專利名稱：地衣芽孢桿菌b－05571及其在制備1,3－二羥基丙酮中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)及其在制備1，3-二羥基丙酮中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
二羥基丙酮，又稱為1，3-二羥基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone)(以下簡(jiǎn)稱DHA)，是最單的酮糖，帶有甜味的白色粉末狀結(jié)晶，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑。這種化學(xué)物質(zhì)的分子量為90.08。
DHA是一種重要的化工原料、醫(yī)藥中間體和食品添加劑，用途廣泛(1)DHA分子中含有三個(gè)官能團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng)，是一種重要的化學(xué)合成的中間體，也是一個(gè)重要的多功能試劑，如能有效地參與從甲醛到羥醛、羥酮的縮合反應(yīng)。(2)DHA廣泛應(yīng)用于化妝品中，能阻止皮膚的水份的過(guò)度蒸發(fā)，對(duì)皮膚起到保濕和防曬作用，在制革工業(yè)中，DHA可作為皮革制品的保護(hù)劑。(3)DHA是一種重要的醫(yī)藥中間體和藥物，現(xiàn)已應(yīng)用于低血糖和糖尿病及某些皮膚病的治療。(4)DHA可作為一種食品添加劑，可應(yīng)用于食品生產(chǎn)。
由于DHA用途廣泛，市場(chǎng)容量大，用生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的研究具有重要的意義。
國(guó)外用微生物發(fā)酵方法轉(zhuǎn)化甘油為二羥基丙酮己有很多專利和文獻(xiàn)報(bào)道，所用的用于產(chǎn)生甘油脫氫酶的微生物主要是葡糖桿菌屬(Gluconobacter)(US 5770411)和醋桿菌屬(Acetobacter)(US 4076589)微生物，尤其是氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化醋桿菌(Acebobacter Suboxydans)的報(bào)道居多，此外還研究過(guò)芽孢桿菌屬(Bacillus)的枯草桿菌(Bacillus subtilis FERM P-10524)(JP 2286089)、單孢絲菌屬(Micromonospora)(JP 62210994)，假單孢菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克霉伯氏菌屬(Klebsiella)、歐文藝節(jié)目氏菌屬(Erwinia)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)(US 4576913)。
微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)DHA與化學(xué)合成法相比具有許多優(yōu)點(diǎn)專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、底物利用率高、轉(zhuǎn)化率高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。從技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性，環(huán)境的友好性的角度來(lái)看，微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA更具有經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。而且生物轉(zhuǎn)化技術(shù)已日趨成熟，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類物質(zhì)的生產(chǎn)，如抗生素、甾體激素、氨基酸等。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了提供一株從土壤中篩選到將甘油生物轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮的新的微生物菌株地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformisB-05571)及其在制備1，3-二羥基丙酮中的應(yīng)用。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No.M 206082，保藏日期2006年8月29日。提議的分類命名為地衣芽孢桿菌B-05571(Bacilluslicheniformis B-05571)。
所述地衣芽孢桿菌B-05571菌落形態(tài)為菌落呈土黃色，邊緣光滑，表面微隆起，微縐折，粘稠；細(xì)胞形態(tài)為顯微鏡觀察菌體形狀呈桿狀，有時(shí)候成鏈狀，產(chǎn)芽孢；生理生化指標(biāo)為接觸酶陽(yáng)性，V-P測(cè)定陽(yáng)性，能利用明膠、淀粉，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽。能利用肌醇，半乳糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇等。
根據(jù)以上微生物學(xué)特征，這新的菌株被鑒定地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。這株微生物不屬于上述已公開(kāi)專利菌種的任何一種，該微生物菌株具有將甘油轉(zhuǎn)化為DHA的能力，可以用于DHA的生產(chǎn)。
所述的地衣芽孢桿菌B-05571可用于制備1，3-二羥基丙酮。所用到的原料是一種廣泛應(yīng)用工業(yè)化學(xué)品——甘油(丙三醇)，甘油2位羥基(2-OH)經(jīng)過(guò)微生物細(xì)胞內(nèi)甘油脫氫酶催化反應(yīng)，生成酮基，得到DHA。
應(yīng)用時(shí)，可將菌種接種至含底物甘油的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)分離純化獲得DHA；也可將菌種接種至含底物甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分離獲得菌體，利用菌體生物催化甘油生產(chǎn)DHA，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到DHA；或者將菌種接種至含底物甘油的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中流加滅菌后的甘油水溶液，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化得到DHA。
具體的，所述的應(yīng)用是將所述地衣芽孢桿菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，初始pH為4.0～7.0，在20～40℃下發(fā)酵培養(yǎng)24～96小時(shí)，優(yōu)選在28℃～35℃、中性pH值下培養(yǎng)48小時(shí)左右，發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述的1，3-二羥基丙酮。該方法中培養(yǎng)基組成中的甘油既是微生物利用的碳源，又是被微生物分解的底物；底物甘油經(jīng)過(guò)微生物的脫氫反應(yīng)，生成DHA。
或者，將所述地衣芽孢桿菌B-05571在含有底物甘油、以及、氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，初始pH為4.0～7.0，在20～40℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液離心分離得到菌體，所得菌體再加入0.5～15％的甘油水溶液中反應(yīng)1～90小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述的1，3-二羥基丙酮。本發(fā)明中所述甘油水溶液的濃度以重量/體積百分比表示，濃度為1％表示每100mL溶液中含有1g甘油。
又或者，所述的應(yīng)用是將所述地衣芽孢桿菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，初始pH為4.0～7.0，在20～40℃下發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中流加滅菌后的10％～80％的甘油水溶液，發(fā)酵24～96小時(shí)。反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述的1，3-二羥基丙酮。
所述培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用。所述培養(yǎng)基組成以重量/體積百分比表示，某組分含量為1％表示每100mL培養(yǎng)基中含有1g該物質(zhì)。
從發(fā)酵液中提取目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，可采用常規(guī)的發(fā)酵產(chǎn)物提取法。如過(guò)濾、離心、沉淀、結(jié)晶、重結(jié)晶、濃縮、干燥、冷凍干燥，吸附、離子交換、層析等等。
本發(fā)明中，所述1，3-二羥基丙酮的分離純化方法如下將發(fā)酵液或反應(yīng)液濃縮，上述濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。BV/h表示每小時(shí)流經(jīng)柱子的洗脫液為柱床體積BV(Bed Volume)的倍數(shù)。
優(yōu)選的，所述1，3-二羥基丙酮制備方法如下培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用；(1)取上述培養(yǎng)基，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)24小時(shí)獲得種子液；(2)取上述培養(yǎng)基，滅菌，以體積比1.5％接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)72小時(shí)，收集發(fā)酵液，10000g離心10分鐘，濃縮至濃縮液為原液體積的1/3，55℃下活性炭脫色30min，真空濃縮至漿狀，加入無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮除去乙醇，反復(fù)加入乙醇濃縮至無(wú)乙醇，得濃縮物；(3)步驟(2)所得濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
或者，所述1，3-二羥基丙酮制備方法如下培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用；(1)取上述培養(yǎng)基，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)液離心分離得到菌體，加入5％的甘油水溶液中，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，28℃下反應(yīng)24小時(shí)；(2)步驟(1)所得反應(yīng)液10000g離心10分鐘，濃縮至濃縮液為原液體積的1/3，55℃下活性炭脫色30min，真空濃縮至漿狀，加入無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮除去乙醇，反復(fù)加入乙醇濃縮至無(wú)乙醇，得濃縮物；(3)步驟(2)所得濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集合1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
又或者，所述1，3-二羥基丙酮制備方法如下培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用；(1)取上述培養(yǎng)基，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)24小時(shí)獲得種子液；(2)取上述培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐，滅菌，以體積比1.5％的接種量接入種子液，通氣量0.8vvm，28℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再流加甘油，每7L培養(yǎng)基流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.5mL/min，28℃下培養(yǎng)80小時(shí)；(3)收集發(fā)酵液，10000g離心10分鐘，濃縮至濃縮液為原液體積的1/3，55℃下活性炭脫色30min，真空濃縮至漿狀，加入無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮除去乙醇，反復(fù)加入乙醇濃縮至無(wú)乙醇，得濃縮物；(4)步驟(3)所得濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
本發(fā)明中，DHA的分析方法可采用氣相色譜與薄層層析方進(jìn)行DHA薄層層析方法實(shí)驗(yàn)采用G型硅膠板(20mm×10mm)，展開(kāi)劑氯仿-甲醇-蒸餾水混合溶劑(體積比為80∶19∶1)，顯色劑組成為磷鉬酸3g，甲醇45ml，蒸餾水45ml和濃硫酸10ml。具體操作步驟將點(diǎn)樣后的硅膠薄板以基準(zhǔn)線向下放置在裝有展開(kāi)劑的層析缸中展開(kāi)10～15min，直至展開(kāi)劑擴(kuò)散至距離薄板頂端1～2cm處。取出薄板，吹干，碘缸中熏蒸2～5min，顯色，放入烘箱中，在110℃下烘烤10min左右，即可呈現(xiàn)DHA斑點(diǎn)，通過(guò)和不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品顯示的斑點(diǎn)大小相比較，判斷樣品中DHA含量。
DHA氣相色譜分析方法所用的儀器瓦里安varian cp-3800氣相色譜儀，帶氫火焰離子化檢測(cè)器；PY-2020iD型裂解器(Frontier LaboratoriesLtd.Japan)。所用試劑TMAH(25％水溶液)，二羥基丙酮(色譜純)，甘油、無(wú)水甲醇(分析純)，蒸餾水。色譜條件Ultra ALLOY-5不銹鋼毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；汽化溫度400℃；檢測(cè)器溫度280℃；柱溫50℃開(kāi)始以1℃/min升至60℃，再以10℃/min升至280℃；分流比30∶1；載氣，氮?dú)?；柱流?ml/min。加樣0.2μL發(fā)酵上清夜和0.4μL TMAH(25％水溶液)。
本發(fā)明的微生物菌株地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformisB-05571)，不僅能在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且對(duì)甘油進(jìn)行脫氫反應(yīng)的能力較強(qiáng)；利用地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformisB-05571)生產(chǎn)二羥基丙酮，甘油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％～90％，(即1摩爾的甘油能轉(zhuǎn)化為0.50～0.99摩爾的二羥基丙酮)，適用于二羥基丙酮的工業(yè)化生產(chǎn)。
(四)


地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No.M 206082，保藏日期2006年8月29日。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1培養(yǎng)基配方(重量/體積百分比，以下同)甘油0.5％，酵母粉0.1％，蛋白胨0.1％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，用自來(lái)水配制，用HCl溶液將pH調(diào)到4.0，再加入CaCO30.2％，滅菌備用。
取100mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在2個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液。
取2L上述培養(yǎng)基，平均分裝入40個(gè)500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，以體積比1.5％的接種量接入種子液，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為72h，甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為88％。
收集上述發(fā)酵液1.5L，經(jīng)過(guò)離心(10000×g，10min)之后，上清液濃縮至500mL，在55℃下活性炭脫色30min，然后真空濃縮至漿狀，加入與漿狀物同體積的無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮去乙醇，反復(fù)加入乙醇三次，濃縮至無(wú)乙醇為止，濃縮物備用。
上述濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離濃縮物中的二羥基丙酮和甘油，柱高徑比35∶1，使用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積5％時(shí)，采用95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.2BV/h，收集含二羥基丙酮段樣品，進(jìn)行真空濃縮，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中獲得白色二羥基丙酮結(jié)晶，冷凍干燥后得到2.86克DHA。
實(shí)施例2培養(yǎng)基配方甘油8.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.5％，CaCO30.4％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為50h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為65％。
收集上述發(fā)酵液400mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到7.42克DHA。
實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基配方甘油14％，酵母粉2.5％，蛋白胨2.5％，牛肉膏2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％，CaCO30.1％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
種子培養(yǎng)基配方甘油1.0％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.2％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0，滅菌備用。
取100mL種子培養(yǎng)基，平均分裝在2個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，在30℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
取4L發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝在80個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入種子液，以體積比2.0％的接種量接入種子液，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為50％。
收集上述發(fā)酵液3.5L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到116.1克DHA。
實(shí)施例4培養(yǎng)基配方甘油1.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，NaH2PO4·2H2O0.5％，CaCO30.2％，用自來(lái)水配制，pH 7.0，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基6.0L，滅菌，接入種子液100mL，28℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
在接種后，隨即開(kāi)始流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.4mL/min；培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h左右，通氣量5L/min，攪拌速度300r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為70％。
收集上述發(fā)酵液6L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到216.3克DHA。
實(shí)施例5培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，NaH2PO4·2H2O0.5％，用自采水配制，pH6.5，再加入CaCO30.2％，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基7L，滅菌，接入種子液100mL，28℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
在菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)(發(fā)酵20h后)進(jìn)行流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.5mL/min；培養(yǎng)溫度28℃，繼續(xù)培養(yǎng)80h左右，通氣量5L/min，攪拌速度300r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為68％。
收集上述發(fā)酵液7L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到235.7克DHA。
實(shí)施例6培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，用自來(lái)水配制，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，再加入CaCO30.1％，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，28℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL0.5％的甘油水溶液中，利用菌體對(duì)甘油進(jìn)行脫氫反應(yīng)；反應(yīng)條件溫度28℃，初始pH為6.5，反應(yīng)時(shí)間為24h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為99％。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.7克DHA。
實(shí)施例7培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，CaCO30.1％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，28℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL14％的甘油水溶液中，利用菌體生物催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮；反應(yīng)條件溫度32℃，初始pH為5.0，反應(yīng)時(shí)間為48h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為60％。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到13.1克DHA。
實(shí)施例8培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，CaCO30.1％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，滅菌備用。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，28℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到300mL 1.0％的甘油水溶液中，利用菌體生物催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮，在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)流加50％甘油60mL，流加速度為0.1mL/min；反應(yīng)條件溫度32℃，初始pH為5.0，反應(yīng)時(shí)間為48h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為70％。
收集上述反應(yīng)液250mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到9.8克DHA。
實(shí)施例9培養(yǎng)基配方甘油2.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，NaH2PO4·2H2O0.5％，用自來(lái)水配制，pH6.5，再加入CaCO30.2％，滅菌備用。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基7L，滅菌，接入種子液150mL，通風(fēng)量5L/min，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)24小時(shí)為種子液，備用。
在500L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基350L，滅菌，接入種子液5.5L，通風(fēng)量200L/min，轉(zhuǎn)速300rpm，在菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)(發(fā)酵20h后)進(jìn)行流加50％的甘油水溶液50L，流加速度20mL/min；培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間為70h左右。甘油轉(zhuǎn)化成DHA的轉(zhuǎn)化率為85％。
收集上述發(fā)酵液10L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到241.3克DHA。
權(quán)利要求
1.地衣芽孢桿菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No.M 206082。
2.如權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌B-05571，其特征在于所述地衣芽孢桿菌B-05571菌落形態(tài)為菌落呈土黃色，邊緣光滑，表面微隆起，微縐折，粘稠；細(xì)胞形態(tài)為顯微鏡觀察菌體形狀呈桿狀，有時(shí)候成鏈狀，產(chǎn)芽孢；生理生化指標(biāo)為接觸酶陽(yáng)性，V-P測(cè)定陽(yáng)性，能利用明膠、淀粉，能利用檸檬酸鹽、丙酸鹽，能利用肌醇，半乳糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇。
3.如權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌B-05571在制備1，3-二羥基丙酮中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將所述地衣芽孢桿菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，初始pH為4.0～7.0，在20～40℃下發(fā)酵培養(yǎng)24～96小時(shí)，發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述的1，3-二羥基丙酮。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將所述地衣芽孢桿菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，初始pH為4.0～7.0，在20～40℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液離心分離得到菌體，所得菌體再加入0.5～15％的甘油水溶液中反應(yīng)1～90小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述的1，3-二羥基丙酮。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將所述地衣芽孢桿菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，初始pH為4.0～7.0，在20～40℃下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中流加10％～80％的甘油水溶液，總發(fā)酵時(shí)間24～96小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述的1，3-二羥基丙酮。
7.如權(quán)利要求4～6之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用。
8.如權(quán)利要求4～6之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述1，3-二羥基丙酮的分離純化方法如下將發(fā)酵液或反應(yīng)液濃縮，濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述1，3-二羥基丙酮制備方法如下培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用；(1)取上述培養(yǎng)基，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)24小時(shí)獲得種子液；(2)取上述培養(yǎng)基，滅菌，以體積比1.5％的接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)72小時(shí)，收集發(fā)酵液，10000g離心10分鐘，濃縮至濃縮液為原液體積的1/3，55℃下活性炭脫色30min，真空濃縮至漿狀，加入無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮除去乙醇，反復(fù)加入乙醇濃縮至無(wú)乙醇，得濃縮物；(3)步驟(2)所得濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
10.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述1，3-二羥基丙酮制備方法如下培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用；(1)取上述培養(yǎng)基，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)液離心分離得到菌體，加入5％的甘油水溶液中，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，28℃下反應(yīng)24小時(shí)；(2)步驟(1)所得反應(yīng)液10000g離心10分鐘，濃縮至濃縮液為原液體積的1/3，55℃下活性炭脫色30min，真空濃縮至漿狀，加入無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮除去乙醇，反復(fù)加入乙醇濃縮至無(wú)乙醇，得濃縮物；(3)步驟(2)所得濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
11.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述1，3-二羥基丙酮制備方法如下培養(yǎng)基組成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量為水，pH值4.0～7.0，滅菌備用；(1)取上述培養(yǎng)基，滅菌，接入斜面菌種地衣芽孢桿菌B-05571，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)24小時(shí)獲得種子液；(2)取上述培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐，滅菌，以體積比1.5％的接種量接入種子液，通氣量0.8vvm，28℃下發(fā)酵培養(yǎng)菌體至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再流加甘油，每7L培養(yǎng)基流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.5mL/min，28℃下培養(yǎng)80小時(shí)；(3)收集發(fā)酵液，10000g離心10分鐘，濃縮至濃縮液為原液體積的1/3，55℃下活性炭脫色30min，真空濃縮至漿狀，加入無(wú)水乙醇混勻，真空濃縮除去乙醇，反復(fù)加入乙醇濃縮至無(wú)乙醇，得濃縮物；(4)步驟(3)所得濃縮物通過(guò)裝有100～200目硅膠的吸附層析柱分離提取其中的二羥基丙酮，柱高徑比10～40∶1，采用石油醚濕法裝柱，加樣量為柱床體積3％～10％，以體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶劑為流動(dòng)相洗脫，洗脫流速0.05BV/h～0.5BV/h、收集含1，3-二羥基丙酮洗脫液，真空濃縮，在體積比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中結(jié)晶，得到所述1，3-二羥基丙酮的晶體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株從土壤中篩選到將甘油生物轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮的新的微生物菌株地衣芽孢桿菌B－05571(Bacillus licheniformisB－05571)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No.M 206082，保藏日期2006年8月29日。提議的分類命名為地衣芽孢桿菌B－05571(Bacillus licheniformin B－05571)。本發(fā)明的微生物菌株地衣芽孢桿菌B－05571(Bacillus licheniformis B－05571)，不僅能在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且對(duì)甘油進(jìn)行脫氫反應(yīng)的能力較強(qiáng)；利用地衣芽孢桿菌B－05571(Bacillus licheniformis B－05571)生產(chǎn)二羥基丙酮，在較佳工藝條件下，甘油的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％～90％，(即1摩爾的甘油能轉(zhuǎn)化為0.50～0.90摩爾的二羥基丙酮)，適用于二羥基丙酮的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/24GK101037659SQ200610053548
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 胡忠策, 柳志強(qiáng), 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)