專利名稱：添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法，涉及吸水鏈霉菌發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Microbial transglutaminase，簡(jiǎn)稱MTG)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)，從而直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的特性，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，生產(chǎn)出滿足人們需求的新型蛋白食品?，F(xiàn)在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用在許多方面在食品加工過(guò)程中，可以保護(hù)食品蛋白質(zhì)中的賴氨酸避免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而保護(hù)限制性氨基酸，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；在肉制品加工中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的交聯(lián)作用將一些低價(jià)值的碎肉進(jìn)行重組，從而改善其外觀、結(jié)構(gòu)、風(fēng)味，以提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值；在水產(chǎn)品保鮮中，可通過(guò)形成可食性的薄膜，包埋脂類物質(zhì)；在乳制品加工中，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)性；在醫(yī)藥工業(yè)中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶包埋脂類或脂溶性物質(zhì)，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中，提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業(yè)，還被用來(lái)提高蠶絲織物以及羊毛織物的品質(zhì)。
目前生產(chǎn)MTG的方法主要是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，目前商業(yè)化的產(chǎn)品主要由日本味之素等公司生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)MTG尚處于起步階段，菌種主要為茂原鏈霉菌，生產(chǎn)水平較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案菌種吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC No.203062(中國(guó)專利03152956.92003年公開(kāi))，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)研究室保藏和提供。
培養(yǎng)基麥汁斜面培養(yǎng)基(g/L)麥汁50，葡萄糖4，酵母膏4，瓊脂20，PH7.0。
種子培養(yǎng)基(g/L)甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)淀粉5，甘油20，葡萄糖5，蛋白胨15，冷榨豆餅粉30，酵母膏5，碳酸鈣5，NaH2PO45，Na2HPO45，Mg2SO45，pH8.0。
培養(yǎng)方法將成熟的孢子接種到麥汁斜面上，32℃下培養(yǎng)10～20d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無(wú)菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。吸取種子培養(yǎng)液，按4％～8％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)48h。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力的測(cè)定方法發(fā)酵液經(jīng)離心后的清液稀釋5倍后用于活力的測(cè)定。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力采用分光光度法在37℃下測(cè)定。吸取0.4mL稀釋樣品于試管中，加入1mL試劑A；37℃水浴保溫10min，加入0.4mL試劑B，終止反應(yīng)，525nm波長(zhǎng)比色。
試劑A將100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)完全溶解于2mL 0.2mol/L的NaOH溶液中，并加入4mLa溶液，2mL b溶液和2ml c溶液，調(diào)pH為6.0。[a溶液0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，pH6.0；b溶液1mol/L羥胺；c溶液0.01mol/L GSH(還原型谷光甘肽)]。
試劑B3mol/L HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1mol/LHCl中)按1∶1∶1混合配制。一個(gè)單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活定義(U/mL)37℃時(shí)每分鐘催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量。
提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是一種胞外酶，首先生成沒(méi)有酶活力的酶原，經(jīng)蛋白酶切割后生成有活力的成熟酶。在普通的發(fā)酵過(guò)程中，由于蛋白酶抑制劑的存在，酶原只能在特定階段緩慢逐步地轉(zhuǎn)化為成熟酶。
在發(fā)酵過(guò)程中，適時(shí)添加適量的胰蛋白酶可以促進(jìn)產(chǎn)酶，實(shí)現(xiàn)了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的高表達(dá)。可以使酶原從一產(chǎn)生就開(kāi)始大量迅速地轉(zhuǎn)化為成熟酶，從而使生物反應(yīng)的平衡發(fā)生改變，產(chǎn)生更多的酶原，最終提高發(fā)酵的產(chǎn)酶量。在發(fā)酵至0-16h在發(fā)酵液中添加10-100U/mL的胰蛋白酶，發(fā)酵終了時(shí)發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶活水平達(dá)5.6U/mL。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明選用的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13合成的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶為胞外酶，并且是迄今為止已報(bào)道過(guò)的熱、堿穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)交聯(lián)特性都較好的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，用于食品加工、醫(yī)藥行業(yè)以及紡織行業(yè)具有很大的潛力。所用的胰蛋白酶價(jià)格低廉，用量少，顯著提高了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量，搖瓶培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)水平達(dá)國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中，在發(fā)酵的0h添加20U/ml的胰蛋白酶，發(fā)酵至結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量為5.64U/mL，比不加胰蛋白酶的對(duì)照例提高了35.2％。不添加胰蛋白酶的發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量為4.17U/mL。
實(shí)施例2在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中，在發(fā)酵的16h添加50U/mL的胰蛋白酶，發(fā)酵至結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量為5.24U/mL。
實(shí)施例3在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵液中，在發(fā)酵的8h添加10u/ml的胰蛋白酶，發(fā)酵至結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量為5.42U/mL。
權(quán)利要求
1.一種提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法，其特征是采用吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，菌種保藏編號(hào)為CCTCC NO203062，作為出發(fā)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加胰蛋白酶，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的發(fā)酵產(chǎn)酶量。。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在發(fā)酵過(guò)程中添加胰蛋白酶，發(fā)酵至0-16h在發(fā)酵液中添加10-100U/mL的胰蛋白酶。
全文摘要
一種添加胰蛋白酶提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法，涉及吸水鏈霉菌發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用吸水鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加胰蛋白酶，最終實(shí)現(xiàn)了提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的目標(biāo)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所用胰蛋白酶用量較少，且價(jià)格低廉，可顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量，在其它培養(yǎng)條件相同的情況下，本發(fā)明比不添加胰蛋白酶的對(duì)照例產(chǎn)量提高達(dá)35％，達(dá)到發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的先進(jìn)水平。
文檔編號(hào)C12R1/55GK1944632SQ200610097160
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月28日
發(fā)明者陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 程力, 張東旭 申請(qǐng)人:江南大學(xué)