專利名稱：核酸適體衍生物及其在制備藥物載體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸適體衍生物及其在制備藥物載體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是世界上最普遍的和高致命性的癌癥之一。目前早期肝癌患者的有效治療方 法主要是手術(shù)切除和肝移植。傳統(tǒng)的化療對(duì)肝癌患者效果不好，并且傳統(tǒng)藥物由于缺乏對(duì) 肝癌細(xì)胞的特異性，通常會(huì)給患者帶來致命性的副作用。為了克服這些問題并提高化療的 選擇性，需要研發(fā)在腫瘤區(qū)域特異性給藥的靶向藥物。腫瘤細(xì)胞靶向給藥是提高腫瘤治療效果減少毒副作用的有效途徑。將藥物偶聯(lián)于 腫瘤細(xì)胞特異性配體上是靶向給藥的主要方法。例如將藥物共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志 物的單克隆抗體上，這些偶聯(lián)藥物的單抗能選擇性結(jié)合腫瘤組織，從而提高抗腫瘤藥物的 效果，減少毒副作用。這類藥物在臨床前的試驗(yàn)中取得了很好的效果，目前正在進(jìn)行相關(guān) 的臨床實(shí)驗(yàn)(Carter, P. J. ；Senter, P. D. Cancer J. 2008，14，154—169. Chari, R. V. J. Acc. Chem. Res. 2008，41，98-107.)。例如人源化的CD33抗體-加里剎霉素偶聯(lián)物Mylotarg,已 經(jīng)被批準(zhǔn)用于急性骨髓系白血病(AML)的治療。但是用于藥物靶向輸送的抗體來源于動(dòng)物 或融合的單克隆細(xì)胞，需通過生物過程產(chǎn)生，其制備繁瑣，成本高，穩(wěn)定性差，難以進(jìn)行化學(xué) 修飾和改造；同時(shí)抗體還具有分子量大、組織穿透力弱、易引起免疫反應(yīng)等問題，限制了其 廣泛應(yīng)用。尋找新的腫瘤細(xì)胞特異性識(shí)別分子取代抗體是靶向藥物治療的一個(gè)重要發(fā)展方 向。核酸適體(Aptamer，又稱核酸適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某 種生物靶標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是從SELEX(指數(shù)富集配基系 統(tǒng)進(jìn)化)過程中選擇出來的。它們通過分子內(nèi)堿基堆積、疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作 用折疊形成獨(dú)特的三維空間結(jié)構(gòu)，從而與靶分子特異性結(jié)合(Breaker R R，Nature 2004， 432，838-845)。核酸適體與靶分子結(jié)合的親和力和特異性與單克隆抗體相似，甚至更強(qiáng)。與 抗體相比，核酸適體具有較低的分子量(15-50bases ；4-15kD)、快速組織通透性、沒有免疫 源性和毒性。核酸適體一旦篩選出來，就可以通過自動(dòng)化的固相化學(xué)合成來制備，無需免疫 動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)的過程以及后續(xù)繁瑣的分離純化過程，價(jià)格大大降低。核酸適體很容易進(jìn) 行結(jié)構(gòu)改造并標(biāo)記上各種分子，如放射性元素、熒光染料等(Nutiu R & Li Y，Angew Chem Int Ed 2005，44，1061-1065 ；Liu, J. W. & Lu, Y. Angew Chem Int Ed 2006，45，90-94)。核 酸適體穩(wěn)定性高，可以可逆的變性與復(fù)性，可在常溫下保存和運(yùn)輸。從靶向老鼠肝癌細(xì)胞的核酸適體中曾經(jīng)篩選得到一條核酸適體序列TLSllajn 序列表的序列 1 所不(Shangguan, Dihua ；Meng, Ling ；Cao, Zehu i Charles ；Xiao, Zeyu ； Fang, Xiaohong ；Li, Ying ；Cardona, Diana ；ffitek, Rafal P. ；Liu, Chen ；Tan, ffeihong, Identification of Liver Cancer-Specific Aptamers Using Whole Live Cells. Analytical Chemistry,2008,80(3)，721-728.。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供核酸適體衍生物及其在制備藥物載體中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的核酸適體衍生物為式⑴或式(II)或式(III)所示的單鏈DNA ；式(I):5，-(CG)n-核酸適體-3，；式(II) :5’ -核酸適體 _(CG)m_3’ ；式(III)5，-(CG)tl-核酸適體-(CG) t2_3，；所述核酸適體如序列表的序列1所示；η = 1-50 ；m = 1-50 ；tl = 1-50 ；t2 = 1-50。n、m、tl和t2均為自然數(shù)。還可將所述核酸適體衍生物進(jìn)行如下改造，也可以達(dá)到相同的靶向功能(1)將核酸適體衍生物的骨架部分或全部改造為硫代磷酸酯骨架或?qū)Σ糠只蛉?骨架上的糖環(huán)進(jìn)行2’ -F和2’ -NH2修飾；(2)將核酸適體衍生物的部分或全部改造為肽核酸；(3)將核酸適體衍生物中的一個(gè)以上核苷酸替換為鎖核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)和/或連接分子，再將抗癌藥物通過嵌入形成核酸適體-藥物復(fù)合物；所述連接 分子為一個(gè)以上的六聚乙二醇-ι-磷酸。O=P-O式(工)。
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0-如式(I)所示，六聚乙二醇-1-磷酸的骨架為6個(gè)乙二醇的聚合物，骨架一端的氧 連接一個(gè)帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)。用六聚乙二醇-1-磷酸替代核酸適體中的核苷酸時(shí)，通過骨 架兩端的氧與兩端的核苷酸連接。所述核酸適體衍生物具體可如序列表的序列3、序列4或序列5所示。所述核酸適體衍生物可用于制備藥物載體，特別是靶向藥物載體。所述藥物可為 抗癌藥物，所述抗癌藥物具體可為抗肝癌藥物，如阿霉素。本發(fā)明還保護(hù)一種治療癌癥的藥物，它的活性成分由所述核酸適體衍生物和抗癌 藥物組成。所述癌癥可為肝癌，所述抗癌藥物具體可為抗肝癌藥物，如阿霉素。所述活性成 分中，所述抗癌藥物嵌入所述核酸適體中，所述核酸適體和所述抗癌藥物的配比具體可為 1 25(摩爾比)。所述的核酸適體衍生物可用于制備輔助鑒別肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的試劑盒。所述肝癌細(xì)胞具體可為人體肝癌細(xì)胞系LH86。所述正常肝細(xì)胞具體可為人體正常 肝細(xì)胞Hul082。所述的核酸適體衍生物可用于輔助鑒別肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞。所述肝癌細(xì)胞具體可為人體肝癌細(xì)胞系LH86。所述正常肝細(xì)胞具體可為人體正常 肝細(xì)胞Hul082。本發(fā)明在核酸適體TLSlla的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它能特異結(jié)合人的肝癌細(xì)胞。 本發(fā)明中，將核酸適體的末端分別或同時(shí)添加一段延伸序列(如可形成雙鏈的GC重復(fù)序 列)，可以得到核酸適體衍生物?？拱┧幬锟梢郧度氲紻NA雙鏈的GC堿基對(duì)中，形成核酸適 體_藥物復(fù)合物。核酸適體_藥物復(fù)合物可制備人體肝癌的靶向藥物?？拱┧幬锱c選擇性試劑(如抗體，核酸適體)的結(jié)合是一種潛在的，可用于增強(qiáng)化療的效果并降低藥物毒性的方法。利用本發(fā)明的核酸適體衍生物作為藥物載體，可以使藥 物特異性結(jié)合靶細(xì)胞，降低給藥劑量，明顯降低藥物毒副作用、提高治療效果，具有很高的 潛在應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供的核酸適體衍生物具有肝癌細(xì)胞靶向性，可以作為藥物載體，對(duì)體內(nèi) 肝癌細(xì)胞進(jìn)行靶向給藥，特異性殺死肝癌細(xì)胞，大大降低抗癌藥物對(duì)機(jī)體的毒性。本發(fā)明提 供的核酸適體衍生物可大規(guī)?；瘜W(xué)合成、易于與藥物分子連接，成本低，分子量相對(duì)較小， 沒有免疫活性和毒性，穩(wěn)定性好，形成的藥物復(fù)合物穩(wěn)定。本發(fā)明提供的藥物復(fù)合物(靶向 藥物)與肝癌細(xì)胞結(jié)合力強(qiáng)，能大大降低肝癌化療中毒副作用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為核酸適體衍生物與肝癌細(xì)胞系LH86、人體正常肝細(xì)胞Hul082的親和力表 征。圖2為核酸適衍生物_阿霉素復(fù)合物(TLSlla-(GC)29-D0x)示意圖。圖3為核酸適體衍生物_阿霉素復(fù)合物對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；橫坐標(biāo) 為濃度，坐標(biāo)值標(biāo)注為阿霉素的濃度，TLSlla和TLSlla-(GC)29的濃度均為坐標(biāo)值標(biāo)注除以 25。圖4為經(jīng)核酸適體衍生物_阿霉素復(fù)合物處理后的老鼠活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4A為老 鼠腫瘤體積；圖4B為老鼠體重的降低率。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以 下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。人體正常肝細(xì)胞Hul082購自美國ATTC公司(Manassas，VA)。人體肝癌細(xì)胞系 LH86由美國佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系劉晨教授實(shí)驗(yàn)室提供，由高分化的肝癌組織切片制 備，制備方法見文獻(xiàn)("Hepatitis C virus triggers apoptosis of a newly developed hepatoma cell line through antiviral defense system，，，Zhu H, Dong H, Eksioglu E, Hemming A, Cao M, Crawford JM, Nelson DR, Liu C., Gastroenterology2007,133, 1649-59)；譚蔚泓保證向公眾提供。NOD. Cg-Prkdc (scid)IL2型老鼠購自美國Jackson Laboratory (Bar Harber, ME, USA)，在佛羅里達(dá)州立大學(xué)的動(dòng)物設(shè)施上養(yǎng)殖。洗滌緩沖液含5mM MgCl2,4. 5mg/mL葡萄糖的PBS溶液。結(jié)合緩沖液含5mM MgCl2,4. 5mg/mL 葡萄糖，0. lmg/mL yeast tRNA, lmg/mL BSA 的PBS溶液。肝癌核酸適體TLSlla的序列為(序列表的序列1)5，-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT G-3，。對(duì)照核酸適體TD05的序列為(序列表的序列2)5’ -CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG-3，。
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實(shí)施例1、核酸適體衍生物與人體肝癌細(xì)胞親和力的表征一、核酸適體及其衍生物的制備人工合成三種核酸適體衍生物，分別在核酸適體TLSlla的5’末端引入1個(gè)GC、29 個(gè)GC和50個(gè)GC0 TLSlla-(GC)1如序列表的序列3所示。TLSlla-(GC)29如序列表的序列 4所示。TLSlla-(GC)5tl如序列表的序列5所示。人工合成三種對(duì)照核酸適體衍生物，分別在核酸適體TD05的5’末端引入1個(gè)GC、 29個(gè)GC和50個(gè)GC0 TD05-(GC)工如序列表的序列6所示。TD05-(GC)29如序列表的序列7 所示。TD05- (GC) 50如序列表的序列8所示。人工合成序列表的序列1所示的核酸適體TLSlla和序列2所示的對(duì)照核酸適體 TD05。二、核酸適體衍生物的熒光標(biāo)記用熒光染料PhyCOerythrin-Cy5. 5(藻紅蛋白/青色素染料5. 5)標(biāo)記步驟一合 成的三種核酸適體衍生物、三種對(duì)照核酸適體衍生物、核酸適體TLSlla以及對(duì)照核酸適體 TD05。三、核酸適體衍生物與人體肝癌細(xì)胞親和力的表征分別檢測(cè)三種核酸適體衍生物、三種對(duì)照核酸適體衍生物、核酸適體TLSlIa和對(duì) 照核酸適體TD05與人體肝癌細(xì)胞(或人體正常肝細(xì)胞Hul082)的親和力，檢測(cè)方法如下人體癌細(xì)胞LH86采用無酶細(xì)胞裂解液(Cellgro)溶解，并用洗滌緩沖液清洗。 在IOOmL結(jié)合緩沖液中將肝癌細(xì)胞LH86(約IO5個(gè))分別與0. ImL 25nM核酸適體衍生 物(TLSlla-(GC)P TLSlla-(GC)29、TLSlla-(GC)5。、TDOS-(GC)1, TD05_(GC)29、TD05_(GC)5。、 TLSlla或TD05)混合，冰浴下培養(yǎng)0. 5小時(shí)。然后用洗滌緩沖液清洗細(xì)胞兩次并懸浮于 0. 2mL結(jié)合緩沖液中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果見圖1 ；A =TLSlla及其三種衍生物；B :TD05及其三種衍生物。結(jié)果表明=TLSlla及其衍生物對(duì)人體肝癌細(xì)胞(LH86)有著顯著的親和力，但是人 體正常肝細(xì)胞(Hul082)不與TLSl Ia及其衍生物作用，TLSl Ia及其衍生物與肝癌細(xì)胞的結(jié) 合力比與正常肝細(xì)胞的結(jié)合力顯著增加，與人體肝癌細(xì)胞結(jié)合均有較高的特異性和高結(jié)合 能力，可以作為區(qū)分正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的探針；TD05及其三種衍生物對(duì)人體肝癌細(xì)胞 (LH86)和人體正常肝細(xì)胞(Hul082)的親和力沒有顯著差異。實(shí)施例2、核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物的制備一、核酸適體TLSlla和核酸適體衍生物TLSlla-(GC)29的制備為了嵌入較多的阿霉素，在核酸適體TLSlla的5’末端引入一個(gè)長的GC序列(由 29個(gè)GC依次連接組成)，從而得到一個(gè)具有延伸序列的核酸適體衍生物TLSlla-(GC)29。 TLSlla-(GC)29如序列表的序列4所示。人工合成序列表的序列1所示的核酸適體TLSlla。人工合成序列表的序列4所示 的核酸適體衍生物TLSlla-(GC) 29。二、核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物的制備和表征1、核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物的制備在結(jié)合緩沖液中，將核酸適體衍生物TLSlla-(GC)29與阿霉素以1 25(摩爾比) 的比例混合，室溫?cái)嚢璺跤?小時(shí)，得到核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物。
2、核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物的純化步驟1制備的核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物采用HPLC進(jìn)行純化。色譜柱柱長為250mm，內(nèi)徑為4. 6mm。填料為silica，粒徑為5um。流動(dòng)相為 This-HCl緩沖溶液(IOmM, ρΗ7· 4)和乙腈(梯度淋洗:0-3min，O %乙腈，3-30min 乙腈濃 度線形增至60 %，30-35min 乙腈濃度線形增至90 %，35_45min乙腈90 %，45min后O % 乙腈)。流速為lmL/min。檢測(cè)波長為260nm。目標(biāo)產(chǎn)物核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物 (TLSlla-(GC)29)在 35min 出峰。3、核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物的表征對(duì)純化得到的核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物進(jìn)行紫外檢測(cè)。阿霉素濃度由495nm 波長紫外吸收值得到。TLSlla-(GC)29濃度由260nm波長紫外吸收值得到。由于阿霉素在 260nm處有明顯的紫外吸收，干擾TLSlla- (GC) 29濃度的測(cè)定，為準(zhǔn)確測(cè)定TLSlla- (GC) 29濃 度，采用紫外光譜儀分別測(cè)量495nm、260nm的吸收值。阿霉素在495nm、260nm的紫外吸光 系數(shù)分別為ε 495 = WOOOGm-1M-1，ε 260 = 24000^^^ 0通過495nm測(cè)得的阿霉素濃度，扣 除阿霉素在260nm處的干擾，最終得到TLSlla-(GC)29的濃度。TLSlla-(GC)29濃度由以下 公式計(jì)算得到
A260-(8260X A495/8495)Ua-(CiL)29(M)= ^^A為對(duì)應(yīng)波長的紫外吸收值。
平均每個(gè)核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物中，含有1個(gè)核酸適體衍生物和25個(gè)阿霉
ο核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物(TLSlla-(GC)29-DOX)示意圖如圖2所示。三、核酸適體_藥物復(fù)合物的制備和表征1、在結(jié)合緩沖液中，將核酸適體TLSlla與阿霉素以1 25(摩爾比)的比例混合， 室溫?cái)嚢璺跤?小時(shí)，得到核酸適體_藥物復(fù)合物。2、核酸適體-藥物復(fù)合物的純化步驟1制備的核酸適體_藥物復(fù)合物采用HPLC進(jìn)行純化。液相色譜參數(shù)同步驟
--ο核酸適體-藥物復(fù)合物的峰在24min時(shí)出現(xiàn)。3、核酸適體-藥物復(fù)合物的純化步驟2制備的核酸適體_藥物復(fù)合物采用紫外表征，檢測(cè)參數(shù)同步驟二。結(jié)果表明，平均每個(gè)核酸適體_藥物復(fù)合物中，含有1個(gè)核酸適體和2個(gè)阿霉素。因此，利用核酸適體衍生物能提高載藥量。實(shí)施例3、核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物對(duì)肝癌細(xì)胞的影響肝癌細(xì)胞LH86對(duì)阿霉素或核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物的化學(xué)敏感性的測(cè)定使 用CellTiter 96* AQueous單溶液細(xì)胞增殖分析試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)進(jìn)行。 CellTiter 96 AQueous式齊[J 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymet hoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,內(nèi)鹽；MTS 和一個(gè)電子偶聯(lián)試劑(乙硫 吩嗪，PES)。具體如下100 μ L肝癌細(xì)胞LH86 (約5 X IO4細(xì)胞/mL)在96孔板(η = 3)上 接種并37°C放置過夜生長(5% CO2,無FBS的DMEM培養(yǎng)基)，然后分別加入100 μ L下列DNA鏈(I)TLSlla;設(shè)置四個(gè)濃度梯度，分別與(4)中核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物中的 TLS1 la- (GC) 29 濃度相同，即分別為 40，100，200，300nM。(2) TLSlla-(GC)29 ；設(shè)置四個(gè)濃度梯度，分別與(4)中核酸適體衍生物-藥物復(fù)合 物中的TLS1 la- (GC) 29濃度相同，即分別為40，100，200，300nM。(3)阿霉素；設(shè)置四個(gè)濃度梯度，分別為1. 0，2. 5，5. 0. 7. 5 μ Μ。(4)實(shí)施例2純化得到的TLSlla-(GC)29-DOX ；設(shè)置四個(gè)濃度梯度，以阿霉素的濃 度計(jì)，濃度分別為 1.0，2. 5,5. 0. 7. 5μ M JgSTLSlla-(GC)29 的濃度分別為 40，100，200， 300ηΜ。1小時(shí)后清洗并在新鮮的DMEM培養(yǎng)基(10% FBS)中培養(yǎng)48h。細(xì)胞毒性測(cè)定中，先除去每個(gè)孔中的培養(yǎng)基，然后在每個(gè)孔中加入20uL細(xì)胞滴定 試劑(CellTiter 96 AQueous單溶液試劑)和DMEM培養(yǎng)基(100 μ L)，培養(yǎng)3h。采用微孔 板報(bào)告器(Tecan Safire microplate reader,AG, Swi tzerland)，在490nm下記錄吸收值。 通過對(duì)比用TLSlla、TLSlla-GC、阿霉素、核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物處理過的細(xì)胞與空 白細(xì)胞的活性，來計(jì)算細(xì)胞活性(活細(xì)胞數(shù)量)。結(jié)果見圖3。TLSlla-GC與TLSlla對(duì)細(xì)胞活性沒有明顯影響，阿霉素和 TLSlla-(GC)29-D0X能明顯地降低肝癌細(xì)胞活性。結(jié)果表明，不同濃度下，核酸適體衍生 物_藥物復(fù)合物對(duì)肝癌細(xì)胞具有與阿霉素相近的殺滅能力。實(shí)施例4、核酸適體衍生物-藥物復(fù)合物在活體動(dòng)物靶向給藥中的應(yīng)用20只NOD. Cg-Prkdc (scid) IL2老鼠，每只注射約7 X IO6個(gè)人體肝癌細(xì)胞LH86。注 射1天后，小鼠肝部均可以檢測(cè)到腫塊，活體檢測(cè)腫瘤體積為100-200mm3。將實(shí)施例2純化得到的核酸適體衍生物_藥物復(fù)合物用生理鹽水稀釋。將上述得到的小鼠進(jìn)行為期12天的試驗(yàn)如下(20只小鼠分成三組)第一組(6只)(對(duì)照組)每次注射IOOuL生理鹽水；第二組(7只)每次注射IOOuL阿霉素溶液，給藥劑量為2mg阿霉素/kg體重；第三組(7只)每次注射lOOuLTLSl la-(GC)29-DOX溶液，給藥劑量為2mg阿霉素 /kg體重；實(shí)驗(yàn)前后，每只老鼠稱重，計(jì)算各組老鼠的平均值。分別在第1、2、3、4、5、9、10、11 天通過老鼠尾部靜脈注射給藥并檢測(cè)老鼠的腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，統(tǒng)計(jì)各組老鼠的體重 下降率，體重下降率=(實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體重-實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重)/實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體重X100%。2、核酸適體-藥物復(fù)合物對(duì)老鼠的毒性分析實(shí)驗(yàn)過程中，老鼠的腫瘤體積見圖4A，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組老鼠的體重下降率見圖 4B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TLSlla-(GC)29-D0X與阿霉素對(duì)老鼠腫瘤體積的增長均具有較強(qiáng)的抑制 作用。TLSlla-(GC)29-D0X對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制作用與阿霉素相近，但是老鼠的體重降低 更少即副作用更少，說明核酸適體和藥物結(jié)合后，具有細(xì)胞膜穿透性的阿霉素對(duì)細(xì)胞的非 特異性作用得到了抑制，因此核酸適體_藥物復(fù)合物的非特異性細(xì)胞毒性大大降低。結(jié)果 表明核酸適體-藥物復(fù)合物能在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞靶向給藥，對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制作 用與阿霉素相近，但非特異性細(xì)胞毒性比阿霉素大大降低。
權(quán)利要求
核酸適體衍生物，是式(I)或式(II)或式(III)所示的單鏈DNA；式(I)5’ (CG)n 核酸適體 3’；式(II)5’ 核酸適體 (CG)m 3’；式(III)5’ (CG)t1 核酸適體 (CG)t2 3’；所述核酸適體如序列表的序列1所示；n＝1 50；m＝1 50；t1＝1 50；t2＝1 50。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸適體衍生物，其特征在于所述核酸適體衍生物如序列表 的序列3、序列表的序列4或序列表的序列5所示。
3.權(quán)利要求1或2所述核酸適體衍生物在制備藥物載體中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為抗癌藥物；所述抗癌藥物優(yōu)選為 抗肝癌藥物，最優(yōu)選為阿霉素。
5.一種治療癌癥的藥物，它的活性成分由權(quán)利要求1或2所述核酸適體衍生物和抗癌 藥物組成。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所述癌癥為肝癌；所述抗癌藥物為抗肝癌藥 物，優(yōu)選為阿霉素。
7.權(quán)利要求1或2所述核酸適體衍生物在制備輔助鑒別肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的試劑 盒中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝癌細(xì)胞為人體肝癌細(xì)胞系LH86；所 述正常肝細(xì)胞為人體正常肝細(xì)胞Hul082。
9.權(quán)利要求1或2所述核酸適體衍生物在輔助鑒別肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝癌細(xì)胞為人體肝癌細(xì)胞系LH86；所 述正常肝細(xì)胞為人體正常肝細(xì)胞Hul082。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸適體衍生物及其在制備藥物載體中的應(yīng)用。式(I)所示的單鏈DNA；所述核酸適體如序列表的序列1所示；n＝1-50。本發(fā)明提供的核酸適體衍生物具有肝癌細(xì)胞靶向性，可以作為藥物載體，對(duì)體內(nèi)肝癌細(xì)胞進(jìn)行靶向給藥，特異性殺死肝癌細(xì)胞，大大降低抗癌藥物對(duì)機(jī)體的毒性。本發(fā)明提供的核酸適體衍生物可大規(guī)模化學(xué)合成、易于與藥物分子連接，成本低，分子量相對(duì)較小，沒有免疫活性和毒性，穩(wěn)定性好，形成的藥物復(fù)合物穩(wěn)定。本發(fā)明提供的藥物復(fù)合物(靶向藥物)與肝癌細(xì)胞結(jié)合力強(qiáng)，能大大降低肝癌化療中毒副作用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。式(I)5’-(CG)n-核酸適體-3’。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101942445SQ201010230219
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者劉晨, 方曉紅, 譚蔚泓 申請(qǐng)人:譚蔚泓