專利名稱：一種提高靈芝多糖產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用稀土元素提高靈芝多糖產(chǎn)量的 液體發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma lucidum)為擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝菌屬真菌。在中國古代 被盛傳為仙草，古代醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)靈芝通過扶正固本使人體處于平衡狀態(tài)。靈芝多糖是靈芝 最主要的生理活性物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、防止動脈硬化等作 用。在靈芝藥用價值被廣泛揭示的同時，靈芝多糖的產(chǎn)量成為抑制其應(yīng)用的限制因素，因?yàn)?在自然界中野生靈芝十分稀少，遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。研究發(fā)現(xiàn)從靈芝子實(shí)體或菌絲體 得到的靈芝多糖在基本結(jié)構(gòu)上是相同的。采用靈芝液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)靈芝多糖因?yàn)榫哂?生產(chǎn)周期短、勞動力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種有效的方法。但靈芝多糖的發(fā)酵水平不高，產(chǎn)量偏低限制了其工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。目前，國內(nèi)外 學(xué)者對靈芝多糖的發(fā)酵研究主要集中在培養(yǎng)基組成、溶氧、PH值及產(chǎn)物提取分離等工藝層 面上，對靈芝多糖發(fā)酵水平提高有限，還不能滿足現(xiàn)代工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要。稀土元素是化學(xué)元素周期表中鑭系元素及兩個相關(guān)元素鈧和釔的總稱，我國稀土 資源豐富，占世界貯量的80%。目前，稀土元素的應(yīng)用越來越廣泛，不僅應(yīng)用于各工業(yè)部門， 其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、微生物等生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究也越來越活躍。近年來有關(guān)利用稀土元素 提高微生物發(fā)酵產(chǎn)物的研究也有報(bào)道，如王怡平等.稀土元素對紅酵母的生長及類胡蘿卜 素合成的影響.微生物學(xué)通報(bào)，1999，26 (2) :117-119。稀土元素對紅菇多糖深層發(fā)酵也具 有一定的促進(jìn)作用，參見李增利.稀土元素鐠、釹、鉺對紅菇多糖深層發(fā)酵的影響.食品科 學(xué)，2007,28(12) :312-316。目前，稀土元素在靈芝液體發(fā)酵上的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。CN1264743公開了一種液體發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝，是以靈芝屬 Ganodermalucidum(LeyssexFr.)Karst.的菌種接種于有培養(yǎng)基的搖瓶中，回旋培養(yǎng)，發(fā)酵 4 12天，然后采用常規(guī)的方法從發(fā)酵產(chǎn)物中收集靈芝多糖和靈芝酸，培養(yǎng)基為常規(guī)的含 有碳源、氮源、無機(jī)鹽和維生素成分的培養(yǎng)基，濃硫酸_苯酚法測定胞內(nèi)和胞外多糖總量為 2. 34g/L。該方法的不足之處是需要靜置培養(yǎng)誘導(dǎo)合成產(chǎn)物的過程，發(fā)酵周期長，液體好氧 發(fā)酵加上靜置培養(yǎng)的總發(fā)酵時間需20天以上，而一般靈芝產(chǎn)品發(fā)酵時間為5 8天，因此 其整體的生產(chǎn)效率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供稀土元素在靈芝多糖液體發(fā)酵中的應(yīng)用，同時提供稀土元素在靈 芝多糖發(fā)酵中的使用方法，從而提供一種工藝簡單、成本低廉、效果顯著，利用稀土元素提 高靈芝多糖產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，本方法可用于靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述靈芝 多糖包括胞外多糖和胞內(nèi)多糖。本發(fā)明技術(shù)方案如下
一種利用稀土元素提高靈芝多糖產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括以下步驟1、稀土元素母液的配制稱取硝酸鐠、硝酸釹或硝酸鑭中的一種，用蒸餾水配制成濃度lmol/L的溶液，作 為稀土元素母液備用。2、靈芝種子液制備將靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.) Karst.菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng) 基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g和蒸餾水IOOOmL, 培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時間5 8天，得到靈芝種子液。所說的菌種為CGMCC No. 5. 75、CGMCC No. 5. 110、CGMCC No. 5. 533、 CGMCCNo. 5. 616、CGMCC No. 5. 644 或 CGMCC No. 5. 653。3、將步驟1配制的稀土元素母液加入到與步驟2相同的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 制備含有濃度為0. 001-0. lmmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基。所述稀土元素為鐠Pr3+、釹 Nd3+ 或鑭 La3+。4、靈芝多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2獲得的靈芝種子液按2 8%體積比接種量接入到步驟3制備的含有濃 度為0. 001-0. 15mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速 100 180r/min，溫度25 30°C，時間5 8天，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體。按現(xiàn)有技術(shù)分離發(fā)酵液和靈芝菌絲體后，分別提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖。優(yōu)選的，上述步驟2中，所述的菌種為菌種編號為CGMCC No. 5. 644的泰山赤靈芝 (Ganoderma lucidum)，菌種編號為 CGMCC No. 5. 533 的京大靈芝(Ganoderma lucidum)或 菌種編號為CGMCC No. 5. 534的信州靈芝(Ganoderma lucidum)。其中最優(yōu)選的菌種為菌種 編號為 CGMCC No. 5. 644 的泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)。優(yōu)選的，上述步驟1中，所述硝酸鐠、硝酸釹和硝酸鑭的純度均為99%。根據(jù)上述方法，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選如下步驟(2)所述的稀土元素優(yōu)選為鐠Pr3+或釹Nd3+，最優(yōu)選的稀土元素為鐠Pr3+。步驟⑵所述的稀土元素在PD液體培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為鑭La3+O. 01-0. IOmmol/ L、釹 Nd3+O. 01-0. IOmmol/L 或鐠 Pr3+O. 001-0. 01mmol/L。從發(fā)酵液和靈芝菌絲體分別提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖的方法按現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明 提供以下說明胞外多糖提取取50mL除去靈芝菌絲體的發(fā)酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混 勻后，IOOOOrpm離心lOmin，取沉淀，用6mL IN NaOH 60°C溶解lh，即為胞外多糖溶液。胞內(nèi)多糖提取稱取0. Ig(干重)靈芝菌絲體，用1.0N的NaOH于60°C浸提lh。 12000r/min，離心5min，取上清液為胞內(nèi)多糖溶液。靈芝多糖的測定，采用本領(lǐng)域通用的濃硫酸_苯酚法測定胞內(nèi)、胞外多糖。從上述的胞外多糖測定溶液、胞內(nèi)多糖測定溶液中分別取樣品，按以下方法測 定從各個樣品中吸取5yL于試管中，用蒸餾水定容至l.OmL，搖勻?？瞻讓φ諡?1. OmL水。分別加入5%苯酚試液1. OmL，再迅速滴加濃硫酸各5. OmL，搖勻，冷至室溫，測OD 490nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。
本發(fā)明所產(chǎn)靈芝多糖可用于免疫力調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖等藥物的制備。本發(fā)明與已有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明將稀土元素鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+用于靈芝多糖的液體發(fā)酵，大幅度提 高靈芝多糖的產(chǎn)量，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量可達(dá)772. 56mg/L，胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)452. 76mg/L，具有 很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2、本發(fā)明采用液體好氧發(fā)酵方法，周期短，一般為5 8天，無需靜置培養(yǎng)誘導(dǎo)合 成產(chǎn)物的過程，生產(chǎn)效率較高。3、本發(fā)明所述稀土元素Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+來源廣泛，均具有很好的促進(jìn)效果， 實(shí)驗(yàn)方法簡便，重復(fù)性好。4、本發(fā)明所采用的靈芝液體發(fā)酵工藝簡單，環(huán)保無毒，原材料成本低廉，更為重要 的是整個發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1是實(shí)施例1稀土元素對靈芝胞外多糖產(chǎn)量的影響曲線。圖2是實(shí)施例2稀土元素對靈芝胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響曲線。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹和硝酸鑭，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所購得。所有靈芝菌種均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。實(shí)施例1 靈芝菌種為泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)，菌種編號為CGMCC No. 5. 644。一種利用稀土元素提高靈芝多糖液體發(fā)酵方法，具體步驟為1、稀土元素母液的配制分別稱取純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹和硝酸鑭，用蒸餾水分別配制成濃度 lmol/L的溶液。作為稀土元素母液備用。2、靈芝種子液制備將靈芝菌種CGMCC No. 5. 644接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，蒸餾水IOOOmL)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時間6天，得到靈芝種子液。3、取步驟1配制的3種稀土元素母液各3份，分別加入到與步驟2相同的PD液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中，制備含有濃度為0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、0. lmmol/L稀土元素的PD液體 培養(yǎng)基系列。所述稀土元素為鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+。4、液體發(fā)酵培養(yǎng)將上述步驟2獲得的靈芝種子液按5% (V/V)的接種量分別接入到步驟3制備的 含有濃度為0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、0. lmmol/L稀土元素的系列PD液體培養(yǎng)基中，分別 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時間7天，得發(fā)酵液 和靈芝菌絲體5、在15000rpm下離心分離步驟4的產(chǎn)物，得到靈芝菌絲體和除去菌絲體的發(fā)酵液。分別按現(xiàn)有技術(shù)提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖。為了考察稀土元素對靈芝胞外多糖產(chǎn)量的影響，進(jìn)行如下測定胞外多糖溶液的制備取50mL除去菌體的發(fā)酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混 勻后，IOOOOrpm離心lOmin，取沉淀，用6mL IN NaOH 60°C溶解lh，即為胞外多糖溶液。多糖的測定從各個樣品中吸取5. O μ L上清液于試管中，用蒸餾水定容至1. OmL, 搖勻?？瞻讓φ諡?. OmL水。分別加入5%苯酚試液1. OmL，再迅速滴加濃硫酸各5. OmL，搖 勻，冷至室溫，測OD 490nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出稀土元素鐠、釹和鑭均明顯促進(jìn)了靈芝胞外多糖的合成，其中稀 土元素鐠促進(jìn)效果最明顯，當(dāng)鐠在濃度0. OOlmmol/L時，靈芝胞外多糖產(chǎn)量為452. 76mg/L, 是不加稀土元素的對照組(148.45mg/L)的3. 05倍；其次，稀土元素釹對靈芝胞外多糖生 產(chǎn)促進(jìn)效果最好，在濃度為0. Olmmol/L時，產(chǎn)量達(dá)到355. 74mmol/L，是對照的2. 40倍；而 稀土元素鑭在濃度為0. 01mmol/L時也具有較好的促進(jìn)作用，產(chǎn)量為186. 24mg/L，是對照的 1. 25倍。圖1中稀土元素濃度為Ommol/L時的產(chǎn)量即為空白對照值。實(shí)施例2 靈芝菌種為泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)，菌種編號為CGMCC No. 5. 644?！N利用稀土元素提高靈芝多糖液體發(fā)酵方法，具體步驟為1、稀土元素母液的配制分別稱取純度為99%的硝酸鐠、硝酸釹和硝酸鑭，用蒸餾水分別配制成濃度 lmol/L的溶液。作為稀土元素母液備用。2、靈芝種子液制備將靈芝菌種CGMCC No. 5. 644接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，蒸餾水IOOOmL)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時間7天，得到靈芝種子液。3、取步驟1配制的3種稀土元素母液各3份，分別加入到與步驟2相同的PD液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中，制備含有濃度為0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、0. lmmol/L稀土元素的PD液體 培養(yǎng)基系列。所述稀土元素為鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+。4、液體發(fā)酵培養(yǎng)將上述步驟2獲得的靈芝種子液按 % (V/V)的接種量分別接入到步驟3制備的 含有濃度為0. 001mmol/L、0. 01mmol/L、0. lmmol/L稀土元素的系列PD液體培養(yǎng)基中，分別 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，溫度25 30°C，時間7天，得發(fā)酵液 和靈芝菌絲體。5、在15000rpm下離心分離步驟4的產(chǎn)物，得到靈芝菌絲體和除去菌絲體的發(fā)酵 液。分別按現(xiàn)有技術(shù)提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖。為了考察稀土元素對靈芝胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響，進(jìn)行如下測定胞內(nèi)多糖測定溶液的制備稱取0. Ig (干重)靈芝菌絲體，用1.0N的NaOH于60°C 浸提lh。12000r/min，離心5min，取上清液，作為胞內(nèi)多糖待測溶液。多糖的測定從各個樣品中吸取5. 0 μ L上清液于試管中，用蒸餾水定容至1. OmL, 搖勻?？瞻讓φ諡?. OmL水。分別加入5%苯酚試液1. OmL，再迅速滴加濃硫酸各5. OmL，搖 勻，冷至室溫，測OD 490nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。結(jié)果如圖2所示。
由圖2可知稀土元素鐠Pr3+對靈芝胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量促進(jìn)效果最顯著，當(dāng)鐠在濃 度為0. Olmmol/L時，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到772. 56mg/L，是對照組的4. 67倍；其次是稀土元素 釹Nd3+，在濃度0. lmmol/L時，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到514. 12mg/L，是對照的3. 10倍；稀土元素 鑭La3+誘導(dǎo)效果，在0. OOlmmol/L時，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到235. 40mg/L，僅為對照的1. 40倍。 圖2中稀土元素濃度為Ommol/L時的產(chǎn)量即為空白對照值。實(shí)施例3 如實(shí)施例1所述，所不同的是靈芝菌種為京大靈芝(Ganoderma lucidum)菌種編號為CGMCC No. 5. 533 ；步驟3中所述稀土元素為鐠Pr3+，結(jié)果靈芝胞外多 糖產(chǎn)量可達(dá)435. 22mg/L。 實(shí)施例4 如實(shí)施例2所述，所不同的是靈芝菌種為京大靈芝(Ganoderma lucidum)菌種編號為CGMCC No. 5. 533 ；步驟3中所述稀土元素為鑭La3+，結(jié)果靈芝胞內(nèi)多 糖產(chǎn)量可達(dá)682. 31mg/L。實(shí)施例5 如實(shí)施例1所述，所不同的是靈芝菌種為信州靈芝(Ganoderma lucidum)菌種編號為CGMCC No. 5. 534 ；步驟3中所述稀土元素為釹Nd3+，結(jié)果靈芝胞外多 糖產(chǎn)量可達(dá)417. 36mg/L。實(shí)施例6 如實(shí)施例2所述，所不同的是靈芝菌種為信州靈芝(Ganoderma lucidum)菌種編號為CGMCC No. 5. 534 ；步驟3中所述稀土元素為鐠Pr3+，結(jié)果靈芝胞內(nèi)多 糖產(chǎn)量可達(dá)702. 25mg/L。
權(quán)利要求
一種提高靈芝多糖產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括以下步驟(1)稱取硝酸鐠、硝酸釹或硝酸鑭，用蒸餾水配制成濃度1mol/L的溶液，作為稀土元素母液備用；(2)將靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.菌種接種到PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為馬鈴薯200g、葡萄糖20g和蒸餾水1000mL，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，時間5～8天，得到靈芝種子液；所說的菌種為CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCNo.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653；(3)將步驟(1)配制的稀土元素母液加入到與步驟(2)相同的PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，制備含有濃度為0.001-0.1mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基；所述稀土元素為鐠Pr3+、釹Nd3+或鑭La3+；(4)將步驟(2)獲得的靈芝種子液按2～8％體積比接種量接入到步驟(3)制備的含有濃度為0.001-0.15mmol/L稀土元素的PD液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100～180r/min，溫度25～30℃，時間5～8天，得發(fā)酵液和靈芝菌絲體；按現(xiàn)有技術(shù)分離發(fā)酵液和靈芝菌絲體后，分別提取胞外多糖和胞內(nèi)多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的菌種為菌種編號為 CGMCCNo. 5. 644 的泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)，菌種編號為 CGMCC No. 5. 533 的京 大靈芝(Ganoderma lucidum)或菌種編號為CGMCC No. 5. 534的信州靈芝(Ganoderma lucidum)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的菌種為菌種編號為 CGMCCNo. 5. 644 的泰山赤靈芝(Ganoderma lucidum)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的稀土元素為鐠Pr3+或釹Nd3+。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的稀土元素為鐠Pr3+。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的稀土元素在PD液體培養(yǎng)基 中的濃度為鑭 La3+O. 01-0. 10mmol/L、釹 Nd3+O. 01-0. IOmmol/L 或鐠 Pr3+O. 001-0. 01mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種提高靈芝多糖產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法。該方法是利用靈芝細(xì)胞的液體培養(yǎng)，通過在培養(yǎng)基中添加稀土元素鐠、釹或鑭，提高靈芝多糖的產(chǎn)量。所產(chǎn)靈芝多糖可用于免疫力調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖等藥物的制備。
文檔編號C12P19/04GK101880700SQ201010230690
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者任海霞, 任鵬飛, 劉巖, 姚強(qiáng), 宮志遠(yuǎn), 曲玲, 李瑾, 趙軍勝, 韓建東, 高興喜 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所