮮骨的平均鮮重為180毫克。證實(shí)所制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導(dǎo)成骨活性(圖4)。實(shí)施例2:將分子量為5KDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖溶于5%乙酸水溶液中,配制成重量體積比為5%的溶液,按照重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:10將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流150V)下滴入pH為4的凝膠浴中制備成重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%,乙醇的濃度為30%,且溶劑為水。去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。經(jīng)測(cè)試,微球平均粒徑為760Wn,包封率為80%,蛋白活性95%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天時(shí)累積釋放52.9%±3.8°/0。樣品經(jīng)小鼠肌袋內(nèi)植入異位成骨活性試驗(yàn)測(cè)試表明,4周后含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內(nèi)形成新鮮骨的平均鮮重為140毫克。證實(shí)所制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導(dǎo)成骨活性。實(shí)施例3:將分子量為50KDa、脫乙酰度為50%的殼聚糖溶于0.2%乙酸的水溶液中,配制成重量體積比為0.2%的溶液,按照重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為5:100將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流300V)下滴入pH為5的凝膠浴中制備成重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%,乙醇的濃度為30%,且溶劑為水。去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。經(jīng)測(cè)試,微球平均粒徑為250陶,包封率為90%,蛋白活性98%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天時(shí)累積釋放37.6%±5.7%。樣品經(jīng)小鼠肌袋內(nèi)植入異位成骨活性試驗(yàn)測(cè)試表明,4周后含100微克rh麗P-2的微球的樣品在肌袋內(nèi)形成新鮮骨的平均鮮重為110毫克。證實(shí)所制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導(dǎo)成骨活性。實(shí)施例4:將分子量為30KDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖溶于2%乙酸的水溶液中,配制成重量體積比為2%的溶液,按照重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:100將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流220V)下滴入pH為4的凝膠浴中制備成重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為3%,乙醇的濃度為30%,且溶劑為水。去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。經(jīng)測(cè)試,微球平均粒徑為450um,包封率為100%,蛋白活性100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天時(shí)累積釋放48.6%±4.3%。樣品經(jīng)小鼠肌袋內(nèi)植入異位成骨活性試驗(yàn)測(cè)試表明,4周后含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內(nèi)形成新鮮骨的平均鮮重為130毫克。證實(shí)所制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導(dǎo)成骨活性。實(shí)施例5:將分子量為30KDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖溶于2%乙酸溶液中,配制成重量體積比為2%的溶液,按照重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為30:100將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,混合液在高壓靜電作用(輸出電壓直流250V)下滴入pH為6.5的凝膠浴中制備成重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為3%,乙醇的濃度為30%。去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。經(jīng)測(cè)試,微球平均粒徑為520ym,包封率為75%,蛋白活性95%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天時(shí)累積釋放70.3%±8.3%。樣品經(jīng)小鼠肌袋內(nèi)植入異位成骨活性試驗(yàn)測(cè)試表明,4周后含100微克rh函P-2的微球的樣品在肌袋內(nèi)形成新鮮骨的平均鮮重為160毫克。證實(shí)所制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導(dǎo)成骨活性。實(shí)施例6-18重復(fù)實(shí)施例1的制備過(guò)程,不同點(diǎn)僅在于分別用以下條件替換實(shí)施例1中的相應(yīng)條件。在實(shí)施例6中,在凝膠浴中,用10%異丙醇替換10%乙醇。在實(shí)施例7中,在凝膠浴中,用10%異丙醇+10%乙醇替換10%乙醇。在實(shí)施例8中,用2%的檸檬酸溶液替換2%乙酸溶液。在實(shí)施例9中,用1%的甲酸溶液替換2%乙酸溶液。在實(shí)施例10中,用分子量為15KDa、脫乙酰度為70%的殼聚糖替換分子量為5KDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖。在實(shí)施例ll中,人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:300。在實(shí)施例12中,人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為80:300。在實(shí)施例13中,高壓靜電條件為輸出電壓直流480V。在實(shí)施例14中,高壓靜電條件為輸出電壓直流200V。在實(shí)施例15中,凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為6%。在實(shí)施例16中,凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為10%。含有1%聚磷酸。在實(shí)施例18中,凝膠浴中三聚磷酸鈉的濃度為2%并且含有3%聚磷酸。結(jié)果同樣制備了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球。經(jīng)測(cè)試,這些微球平均粒徑為70-800微米。包封率為75-95%,蛋白活性保持率約95%,緩釋周期達(dá)4周以上。另外,實(shí)施例1-18的結(jié)果提示,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和殼聚糖的混合溶液中殼聚糖的濃度越大,則微球的平均粒徑越大。高壓靜電的電壓值越高,平均粒徑約小。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和殼聚糖的混合溶液中殼聚糖重量比例越大,凝膠浴中離子交聯(lián)劑濃度越大,凝膠浴pH越小,包封率越高。另外,本發(fā)明微球大小非常均一,其粒徑發(fā)布窄,幾乎90%以上(如100%)的微球粒徑在0.9M1.1M范圍內(nèi),其中M是微粒的平均粒徑(如下表所示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例19實(shí)施例19與實(shí)施例4基本相同,不同點(diǎn)在于使用不含醇的凝膠浴。方法如下將分子量為30KDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖溶于2%乙酸溶液中,配制成重量體積比為2%的溶液,按照重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/殼聚糖重量比為1:100將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2溶于其中,混合液在高壓靜電作用下滴入pH為4的凝膠浴中制備成重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。凝膠浴為三聚磷酸鈉的水溶液,濃度為3%。去離子水清洗微球,冷凍干燥后保存待用。經(jīng)測(cè)試,微球較易分散,平均粒徑為470um,包封率為100%,蛋白活性100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天時(shí)累積釋放50.4%±3.6%。樣品經(jīng)小鼠肌袋內(nèi)植入異位成骨活性試驗(yàn)測(cè)試表明,4周后含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內(nèi)形成新鮮骨的平均鮮重為134毫克。證實(shí)所制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球具有好的誘導(dǎo)成骨活性。與實(shí)施例19(不含醇溶劑的凝膠浴出)相比,添加一定濃度的醇溶劑(如實(shí)施例4)有利于微球分散,不產(chǎn)生粘連,對(duì)粒徑、包封率等影響不顯著。實(shí)施例20重復(fù)實(shí)施例1的制備過(guò)程,不同點(diǎn)僅在于用免疫球蛋白G蛋白替換重組的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。結(jié)果,制得了免疫球蛋白G的殼聚糖微球。經(jīng)測(cè)試,微球平均粒徑約為120微米,包封率為75%。這表明,本發(fā)明的靜電液滴-離子交聯(lián)法同樣可適用于包封其他活性蛋白。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1、一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球,其特征在于,微球基質(zhì)成分為殼聚糖,包裹的藥物為人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,殼聚糖通過(guò)與離子交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2包裹其中,并且所述微球的平均粒徑在50~1000μm,包封率在75%~100%,蛋白活性90%~100%保持,緩釋周期達(dá)4周以上,28天累積釋放為35%~90%。2、如權(quán)利要求1所述的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球,其特征在于,90%以上的所述微球的粒徑在0.9ML1M范圍內(nèi),其中M是所述微粒的平均粒徑。3、如權(quán)利要求1所述的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球,其特征在于,所述微球中選自下組的物質(zhì)的各自含量《0.05wt%:表面活性劑、油相、和石油醚。4、如權(quán)利要求1所述的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球,其特征在于,所述的微球是采用靜電液滴-離子交聯(lián)法制備的。5、一種制備活性蛋白的殼聚糖微球的方法,其特征在于,包括步驟(a)提供一含殼聚糖和所述活性蛋白的混合水溶液或水性溶液;其中,在所述混合溶液中,殼聚糖的濃度按重量體積比為0.2-6%;并且所述活性蛋白與殼聚糖的重量比1100:300;和(b)在靜電場(chǎng)下,將所述的混合溶液滴入凝膠浴中,從而形成活性蛋白的殼聚糖微球,其中所述的凝膠浴是含離子交聯(lián)劑的水溶液或水性溶液,其PH為27。6、如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟(a)的混合溶液中含有0.01-1.5M酸,并且在所述濃度的酸存在下對(duì)活性蛋白的活性無(wú)不利影響。7、如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,配制殼聚糖酸溶液所用的酸濃度按重量比為0.1%8%。8、如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,在所述混合溶液中,殼聚糖的濃度按重量體積比為0.5%-5%。9、如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述的活性蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。10.—種藥物組合物,其特征在于,它含有藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求1所述的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖微球及其制備方法。本發(fā)明的微球基質(zhì)成分為殼聚糖,包裹的藥物為重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,平均粒徑為50-900μm,包封率可達(dá)75%~100%,蛋白活性保持率高,緩釋周期長(zhǎng)。本發(fā)明微球外觀圓整,均勻度好,顆粒規(guī)則無(wú)粘連,凍干后的微球不粘連,再分散性良好。本發(fā)明還提供了制備所述微球的方法,該方法工藝簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,易于實(shí)施,反應(yīng)條件溫和,無(wú)須添加乳化劑、化學(xué)交聯(lián)劑。文檔編號(hào)A61K9/16GK101637454SQ20091005128公開(kāi)日2010年2月3日申請(qǐng)日期2009年5月14日優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日發(fā)明者劉昌勝,馬莉華申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)
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