專利名稱：雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑點雜交檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞致病性外源性禽白血病病毒核酸探針交叉斑點雜交檢測試劑 盒，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽白血病及禽白血病病毒禽白血病毒(ALV)是一種基因組為單股RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒，類似于人的艾滋病毒， 但不感染人。不同的鳥類可能感染不同的ALV，根據(jù)病毒與宿主細胞特異性相關(guān)的囊膜蛋白 的抗原性，ALV可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十個亞群。但自然感染雞群的還只有A， B，C，D，E和J六個亞群。有致病性的分屬于A、B、C、D和J亞群，其中的J亞群對雞的致病 性和傳染性最強。而E亞群是非致病性的或者致病性很弱，但也有個別外源性ALV的致病 性也很弱。由致病性ALV引發(fā)的雞白血病可表現(xiàn)為多種不同臟器不同細胞類型的腫瘤，在嚴 重感染的雞群其死淘率可高達20 %。此外，ALV感染還能弓I起生長遲緩、免疫抑制和產(chǎn)蛋下 降等病理表現(xiàn)，對養(yǎng)雞業(yè)的危害很大。1.禽白血病病毒外源性病毒和內(nèi)源性病毒ALV與其他病毒不同的一個最大特點 是，雞的ALV還可分為外源性ALV和內(nèi)源性ALV 二大類。雞的外源性ALV是指不會通過宿 主細胞染色體傳遞的ALV，包括A，B, C，D和J亞群，致病性強的雞ALV都屬于外源性病毒。 它們既可以象其他病毒一樣在細胞與細胞間以完整的病毒粒子形式在個體與群體間通過 直接接觸或污染物發(fā)生橫向傳染，也能以完整的病毒粒子形式通過雞胚從種雞垂直傳染給 后代。內(nèi)源性ALV是指前病毒cDNA可整合進宿主細胞染色體基因組、并能穩(wěn)定遺傳，因而 可通過染色體垂直傳播的ALV0它可能只是基因組的不完全片斷，不會產(chǎn)生傳染性病毒，一 般也與致病性無關(guān)。但也可能是全基因組因而能產(chǎn)生傳染性病毒，不過這類病毒通常致病 性很弱或沒有致病性。目前發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生傳染性病毒的內(nèi)源性ALV都屬于E亞群。雞細胞 基因組某個特定位點含有(穩(wěn)定地整合)能復(fù)制可傳染性病毒粒子的E亞群ALV的全基因 組，如性染色體Z上與決定快慢羽相關(guān)基因K緊密連鎖的ev21位點。從這個ev21可產(chǎn)生 傳染性病毒EV21。(Bacon et al. 1988, Poultry Science)。E亞群內(nèi)源性ALV通常沒有致 病性，但會干擾對白血病的鑒別診斷。種雞群凈化ALV，在現(xiàn)階段主要是凈化外源性病毒。 我們了解雞群有無ALV感染，在現(xiàn)階段也僅是指外源性病毒感染，特別是那些有致病性的 外源性ALV感染。2.養(yǎng)雞業(yè)對鑒別外源性病毒和內(nèi)源性病毒的需求。近幾年來，雞白血病在我國不 同地區(qū)的流行呈漫延趨勢。為了有效地預(yù)防控制雞群中ALV的流行，必須要解決二個問題 (1)雞的腫瘤病的病原學(xué)鑒別診斷；(2)種雞的凈化。雖然目前已有商品化的ALV的p27抗 原檢測試劑合用于病料或其它樣品中ALV的檢測，但由于p27是各個亞群共同的抗原，因此 對P27抗原的檢測不能區(qū)別致病性的外源性ALV和無致病性的內(nèi)源性ALV，不能直接用于病料或其它樣品中有無致病性外源性ALV的鑒別性檢測。而常規(guī)雞群中，許多個體都攜帶內(nèi) 源性E亞群ALV或其它亞群ALV的基因組片段，因此，不論是為了現(xiàn)場病例的鑒別診斷還是 為凈化ALV對原祖代雞群的定期檢測都有賴于對外源性ALV的鑒別性檢測，特別是那些有 致病性的外源性ALV。目前用于外源性ALV鑒別性檢測的方法有二種將腫瘤病料或其它待檢樣品(如 血漿、蛋清等)接種于對內(nèi)源性E亞群ALV有抵抗力的Dfl細胞上，培養(yǎng)14天后，再用商品 化的ALV p27抗原ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清液或細胞裂介液中的p27。如果檢測出 P27抗原，表明檢測出外源性ALV?；蛴孟鄳?yīng)的ALV特異性抗體做簡接熒光抗體反應(yīng)(IFA) 來觀察有無ALV感染。這一方法也可適用于大量樣品的檢測(如大于100份)，但細胞培 養(yǎng)分離病毒這種試驗一般需要在能熟練實施細胞培養(yǎng)技術(shù)的專業(yè)化試驗室內(nèi)完成。這一方 法，一般需要10 15天才能完成。而且檢測水平受細胞培養(yǎng)的狀態(tài)影響很大，對實驗室技 術(shù)和經(jīng)驗的要求非常高。另一個方法是從病料或樣品中直接用PCR擴增ALV的env基因和 LTR，將選擇到的PCR產(chǎn)物克隆送商業(yè)化公司做核酸測序，根據(jù)完整的env基因和LTR的序 列比較，以確定是否存在有致病性的外源性ALV。應(yīng)用這一技術(shù)一般需要1-3周的時間(決 定于操作人員技術(shù)和商業(yè)公司服務(wù)的即時服務(wù)效率，這是不可控的)，且這一方法不適合于 需檢測大量樣品的種雞群凈化的檢測。對大量不同亞群ALV分離株(包括大約15個國際參考株及約20個我們自行分 離鑒定的我國分離株)的序列比較證明，有致病性的外源性ALV在其的基因組3'末端 的U3獨特區(qū)片段的同源性均在80%以上，而與無致病性的內(nèi)源性E亞群ALV的U3片段 間的同源性均在40%以下。(見附表1，2，3和4)。近幾年來在美國和中國均報道了一些 具有內(nèi)源性ALV的U3區(qū)的重組A亞群外源性ALV(Zavala and Cheng. 2006. Detection and characterization of avian leukosis virusin Marek' s disease vaccines. Avain Dis, 50 :209-215. ；Zavala G, Cheng S, Jackwood MW. Molecularepidemiology of avian leukosis virus subgroup J and evolutionary history of its 3' untranslated region. Avian Dis, 2007, 51 (4) :942_53.；張青嬋，趙冬敏，郭慧君，崔治中.Isolation and Identification of a Subgroup A Avian Leukosis Virus fromlmported Meat-type Grand-parent Chickens. Virologica Sinica. 2010, 25(2) : 130-136),這給 U3區(qū)核酸特異性的意義提出了疑問。但不論是帶有內(nèi)源性ALV的U3的美國重組病毒 PDRC-1339、PDRC-1346 和 PDRC-1349 (Zavala G, Cheng S. Experimental infection with avianleukosis virus isolated from Marek' s disease vaccines. Avian Dis,2006b, 50(2) -.232-237. ；Barbosa et al. ,Molecular characterization of three recombinant isolates of avianleukosis virus obtained from contaminated Marek' s disease vaccines. Avian Dis. 2008,52 -.245-252.)，還是本發(fā)明人分離鑒定的重組病毒SDAU09E1 株，它們的致病性及在體內(nèi)體外細胞培養(yǎng)上的復(fù)制能力均較常規(guī)的有致病性的外源性ALV 低得多。這些毒株雖然屬外源性，但由于致病性弱或在細胞上的復(fù)制能力很弱，顯著不同于 危害養(yǎng)雞業(yè)的致病性外源性ALV。本

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能同時鑒別性地檢測大量樣品中的有致病性的外源 性ALV的特異性狄可辛核酸探針試劑盒。通過對樣品DNA提取物或樣品DNA的PCR產(chǎn)物做交叉斑點分子雜交，鑒別性地檢測樣品中致病性外源性ALV。本發(fā)明所涉及的試劑盒是分別利用致病性外源性和低致病性的或內(nèi)源性的ALV 的4個代表株的U3片段為模板，用特定引物通過PCR合成了經(jīng)狄高辛(DigoxiaenimDIG) 標記的特異性核酸探針。通過交叉斑點分子雜交，這些探針將可用于檢測病料樣品中致病 性外源性ALV病毒特異性核酸的存在，用于判定有無外源性致病性ALV病毒感染。利用這 一方法，在1張8 X 8cm大小的硝酸纖維膜或尼龍膜上可同時檢測約80份病料的核酸樣品。 將病料組織樣品核酸提取物直接加樣或?qū)⑵銹CR產(chǎn)物加樣后，如將同一批樣品的核酸提取 物分別點在4張膜上，分別用4個不同特異性U3片段的核酸探針作交叉斑點分子雜交，可 在24 36小時內(nèi)完成檢測并報告結(jié)果。本申請專利“交叉斑點分子雜交法”的原理是在自然狀態(tài)下和在一定的溫度和離 子強度范圍內(nèi)，DNA分子的二條鏈是以雙螺旋的形式以非共價鍵結(jié)合在一起的。但隨著溫 度的升高和離子強度的下降，二條鏈分離的比例(趨勢)逐漸增大，最終完全分離呈游離單 鏈狀態(tài)。而且這一過程是可逆的。例如，自然DNA分子的二條鏈，在68°C下離子強度0. OlM 和PH7. 6的條件下，有50%的分子二條鏈呈分離狀態(tài)。當(dāng)在溫度超過95°C，所有DNA分子 全部分離變成單鏈分子。但在溫度下降時，特別是降低到68°C以下或更低時，二條鏈又會 重新結(jié)合起來。分子雜交是利用雙鏈DNA的變性和復(fù)性是可逆性這一特點。但在分子雜 交時，這種結(jié)合不一定要分子的原有二條單鏈的結(jié)合。類似的不同分子來源的二條鏈也可 隨機結(jié)合，即所謂的分子雜交。這取決于二條互補單鏈所來源的DNA分子的核酸序列同源 性程度和分子雜交條件的嚴格性程度(Stringency)。同源性高的不同DNA分子的單鏈間， 在嚴格的雜交條件下，也會發(fā)生結(jié)合(即所謂雜交)。但在較寬松的條件下，即使同源性在 80%左右的不同DNA分子的單鏈間也能發(fā)生結(jié)合。但是，在核酸序列同源性低而差別很大 的DNA分子(如同源性低于50%或更低)的單鏈間，則不會發(fā)生結(jié)合，或結(jié)合程度很弱。我們對不同亞群的大量國內(nèi)ALV毒株的比較發(fā)現(xiàn)，致病性外源性ALV的不同毒株 的U3區(qū)的核酸序列同源性均在80%以上。另一方面，非致病性的E亞群內(nèi)源性ALV或低致 病性的天然重組A亞群ALV的U3區(qū)相互間同源性也在80%以上。但與致病性外源性ALV 的U3的同源性均在40%以下。在本申請專利的交叉斑點分子雜交中，所有待檢的核酸樣品 均分別按序在四張硝酸纖維膜(或尼龍膜)上加樣。在四張膜上，還同時滴加了未經(jīng)標記 的四株ALV的U3片段核酸作為特異性對照。在用4個不同毒株的U3區(qū)的特異性探針分別 對四張膜各自實施分子雜交反應(yīng)后，將待檢各樣品在與不同探針的雜交反應(yīng)中的顯色程度 特別是與對照樣品交叉顯色程度的對比，即可對待檢樣品中是否存在致病性外源性ALV核 酸作出判斷。發(fā)明的詳細描述一、致病性外源性ALV的U3片段和無致病性內(nèi)源性ALV-U3片段核酸探針及其非 標記對照DNA的制備(一 )致病性外源性J亞群ALV-NXO101株U3片段(序列1)PCR法制備地高辛標 記探針1. NX0101株U3_138bp片段的擴增(用作非標記的對照DNA)引物F TTATAAGGAAAGAAAAGGCACTGT (序列 5)R CTGTAATGCGGAACTAAGGAGC (序列 6)
模板NX0101株病毒3，-LTR克隆質(zhì)粒pNX0101_LTR(本發(fā)明人制備和測序并保 存)，PCR體系如下表1。表1NX0101株U3_138bp片段常規(guī)PCR擴增的反應(yīng)體系(25 μ 1)

注10XBuffer(Mg2+free)成分100mmol/LTris. Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明膠。將上述成分加入滅菌的PCR管中，混和均勻后，離心后置于PCR擴增儀。按照以下 擴增程序進行反應(yīng)。PCR擴增程序為首先95°C，4min預(yù)變性其次95°C，40sec,55°C，40sec, 72°C，lmin,進行 30 個循環(huán)；最后72°C，延伸5min ；置4°C保存。NX0101株U3-138bp片段PCR產(chǎn)物DNA電泳圖譜見圖5a。2. NX0101株U3片段PCR法制備地高辛標記探針以表1中的pNXO 101-LTR質(zhì)粒DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系見表2。表2NX0101株U3片段PCR法制備地高辛標記探針的反應(yīng)體系 PCR 反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性 4min，95°C 變性 40sec，55 °C 退火 40sec，72 °C 延伸 lmin,共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結(jié)果 見圖5b。( 二)致病性外源性B亞群ALV的SDAU09C2株(趙冬敏，張青嬋，崔治中.蘆花 雞中B亞群禽白血病病毒的分離與鑒定.病毒學(xué)報.2010，26(1) :74-78)U3片段(序列2) PCR法制備地高辛標記探針1. SDAU09C2株U3_198bp片段的擴增(用作非標記的對照DNA)模板質(zhì)粒DNA :p-SDAU09C2_LTR(本發(fā)明人克隆鑒定和保存)引物F :ACCCTTATGTAACGATGAC (序列 7)R :AGCTAGCTACTTAAATACAACA (序列 8)PCR反應(yīng)體系見表3。表3SDAU09C2株U3_198bp片段的常規(guī)PCR擴增反應(yīng)體系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分lOOmmol/LTris.Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明膠。將上述成分加入滅菌的PCR管中，混和均勻后，離心后置于PCR擴增儀。按照以下擴增程序進行反應(yīng)。PCR擴增程序為首先95°C，5min預(yù)變性其次95°C，40sec,53°C，40sec, 72°C，50sec，進行 30 個循環(huán)；最后72°C，延伸5min ；置4°C 保存。ALV-B-U3-198bp片段電泳圖譜見圖6a。2. SDAU09C2株U3片段狄高辛標記探針的制備模板質(zhì)粒DNA :p-SDAU09C2-LTR (同上)，PCR擴增反應(yīng)體系見表4。表4SDAU09C2株U3片段狄高辛標記探針制備使用的反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)條件為95 V預(yù)變性4min，95 °C變性40sec，53 °C退火50sec，72 V延伸 lmin,共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結(jié)果 見圖6b。(三)低致病性重株病毒SDAU09E1株(朱美真，吳玉寶，崔治中等。地方品系雞中 一株A亞群雞白血病病毒的分離和鑒定。中國動物傳染病學(xué)報，2009，17 (4) 31-35)內(nèi)源 性特異性U3片段(序列3)狄高辛標記探針的制備1. SDAU09El-U3-134bp片段的擴增(用作非標記的對照DNA)模板質(zhì)粒DNA :p-SDAU09El_LTR(本發(fā)明人克隆測序保存)引物F CCAAATAAGGAAAGCCAGAAG (序列 9)
R TTCGTCTACGCCCATCAGG (序列 10)PCR反應(yīng)體系如表5。表5SDAU09E1-U3_134bp片段擴增的反應(yīng)體系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分IOOmmo1/L Tris. Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl明膠。將上述成分加入滅菌的PCR管中，混和均勻后，離心后置于PCR擴增儀。按照以下 擴增程序進行反應(yīng)。PCR擴增程序為首先95°C，4min預(yù)變性其次95°C，40sec,55°C，40sec, 72°C，lmin,進行 30 個循環(huán)；最后72°C，延伸5min ；置4°C 保存。SDAU09El-U3-134bp片段的擴增電泳圖譜見圖7a。2. SDAU09E1株內(nèi)源性ALV特異性U3片段地高辛標記探針的制備模板質(zhì)粒DNA :p-SDAU09El_LTR(本發(fā)明人克隆測序保存)PCR反應(yīng)體系見表6。表6SDAU09E1株內(nèi)源性ALV特異性U3片段地高辛標記探針的制備使用反應(yīng)體系 PCR 反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性 4min，95°C 變性 40sec，55 °C 退火 40sec，72 °C 延伸 lmin,共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結(jié)果 見圖7b電泳圖譜。(四)經(jīng)典E亞群內(nèi)源性病毒BJlOCl株內(nèi)源性特異性U3片段(序列4)狄高辛標 記探針的制備1.內(nèi)源性BJlOCl株ALV-E(內(nèi)源)_U3_172bp片段的擴增(用作非標記的對照 DNA)引物F :AATAGAGCCAGAGGCAACTTG (序列 11)R :ATGGCGTTTATTTGATGG (序列 I2)模板p-BJ10Cl-LTR質(zhì)粒大小約為808bp左右(本發(fā)明人克隆鑒定測序)，PCR反 應(yīng)體系見表7。表7BJIOCl株ALV-E (內(nèi)源)_U3_172bp片段的擴增的反應(yīng)體系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分100mmol/LTris. Cl pH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明膠。2. BJlOCl株ALV-E (內(nèi)源)_U3_172bp (片段地高辛標記探針的制備
模板p-BJIOCI-LTR質(zhì)粒DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系為見表8。表8BJ10C1株ALV_E(內(nèi)源)_U3片段地高辛標記探針的制備使用的反應(yīng)體系 PCR 反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性 4min，95°C 變性 40sec，55 °C 退火 40sec，72 °C 延伸 50sec，共32個循環(huán)，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結(jié) 果見圖8。二、試劑盒的組成1.特異性核酸探針試劑管#1 (探針DNA#1)狄高辛標記的外源性J亞群NX0101株U3片段(序列1) 特異性核酸探針，1 μ g/Ι μ 1，10 μ 1 50 μ 1/瓶;試劑管#2 (探針DNA#2)狄高辛標記的外源性B亞群SDAU09C2株U3片段(序列 2)核酸探針，1 μ g/Ι μ 1，10 μ 1 50 μ 1/ 瓶；試劑管#3 (探針DNA#3)狄高辛標記的低致病性A+E重組SDAU09E1株U3片段(序 列3)核酸探針，1 μ g/Ι μ 1，10 μ 1 50 μ 1/瓶;試劑管#4(探針DNA#4)狄高辛標記的經(jīng)典內(nèi)源性E亞群ALV U3株U3片段(序 列4)核酸探針，1μ g/ μ 1，10μ 1 50 μ 1/瓶。2.未標記的不同株U3片段對照DNA試劑管#5(對照DNA#1)外源性J亞群NX0101株U3片段(序列1)PCR擴增的DNA， IOpg/μ 1，50 μ 1/瓶；
試劑管#6 (對照DNA#2) DNA，10pg/y 1，50μ 1/瓶；試劑管#7 (對照DNA#3) 增的 DNA，10pg/y 1，50μ 1/瓶；試劑管#8 (對照DNA#4) lOpg/μ 1，50μ 1/瓶。3. PCR 引物試劑管9 J亞群特異性正向引物，5 ‘-AAGGCTTGACTGAGGGGACC(序列13)；試劑管10 J亞群特異性反向引物，5 ‘-TGTGGTGGGAGGTAAAATGGC(序列14)；試劑管11 :A、B、C、D和E亞群共同性正向引物，5，-TCCTGCAGAACCGAGCG (序列15)；外源性B亞群SDAU09C2株U3片段(序列2) PCR擴增的 低致病性A+E重組SDAU09E1株U3片段(序列3) PCR擴 經(jīng)典內(nèi)源性E亞群ALV U3片段(序列4) PCR擴增DNA,
試劑管12 :A、B、C、D和E亞群共同性反向向引物，5 ‘-ATGGTGGGAGGTAAAATGGC(序 列 16)。4.硝酸纖維膜8 X 8cm，20 100片。5.其他試劑試劑管#13:封閉試劑(購自Roche公司，Catlog No. 1096176) Ig/瓶，9瓶試劑管#14 堿基磷酸本科標記的抗Digoxiaenin抗體(購自Roche公司，10 μ 1/ 瓶；anti-digoxigenin-AP conjugate, Cat. No 1093274)。試劑#15 5-溴-4 氯-3 吲哚-磷酸溶液(5-bromo-4-chloro-3-inolyl-phospha te，B CPI)5ml, (250mg)試齊[J#16 氮藍四唑(4-Ntro blue terazolium chloride,NBT)溶液5ml，(500mg)6.自備試劑和消耗品20 X SSC溶液(3M NaCl，0. 3M枸櫞酸三鈉，調(diào)整pH至7. 0)，可塑封塑料袋，尖頭一 次性滴頭。7需配備設(shè)備水浴鍋，壓膜機，5 μ 1、100 μ 1移液器。三、試劑盒的操作方法1核酸樣品的制備1. 1樣品核酸直接斑點分子雜交檢測的樣品即懷疑有病毒感染的動物的不同組 織或細胞，按常規(guī)的方法(J.薩姆布魯克、Ε. F.弗里奇、Τ.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓 等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學(xué)出版社，1996)提取其基因組DNA，即作為檢測的樣
品 O1. 2樣品核酸的PCR產(chǎn)物的斑點分子雜交將以上1. 1項中提取的樣品核酸，分別 用試劑管#9和#10 (序列#13和#14)及試劑管#11和#12 (序列#15和#16)中2對特異 性不同的引物，PCR反應(yīng)體系見表9。表9樣品DNA的PCR反應(yīng)體系(25 μ 1) 注10XBuffer(Mg2+free)成分100mmol/L Tris. ClpH 8. 0,500mmol/L KCl 1%明膠。將上述成分加入滅菌的PCR管中，混和均勻后，離心后置于PCR擴增儀。按照以下 擴增程序進行反應(yīng)。PCR擴增程序為95°C，4min 預(yù)變性；95°C，40sec，55°C，40sec，72°C，lmin，進行 30 個循環(huán)；72°C，延 伸5min;置4°C保存。2.斑點分子雜交檢測步驟(1) 一張適當(dāng)大小的NC膜或尼龍膜，劃好格子，長和寬各8mm，做好標記；(2)分別在A1-A4點添加試劑管#5、#6、#7和#8的4個毒株U3片段的未經(jīng)標記 的 DNA 各 1 μ 1 ； (3)吸取1. 0 μ 1待檢核酸樣品(約1 μ g待檢樣品或Iul待檢樣品DNA的PCR產(chǎn) 物，所有PCR產(chǎn)物不必先作電泳，只需直接點樣)點于膜上各個格子的中央；(4)將NC膜或尼龍膜(點樣面朝上)放于已用變性液(0. 5mol/LNa0H 1. 5mol/ LNaCl)飽和的雙層濾紙上變性lOmin，再放于已用中和液(O. 5mol/LTris_Cl ；3. Omol/ LNaCl pH 7. 4)飽和的雙層濾紙上中和5min ；(5)NC膜室溫干燥30min，然后在80°C干烤2h固定DNA。(6)將 NC 膜放于預(yù)雜交液(5X SSC, 0. 2% SDS，2%封閉試劑 Blocking Reagent, 0. 1% (ff/V) N-Lauroy 1 sarcosine)于 65°C 68°C反應(yīng) 2h，期間經(jīng)常搖動 NC 膜容器；(7)取適量各個標記的探針(試劑管1、2、3和4管)置于含ΙΟΟμΙ蒸餾水的離心 管內(nèi)于沸水中變性lOmin，取出后立即置于預(yù)先在-80°C保存的無水乙醇中速凍5min，防止 探針變性后復(fù)性；(8)將各個變性(后)的探針分別加入10 20ml預(yù)雜交液中，充分混勻即成雜 交液，并在恒定保持在65°C左右，使NC膜在其中雜交6h以上，最好過夜(雜交后回收雜交 流，可用三次)；(9)將NC膜放于洗液I(2XSSC，0. 1% SDS)中于室溫洗滌15min，2次；(10)將 NC 膜放于洗液 11(0. 5 X SSC，0. SDS)中于 65°C洗滌 15min，2 次；(11)置 NC 膜于緩沖液 1(0. lmol/L Tris-Cl, 0. 15mol/L NaCl，pH7.5)中洗 Imin ；(12)置NC膜于緩沖液II(緩沖液1+2%封閉試劑Blocking Reagent)中反應(yīng) 30min，再用緩沖液I洗Imin ；(13)在20ml緩沖液II中加入4 μ 1抗狄高辛抗體的堿性磷酸酶標記物(用之前 離心5min，1000r/min)，置于適當(dāng)大小(略大于NC膜，為了有效利用試劑)的容器中，將膜 放于其中于37°C浸泡30min(不要超過這一時間，免得影響酶活性)；(14)緩沖液 I 洗滌5minX5 次；(15)置NC膜于緩沖液 111(0. lmol/L Tris-Cl,0. lmol/L NaCl，0. 05mol/L MgCl2, pH 9. 5)中反應(yīng)浸泡2min ；(16)在適當(dāng)大小(為了有效利用試劑)的容器中加入IOml緩沖液III和 100 μ 1 (NBT和BCIP混合物)，將NC膜放入其中在25°C下顯色一定時間(2 18h)；(避光， 不要搖動)(17)加入TE緩沖液(pH 8. 0)終止顯色反應(yīng)。
3結(jié)果的判定3. 1四個探針特異性的確定當(dāng)雜交雜交溫度為68 70°C時，各探針之間彼此顯出很強的特異性。見附圖 9 (9a, 9b, 9c和9d)由圖9 (9a, 9b, 9c和9d)表明，在該溫度下，各探針只和自身的DNA有斑 點反應(yīng)。但在68 70°C條件下做斑點分子雜交時，靈敏度會顯著下降。為此可適當(dāng)降低斑 點雜交溫度，以提高靈敏度。當(dāng)通常在60V 65°C做點雜交反應(yīng)時，靈敏度將提高，但不同探針間有時會表現(xiàn) 不同程度的交叉反應(yīng)，見圖10 (10a，10b，IOc和IOd)。這決定于探針與相應(yīng)樣品DNA相互之 間核酸序列同源性程度，見圖11。在這溫度條件下，足以將雞致病性外源性禽白血病病毒與 內(nèi)源性白血病毒區(qū)別開來了。3. 2.交叉分子雜交有效性的確定當(dāng)?shù)渭恿讼嗤瑯悠返乃膹埬７謩e用四個不同的U3探針作分子雜交后，首先觀察 各個添加有四個不同U3對照DNA的加樣點的呈色反應(yīng)。如果每一個探針對照DNA顯色深 度的相互關(guān)系如下表10，則反應(yīng)成立；如果有一項明顯不符合，則反應(yīng)不成立，需重做。表10判斷交叉分子雜交是否有效的結(jié)果對照表對照DNA#1對照DNA#2對照DNA#3對照 DNA#4所#1+++-#+-+++“-，，或 “ +” ‘‘-，，或
用#2+-++++++-#“-，，或 “ +” ‘‘-，，或
探#3‘‘-，，或 ‘‘ +，，‘‘-，，或 ‘‘ +，，+++-#+-+++
針#4‘‘-，，或 ‘‘ +，，‘‘-，，或 ‘‘ +，，+-++++++-#
3. 2.樣品特異性的判定如果在用探針#1或探針#2做雜交反應(yīng)的膜上，任一樣品點的呈色反應(yīng)的程度接 近或達到甚至高于對照DNA#1或#2，或至少顯著高于對照DNA#3和#4，即可判定為檢測出 有致病性的外源性ALV的U3片段，即該樣品核酸來源的細胞呈致病性的外源性ALV感染陽 性。如果不顯顏色反應(yīng)或只相當(dāng)于對照DNA#3和#4的呈色反應(yīng)，則判為沒有檢測出致病性 外源性ALV的U3片段，即致病性外源性ALV感染陰性。如果顯色反應(yīng)僅略高于對照DNA#3 和#4，則判定為可疑。如果在用探針#3或探針#4做雜交反應(yīng)的膜上，任一樣品點的呈色反應(yīng)的程度接 近或達到甚至高于對照DNA#3或#4，即可判定為檢測出內(nèi)源性ALV的U3片段或低致病性的 重組外源性ALV的U3片段核酸。但不能做出有或無能呈致病性的外源性ALV感染的判定。如果某一加樣點，對四個核酸探針都能呈現(xiàn)不同程度的顯色反應(yīng)，表明待檢樣品 中即有內(nèi)源性ALV的U3片段或低致病性的重組外源性ALV的U3片段核酸，又確實存在著 有致病性的外源性ALV核酸。對四個探針均為陰性，表明樣品中既無內(nèi)源性ALV也無外源性ALV核酸檢出。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明，分別以狄可辛標記致病性外源性及和低致病性(包括內(nèi)源性和少數(shù)外源 性)ALV代表株的U3片段核酸，以此做為特異性核酸探針。根據(jù)交叉斑點分子雜交中相對 顯色的結(jié)果，用以鑒別性地檢測臨床病料或其它樣品中是否存在有致病性的外源性ALV。
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本方法可以與目前國際上普遍采用的Dfl細胞培養(yǎng)法一樣，可適于大批量樣品 (如大于100份)的檢測(樣品的核酸提取階段可用相應(yīng)儀器批量處理)，且在2 3天內(nèi) 報告結(jié)果，比細胞培養(yǎng)法提前7 10天。利用本發(fā)明所涉及的試劑盒，提取病料組織樣品的核酸后，分別用四種不同特異 性的U3核酸探針作交叉分子雜交反應(yīng)，斑點分子雜交可在24 36小時內(nèi)完成檢測并報告 結(jié)果。當(dāng)病料或細胞被外源性ALV顯著感染時，利用這一方法可直接檢測出病毒核酸。如 將同一樣品的核酸提取物分別點在4張膜上，通過與不同特異性的對照U3片段DNA的比較 即可鑒別性地檢測出樣品中的致病性的外源性ALV。在1張8X8cm大小的硝酸纖維膜或尼 龍膜上可同時檢測約80份病料的核酸樣品。如果進一步用待檢樣品DNA的PCR產(chǎn)物做交叉分子雜交反應(yīng)，則可在不影響特異 性的條件下把檢測的靈敏度提高100倍以上。一些PCR產(chǎn)物，即使在電泳中看不到條帶，也 能在分子雜交反應(yīng)中顯示出來。另一方面，交叉斑點分子雜交反應(yīng)保證了結(jié)果的特異性。


圖1不同亞群的ALV的23個代表株U3區(qū)核苷酸序列同源性比較。圖中每個毒株 第一個大寫字母代表亞群；小寫“r”代表致病性很低的具有A亞群gp85基因和內(nèi)源性U3 區(qū)的重組病毒(編號為22和23的毒株)。圖2六個內(nèi)源性E亞群ALV與17個不同亞群ALV中國分離株的U3區(qū)核苷酸序列 同源性比較。圖中每個毒株第一個大寫字母代表亞群，小寫“r”代表致病性很低的具有A 亞群gp85基因和內(nèi)源性U3區(qū)的重組病毒。圖323個不同亞群致病性外源性ALV的U3區(qū)核苷酸序列同源性比較。圖中每個 毒株第一個大寫字母代表亞群。圖47個內(nèi)源性E亞群和4個致病性很低的具有A亞群gp85基因和內(nèi)源性U3區(qū)的 重組病毒U3區(qū)核苷酸序列同源性比較。圖中每個毒株第一個大寫字母代表亞群，小寫“r” 代表致病性很低的具有A亞群gp85基因和內(nèi)源性U3區(qū)的重組病毒。圖 5a NX0101 株 U3_138bp 片段 PCR 產(chǎn)物 DNA 電泳圖譜 M :DL2000 ；泳道 1 NX0101-U3-138bp 擴增片段。圖5b NX0101株U3片段PCR法制備地高辛標記探針電泳圖1 未標記的 NX0101-U3-134bp 片段 PCR 產(chǎn)物(2 μ 1) ；2 地高辛標記 NX0101_U3_134bp 片段 PCR 產(chǎn)物 (4 μ 1) ；3 =PCR反應(yīng)體系中不加模板DNA的陰性對照；M :DL2000核酸片段大小標志物。圖 中在槽2中，被地高辛標記NX0101-U3-134bp片段在電泳中比不經(jīng)標記的134bp片段分子 量增大，因此移動滯后，落在相當(dāng)于大約200bp的位置。根據(jù)與已知濃度的核酸條帶的亮度 比較，推算出該標記的核酸探針樣品中的核酸探針的濃度大約為15ng/y 1圖 6a ALV-B-U3-198bp 片段電泳圖譜 ALV_B-U3_198bp 片段電泳圖譜 M :DL2000 ； 泳道 1 :SDAU09C2-U3-198bp 擴增片段。圖6b SDAU09C2株U3片段狄高辛標記探針電泳圖譜1 未標記的 SDAU09C2-U3-198bp 片段 PCR 產(chǎn)物(2 μ 1) ；2 地高辛標記 SDAU09C2_U3_198bp 片段 PCR 產(chǎn) 物(2 μ 1) ；3 =PCR反應(yīng)體系中不加模板DNA的陰性對照；M :DL2000核酸片段大小標志物。在槽2中，被地高辛標記SDAU09C2-U3_198bp片段在電泳中比不經(jīng)標記的198bp片段分子量增大，因此移動滯后，落在相當(dāng)于大約280bp的位置。根據(jù)與已知濃度的核酸條 帶的亮度比較，推算出該標記的核酸探針樣品中的核酸探針的濃度大約為25ng/y 1。圖7a SDAU09El-U3-134bp片段的擴增電泳圖譜M :DL2000 ；泳道1 SDAU09El-U3-134bp 擴增片段。圖7b SDAU09E1株內(nèi)源性ALV特異性U3片段地高辛標記探針電泳圖譜1 未標記 的 SDAU09El-U3-134bp 片段 PCR 產(chǎn)物(2 μ 1) ；2 地高辛標記 SDAU09El_U3_134bp 片段 PCR 產(chǎn)物(2 μ 1) ；3 :PCR反應(yīng)體系中不加模板DNA的陰性對照；M :DL2000核酸片段大小標志物。 在槽2中，被地高辛標記SDAU09El-U3-134bp片段在電泳中比不經(jīng)標記的134bp片段分子 量增大，因此移動滯后，落在相當(dāng)于大約200bp的位置。根據(jù)與已知濃度的核酸條帶的亮度 比較，推算出該標記的核酸探針樣品中的核酸探針的濃度大約為20ng/y 1。圖8經(jīng)典E亞群內(nèi)源性病毒BJlOCl株_U3_172bp片段的擴增電泳圖譜1 以 BJlOCl株)-U3-172bp片段為模板的PCR結(jié)果(2 μ 1) ；2 地高辛標記PCR結(jié)果(4 μ 1) ;3 陰性對照；M:DL2000 ；根據(jù)與標準分子量DNA條帶的亮度比較，可估計標記探針的濃度為 15ng/μ I。圖9不同毒株U3-DNA樣品與各個U3探針在68°C下的交叉斑點雜交反應(yīng)1 雙蒸水；2 SPF 組織；3 :NX0101-U3-DNA ；4 :SDAU09E1-U3_DNA ；5 :SDAU09C2-U3_DNA ；6 BJ01C1-U3-DNA ；其中圖 9a 用 ALV-NXO101-U3-探針做點雜交；圖 9b 用 SDAU09E1-U3-探 針做點雜交；圖9c用SDAU09C2-U3-探針做點雜交；圖9d用BJ01C1-U3-探針做點雜交。圖10不同毒株U3-DNA樣品與各個U3探針在61°C下的交叉斑點雜交反應(yīng)，各探針 之間會出現(xiàn)相互之間的雜交反應(yīng)。各點加樣為1 :NX0101-U3-DNA ；2 :SDAU09C2_U3_DNA ；3 SDAU09E1-U3-DNA ；4 :BJ10C2-U3_DNA。A 每點 10_15pg DNA ；B 每點 l_5pgDNA 圖 IOa 用 NX0101-U3-探針；圖 IOb 用 SDAU09C2-U3-探針；圖 IOc 用 SDAU09E1-U3-探針；圖 IOd 用 BJ10C1-U3-探針。圖11四個不同ALV毒株U3區(qū)探針核酸序列同源性比較。
權(quán)利要求
一種雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針斑點雜交檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒含有(1)分別經(jīng)狄高辛標記的如序列1、序列2、序列3和序列4所述的核酸序列；(2)未經(jīng)標記的作為對照用如序列1、序列2、序列3和序列4所述的核酸序列；(3)序列13、序列14是用于樣品DNA擴增的J亞群特異性的一對引物；序列15和序列16是用于樣品DNA擴增的A、B、C、D和E亞群共同性的一對引物；(4)硝酸纖維膜、封閉試劑、堿基磷酸酶標記的抗狄高辛抗體、NCPI溶液、NBT溶液和20×SSC溶液。
2.一種雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑點雜交檢測試劑盒制備 方法，其特征在于分別利用各自對應(yīng)的特定引物通過PCR合成了經(jīng)狄高辛標記的特異性核 酸探針，通過交叉斑點分子雜交，這些探針將可用于檢測病料樣品中某種病毒特異性核酸 的存在。
3.如權(quán)利要求1、2所述的一種雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑 點雜交檢測試劑盒制備方法，其特征在于用PCR合成經(jīng)狄高辛標記的外源性和內(nèi)源性禽白 血病核酸探針，分別使用的引物含有序列5、6，序列7、8，序列9、10和序列11、12。
4.一種雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針斑點雜交檢測試劑盒的應(yīng)用，其 特征在于是該試劑盒利用外源性和內(nèi)源性ALV的U3區(qū)同源性量的差異，作交叉斑點分子雜 交，根據(jù)對顯色的相對深淺，測定樣品中的ALV病毒是內(nèi)源性非致病性的還是有外源性致 病性的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞致病性外源性禽白血病病毒特異性核酸探針交叉斑點雜交檢測試劑盒，是用特定引物通過PCR合成了經(jīng)狄高辛標記的雞致病性外源性及內(nèi)源性禽白血病病毒特異性核酸探針，通過交叉斑點分子雜交，這些探針將可用于檢測病料樣品中致病性外源性禽白血病毒特異性核酸的存在。利用本發(fā)明所涉及的試劑盒，對從病料組織樣品中提取的基因組DNA作交叉斑點分子雜交或?qū)μ崛〉腄NA用相應(yīng)引物擴增后的PCR產(chǎn)物作交叉斑點分子雜交，可在24～36h內(nèi)完成檢測并報告結(jié)果。顯示檢測樣品中是否存在致病性外源性禽白血病病毒。
文檔編號C12R1/93GK101886141SQ20101023029
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者孫淑紅, 崔治中, 王鑫, 趙鵬 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)