專利名稱：微生物方法制備丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(cephalosporansaure)衍生物及其可溶性鹽，其結(jié)構(gòu)通式為
(其中R是氫原子、羥基或乙酸基)。論述一種新的從相應(yīng)的頭孢菌素C衍生物出發(fā)的制備方法，以及一種適用于此方法的新的微生物。
其次，本發(fā)明還涉及一種新的微生物方法，從丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物制備7-氨基頭孢烷酸衍生物，并敘述一種假單孢菌屬(PesudomonasSP，DSM7509)微生物的新的應(yīng)用方法。
下面將說(shuō)明丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物(結(jié)構(gòu)式Ⅲ)，頭孢菌素C-衍生物(結(jié)構(gòu)式Ⅳ)，根據(jù)結(jié)構(gòu)式Ⅱ的丙二酰-內(nèi)酯，以及結(jié)構(gòu)式Ⅰ的內(nèi)酯及其可溶性鹽，例如銨鹽或堿金屬鹽。
丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物可作為制備7-氨基頭孢烷酸衍生物的初始原料，它也是制備頭孢菌屬抗生素的重要初始化合物(J.Bacteriol.，1987，16912，5815-5820)。
至今不知道由丙二酰-7-頭孢烷酸衍生物來(lái)的化學(xué)的和微生物制備方法。
許多微生物方法是以頭孢菌素C為原料制備7-氨基頭孢烷酸，例如在JP-A6248380中所描述的。但是這種方法有許多缺點(diǎn)，以至大型工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)變得不可行。
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種利用新的微生物來(lái)制備新的丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物的方法，這是一種簡(jiǎn)單而又經(jīng)濟(jì)的微生物方法。接著在任務(wù)是用這種新的衍生物采用新的微生物方法制備7-氨基頭孢烷酸衍生物。
按照本發(fā)明，這一任務(wù)可以通過(guò)按照權(quán)利要求1的新的微生物，通過(guò)按照權(quán)利要求3的新的方法，通過(guò)按照權(quán)利要求8的新的丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物，以及通過(guò)按照權(quán)利要求10的新方法來(lái)解決。
按照本發(fā)明，篩選一種微生物，它能把內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)式為
作為唯一的碳源、氮源和能源，通過(guò)丙二酰內(nèi)酯其結(jié)構(gòu)式為
而被利用，后者不會(huì)被分解代謝。這些微生物可以用按照結(jié)構(gòu)式Ⅰ的內(nèi)酯藉助傳統(tǒng)的微生物技術(shù)，例如從各種各樣的土樣中進(jìn)行篩選，也就是說(shuō)從土樣中接種進(jìn)行微生物培養(yǎng)，可以得到微生物用按照結(jié)構(gòu)式Ⅰ的內(nèi)酯作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)。然后按照專業(yè)的普通方法篩選這些微生物，篩選出能把按照結(jié)構(gòu)式Ⅰ的內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)式Ⅱ的丙二酰內(nèi)酯，而不分解代謝的微生物。
篩選所需的內(nèi)酯(結(jié)構(gòu)式Ⅰ)可以從市場(chǎng)上購(gòu)得的去乙酰頭孢菌素C取得，為此，首先用已知的方法(Jefferayetal.，Biochem.J.，1961，81，591)把去乙酰頭孢菌素C進(jìn)行內(nèi)酯化成相應(yīng)的內(nèi)酯，為生成希望得到的、具有內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)(結(jié)構(gòu)式Ⅰ)的內(nèi)酯，可以用專業(yè)的方法，例如借助青霉素酶將內(nèi)酰胺環(huán)打開(kāi)。
原則上在此篩選壓力下取得的所有微生物都適用。這類微生物在文獻(xiàn)中未曾描述，是本發(fā)明的組成部分。
據(jù)此目的，通過(guò)篩選可獲得標(biāo)記為FBI(DSM7007)的微生物及其突變體和子系體。這些均在1992年3月25日存入德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)公司(Mascheroderweg1b，D-3300Braunschweig)。
在提出關(guān)于16sRNA分析報(bào)告的優(yōu)先日后這些微生物鑒定歸入SphingomonasSP。
SphingomonasSpFB1(DSM7007)的描述細(xì)胞形態(tài)微小桿菌寬度，μm0.4～0.6長(zhǎng)度，μm0.8～1.5活動(dòng)性+鞭毛極生1革蘭氏反應(yīng)-3%KOH溶菌作用+氨肽酶(Cerny)+孢子-
氧化酶+過(guò)氧化氫酶+主要苯醌組分輔酶Q10HPLC-快速法的DNA-堿基組成63mol%G+C一般是在無(wú)機(jī)鹽介質(zhì)中進(jìn)行微生物的篩選和培養(yǎng)，這種無(wú)機(jī)鹽介質(zhì)的組成列于表1(a和b)。成功的篩選出微生物后，最理想的是在另一種介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)，例如商業(yè)上通用的完全培養(yǎng)基。
據(jù)此目的，培養(yǎng)和篩選時(shí)，將0.2～1重量%，最好是0.3～0.6重量%的結(jié)構(gòu)Ⅰ內(nèi)酯加入列機(jī)鹽培養(yǎng)基中。
篩選和培養(yǎng)溫度為0～60℃，最好是20～40℃。pH值5～9，最好是6～8。
在650nm(OD650)時(shí)光密度達(dá)到0.1～1，可以按照專業(yè)通用的方法采集微生物，并使用本發(fā)明的方法。
按本發(fā)明，用這一方法篩選出的微生物使用本發(fā)明的方法將頭孢菌素C衍生物，其結(jié)構(gòu)通式為 其中R是氫原子、羥基或乙酸基(作為底物)，轉(zhuǎn)化為丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物，其結(jié)構(gòu)通式為
其中R如前述。
適宜的是，這一方法用篩選出的如前所述保存的微生物SphingomonasSP.FB1(DSM7007)或其子系體和突變體來(lái)實(shí)施。
一般，這一方法以專業(yè)通用的方法用未生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行。
將頭孢菌素C衍生物(結(jié)構(gòu)通式Ⅳ)作為底物，其中R為前述。用頭孢菌素C(R在結(jié)構(gòu)式Ⅲ中＝乙酸基)作底物也是適宜的。
按照本方法，可將底物一次性或持續(xù)性地加入。理想的做法是，添加底物使其在培養(yǎng)基中的濃度不超過(guò)20重量%，最好是4重量%。
本方法可使用專業(yè)通用的介質(zhì)，最好是在低分子的HEPES(4-(2-羥乙基)-哌嗪-1-乙烷-磺酸)緩沖液中進(jìn)行。
一般，此方法可以用微生物懸浮液進(jìn)行，此懸浮液OD650為1～100，最好是2～50。
本方法適宜在溫度為0～60℃之間，最好是20-40℃，pH值為5-9，最好是6-8時(shí)進(jìn)行。
通常經(jīng)1～24小時(shí)轉(zhuǎn)化后，可以用專業(yè)通用的方法分離出至今尚未敘述過(guò)的丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物，作為分離的丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物的最好代表物是丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(R在結(jié)構(gòu)式Ⅲ中＝乙酸基)。
本發(fā)明方法制備7-氨基頭孢烷酸衍生物的結(jié)構(gòu)通式為
其中R如前述，按下述方式進(jìn)行將丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物或其可溶性鹽(結(jié)構(gòu)通式Ⅲ)作為底物，借助假單孢菌屬(DSM7509)微生物，或其子系體和突變體，或者用此微生物無(wú)細(xì)胞的酶轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式Ⅴ)。
這種假單孢菌屬微生物PseudomonasSP(DSM7509)于1993年3月5日存入德國(guó)微生物與細(xì)胞培養(yǎng)公司(Mascheroderweg1b，D-3300Bravnschweig)。
這類微生物為已知的，在JP-A6248380中敘述為假單孢菌微生物PseudomonasSP.SE-495(FERMBP-818)，按照J(rèn)PA6248380所述，這類微生物的篩選方法是，將戊二酰-7-氨基頭孢烷酸水解為7-氨基頭孢酸。但未述及利用此微生物水解丙二酰-7-氨基頭孢烷酸。
然后本發(fā)明再論述利用這類微生物水解丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物(結(jié)構(gòu)式Ⅴ)，特別是丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(R＝乙酸基)。
本發(fā)明也適宜用具有通透性的微生物細(xì)胞，或用無(wú)細(xì)胞的酶提取物來(lái)進(jìn)行，最好是用無(wú)細(xì)胞的酶提取物。
可以用專業(yè)通用的方法制備無(wú)細(xì)胞酶提取物，例如用超聲技術(shù)或應(yīng)用“French-Press”方法。
可以用丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物作為底物(結(jié)構(gòu)通式Ⅴ，其中R如前述)。用丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(R＝乙酸基)作底物更適宜。
可以將底物一次性或持續(xù)性地加入，適當(dāng)?shù)姆绞绞堑孜镌谂囵B(yǎng)基中的濃度不超過(guò)10重量%，最好為2重量%。
在本方法中可使用專業(yè)通用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
要是本方法使用無(wú)細(xì)胞的酶提取物，則此提取物的蛋白質(zhì)濃度應(yīng)為0.1-20克/升，最好是1～5克/升。
本方法適合在溫度4～50℃，最好為20-35℃，pH值為4-9，最好是7-8的條件下進(jìn)行。
一般經(jīng)過(guò)3-24小時(shí)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，就可分離出7-氨基頭孢酸衍生物(結(jié)構(gòu)式Ⅴ)。
實(shí)施例1微生物分離把從Visp(瑞士)郊區(qū)土壤中取得的各種土樣作為接種物加入100毫升無(wú)機(jī)鹽介質(zhì)中(表1)，pH7.0，含5毫克分子濃度(0.5mmol/100毫升)具有酰胺開(kāi)環(huán)(結(jié)構(gòu)式Ⅰ)的內(nèi)酯，于25℃在搖床上培養(yǎng)，搖床為140UPm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))。把這些培養(yǎng)物在新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中移種4次，然后借助分析型HPLC對(duì)內(nèi)酯轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行測(cè)試。
然后將此培養(yǎng)物在含5毫克分子濃度內(nèi)酯(結(jié)構(gòu)Ⅰ)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基-瓊脂-平板上于25℃時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。接著分離SphingomonasSP.FB1(DSM7007)菌株，它在內(nèi)酯中生長(zhǎng)時(shí)生成丙二酰-丙酯(結(jié)構(gòu)式Ⅱ)，后者不會(huì)完全分解。
實(shí)施例2丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(結(jié)構(gòu)式Ⅲ)的生成把微生物Sphingomonas SP.FB1(DSM7007)在含5毫克分子濃度內(nèi)酯(結(jié)構(gòu)式Ⅰ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，pH為7.0(表1b)，4天內(nèi)達(dá)到OD650＝0.44。(在頭2天后再加入此內(nèi)酯，使總濃度達(dá)到1毫克分子/100毫升培養(yǎng)基)。接著離心分離細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀物在20毫升10毫克分子濃度HEPES緩沖液中(pH為7.0)再懸浮，此時(shí)將OD650調(diào)節(jié)到2.2。在細(xì)胞懸浮液中加入0.4毫克分子頭孢菌素C(結(jié)構(gòu)式Ⅳ)，在搖床上(140轉(zhuǎn)/分鐘)于25℃時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。
在30分鐘、60分鐘、2.25小時(shí)、5小時(shí)和24小時(shí)后，用HPLC分析法測(cè)試樣品。
丙二酰-7-氨基頭孢烷酸的生成率在2.25小時(shí)時(shí)為410毫克/升/小時(shí)/OD650。
5小時(shí)后分析可檢出142mg丙二酰-7-氨基頭孢烷酸，相當(dāng)于轉(zhuǎn)化99%頭孢菌素C。丙二酰-7-氨基頭孢烷酸可用制備型HPLC分離，得率為40%。
實(shí)施例3丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(結(jié)構(gòu)式Ⅲ)的鑒定鑒定結(jié)構(gòu)式Ⅲ的產(chǎn)物采用500ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(表Ⅰ)，pH7.0，加入結(jié)構(gòu)式Ⅰ的內(nèi)酯溶液，使最終濃度達(dá)到5毫克分子。然后將此預(yù)培養(yǎng)溶液，OD650＝0.5，在25℃和140轉(zhuǎn)/分條件下進(jìn)行接種，一天后每500毫升培養(yǎng)基再加入5mmol內(nèi)酰(結(jié)構(gòu)式Ⅰ)。當(dāng)OD650達(dá)到0.5時(shí)收集細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀物放入30ml10毫克分子濃度的HEPES緩沖液中再懸浮，pH為7.0，含0.6mmol頭孢菌素C(結(jié)構(gòu)式Ⅳ)。在25℃，140轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)5小時(shí)后將細(xì)胞離心分離，并用制備型HPLC將丙二酰-7-氨基頭孢烷酸從上清液中凈化。將凈化的樣品經(jīng)冷凍干燥過(guò)夜，用NMR(1H和13C)分析凍干物。
對(duì)照化學(xué)方法制備的參比物(從7-氨基頭孢烷酸制得，按照Bull.Soc.Chem.Belg.，1977，86，991～1002)，證實(shí)生成丙二酰-7-氨基頭孢烷酸。
丙二酰-7-氨基頭孢烷酸鈉鹽(化學(xué)標(biāo)準(zhǔn))13C-NMR(DMSO，100.5MHz，δ以ppm計(jì))
20，s;25，s;40，m;58，d;64，s;112，s;134，s;164，d;170，t。
丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(按照本發(fā)明的方法)13C-NMR(DMSO，100.5MHzδ以ppm計(jì))20，s;25，s;40，m;58，d;64，s;112，s;134，s;164，d;170，t。
1H-NMR(化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，DMSO，400MHz，δppm計(jì));
20，s;2.5，s;3.0，t;3.5，m;4.8，d;5.0，d;5.6，d。
1H-NMR(按本發(fā)明的方法)2.0，s;2.5，s;3.0，t;3.5，m;4.8，d;5.0，d;5.6，d。
實(shí)施例4去乙酰頭孢菌素的內(nèi)酯化用下述方法從去乙酰頭孢菌素C(Ciba-Geigy公司，Basel)制備去乙酰頭孢菌素C-內(nèi)酯將100g去乙酰頭孢菌素C溶于1升20毫克分子濃度磷酸鈉pH7.0緩沖液中，再將離子交換劑DOWEX50×8(H+型)(Fluka)加入此溶液中，使pH達(dá)到2.5。攪拌10分鐘后(250轉(zhuǎn)/分，室溫下)，濾出離子交換樹(shù)脂，用濃鹽酸將溶液的pH值調(diào)節(jié)到0.8;攪拌1小時(shí)后(室溫，250轉(zhuǎn)/分)在反應(yīng)液中加DOWEX1×8(乙酸鹽型)(Fluka)使pH達(dá)到3.0～3.2。
然后在室溫，250轉(zhuǎn)/分繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)，接著濾出離子交換樹(shù)脂，重又加入DOWEX1×8(乙酸鹽型)至pH達(dá)到3.3～3.5，攪拌1小時(shí)(室溫，250轉(zhuǎn)/分)，接著再濾出離子交換樹(shù)脂，然后將反應(yīng)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)蒸發(fā)(30毫巴，30℃)干燥。為去除尚存的乙酸，將蒸發(fā)后產(chǎn)物溶于水成35%溶液，然后用濃鹽酸將pH調(diào)到1.5。將得到的溶液用等體積乙酸乙酯提取2次，液相凈化并用3克分子濃度KOH溶液將pH調(diào)到3.5，再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)蒸發(fā)(30毫巴，30℃)。然后再將此產(chǎn)品置干燥器內(nèi)于真空下(30毫巴，20℃)完全干燥。
總得率為60克，相當(dāng)于100g去乙酰頭孢菌素C中得率60%。
實(shí)施例5制備內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)的內(nèi)酯(結(jié)構(gòu)式Ⅰ)為制備內(nèi)酯，將去乙酰頭孢菌素C-內(nèi)酯置于含有β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶〔E.C.3.5.2.6〕(Sigma))的儲(chǔ)備溶液6(表1a)中進(jìn)行處理。加入青霉素酶后反應(yīng)立即開(kāi)始，在反應(yīng)過(guò)程中加入1當(dāng)量NaoH溶液使pH保持在7.0，一俟不再加NaoH而pH值穩(wěn)定在7.0時(shí)反應(yīng)即結(jié)束。在反應(yīng)結(jié)束后(約2小時(shí))將此溶液滅菌過(guò)濾(0.2Mm濾器)，保藏在-80℃。
實(shí)施例67-氨基頭孢烷酸(結(jié)構(gòu)式Ⅴ)的生成將假單孢菌屬微生物PseudomonasSpSE-495(DSM7509;FERMBP-818)置于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過(guò)夜，該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基pH為7.0，含0.2%W/V肉汁，0.2%W/V酵母提取物，0.5%W/V胨，0.5%W/V谷氨酸鈉和0.005%W/V硫酸鎂。再將此培養(yǎng)物置于相同組成的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行移種(接種量為10%)，再培養(yǎng)2-4天。
接著，通過(guò)離心分離(20分鐘，600轉(zhuǎn)/分)收集細(xì)胞，置于0.1克分子濃度磷酸鉀緩沖液中懸浮，并再離心分離(總共各3次，為培養(yǎng)物的10%容量)，然后在盡可能少容量的磷酸鉀緩沖液中將細(xì)胞沉淀物再懸浮，在冰冷下用超聲波處理(10次;每次30秒間隔20秒)，然后離心分離(20分鐘，至少10000轉(zhuǎn)/分)將粗提取物從細(xì)胞碎片中分離出來(lái)。
為生成7-氨基頭孢酸將此粗提取物(蛋白質(zhì)濃度為2毫克/毫升)加熱至室溫，然后添加在磷酸鉀緩沖液中的丙二酰-7-氨基頭孢烷酸，使其濃度為5毫克分子/升。全部于25℃靜置培養(yǎng)，并在24小時(shí)內(nèi)分析生成的7-氨基頭孢烷酸。
分析用薄層色譜法，(平板硅膠60F245，溶劑丁醇-甲醇-冰醋酸-水，比例50∶30∶3∶17)。從丙二酰-7-氨基頭孢烷酸(Rf-值0.43)生成7-氨基頭孢烷酸(Rf-值0.51)可用UV-波長(zhǎng)254nm檢測(cè)，或者噴灑Fluram試劑(3mg Fluram;Fluka CH-9470 Buchs在10毫升丙酮中)后在UV-波長(zhǎng)366nm檢測(cè)。
用此粗提取物(含丙二酰-7-氨基頭孢烷酸-酰基轉(zhuǎn)移酶)在約14小時(shí)后可檢測(cè)出50～100μmol7-氨基頭孢烷酸。
表1a)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基儲(chǔ)備液儲(chǔ)備液1:
NaH2PO4·2H2O 156.0gNH4Cl 10.0gK2SO41.2g蒸鎦水500.00ml儲(chǔ)備液2:
對(duì)氨基苯甲酸8.0mgD-生物素2.0mg煙酸20.0mgD-泛酸鈣10.0mg吡哆醛鹽酸鹽30.0mg二氯化硫胺20.0mg氰鈷胺素10.0mg蒸鎦水100.0ml滅菌儲(chǔ)備液3:
HCl(37%)7.0mlFeCl2·4H2O 1.5gZnCl20.07gMnCl2·4H2O 0.1gH3BO30.006gCoCl2·6H2O 0.19gCuCl2·6H2O 0.002gNiCl2·6H2O 0.024gNa2MoO4·2H2O 0.036g蒸鎦水1000.00ml,高壓滅菌121℃,20分鐘儲(chǔ)備液4NaoH0.5gNa2SeO3;·5H2O 0.003gNa2WO4·2H2O 0.004g蒸鎦水1000.0ml,高壓滅菌121℃,20分鐘儲(chǔ)備液5:
MgCl2·6H2O 40.0gCaCl2·2H2O 5.0g蒸餾水200.0ml,高壓滅菌,
121℃,20分鐘儲(chǔ)備液6:
去乙酰頭孢菌素C-內(nèi)酯3.55g蒸鎦水60.0ml青霉素酶(EC3.5.2.6)1.0mg(25000單位)(Sigma pO389)用NaOH調(diào)pH至7.0加蒸鎦水至100mlb)制備無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基儲(chǔ)備液1:25.0ml用KOH調(diào)pH至7.0然后蒸鎦水加至950.0ml,高壓滅菌,121℃,20分鐘消毒滅菌后加入下列物質(zhì):
儲(chǔ)備液20.5ml儲(chǔ)備液31.0ml儲(chǔ)備液41.0ml儲(chǔ)備液50.5ml從實(shí)施例5得到的溶液50.0ml
權(quán)利要求
1.一種篩選的微生物，它能把內(nèi)酯或其可溶性鹽，結(jié)構(gòu)式為 作為唯一的碳源、氮源和能源，通過(guò)丙二酰-內(nèi)酯或其可溶性鹽結(jié)構(gòu)式為 被利用，而后者不會(huì)被分解代謝。
2.按照權(quán)利要求1的微生物，標(biāo)號(hào)為Sphingomonas SP.FB1(DSM7007)及其子系體和突變體。
3.用微生物方法制備丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物或其可溶性鹽，其結(jié)構(gòu)式為
(其中R是氫原子、羥基或乙酸基)，其特征在于可把頭孢菌素C衍生物或其可溶性鹽其結(jié)構(gòu)通式為
(其中R如前述)作為底物通過(guò)按照權(quán)利要求1的微生物方法轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)式Ⅲ的產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以用微生物Sphingomonas SP.FB1(DSM7007)或其子系體和突變體來(lái)進(jìn)行。
5.至少按照權(quán)利要求3和4之一的方法，其特征在于，用頭孢菌素C作底物。
6.至少用權(quán)利要求3-5之一的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化反應(yīng)在一次性或連續(xù)性加入底物的情況下進(jìn)行，培養(yǎng)基中的底物濃度不超過(guò)20重量%。
7.至少按照權(quán)利要求3-6之一的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化反應(yīng)在溫度0-60℃，pH5-9條件下進(jìn)行。
8.丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物或其可溶性鹽，其結(jié)構(gòu)式為
(其中R是氫原子、羥基或乙酸基)。
9.丙二酰-7-氨基頭孢烷酸。
10.微生物方法制備7-氨基頭孢烷酸衍生物或其可溶性鹽，其結(jié)構(gòu)通式為
(其中R如權(quán)利要求3所述)，其特征在于，可以將丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物或其可溶性鹽(結(jié)構(gòu)式Ⅲ)作為底物，通過(guò)假單孢菌屬微生物Pseudomonas SP.(DSM 7509)或其子系體和突變體，或用這些微生物的無(wú)細(xì)胞的酶轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)式Ⅴ的產(chǎn)物。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于，可以用丙二酰-7-氨基頭孢烷酸作底物。
12.至少按照權(quán)利要求10和11之一的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以在一次性或連續(xù)性加入底物的情況下進(jìn)行，培養(yǎng)基中底物濃度不得超過(guò)10重量%。
13.至少按照權(quán)利要求10-12之一的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化反應(yīng)在溫度為4-50℃，pH為4-9條件下進(jìn)行。
14.利用假單孢菌屬Pseudomonas SP.(DSM7509)微生物，將丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物及其可溶性鹽(結(jié)構(gòu)式Ⅲ)水解生成7-氨基頭孢烷酸衍生物(結(jié)構(gòu)通式Ⅴ)。
15.用按照權(quán)利要求14的方法，其特征在于，將丙二酰-7-氨基頭孢烷酸水解反應(yīng)生成7-氨基頭孢酸。
全文摘要
敘述一種新的微生物，其篩選方法是用內(nèi)酯或其可溶性鹽，結(jié)構(gòu)式為(I)。作為唯一的碳源、氮源和能源，通過(guò)丙二酰-內(nèi)酯或其可溶性鹽，結(jié)構(gòu)式為(II)而被利用，后者不會(huì)被分解代謝。其次敘述一種微生物方法制備丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物或其可溶性鹽，結(jié)構(gòu)通式為(III)。此方法是由頭孢菌素C衍生物或其可溶性鹽，結(jié)構(gòu)通式為(IV)用微生物制得的。此外還敘述了由丙二酰-7-氨基頭孢烷酸衍生物制備7-氨基頭孢烷酸衍生物的新方法，其結(jié)構(gòu)通式為(V)。
文檔編號(hào)C07D513/14GK1077989SQ93105288
公開(kāi)日1993年11月3日 申請(qǐng)日期1993年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月29日
發(fā)明者薩賓·舒爾, 安德烈亞斯·切希 申請(qǐng)人:瑞士隆薩股份公司