專利名稱：假單孢菌zjwp－14及其在不對稱水解制備L－半胱氨酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物新菌種假單孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)及其在不對稱水解制備L-半胱氨酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-半胱氨酸所帶有的巰基具有重要的生理功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和飼料等行業(yè)。此外，L-半胱氨酸還可作為重要的中間體原料用于制備谷胱甘肽、色氨酸以及制備得到多種L-半胱氨酸的衍生物。L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法主要有天然產(chǎn)物提取法、化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法。國內(nèi)目前生產(chǎn)主要采用人或動(dòng)物毛發(fā)原料先經(jīng)酸水解或堿水解法提取L-胱氨酸后，再經(jīng)過電解還原制得L-半胱氨酸，此法常受到原料來源的限制，而且產(chǎn)物中易混入其它的氨基酸。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，特別是近年來歐洲等地瘋牛病的出現(xiàn)，迫使歐共體宣告從1998年7月1日起禁用由動(dòng)物毛發(fā)原料制得的L-半胱氨酸。化學(xué)合成法不僅步驟較多，而且得到的產(chǎn)物通常為DL型的外消旋體，尚需經(jīng)拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。由于酶轉(zhuǎn)化法具有立體選擇性好，可獲得單一構(gòu)型的產(chǎn)物；反應(yīng)條件溫和；對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視(楊金奎等.微生物方法生產(chǎn)L-半胱氨酸的研究進(jìn)展.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2001，22(4)179)。
酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-半胱氨酸可選擇采用三種底物(1)O-乙酰絲氨酸；(2)3-氯-L-丙氨酸；(3)DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)。1977年Sano等人從土壤中篩選到一些假單孢菌(Pseudomonas sp.)，可將DL-ATC不對稱水解為L-半胱氨酸。除假單孢菌外，許多細(xì)菌也能轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸。假單孢菌屬的不同菌株其代謝途徑存在差異，采用Pseudomonas putida AJ3865和Pseudomonas sp.ON-4a菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，中間產(chǎn)物為氮-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamoyl-L-cysteine，簡稱L-NCC)；而Pseudomonas sp.CU6和Pseudomonas thiazolinophilum菌株的轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物為硫-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamoyl-L-cysteine，簡稱L-SCC)。劉忠等人從生產(chǎn)DL-ATC環(huán)境采取土樣，從中分離得到一株假單孢菌(Pseudomonas sp.)TS1138菌株，可轉(zhuǎn)化DL-ATC生成L-半胱氨酸。(劉忠等.微生物酶法合成L-半胱氨酸和L-胱氨酸.微生物學(xué)通報(bào)，2003，30(6)16-21.)前面所提到的可將DL-ATC不對稱水解為L-半胱氨酸的假單孢菌Pseudomonas sp..ON-4a、Pseudomonas putida屬惡臭假單孢菌(pseudomonas putida)株。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可生物轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的微生物新菌株假單孢菌zjwp-14，以及利用該菌株生物催化DL-ATC不對稱水解合成L-半胱氨酸的方法。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是假單孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO.M 206104，保藏日期2006年9月29日。
菌種來源假單孢菌zjwp-14(以下簡寫為zjwp-14)是從杭州祥符鎮(zhèn)附近的土壤中分離培養(yǎng)得到的野生菌株HJ-14經(jīng)過紫外線照射、微波誘變、Co60-γ射線輻照誘變處理，以及DL-ATC底物抗性篩選獲得。紫外線照射功率為15w，照射距離30cm，照射時(shí)間為30～150s；微波誘變?yōu)榈突饳n，冰浴處理20～120秒；Co60-γ射線輻照劑量范圍在0.25KGy～2.0KGy。野生菌株HJ-14的分離方法為將采集土樣采用含DL-ATC的培養(yǎng)液進(jìn)行微生物富集培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后涂布在以DL-ATC為唯一氮源的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25～36℃，培養(yǎng)2～4d。以HJ-14菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)過如下所示的誘變譜系選育得到zjwp-14菌株。
出發(fā)菌株HJ14→紫外誘變→微波誘變→Co60-γ輻照→底物DL-ATC抗性篩選→自然分離→菌株zjwp-14zjwp-14的生長特性zjwp-14為非發(fā)酵菌，生長迅速，30℃初代培養(yǎng)24h后長出細(xì)小、點(diǎn)狀、圓形、濕潤、乳白色的菌落，48h后菌落長到直徑2-3mm，表面濕潤，并聯(lián)成一片。
zjwp-14的形態(tài)為革蘭氏陰性、短小的桿菌。直徑為0.5-1.0um，長為2um，革蘭氏染色后顯微鏡照片見圖1。
假單孢菌zjwp-14的生化特性細(xì)菌氧化酶陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性。采用API生化鑒定板條(法國biomerium公司)及經(jīng)典的手工方法加以鑒定。結(jié)果顯示zjwp-14與Pseudomonas mendocina相似，但符合率不到90％。將全自動(dòng)微生物生化分析儀(API20NE，RapID，andVITEK-Ams60)分鑒定數(shù)據(jù)總結(jié)見表1。
表1zjwp-14生化特性(表中-表示陰性；+表示陽性)
zjwp-14的16S rDNA特性用細(xì)菌的16S rDNA的序列可比較精確地鑒定細(xì)菌的屬和種。將zjwp-14的16S rDNA的PCR產(chǎn)物的序列與基因庫NCBI中的16S rDNA序列比對，發(fā)現(xiàn)與假單孢菌屬中一些菌，如Pseudomonas sp.BS有99.7％的同源性，zjwp-14的16S rDNA的部分核苷酸序列如下ATTGACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTAGGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTCATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGG。
本發(fā)明假單孢菌zjwp-14可用于DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-Δ2-thiazolin-4-carbonic acid，DL-ATC)不對稱水解制備L-半胱氨酸。
所述的應(yīng)用為以假單孢菌zjwp-14進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)處理得到粗酶液為酶源，以DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸為底物，在轉(zhuǎn)化液中于20～52℃下進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)1～9h，反應(yīng)完全得含L-半胱氨酸的反應(yīng)液，經(jīng)分離提取制得L-半胱氨酸。
所述的底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸初始質(zhì)量濃度為0.5％～2.5％。
所述的酶源為濕菌體，所述濕菌體來自發(fā)酵酶液，所述發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6，所述濕菌體添加量按發(fā)酵酶液與轉(zhuǎn)化液體積比為0.5～5∶1計(jì)。
具體的，所述的應(yīng)用是以假單孢菌zjwp-14進(jìn)行種子培善養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵酶液中離心得到的濕菌體作為酶源，所述發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6，以含0.1～1.5％DL-ATC的磷酸鹽緩沖溶液為轉(zhuǎn)化液，所述濕菌體添加量按發(fā)酵酶液與轉(zhuǎn)化液體積比為0.5～5∶1計(jì)，控制轉(zhuǎn)化溫度為20～52℃，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)1～9h，反應(yīng)完全得含L-半胱氨酸的反應(yīng)液，經(jīng)分離提取制得L-半胱氨酸。
所述應(yīng)用按如下方法取得濕菌體(1)斜面培養(yǎng)挑取保存的假單孢菌zjwp-14轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24～48h得活化的菌種；所述的斜面培養(yǎng)基組成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油10～30g/L，酵母浸出物2.0～10g/L，牛肉膏2.0～10g/L，NaCl 1.0～5.0g/L，瓊脂15～25g/L，pH7.0～8.0；121℃滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取一環(huán)假單孢菌zjwp-14轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)10～24h得種子培養(yǎng)液；所述的種子培養(yǎng)基組成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油5.0～30.0g/L，酵母浸出物5.0～30g/L，蛋白胨5.0～30g/L，牛肉膏5.0～30g/L，NaCl 1.0～5.0g/L，pH7.0～8.0g/L；121℃滅菌20min，滅菌后冷卻制成種子培養(yǎng)基；(3)產(chǎn)酶培養(yǎng)取種子培養(yǎng)液接種，接種量為0.5～5％，25～35℃，搖床轉(zhuǎn)速100～250r/min，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)10～24h，獲得發(fā)酵酶液；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成(同種子培養(yǎng)基)；按上述條件得到的發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6。
(4)將發(fā)酵酶液離心、洗滌，收集濕菌體。
由于半胱氨酸不穩(wěn)定，而胱氨酸比較穩(wěn)定，本發(fā)明將生物轉(zhuǎn)化得到的半胱氨酸氧化成胱氨酸后進(jìn)行提取。具體方法為轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將反應(yīng)液離心(10,000rpm，10min，4℃)，上清液加入微量的FeSO4，在往復(fù)式搖床上通氣振蕩20～30h后，用濃HCl溶液調(diào)節(jié)至pH2左右，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定濃度，冷卻后離心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液作為上柱樣品。將樣品用恒流泵以0.5mL/min的速度流加到裝有732樹脂的離子交換柱中，用去離子水淋洗，再用0.5～1.0mol/L的氨水洗脫，流速為0.5mL/min，洗脫過程中隨時(shí)監(jiān)測流出液中的L-胱氨酸含量，洗脫完畢后合并含量較高的各管，真空干燥得到固體樣品。樣品經(jīng)旋光測定，證實(shí)確為L型產(chǎn)物。比較制備樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的薄板層析圖、質(zhì)譜圖，確定為同一物質(zhì)。
優(yōu)選的，所述應(yīng)用如下所述應(yīng)用為將發(fā)酵酶液直接制成的濕菌體用0.1M，pH8.0的磷酸緩沖液清洗，所述發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6，再將濕菌體轉(zhuǎn)入所述的緩沖液中，所述濕菌體添加量按發(fā)酵酶液與轉(zhuǎn)化液體積比為2∶1計(jì)，同時(shí)加入底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸濃度使底物初始質(zhì)量濃度為1％，于42℃、水浴反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液分離提取制得L-胱氨酸形式存放，所述的分離提取步驟為反應(yīng)液離心，取上清液加入FeSO4足以使足以L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，此時(shí)最好通入空氣促使加速FeSO4將L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，振蕩20～30h后，用濃HCl溶液調(diào)節(jié)至pH2，蒸發(fā)濃縮，冷卻后離心，上清液流加到裝有732樹脂的離子交換柱中，用去離子水淋洗，再用0.5～1.0mol/L的氨水洗脫，洗脫完畢后合并L-胱氨酸含量較高的流出液，真空干燥得到所述L-胱氨酸。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株新的可不對稱水解DL-ATC生產(chǎn)L-半胱氨酸微生物菌種，本發(fā)明提供的假單孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)有別于背景技術(shù)中提到的惡臭假單孢菌，應(yīng)用于制備L-半胱氨酸立體選擇性好、反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好，產(chǎn)率高。


圖1為假單孢菌zjwp-14的革蘭氏染色后顯微鏡照片；圖2為不同菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的掃描譜圖；圖3為實(shí)施例2產(chǎn)物紅外譜圖；圖4為L-胱氨酸紅外標(biāo)準(zhǔn)譜圖；圖5為不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體濃度；圖6為產(chǎn)酶時(shí)間曲線。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1從杭州祥符鎮(zhèn)附近的土壤中分離培養(yǎng)得到的野生假單孢菌株HJ-14、HJ-3、HJ-6、HJ-21、HJ-17、HJ-10，分別按下述順序方法進(jìn)行初篩富集培養(yǎng)基I(g/L)甘油10.0，DL-ATC 3.0，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.0。121℃滅菌20min，滅菌后冷卻接種，將少量土樣接種到培養(yǎng)基中，200rpm回轉(zhuǎn)式搖床，30℃培養(yǎng)2d，作為進(jìn)一步富集培養(yǎng)的種子。
富集培養(yǎng)基II(g/L)甘油10.0，DL-ATC 6.0，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.0。121℃滅菌20min，滅菌后冷卻接種。將經(jīng)過第一次富集的富集液接入培養(yǎng)基II，200rpm回轉(zhuǎn)式搖床，30℃培養(yǎng)2d，作為初篩平板的種子。
平板培養(yǎng)基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油10.0，NaCl 5.0，瓊脂2.0，pH7.0。121℃滅菌20min，滅菌后冷卻接種。將經(jīng)過二次富集的菌體稀釋后涂布在平板上，30℃培養(yǎng)2d。挑取單菌落轉(zhuǎn)接斜面。
斜面培養(yǎng)基(g/L)DL-ATC 2.0，甘油10.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH7.0。121℃滅菌20min，滅菌后冷卻，接種后30℃培養(yǎng)1d。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油20.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.0。裝液量為250ml三角瓶裝50ml培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，滅菌后冷卻接種斜面種子，200rpm搖床，30℃培養(yǎng)12h，作為種子或發(fā)酵酶液。
發(fā)酵酶液稀釋10倍后菌體濁度范圍為OD6000.4～0.6，離心10min(4,000rpm)，收集菌體，用磷酸緩沖液(0.1M，pH8.0)清洗兩次，將菌體轉(zhuǎn)入相同的緩沖液中，使菌體濃度為原發(fā)酵酶液的兩倍，同時(shí)加入濃度為1％的DL-ATC底物，于42℃，水浴反應(yīng)2h后，加入1M HCl，離心除去菌體后得上清液。上清液采用酸性茚三酮法進(jìn)行產(chǎn)物的初步定性和定量分析。結(jié)果如圖2所示。
結(jié)論菌株HJ-14、HJ-3、HJ-6、HJ-21、HJ-17、HJ-10的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與標(biāo)樣半胱氨酸的掃描曲線一致，可以判定這些菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為半胱氨酸，其中HJ-14的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在560nm處的吸收最大，說明其半胱氨酸含量最高。
實(shí)施例2按照實(shí)施例1中的結(jié)果選出菌株HJ-14，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，加入底物DL-ATC(終濃度為1％)，于42℃，水浴反應(yīng)6h后，將反應(yīng)液離心(10,000rpm，10min，4℃)，上清液加入微量的FeSO4，在往復(fù)式搖床上通氣振蕩20～30h后，用濃HCl溶液調(diào)節(jié)至pH2左右，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷卻，離心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液作為上柱樣品。將樣品用恒流泵以0.5mL/min的速度流加到732樹脂柱中，用去離子水淋洗后，用0.5mol/L的氨水進(jìn)行洗脫，流速為0.5mL/min，洗脫過程中隨時(shí)監(jiān)測流出液中的L-胱氨酸含量，洗脫完畢后合并含量較高的各管，真空干燥得到固體樣品。
將提取產(chǎn)物與L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于0.01M HCl，進(jìn)行薄層分析，展開劑為正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1，提取產(chǎn)物的Rf為0.400，L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的Rf為0.402，獲得的產(chǎn)物與L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品有相同的Rf值。L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品Rf為0.593，酶促反應(yīng)液中產(chǎn)物Rf為0.596，證明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物確為半胱氨酸。
轉(zhuǎn)化樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖對照見圖3、圖4所示。
樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的旋光分析將旋光儀中的讀數(shù)代入公式計(jì)算該產(chǎn)物的比旋光度，對獲得的產(chǎn)物測定3次，其讀數(shù)分別為-0.634、-0.628、-0.627，取3次的平均值-0.629。代入公式計(jì)算[α]D20=αLC=-0.6291×0.003=-209.9]]>L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品3次測定的值為-0.628、-0.635、-0.633，取3次平均值-0.632，代入公式計(jì)算 由計(jì)算結(jié)果可知，純化后的產(chǎn)物與L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品有十分接近的比旋光度，證明得到的胱氨酸是L型異構(gòu)體，可以確定由DL-ATC酶促反應(yīng)生成的半胱氨酸也是L型異構(gòu)體。
實(shí)施例3實(shí)施例1篩選得到的野生菌株HJ-14經(jīng)過紫外線照射、微波誘變、Co60-γ射線輻照誘變處理，以及DL-ATC底物抗性篩選(詳細(xì)步驟如前所述)，獲得假單孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)。
斜面培養(yǎng)基(g/L)DL-ATC 2.0，甘油10.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH7.0。121℃滅菌20min，滅菌后冷卻，接入Pseudomonas sp.zjwp-14，30℃培養(yǎng)1d。
種子培養(yǎng)基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油20.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.0。裝液量為250ml三角瓶裝液50ml，121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接入一環(huán)斜面種子，200rpm搖床，30℃培養(yǎng)12h，作為種子。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油20.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.0。裝液量為250ml三角瓶裝液50ml，121℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接入1ml的種子，200rpm搖床，30℃培養(yǎng)，每隔2h，按實(shí)施例1方法測定菌體濁度和酶活。結(jié)果如圖5、圖6所示。
實(shí)施例4用Pseudomonas sp.zjwp-14，按實(shí)例3方法發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵培養(yǎng)12h后，取10ml發(fā)酵酶液，離心后得到的濕菌體加于20ml試管中裝0.1M，pH8.0磷酸緩沖液5ml，含底物DL-ATC量分別為0.1％，0.3％，0.6％，1.0％，1.3％，1.6％于42℃水浴下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)2h后結(jié)束，加1ml HCl(1M)滅活酶源，反應(yīng)液離心除去菌體，得上清液。上清液用酸性茚三酮法測定。結(jié)果如表2表2不同底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響

實(shí)施例5用Pseudomonas sp.zjwp-14，按實(shí)例3方法發(fā)酵培養(yǎng)12h后，取2.5～25ml的發(fā)酵酶液離心后得到的濕菌體加于20ml試管中裝0.1M，pH8.0磷酸緩沖液5ml，起始底物DL-ATC量為0.05g/管，于42℃水浴下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。2h后反應(yīng)結(jié)束，加1mlHCl(1M)滅活酶源，離心除去菌體，得上清液。上清液用酸性茚三酮法測定，結(jié)果如表3。
表3不同的菌體量對轉(zhuǎn)化的影響

實(shí)施例6用Pseudomonas sp.zjwp-14，按實(shí)例3方法發(fā)酵產(chǎn)酶，按實(shí)例5方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，5ml反應(yīng)體系中含底物DL-ATC量為0.05g，金屬離子含量分別為0.2mM和2mM，反應(yīng)2h后取樣，進(jìn)行酸性茚三酮含量分析，結(jié)果如表4所示。
表4不同金屬離子對酶活的影響

實(shí)施例7用Pseudomonas sp.zjwp-14，按實(shí)例3方法發(fā)酵產(chǎn)酶，5ml反應(yīng)體系中含底物DL-ATC量為0.05g，按實(shí)例6方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化于20-52℃的水浴中反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行酸性茚三酮分析含量。結(jié)果如表5。
表5轉(zhuǎn)化溫度曲線

實(shí)施例8用Pseudomonas sp.zjwp-14，發(fā)酵產(chǎn)酶方法同實(shí)例3，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)方法同實(shí)例6，50ml反應(yīng)體系中含底物DL-ATC量為0.5g。于反應(yīng)不同時(shí)間取樣，進(jìn)行酸性茚三酮分析含量并計(jì)算轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。結(jié)果如表6所示。
表6轉(zhuǎn)化時(shí)間曲線

序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>浙江工業(yè)大學(xué)<120>假單孢菌zjwp-14及其在不對稱水解制備L半胱氨酸中的應(yīng)用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1456<212>DNA<213>Pseudomonas sp.zjwp-14<400>1attgacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg gatgacggga gcttgctcct 60tgattcagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggacaacg120tttcgaaagg aacgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg accttcgggc180cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg gtggggtaat ggctcaccaa240ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac actggaactg agacacggtc300cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag360ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc actttaagtt gggaggaagg420gcagtaagtt aataccttgc tgttttgacg ttaccgacag aataagcacc ggctaactct480gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa540gcgcgcgtag gtggttcgtt aagttggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc600atccaaaact ggcgagctag agtagggcag agggtggtgg aatttcctgt gtagcggtga660aatgcgtaga tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga ccacctgggc tcatactgac720actgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta780aacgatgtca actagccgtt ggaatccttg agattttagt ggcgcagcta acgcattaag840ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc900acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggccttga960catgcagaga actttccaga gatggattgg tgccttcggg aactctgaca caggtgctgc 1020atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc 1080ttgtccttag ttaccagcac gttatggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc 1140ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cggcctgggc tacacacgtg 1200ctacaatggt cggtacagag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatct cacaaaaccg 1260atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320cgaatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380tgggagtggg ttgcaccaga agtagctagt ctaaccttcg ggaggacggt taccacggtg 1440tgattcatga ctgggg 145權(quán)利要求
1.假單孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M.206104。
2.如權(quán)利要求1所述的假單孢菌zjwp-14，其特征在于所述假單孢菌zjwp-14的16S rDNA的部分核苷酸序列如下ATTGACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTAGGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTCATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGG。
3.如權(quán)利要求1所述的假單孢菌zjwp-14，其特征在于所述假單孢菌zjwp-14的菌落特征如下為非發(fā)酵菌，生長迅速，30℃初代培養(yǎng)24h后長出細(xì)小、點(diǎn)狀、圓形、濕潤、乳白色的菌落，48h后菌落長到直徑2～3mm，表面濕潤，并聯(lián)成一片，個(gè)體為短小的桿菌，直徑為0.5～1.0μm，長為2μm；所述假單孢菌zjwp-14的生化特性如下革蘭氏陰性，細(xì)菌氧化酶陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，甘露醇陰性，L-丙氨酸陽性，D-葡萄糖陽性，蔗糖陰性，L-阿拉伯糖陰性，麥芽糖陰性，丙酸鹽陽性，辛二酸鹽陰性，L-絲氨酸陽性，L-脯氨酸陽性。
4.如權(quán)利要求1～3之一所述的假單孢菌zjwp-14在DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸不對稱水解制備L-半胱氨酸中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以假單孢菌zjwp-14進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)處理得到粗酶液為酶源，以DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸為底物，在轉(zhuǎn)化液中于20～52℃下進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)1～9h，反應(yīng)完全得含L-半胱氨酸的反應(yīng)液，經(jīng)分離提取制得L-半胱氨酸。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸初始質(zhì)量濃度為0.5％～2.5％。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的酶源為濕菌體，所述濕菌體來自發(fā)酵酶液，所述發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6，所述濕菌體添加量按發(fā)酵酶液與轉(zhuǎn)化液體積比為0.5～5∶1計(jì)。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是以假單孢菌zjwp-14進(jìn)行種子培善養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵酶液中離心得到的濕菌體作為酶源，所述發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6，以含0.1～1.5％DL-ATC的磷酸鹽緩沖溶液為轉(zhuǎn)化液，所述濕菌體添加量按發(fā)酵酶液與轉(zhuǎn)化液體積比為0.5～5∶1計(jì)，控制轉(zhuǎn)化溫度為20～52℃，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)1～9h，反應(yīng)完全得含L-半胱氨酸的反應(yīng)液，經(jīng)分離提取制得L-半胱氨酸。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用按如下方法取得濕菌體(1)斜面培養(yǎng)挑取假單孢菌zjwp-14單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24～48h得活化的菌種；所述的斜面培養(yǎng)基組成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油10～30g/L，酵母浸出物2.0～10g/L，牛肉膏2.0～10g/L，NaCl1.0～5.0g/L，瓊脂15～25g/L，pH7.0～8.0；121℃滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取一環(huán)假單孢菌zjwp-14轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)10～24h得種子培養(yǎng)液；所述的種子培養(yǎng)基組成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油5.0～30.0g/L，酵母浸出物5.0～30g/L，蛋白胨5.0～30g/L，牛肉膏5.0～30g/L，NaCl1.0～5.0g/L，pH7.0～8.0g/L；121℃滅菌20min，滅菌后冷卻制成種子培養(yǎng)基；(3)產(chǎn)酶培養(yǎng)取種子培養(yǎng)液接種，接種量為0.5～5％，25～35℃，搖床轉(zhuǎn)速100～250r/min，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)10～24h，獲得發(fā)酵酶液；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成同種子培養(yǎng)基；(4)將發(fā)酵酶液離心、洗滌，收集濕菌體。10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將發(fā)酵酶液直接制成的濕菌體用0.1M，pH8.0的磷酸緩沖液清洗，所述發(fā)酵酶液稀釋10倍后OD600為0.4～0.6，再將溫菌體轉(zhuǎn)入所述的緩沖液中，所述濕菌體添加量按發(fā)酵酶液與轉(zhuǎn)化液體積比為2∶1計(jì)，同時(shí)加入底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸濃度使底物初始質(zhì)量濃度為1％，于42℃、水浴反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液分離提取制得L-胱氨酸形式存放，所述的分離提取步驟為反應(yīng)液離心，取上清液加入FeSO4足以使足以L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，振蕩20～30h后，用濃HCl溶液調(diào)節(jié)至pH2，蒸發(fā)濃縮，冷卻后離心，上清液流加到裝有732樹脂的離子交換柱中，用去離子水淋洗，再用0.5～1.0mol/L的氨水洗脫，洗脫完畢后合并L-胱氨酸含量較高的流出液，真空干燥得到所述L-胱氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種假單胞菌及其在生物催化制備L－半胱氨酸中的應(yīng)用，所述的假單胞菌zjwp－14(Pseudomonas sp.zjwp－14)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M.206104。以假單胞菌zjwp－14進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)處理得到粗酶液為酶源，以DL－2－氨基－噻唑啉－4－羧酸為底物，在轉(zhuǎn)化液中于20～52℃下進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)1～9h，反應(yīng)完全得含L－半胱氨酸的反應(yīng)液，經(jīng)分離提取制得L－半胱氨酸。本發(fā)明提供了一株新的可不對稱水解DL－ATC生產(chǎn)L－半胱氨酸微生物菌種，應(yīng)用于制備L－半胱氨酸立體選擇性好、反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好，產(chǎn)率高。
文檔編號C12N15/31GK1995327SQ20061005393
公開日2007年7月11日 申請日期2006年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月21日
發(fā)明者王普, 呂國英, 何軍邀, 王浩, 周麗敏 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)