專利名稱：一種異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用PCR技術(shù)早期檢測(cè)異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在奶牛自然繁殖過程中，一胎雙犢比例約為2％，而異性雙胎占0.7％。隨著現(xiàn)代奶牛胚胎移植技術(shù)的推廣應(yīng)用，奶牛一胎雙犢、異性雙犢的比例顯著增加。在孿生犢牛中，如果是一雌一雄，雄性孿生犢牛發(fā)育正常，而雌性孿生犢牛則有很高的幾率(91％～95％)不能生育，即異性孿生母牛不育現(xiàn)象(王元興，郎介金.動(dòng)物繁殖學(xué).江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1993)。
對(duì)異性孿生母牛不育現(xiàn)象目前有兩種解釋。一種解釋是激素學(xué)說，即認(rèn)為雄性胎牛的生殖腺發(fā)育較早，故同胎中雄性胎牛產(chǎn)生的激素可能經(jīng)過融合的胎盤血管到達(dá)雌性胎牛，抑制了雌性胎牛的卵巢皮質(zhì)及生殖道的發(fā)育或者使雌性胎牛雄性化(徐立仁等.異性孿生不育母牛研究.畜牧與獸醫(yī)，1994，26(6)251～253)。但近年來人們對(duì)這個(gè)內(nèi)分泌理論提出了懷疑因?yàn)闆]有證據(jù)支持雄激素可以使哺乳動(dòng)物的卵巢變?yōu)椴G丸的主張；而且，雄激素不能造成副中腎管的退化，而副中腎管退化是異性孿生母牛的普遍特征，其外生殖器官仍然保持雌性。另外一種解釋是近年來有人根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的研究認(rèn)為，孿生時(shí)兩胎牛間尿囊絨毛膜緊密的融合，導(dǎo)致了胎盤血管發(fā)生廣泛的吻合，因此兩胎兒間造血細(xì)胞和其他細(xì)胞進(jìn)行了交換，因而在孿生兩胎牛間出現(xiàn)了相同的紅細(xì)胞抗原，同時(shí)在外周血液細(xì)胞中還出現(xiàn)了白細(xì)胞性染色體的嵌合體。在實(shí)際中，人們也發(fā)現(xiàn)少數(shù)的異性孿生母牛具有生殖能力，研究認(rèn)為這是因?yàn)閷\生時(shí)兩胎牛的胎盤血管沒有發(fā)生吻合，所以沒有形成性染色體的嵌合體所致(王元興，郎介金.動(dòng)物繁殖學(xué).江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1993)。因此目前人們認(rèn)為異性孿生母牛不育是由于其性染色體為嵌合體(XX/XY)造成的(正常母牛的性染色體為XX，正常公牛的性染色體為XY，而異性孿生不育母牛體內(nèi)除了含有X性染色體外，還含有公牛所獨(dú)具的Y性染色體)，而不是以前認(rèn)為的由于激素的影響。
60年代前后，人們知道哺乳動(dòng)物的性別決定依賴于Y染色體，推測(cè)Y染色體上有1個(gè)基因，它編碼了1種睪丸決定因子TDF(testis determining factor)決定性脊發(fā)育為睪丸。直到1990年，人們才克隆到Y(jié)染色體短臂上的性別決定區(qū)基因(sex determining region of chromosome Y，SRY)(在人類稱為SRY，其他動(dòng)物稱為Sry)，Sry是單拷貝基因?，F(xiàn)經(jīng)許多實(shí)驗(yàn)室證實(shí)它具有性別決定基因的性質(zhì)，是目前性別決定的最佳候選基因。該基因在哺乳動(dòng)物中是高度保守的。目前，在畜禽性別控制研究領(lǐng)域，如胚胎性別早期鑒定，精子分離等方面，人們主要利用Sry基因來確定研究對(duì)象的性別。
以前對(duì)異性孿生不育母牛的研究報(bào)道不多，研究開發(fā)異性孿生不育母牛檢測(cè)方法也不多，主要為生化方法，一種是血型鑒定方法，即同時(shí)檢測(cè)異性孿生公母牛的血型，這要求孿生雌雄牛的血樣都要具備，而且這種方法還不能早期判定異性孿生母牛是否具有生育的能力；一種是檢測(cè)白細(xì)胞的染色體，即利用普通顯微鏡檢測(cè)牛樣本中有無Y染色體來判定，這種方法要求檢驗(yàn)者要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且準(zhǔn)確性不高；還有一種是檢測(cè)其移植相容性，這也要求孿生雌雄牛的樣本都要具備，而且所用的試劑價(jià)格偏貴，步驟繁瑣，對(duì)操作者的要求也比較高(徐立仁等.異性孿生不育母牛研究.畜牧與獸醫(yī)，1994，26(6)251～253)?；谏鲜銮闆r，現(xiàn)有的生化方法實(shí)際上是很難真正用于生產(chǎn)上的檢測(cè)應(yīng)用。值得注意的是，近年來隨著我國(guó)奶牛業(yè)的迅速發(fā)展，牛價(jià)不斷升高，有些人有意低價(jià)收購(gòu)異性孿生母牛犢，然后再當(dāng)做正常母牛犢高價(jià)賣出，由于異性孿生母牛犢在外觀上與正常母牛犢很難分別，所以往往買牛者要到牛犢養(yǎng)大了以后才發(fā)現(xiàn)買的母牛犢出現(xiàn)不能發(fā)情，屢配不孕等情況，造成的損失十分慘重，因此，生產(chǎn)上急需有一種能早期快速檢測(cè)異性孿生不育母牛的可行方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)已有檢測(cè)方法中存在的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、準(zhǔn)確性不高、并要求同時(shí)提供孿生雌雄牛的血樣等問題，提供一種應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)中的PCR技術(shù)，能簡(jiǎn)便、快速、靈敏、成本低廉、特異檢測(cè)異性孿生不育母牛的方法。
本發(fā)明的主要依據(jù)是異性孿生不育母牛的性染色體是嵌合體(XX/XY)(即異性孿生不育母牛體內(nèi)存在Y性染色體)，而正常母牛性染色體為XX這一現(xiàn)象，研究開發(fā)了一種基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法即檢測(cè)待檢異性孿生母牛體內(nèi)是否存在Y染色體上特異的Sry基因，如果檢測(cè)出Sry基因，則說明待檢異性孿生母牛體內(nèi)存在Y染色體，判定被檢測(cè)牛是異性孿生不育母牛；如果沒有檢測(cè)出Sry基因，則說明待檢異性孿生母牛體內(nèi)不存在Y染色體，判定被檢測(cè)牛不是異性孿生不育母牛。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法，包括以下步驟1)、待檢異性孿生母牛血液樣品或組織樣品的采取血樣可于待檢母牛尾靜脈采集，每頭0.5毫升～2毫升，用ACD或肝素抗凝；組織樣可于待檢母牛耳采集，每頭10毫克～20毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中；采取的血樣或組織樣現(xiàn)用或在-20℃下冷凍保存；2)、陰性對(duì)照牛(正常母牛)和陽性對(duì)照(正常公牛)牛血樣或組織樣的采取陰性對(duì)照牛和陽性對(duì)照牛的血樣或組織樣可分別采集1-3個(gè)。血樣采集可于正常公、母牛尾靜脈采集0.5毫升～2毫升，用ACD或肝素抗凝；組織樣可采集耳組織10毫克～20毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中；采取的血樣或組織樣現(xiàn)用或在-20℃下冷凍保存；3)、樣品基因組DNA的提取采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，或用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，TE溶解或雙蒸水融解，現(xiàn)用或在-20℃冷凍保存；4)、根據(jù)GenBank中牛1.715微衛(wèi)星DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)標(biāo)基因引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為216bp，引物序列為5′端引物5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′；5)、根據(jù)GenBank中牛Sry基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)基因引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為302bp，引物序列為5′端引物5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′；6)、最佳擴(kuò)增體系的建立利用正交試驗(yàn)，摸索建立牛1.715微衛(wèi)星DNA和Sry基因片斷最佳擴(kuò)增體系；7)、樣本檢測(cè)與判定根據(jù)待檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品的1.715微衛(wèi)星DNA和Sry基因片斷的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)被檢測(cè)母牛是否為異性孿生不育母牛進(jìn)行判定。
本發(fā)明的有益效果為
1、簡(jiǎn)便易行采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)PCR技術(shù)，通過兩次PCR擴(kuò)增，就可以判斷出所檢測(cè)的母牛是否為異性孿生不育母牛；檢測(cè)時(shí)無需同時(shí)具備孿生雌雄牛的血樣，只需采集待檢母牛的血液樣品幾毫升或組織樣品如耳組織幾毫克即可。
2、快速、靈敏、特異性檢測(cè)從取樣到檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，快速得到結(jié)果；通過特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的有無即可進(jìn)行準(zhǔn)確、直觀的判斷；具備簡(jiǎn)單分子生物學(xué)技術(shù)的人員就可以應(yīng)用。
3、成本低廉檢測(cè)一個(gè)樣本的成本低于2元。
4、早期檢測(cè)、降低奶牛養(yǎng)殖戶風(fēng)險(xiǎn)利用這項(xiàng)技術(shù)，一是在奶牛場(chǎng)可以對(duì)出生的異性孿生母牛犢進(jìn)行早期檢測(cè)，以決定孿生母牛犢是留還是淘汰，以免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失；二是應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，就可以在奶牛買賣過程，對(duì)交易奶牛犢實(shí)施檢測(cè)，以判斷其是否是孿生不育母牛犢，可以有效打擊欺詐行為，保障奶農(nóng)的權(quán)益。三是可以對(duì)懷疑買到異性孿生母牛犢的奶農(nóng)提供科學(xué)的檢測(cè)依據(jù)，以供他們?cè)诰S權(quán)時(shí)使用，保障他們的利益。
因此，本檢測(cè)技術(shù)具備快速(5-10個(gè)小時(shí)就可以得到結(jié)果)、簡(jiǎn)便(具備簡(jiǎn)單分子生物學(xué)技術(shù)的人員就可以應(yīng)用)、準(zhǔn)確(通過擴(kuò)增產(chǎn)物有無可以進(jìn)行直觀判斷)，成本低廉等特點(diǎn)，易于推廣使用。


圖1、內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增牛1.715微衛(wèi)星DNA片斷結(jié)果示意圖1-16，牛1.715微衛(wèi)星DNA(216bp)；CK，陰性對(duì)照；M，DL2000；圖2、檢測(cè)引物擴(kuò)增牛Sry基因片斷結(jié)果示意圖1-16，牛Sry基因(302bp)；CK，陰性對(duì)照；M，DL2000。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但以下描述不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何意義上的限定。
實(shí)施例1(以血液為樣品對(duì)異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法)步驟1待檢異性孿生母牛血液樣品的采集。
奶牛血樣采自浙江省金華市部分牛場(chǎng)的黑白花奶牛，共11個(gè)異性孿生母牛，各采取尾靜脈血樣1ml左右，采用抗凝劑ACD抗凝，-20℃凍存。
步驟2陰性和陽性對(duì)照牛血液樣品的采集。
奶牛血樣采自浙江省金華市部分牛場(chǎng)的黑白花奶牛，共5個(gè)樣品，其中3個(gè)為正常母牛樣品，2個(gè)為正常公牛樣品，各采取尾靜脈血樣1ml左右，采用抗凝劑ACD抗凝，-20℃凍存。
步驟3血液樣品的基因組DNA的提取。
采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取血液樣品的基因組DNA，TE溶解(也可雙蒸水融解)后-20℃凍存。
步驟4內(nèi)標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增根據(jù)GenBank中牛1.715微衛(wèi)星DNA序列(GenBank序列號(hào)V00125)設(shè)計(jì)一對(duì)引物作為內(nèi)標(biāo)基因引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為216bp，由上海生物工程公司合成，引物序列為5′端引物Primer 1.715F5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物Primer 1.715R5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′PCR最佳擴(kuò)增體系為見表1
表1.牛1.715微衛(wèi)星DNA的最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系位點(diǎn)雙蒸水10×Buffer dNTP引物1引物2MgCl2 Taq酶模板總體積1.715 16.5μL 2.5μL 1μL 1μL 1μL 1.5μL 0.5μL 1μL 25μLPCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃，30s；56℃，40s；72℃，40s；30個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，獲得216bp的擴(kuò)增條帶(見圖1)。
步驟5檢測(cè)基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增根據(jù)GenBank中牛Sry基因序列(GenBank序列號(hào)AB039748，AF148462)設(shè)計(jì)一對(duì)引物作為檢測(cè)基因引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為302bp，由上海生物工程公司合成，引物序列為5′端引物Primer SryF5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物Primer SryR5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′PCR最佳擴(kuò)增體系為見表2表2.牛Sry基因的最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系位點(diǎn)雙蒸水Buffer 10×dNTP引物1引物2MgCl2 Taq酶模板總體積Sry 16μL 2.5μL 1μL 1μL 1μL 2.0μL 0.5μL 1μL 25μLPCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃，30s；56℃，40s；72℃，40s；30個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，獲得302bp的擴(kuò)增條帶(見圖2)。
步驟6樣本檢測(cè)與判定根據(jù)待檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品的1.715微衛(wèi)星DNA和Sry基因片斷的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)被檢測(cè)母牛是否為異性孿生不育母牛進(jìn)行判定。下面是本實(shí)施例的具體判定過程所用樣品為血樣，共有16個(gè)，其中3個(gè)為正常母牛樣品(陰性對(duì)照)，編號(hào)1，2，3；2個(gè)為正常公牛樣品(陽性對(duì)照)，編號(hào)4，5；11個(gè)為孿生母牛樣品，編號(hào)6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16。
為保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，首先用牛1.715微衛(wèi)星DNA基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因?qū)λ崛〉幕蚪MDNA進(jìn)行檢驗(yàn)。從圖1(牛1.715微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果)中可以看出，所檢測(cè)的十六頭牛中，都擴(kuò)增出了216bp左右的片斷，說明所擴(kuò)增片斷為牛1.715微衛(wèi)星DNA序列片斷。這表明這些樣品的DNA均來自牛，質(zhì)量良好而且可以用來做進(jìn)一步的分析。
接著用檢測(cè)引物對(duì)16頭牛的Sry基因片斷進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖2(牛Sry基因擴(kuò)增結(jié)果)。從圖2中可以看出，樣品1、2、3、11都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而樣本4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16都擴(kuò)增出302bp的片斷，在所檢測(cè)的16個(gè)樣品中，樣品1、2、3為正常母牛，其性染色體型為XX，沒有Y染色體，所以沒有擴(kuò)增出Sry基因片斷。而樣品11雖是異性孿生母牛，但其沒有擴(kuò)增出Sry基因片斷，說明其體內(nèi)不存在Y染色體，是異性孿生母牛中具有生育能力的，可以留用。樣品4、5為正常公牛，其性染色體型為XY，因此擴(kuò)增出Sry基因擴(kuò)增片斷。樣品6、7、8、9、10、12、13、14、15、16為異性孿生母牛，其擴(kuò)增出Sry基因片斷，證明其性染色體型為XX/XY，這十頭母牛是異性孿生母牛中的不育母牛，應(yīng)該被淘汰。
需要指出的是，我們還對(duì)所檢測(cè)的11頭異性孿生母牛進(jìn)行了生殖系統(tǒng)的常規(guī)檢查，其中編號(hào)為11的母牛經(jīng)常規(guī)檢查其生殖器官發(fā)育正常，能正常發(fā)情配種，而其他10頭母牛生殖系統(tǒng)發(fā)育不正常，不能正常發(fā)情配種。這也說明我們所建立的檢測(cè)方法能準(zhǔn)確的檢測(cè)出異性孿生母牛中的不育母牛。本發(fā)明為生產(chǎn)實(shí)踐提供了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異的檢測(cè)異性孿生不育母牛的技術(shù)。
實(shí)施例2(以組織為樣品對(duì)異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法)步驟1待檢異性孿生母牛組織樣品的采集。
奶牛組織樣采自浙江省金華市部分牛場(chǎng)的黑白花奶牛，共11個(gè)異性孿生母牛，各采取耳組織15毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中，-20℃凍存。
步驟2陰性和陽性對(duì)照牛組織樣品的采集。
奶牛組織樣采自浙江省金華市部分牛場(chǎng)的黑白花奶牛，共5個(gè)樣品，其中3個(gè)為正常母牛樣品，2個(gè)為正常公牛樣品，各采取耳組織15毫克，放于裝有70％乙醇的1.5毫升EP管中，-20℃凍存。
步驟3組織樣品的基因組DNA的提取。
采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取組織樣品的基因組DNA。TE溶解(也可雙蒸水融解)后-20℃凍存。
步驟4(內(nèi)標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增)、步驟5(檢測(cè)基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增)和步驟6(樣本檢測(cè)與判定)的方法、步驟及材料均同于實(shí)施例1。
以上以舉例方式詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施過程，但對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，顯而易見的是，在實(shí)施過程中可進(jìn)行許多等效的修改和替換。因此，本發(fā)明的范圍僅以權(quán)利要求書的限定為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟1)、待檢異性孿生母牛血液樣品或組織樣品的采取、備用；2)、陰性對(duì)照牛和陽性對(duì)照牛血樣或組織樣品的采取、備用；3)、樣品的基因組DNA的提??；4)、根據(jù)牛1.715微衛(wèi)星DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)標(biāo)基因引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為216bp，引物序列為5′端引物5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′；5)、根據(jù)牛Sry基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)基因引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為302bp，引物序列為5′端引物5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′；6)、最佳擴(kuò)增體系的建立利用正交試驗(yàn)，摸索建立牛1.715微衛(wèi)星DNA和牛Sry基因片斷的最佳擴(kuò)增體系；7)根據(jù)待檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品的1.715微衛(wèi)星DNA和Sry基因片斷的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)被檢測(cè)母牛是否為異性孿生不育母牛進(jìn)行判定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種異性孿生不育母牛的檢測(cè)方法，屬于動(dòng)物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括待檢母牛和陰性對(duì)照牛(正常母牛)及陽性對(duì)照牛(正常公牛)血液樣品或組織樣品的采??；樣品基因組DNA的提?。桓鶕?jù)GenBank中牛1.715微衛(wèi)星DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)標(biāo)基因引物；根據(jù)GenBank中牛Sry基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)基因引物；最佳擴(kuò)增體系的建立及樣本檢測(cè)與判定等技術(shù)步驟。本方法具備快速(5－10個(gè)小時(shí))、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確(通過擴(kuò)增產(chǎn)物有無即可直觀判斷)，成本低廉(2元/每樣本)等特點(diǎn)，能及早檢測(cè)出異性孿生不育母牛犢，以便及早淘汰，減少奶牛養(yǎng)殖者的損失。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1932032SQ200610053469
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月20日
發(fā)明者徐如海, 胡錦平, 翁經(jīng)強(qiáng), 禇曉紅, 蔣永清, 張妙仙, 黃少珍 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院