專利名稱：白化茶樹品種“灑金”特異dna分子標(biāo)記及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及茶樹品種的生物技術(shù)鑒定，具體為一種光照誘導(dǎo)型白化茶樹品種“灑金”特異DNA分子標(biāo)記及品種“灑金”的鑒定方法，亦屬于茶樹遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
名優(yōu)茶生產(chǎn)目前已成為我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)效益來源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)名優(yōu)茶產(chǎn)量約占總產(chǎn)量的30％，但產(chǎn)值已達(dá)到總產(chǎn)值的70％左右；名優(yōu)茶主要產(chǎn)區(qū)浙江省甚至達(dá)到90％。名優(yōu)茶的生產(chǎn)取決于茶樹優(yōu)良品種推廣和加工技術(shù)，其中品種起決定性作用。茶樹品種新資源的開發(fā)利用，可以為名優(yōu)茶產(chǎn)業(yè)注入新活力。
白茶品種新梢具有白化現(xiàn)象，其葉片中的氨基酸含量(尤其是茶氨酸)比普通品種高2倍以上，使茶葉滋味特別鮮爽，而且，目前茶氨酸已經(jīng)被證明具有增強(qiáng)免疫力、降血壓、促進(jìn)大腦功能和預(yù)防帕金森氏癥等功效，再加上目前資源稀少，售價(jià)非常的高。白茶品種的開發(fā)和利用，對(duì)名優(yōu)茶的發(fā)展和茶葉功能性成分的開發(fā)利用都具有重要的意義。
白茶有兩種類型，一種是在較低溫度下出現(xiàn)白化的白茶，如“白葉茶1號(hào)”茶樹品種。另一種是在強(qiáng)光照條件下產(chǎn)生白化的白茶品種，如“灑金”?！盀⒔稹痹谙募靖邷亍?qiáng)光時(shí)，其新梢葉片呈現(xiàn)白色或黃色，且其白化期間氨基酸含量最高可達(dá)7-10％。由于該品種可以克服普通茶樹品種在夏季由于高溫和強(qiáng)光的作用下產(chǎn)生苦澀味，所以在夏秋季節(jié)同樣能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的名優(yōu)綠茶，推廣該品種是增加綠茶產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟(jì)效益的重要途徑。
由于光照誘導(dǎo)型白化茶樹品種“灑金”屬于名貴品種，市場(chǎng)種苗緊缺。而且該品種只有在高溫強(qiáng)光照季節(jié)才表現(xiàn)出白化現(xiàn)象，在茶樹適宜種植的季節(jié)——冬季則與一般茶樹品種在外部形態(tài)特征上很難區(qū)分?；瘜W(xué)成分測(cè)定也可以用于白化茶樹品種鑒定，但茶樹的化學(xué)成分含量隨生長(zhǎng)季節(jié)和環(huán)境條件而變化，在冬季茶樹種植期，白化茶樹的特征性化合物，如茶氨酸含量也不是最高的季節(jié)，與一般茶樹品種相當(dāng)，所以在具體應(yīng)用上受到季節(jié)限制。因此在苗木交易過程，迫切需要一種更準(zhǔn)確而有效的鑒定技術(shù)，以防止假冒偽劣種苗坑害茶農(nóng)。
DNA分子檢測(cè)是鑒定品種最準(zhǔn)確而穩(wěn)定的方法，如果能尋找出某個(gè)品種的特異性DNA分子標(biāo)記，可以快速而準(zhǔn)確地鑒定品種的真實(shí)性。本發(fā)明提供光照誘導(dǎo)型茶樹品種“灑金”的特異DNA分子標(biāo)記及鑒定方法。該方法穩(wěn)定可靠，不受生長(zhǎng)季節(jié)和環(huán)境條件差異的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供光照誘導(dǎo)型白化茶樹品種“灑金”的特異DNA序列，作為其分子標(biāo)記，通過特定引物進(jìn)行PCR分析，如果具有該特異分子標(biāo)記的DNA序列，就可以確定為品種“灑金”。否則，被鑒定的品種則為“灑金”以外的其它品種。結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)便。
本發(fā)明技術(shù)方案如下白化茶樹品種“灑金”的特異DNA分子標(biāo)記具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，其分子量為285bp。
SEQIDNO.1attttctgag ctagtatcac accattcatg tgagctctgc actctcctcc gtggatagct 60tccataaggt gccttaattc accttcctca acacacaact tatgcattcc tagatggcct 120attttgtaca acttgtttct gcagatnacg aattgaatgg ccagacgccg tattcccttt 180ttgtccttgg cacttgcccc tagtgggtat gcctctttgt ccaggaaatt caagatgtcg 240taatactagg ggtaagtgtc ttgaacctca tctatcacgg cgatt 285以上所述的白化茶樹品種“灑金”的鑒定方法為以下步驟1.從茶樹鮮葉中提取DNA；2.將提取的DNA通過隨機(jī)引物CAATCGCCGT進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增；3.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定、帶型分析，出現(xiàn)分子量為450-500bp條帶的被測(cè)茶樹判定為“灑金”品種。
本發(fā)明方案也可以將步驟3電泳鑒定出現(xiàn)的分子量為450-500bp條帶膠回收，并對(duì)膠回收產(chǎn)物擴(kuò)增和測(cè)序，得到一個(gè)大小為285bp的核苷酸序列；用SEQIDNO.1所述的核苷酸序列對(duì)照測(cè)序結(jié)果判定“灑金”品種。


圖1為白化茶樹品種“灑金”的特異DNA分子標(biāo)記的核苷酸序列(SEQIDNO.1)。
具體實(shí)施例方式
1基因組NDA提取取被鑒定茶樹鮮葉約100mg，放入研缽并加液氮100ml，快速研磨后；將研磨后的粉末快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。加入65℃預(yù)熱的2×CTAB 500μl混勻，65℃水浴5min。加入等量的氯仿-異戊醇(24∶1)混合液，充分混勻，于12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。加入2倍體積無水乙醇，待白色絮狀沉淀出現(xiàn)，用手術(shù)針勾出白色沉淀并轉(zhuǎn)移入另一根新的離心管中，加入1ml 70％乙醇清洗，倒出乙醇；再經(jīng)氯仿-異戊醇混合液和乙醇重懸和洗滌一次，于室溫空氣中晾干，最后用TE buffer或無菌水中稀釋至DNA濃度為100μg/ml，保存于-20℃冰箱備用。
2PCR放應(yīng)在0.5ml離心管中加入以下溶液17.8μl ddH2O，2.5μl的10×buffer，2.5μl的25mmol Mg2+，0.5μl的10mmol dNTP，0.33μl的引物(CAATCGCCGT)溶液，1.2μl的上述DNA溶液，0.17μl的TAG酶溶液。將離心管蓋緊并置于DYADTMPTC-200PCR儀上，在94℃預(yù)變性5min；然后經(jīng)94℃變性30s，36℃退火1min，72℃延伸2min，共40個(gè)循環(huán)處理；最后72℃延伸處理10min；保存于4℃，即為PCR產(chǎn)物。
3電泳取1.5克瓊脂糖(Agrose)，加100ml水，加熱至80℃溶解，倒入電泳槽制成6-7mm厚度的凝膠，冷卻后在加樣孔加入上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，同時(shí)在另一加樣孔加入DNA分析量標(biāo)準(zhǔn)物供分子量鑒定；在100V恒壓條件下電泳約30min。
4帶型鑒別將上述電泳凝膠置于JD-801凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行帶型分析，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物為參照，在紫外線照射下發(fā)現(xiàn)，分子量為450-500bp的條帶只在“灑金”品種出現(xiàn)、其它品種不具備。在品種鑒定中，如果具備該條帶的供鑒定品種為“灑金”品種，否則可以鑒定為非“灑金”品種。
5特異DNA分子標(biāo)記核苷酸序列分析本發(fā)明為了進(jìn)一步了解上述特異性條帶的核苷酸序列，對(duì)該序列進(jìn)行了序列鑒定。方法是在紫外光下用無菌消毒的刀片將該特異條帶從瓊脂凝膠上切下，回收至干凈的1.5ml離心管中，并用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化。以純化后的產(chǎn)物作模板，用相同的引物(CAATCGCCGT)進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％Agrose 1-H凝膠電泳(恒壓100V)檢測(cè)。然后用全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABI 3700)和BigDyeTerminators Cycle Sequencing Kit，按照單引物Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序。測(cè)序結(jié)果見圖1。
實(shí)施例1供試品種為了驗(yàn)證本發(fā)明的特異DNA分子標(biāo)記為光照誘導(dǎo)型白化茶樹品種“灑金”特有，本實(shí)施例以常見的茶樹品種“福鼎大白茶”(編號(hào)1號(hào)品種)，低溫誘導(dǎo)型白化茶樹品種“白葉茶1號(hào)”(編號(hào)2號(hào)品種)、“千年雪”(編號(hào)3號(hào)品種)，光照誘導(dǎo)型白化茶樹品種2個(gè)——“黃金芽”(編號(hào)4號(hào)品種)和“灑金”(編號(hào)5號(hào)品種)等5個(gè)品種為試驗(yàn)材料。每個(gè)品種取1芽1葉新梢1個(gè)進(jìn)行鑒定。
2基因組NDA提取分別秤取上述茶樹品種鮮葉100mg，放入研缽并家液氮100ml，快速研磨后；將研磨后的粉末快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。加入65℃預(yù)熱的2×CTAB 500μl混勻，65℃水浴5min。加入等量的氯仿-異戊醇(24∶1)混合液，充分混勻，于12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。加入2倍體積無水乙醇，待白色絮狀沉淀出現(xiàn)，用手術(shù)針勾出白色沉淀并轉(zhuǎn)移入另一根新的離心管中，加入1ml 70％乙醇清洗，倒出乙醇；再經(jīng)氯仿-異戊醇混合液和乙醇重懸和洗滌一次，于室溫空氣中晾干，最后用TE buffer或無菌水中稀釋至DNA濃度為100μg/ml，保存于-20℃冰箱備用。
2PCR放應(yīng)在0.5ml離心管中加入以下溶液17.8μl ddH2O，2.5μl的10×buffer，2.5μl的25mmol Mg2+，0.5μl的10mmol dNTP，0.33μl的引物(CAATCGCCGT)溶液，1.2μl的上述DNA溶液，0.17μl的TAG酶溶液。將離心管蓋緊并置于DYADTMPTC-200PCR儀上，在94℃預(yù)變性5min；然后經(jīng)94℃變性30s，36℃退火1min，72℃延伸2min，共40個(gè)循環(huán)處理；最后72℃延伸處理10min；保存于4℃，即為PCR產(chǎn)物。
3電泳取1.5克瓊脂糖(Agrose)，加100ml水，加熱至80℃溶解，倒入電泳槽制成6-7mm厚度的凝膠，冷卻后在加樣孔加入上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，同時(shí)在另一加樣孔加入DNA分析量標(biāo)準(zhǔn)物供分子量鑒定；在100V恒壓條件下電泳約30min。
4帶型鑒別將上述電泳凝膠置于JD-801凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行帶型分析，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物為參照，在紫外線照射下發(fā)現(xiàn)，分子量為450-500bp的條帶只在5號(hào)品種“灑金”中出現(xiàn)，編號(hào)為1-4號(hào)的“福鼎大白茶”、“白葉茶1號(hào)”、“千年雪”、“黃金芽”等4個(gè)其它品種檢測(cè)不出該條帶。證明供鑒定品種中5號(hào)品種為“灑金”，編號(hào)為1-4號(hào)的4個(gè)品種不是“灑金”。將該條帶膠回收，并對(duì)膠回收產(chǎn)物擴(kuò)增和測(cè)序，得到一個(gè)大小為285bp的核苷酸序列；用SEQIDNO.1所述的核苷酸序列對(duì)照測(cè)序結(jié)果判定“灑金”品種。
在茶樹種苗交易或品種鑒定研究過程，根據(jù)本發(fā)明提供的DNA序列的特異分子標(biāo)記，應(yīng)用上述方法，可以準(zhǔn)確鑒定所提供的茶樹品種是否“灑金”品種。由于DNA分子結(jié)構(gòu)具有品種特異性，而且不受環(huán)境條件和季節(jié)變化的影響，任何時(shí)間都可以進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.白化茶樹品種“灑金”的特異DNA分子標(biāo)記，其特征在于特異DNA分子標(biāo)記具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，其分子量為285bp。
2.按權(quán)利要求1所述的白化茶樹品種“灑金”，其特征在于它的鑒定方法為以下步驟(1)從茶樹鮮葉中提取DNA；(2)將提取的DNA通過隨機(jī)引物CAATCGCCGT進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定、帶型分析，出現(xiàn)分子量為450-500bp條帶的被測(cè)茶樹判定為“灑金”品種。
3.按權(quán)利要求2所述的白化茶樹品種“灑金”的鑒定方法，其特征在于將步驟(3)電泳鑒定出現(xiàn)的分子量為450-500bp條帶膠回收，并對(duì)膠回收產(chǎn)物擴(kuò)增和測(cè)序，得到一個(gè)大小為285bp的核苷酸序列；用SEQIDNO.1所述的核苷酸序列對(duì)照測(cè)序結(jié)果判定“灑金”品種。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及茶樹品種的生物技術(shù)鑒定。公開了一種光照誘導(dǎo)型白化茶樹品種“灑金”的特異DNA分子標(biāo)記及其鑒定方法，該特異DNA分子標(biāo)記的核苷酸序列其分子量為285bp。它的鑒定方法為從茶樹鮮葉中提取DNA；將提取的DNA通過PCR擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定、帶型分析，出現(xiàn)分子量為450－500bp條帶的被測(cè)茶樹判定為“灑金”品種。將此分子量為450－500bp電泳條帶膠回收，并對(duì)膠回收產(chǎn)物擴(kuò)增和測(cè)序；用本發(fā)明公開的大小為285bp的核苷酸序列對(duì)照測(cè)序結(jié)果判定“灑金”品種。本發(fā)明提供的光照誘導(dǎo)型茶樹品種“灑金”的特異DNA分子標(biāo)記及鑒定方法穩(wěn)定可靠，不受生長(zhǎng)季節(jié)和環(huán)境條件差異的影響。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1955312SQ20061005334
公開日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者梁月榮, 杜穎穎, 金晶, 陸建良, 林晨 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)