專利名稱：ω－芋螺毒素M VII A突變體及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程，涉及ω-芋螺毒素M VIIA(CTX M VIIA)突變體及其融合表達和生產(chǎn)方法，以及在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是從海洋腹足綱軟體動物芋螺(Conus)中得到的一類具有生物活性的肽類毒素，估計有50000余種。這些多肽結(jié)構(gòu)新穎，功能獨特。按其作用靶位可分為α-、ω-、μ-、δ-等類型。由于它們可選擇性地作用于不同的離子通道及其亞型，在神經(jīng)藥理學(xué)研究和疾病治療等方面發(fā)揮重要的作用。
ω型CTX是近年來芋螺毒素的重要研究方向，具有廣闊的藥物開發(fā)前景。其中，ω-芋螺毒素M VIIA(CTX M VIIA)是電壓敏感型鈣離子通道的抑制劑，其組成序列為Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，它由25個氨基酸組成，含6個半胱氨酸(Cys)殘基，形成三對全交叉二硫鍵(即二硫鍵連接方式為Cys1-Cys16，Cys8-Cys20，Cys15-Cys25，C-端為酰胺化Cys)。它們具有很高的鎮(zhèn)痛活性且無成癮性，可以作為嗎啡等成癮止痛劑的替代藥物；近年來，化學(xué)合成的ω-芋螺毒素M VIIA已在美國由FDA批準上市。
目前，已經(jīng)上市的ω-芋螺毒素M VIIA是用化學(xué)合成的方法獲得的，由于其分子中有6個半胱氨酸需要準確配對形成二硫鍵，需要20多步反應(yīng)，得率很低，工藝十分困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，而且成本較高。因此，尋找一種合適的方法獲得ω-芋螺毒素M VIIA成為需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供多肽有機化合物ω-芋螺毒素M VIIA突變體，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列Gly-Ser-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys 27該多肽有機化合物分子中Cys3與Cys18、Cys10與Cys22、Cys17與Cys27之間分別形成三對二硫鍵；C-端為非酰胺化Cys，及具有SEQ ID NO2的編碼突變體的DNA序列g(shù)gatcctgca aaggtaaagg tgcgaaatgc tctcgtctga tgtacgactg ctgcaccggt 60tcttgccgtt ctggtaaatg c 81本發(fā)明的另一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供這種ω-芋螺毒素MVIIA突變體的制備方法，通過以下步驟實現(xiàn)1、用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組表達載體pGEX-2T/CTXM VIIA來表達谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與ω-芋螺毒素M VIIA的融合蛋白(GST-CTX M VIIA)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE)(參見CN 03142052.4)；2、用GST親和層析的方法采用Glutathione-Agarose親和柱來純化融合蛋白，以獲得高純度的GST-CTX M VIIA融合蛋白；3、純化后GST-CTX M VIIA融合蛋白在磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析后用凝血酶(Thrombin)進行酶切，酶切后產(chǎn)物經(jīng)過Sephacryl S-100HR凝膠柱進行分離、純化，對純化得到的CTX M VIIA突變體用0.1％的β-巰基乙醇先把CTX M VIIA突變體的二硫鍵打開，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析過夜，使其在空氣中緩慢氧化，從而形成正確的二硫鍵配對。
所述的GST-CTX M VIIA融合蛋白的制備，采用親和層析，選用填料Glutathione-Agarose，還原型谷胱甘肽和50mM Tris-HCl(pH 8.0)進行洗脫(參見CN 03142052.4)。
所述的凝血酶(Thrombin)酶切GST-CTX M VIIA融合蛋白，是將凝血酶在PBS緩沖體系下在22℃以不同酶濃度，不同酶切工作時間，使GST-CTX MVIIA融合蛋白經(jīng)過酶切，獲得CTX M VIIA突變體小片段。最適酶切反應(yīng)條件為在PBS溶液中，將100μg融合蛋白加2單位(unit)的凝血酶，22℃酶切20小時，獲得CTX M VIIA突變體。
所述的酶切產(chǎn)物CTX M VIIA突變體用分子篩層析純化CTX M VIIA突變體多肽片段，填料選用Sephacryl S-100HR，用經(jīng)22μm無菌濾器濾過的去離子水以1ml/min的流速用Sephacryl S-100HR預(yù)裝柱在AKTA Purifier蛋白純化儀上，對酶切后混合物進行分離、純化及脫鹽。
所述的純化的CTX M VIIA突變體的二硫鍵的正確配對，是先用0.1％的β-巰基乙醇先把CTX M VIIA突變體的二硫鍵打開，再用PBS透析過夜，使其在空氣中緩慢氧化，從而形成正確的二硫鍵配對。
本發(fā)明的又一個目的是提供ω-芋螺毒素M VIIA突變體在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
以基因工程的方式來生產(chǎn)基因重組CTX M VIIA突變體。本方法成功的將CTX M VIIA基因定向克隆于原核表達載體pGEX-2T。該原核表達系統(tǒng)的特點是Ptac啟動子受乳糖操縱子的控制。其下游為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，在GST和多克隆位點之間存在凝血酶的酶切位點。外源基因片段以正確閱讀框架克隆到強啟動子下游的多克隆位點上，在IPTG的誘導(dǎo)下能表達外源蛋白與GST形成的融合蛋白，且可顯著提高融合蛋白的表達產(chǎn)率。融合蛋白可由位點特異性的蛋白酶如凝血酶進行切割以得到目的小肽。GST融合蛋白在水溶液中可溶，在不變性的條件下，通過親和層析得到。因而采用該原核表達系統(tǒng)使CTX M VIIA先以GST-CTX M VIIA融合蛋白的形式得以高產(chǎn)表達，并通過GST采用親和層析快速、簡便的得到高純度的融合蛋白，然后使用該表達系統(tǒng)特異的凝血酶進行酶切使GST分離，得到較純的CTX M VIIA突變體，大大簡化了進一步純化該多肽片段的工作。雖然最終得到的CTX M VIIA突變體帶上了兩個多余的氨基酸殘基但同樣具有很強的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，可以用作神經(jīng)科學(xué)和藥理學(xué)研究，也可進一步開發(fā)成為新型無成癮型的鎮(zhèn)痛藥物。
本發(fā)明的融合蛋白基因工程的生產(chǎn)方法，操作簡單、質(zhì)量穩(wěn)定、成本較低，得到活性的ω-芋螺毒素M VIIA突變體可進行藥物開發(fā)。


圖1為表達質(zhì)粒中CTX M VIIA部分DNA序列測定結(jié)果。
圖2為融合蛋白GST-CTX M VIIA的誘導(dǎo)表達。
圖3為融合蛋白GST-CTX M VIIA的純化結(jié)果。
圖4為AKTA purifier純化GST-CTX M VIIA的結(jié)果。
圖5為以100μg融合蛋白/1unit凝血酶比例加入凝血酶在22℃下酶切，不同時間的酶切結(jié)果。
圖6為以100μg融合蛋白/2unit凝血酶比例加入凝血酶在22℃下酶切，不同時間的酶切結(jié)果。
圖7為以100μg融合蛋白/3unit凝血酶比例加入凝血酶在22℃下酶切，不同時間的酶切結(jié)果。
圖8為以100μg融合蛋白/4unit凝血酶比例加入凝血酶在22℃下酶切，不同時間的酶切結(jié)果。
圖9為融合蛋白GST-CTX M VIIA在不同凝血酶濃度、不同凝血酶酶切時間等條件下的酶切效率。
圖10為CTX M VIIA突變體在不同凝血酶濃度、不同凝血酶酶切時間等條件下的回收率。
圖11為分子篩層析純化CTX M VIIA突變體洗脫圖。
圖12為MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定重組CTX M VIIA突變體。
圖13為大鼠熱尾法測定CTX M VIIA突變體的鎮(zhèn)痛活性。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。
實施例一1材料與方法1.1材料與試劑pGEX-2T/CTX M VIIA質(zhì)粒由本室構(gòu)建；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及標準分子量marker，還原型谷胱甘肽購于上海生工生物工程公司；Glutathione-Agarose、Sephacryl S-100HR購于Parmacia公司；凝血酶(Thrombin)購于Parmacia公司；大腸桿菌BL21(DE)菌種購于Sigma公司；其他試劑均購于國內(nèi)各公司。
1.2方法1.2.1 GST-CTX M VIIA融合蛋白的誘導(dǎo)表達將GST-CTX M VIIA質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE)中，以BL21(DE)空菌和含未插入目的基因的質(zhì)粒的BL21(DE)為陰、陽性對照。挑取重組成功的克隆接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜，2％比例接種新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)中期。取出1毫升，以作陰性對照，其余加入IPTG至終濃度為0.1mM，37℃誘導(dǎo)表達4小時，(參見CN 03142052.4)。
1.2.2 GST-CTX M VIIA融合蛋白的親和純化1.2.2.1測定Glutathione-Agarose填料的吸附容量將已浸泡于20％乙醇和0.5M NaCl中的Glutathione-Agarose填料裝于一簡易柱子，用20％乙醇以點滴的形式平衡1小時后換滅菌PBS平衡1小時，而后加入誘導(dǎo)表達的GST融合蛋白，用滅菌PBS平衡，收集流出物，待10個柱長體積后再收集，而后換成親和洗脫液，還原型谷胱甘肽和50mM Tris-HCl(pH8.0)進行洗脫并收集流出物，洗脫10個柱長體積后在收集流出物，然后換20％乙醇平衡過夜，第二天卸下填料浸泡在20％乙醇和0.5M NaCl的溶液中4℃保存。
1.2.2.2 Glutathione-Agarose親和柱的安裝拆卸Tricom 5/20 column并浸泡于20％的乙醇中，利用鐵架臺搭建固定器。隨后將已浸泡于20％乙醇和0.5M NaCl中的Glutathione-Agarose填料加入離心管并加20％的乙醇，輕柔混勻。在固定器上固定空柱子，在底部安上石棉濾塞以截留填料，隨后在柱子中注滿20％乙醇，待液面流至離柱子底部1/3柱長處加入混合好的Glutathione-Agarose，控制加入的速度使之和流出的速度大致相同。待填料加至離柱子底部的9/10柱長處，封閉柱子底部的流出孔，小心安上頂部蓋子，避免氣體進入。4℃靜止柱子1-2小時使填料充分沉積。隨后將柱子安裝在AKTA Purifier蛋白純化儀上，用20％的乙醇以1ml/min的流速平衡柱子直至OD215、OD280及電導(dǎo)等基線走平。
1.2.2.3 Glutathione-Agarose親和純化GST融合蛋白挑取克隆成功的重組菌接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜，將菌液按1∶50的比例接種于含氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8左右，加入IPTG至終濃度為0.1mM，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。5000rpm/4℃離心10min，棄去上清后，將沉淀重懸于3ml滅菌PBS中，超聲破菌直至溶液澄清，將破碎后的溶液15000rpm/4℃離心15min，取上清4℃保存。
用經(jīng)22μ無菌濾器濾過的滅菌PBS以1ml/min的流速平衡親和柱直至OD215、OD280及電導(dǎo)等基線走平。將超聲離心后4℃保存的上清經(jīng)22μ無菌濾器濾過后上樣，用經(jīng)22μm無菌濾器濾過的滅菌PBS以1ml/min的流速進行平衡，待OD215、OD280及電導(dǎo)等基線又一次走平后換親和洗脫液，還原型谷胱甘肽和50mM Tris-HCl(pH 8.0)進行洗脫，洗脫流速仍為1ml/min，并根據(jù)OD215、OD280及電導(dǎo)等數(shù)值的變化收集洗脫峰并在紫外280nm波長下測吸光度來計算蛋白濃度，待無其他物質(zhì)被洗脫時換20％的乙醇以1ml/min的流速平衡柱子直至OD215、OD280及電導(dǎo)等基線再次走平。卸下柱子放置在4℃保存。純化后收集的樣本用12％SDS-PAGE進行鑒定。
1.2.3分離并純化CTX M VIIA多肽片段1.2.3.1檢驗?zāi)窽hrombin的工作效率將經(jīng)親和純化的GST-CTX M VIIA融合蛋白轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000的透析袋中浸泡在PBS緩沖液里4℃透析并不斷更新PBS(PBS為該凝血酶的工作緩沖溶液)。透析20小時后回收GST-CTX M VIIA融合蛋白，測紫外280nm波長下的吸光度來估算蛋白濃度。將100μg融合蛋白分別用1、2、3及4單位(unit)的凝血酶，在22℃分別酶切4、8、12、16、20和24小時；每一工作時間點立即取出相應(yīng)的反應(yīng)管，加入10μl 5×SDS PAGE Loading Buffer煮沸5min，隨后10000rpm離心5min，放置于-20℃等待SDS-PAGE電泳分析鑒定。
1.2.3.2酶切分離CTX M VIIA多肽片段將親和純化后的GST-CTX M VIIA融合蛋白經(jīng)過透析更換成PBS緩沖體系，并以紫外分光光度法計算融合蛋白的濃度。以100μg融合蛋白/2unit酶的比例加入凝血酶，在水浴22℃的條件下酶切工作20小時后，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為1000的透析袋中，用PEG 20000濃縮，收集濃縮后的樣本放置于4℃保存等待純化。
1.2.3.3分子篩層析分離CTX M VIIA多肽片段將Sephacryl S-100HR預(yù)裝柱安裝在AKTA Purifier蛋白純化儀上，用20％的乙醇以1ml/min的流速平衡柱子直至OD215、OD280及電導(dǎo)等基線走平。用經(jīng)22μm無菌濾器濾過的去離子水以1ml/min的流速平衡親和柱直至OD215、OD280及電導(dǎo)等基線走平。將濃縮好的樣品進行分子篩分離、純化并脫鹽，用經(jīng)22μm無菌濾器濾過去離子水仍以1ml/min的流速進行洗脫，并根據(jù)OD215、OD280及電導(dǎo)等數(shù)值的變化收集洗脫峰，待無其他物質(zhì)被洗脫時，改換20％的乙醇以1ml/min的流速平衡柱子直至OD215、OD280及電導(dǎo)等基線再次走平。卸下柱子放置在4℃保存。根據(jù)洗脫峰的出峰時間大致估計分子量范圍，保存分子量在2000-4000范圍內(nèi)的洗脫峰，作為CTX M VIIA突變體，進行結(jié)構(gòu)鑒定和藥理學(xué)研究。
2結(jié)果2.1GST-CTX M VIIA融合蛋白在宿主菌中的IPTG誘導(dǎo)表達重組表達質(zhì)粒pGEX-2T/CTX M VIIA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL(DE)，LB培養(yǎng)平板(Amp+)上生長良好的單克隆，擴增后抽提質(zhì)粒DNA，由上海生工生物工程公司測定DNA序列，部分序列結(jié)果見圖1，其中核苷酸序列從33～108位編碼CTX M VIIA，其序列為tgc aaa ggt aaa ggt gcg aaa tgc tct cgt ctg atg tacgac tgc tgc acc ggt tct tgc cgt tct ggt aaa tgc，表明CTX M VIIA基因序列正確。
將已轉(zhuǎn)化重組表達質(zhì)粒pGEX-2T/CTX M VIIA的大腸桿菌BL21(DE)的單克隆菌落進行擴增和誘導(dǎo)表達，各取20μl IPTG誘導(dǎo)表達菌液、未加IPTG誘導(dǎo)的菌液、IPTG誘導(dǎo)表達后的培養(yǎng)基上清、超聲破菌、離心后重懸的沉淀及超聲破菌、離心后的上清，加入5μl 5×SDS PAGE Loading Buffer煮沸5min，10000rpm離心5min后取10μl進行SDS-PAGE電泳鑒定，觀察GST融合蛋白質(zhì)是否被誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE結(jié)果參見圖2，其中1為標準分子量marker，2為IPTG誘導(dǎo)的IPTG誘導(dǎo)表達菌液，3為未用IPTG誘導(dǎo)的表達菌液，4為IPTG誘導(dǎo)表達后的培養(yǎng)基上清，5用IPTG誘導(dǎo)的表達菌，超聲破碎、離心后的上清，6用IPTG誘導(dǎo)的表達菌，超聲破碎、離心后的沉淀。根據(jù)比較超聲離心后沉淀和上清中在此條帶附近的條帶的濃度及所占整個泳道蛋白的含量，誘導(dǎo)表達的GST融合蛋白主要集中在破菌離心后的上清溶液中。在對誘導(dǎo)表達后培養(yǎng)基上清進行電泳鑒定后發(fā)現(xiàn)在分子量31000左右沒有明顯條帶，說明GST-CTX M VIIA融合蛋白不被分泌表達。
2.2 GST-CTX M VIIA融合蛋白的純化2.2.1測定Glutathione-Agarose填料的吸附容量將上述轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達、超聲破碎、離心所得的上清經(jīng)Glutathione-Agarose親和柱層析，將各環(huán)節(jié)收集的流出物進行12％SDS-PAGE分析鑒定，結(jié)果參見圖3，其中1標準分子量marker，2未用IPTG誘導(dǎo)的表達菌液，3用IPTG誘導(dǎo)的表達菌，超聲破碎、離心后的上清，4用IPTG誘導(dǎo)的表達菌，超聲破碎、離心后的沉淀，5上清液上樣后最先洗脫成分，6用10倍Glutathione-Agarose柱體積的PBS洗脫液洗脫的成分，710mM還原型谷胱甘肽和50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗脫液洗脫的成分，810倍柱體積的10mM還原型谷胱甘肽和50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗脫液洗脫后的成分。在上樣后收集的出水峰中看到在分子量31000左右有少量的條帶，說明Glutathione-Agarose已經(jīng)被飽和；在洗脫時收集的樣本中除在分子量31000左右有一很濃的條帶外無其他的條帶，表明Glutathione-Agarose具有很強的特異性；而在洗脫10個柱床體積后收集的樣本中基本上沒有看到條帶表明采用Glutathione-Agarose進行親和洗脫具有極強效率，并且通過計算洗脫時收集蛋白的含量估計Glutathione-Agarose的最大吸附量為7mg/ml。
2.2.2 Glutathione-Agarose親和純化GST融合蛋白將2ml Glutathione-Agarose裝于Tricom column 5/20柱子，用AKTA Purifier蛋白純化儀純化GST融合蛋白，用自動檢測器即時測定OD215、OD280及電導(dǎo)，根據(jù)檢測結(jié)果收集樣本，SDS-PAGE結(jié)果見圖4，在第35分種到第42分鐘之間洗脫出GST-CTX M VIIA融合蛋白。收集的樣本經(jīng)12％SDS-PAGE進行鑒定，發(fā)現(xiàn)只有在分子量31000左右有一清晰的條帶。結(jié)果表明采用此種方法可以簡便、高效的獲得高純度的GST-CTX M VIIA的融合蛋白。
2.3分離并純化CTX M VIIA突變體多肽片段2.3.1檢驗?zāi)窽hrombin的工作效率將100μg的GST-CTX M VIIA融合蛋白在PBS緩沖液中加不同酶濃度(1、2、3及4unit)在22℃下分別酶切4、8、12、16、20和24小時，樣品然后進行SDS-PAGE電泳分析來鑒定凝血酶工作效率來挑選最佳酶切條件。酶切結(jié)果表示以100μg融合蛋白/1unit凝血酶比例(推薦比例)加入凝血酶在22℃下酶切24小時后仍有26.2％的融合蛋白沒有被酶切，SDS-PAGE結(jié)果見圖5，其中，1標準分子量marker，2未經(jīng)酶切的GST-CTX M VIIA融合蛋白，3酶切4小時的結(jié)果，4酶切8小時的結(jié)果，5酶切12小時的結(jié)果，6酶切16小時的結(jié)果，7酶切20小時的結(jié)果，8酶切24小時的結(jié)果。同時酶切所得的小片段在酶切20小時時達到了15.7％，在24小時時卻只有12.8％，說明酶切條件可能會影響小片段的穩(wěn)定性。
以100μg融合蛋白/2unit凝血酶比例加入凝血酶，在22℃下酶切24小時后有8.1％的融合蛋白沒有被酶切，SDS-PAGE結(jié)果見圖6，其中，1標準分子量marker，2未經(jīng)酶切的GST-CTX M VIIA融合蛋白，3酶切4小時的結(jié)果，4酶切8小時的結(jié)果，5酶切12小時的結(jié)果，6酶切16小時的結(jié)果，7酶切20小時的結(jié)果，8酶切24小時的結(jié)果。其中，同時酶切所得的小片段在此酶切條件下酶切20小時時達到了最大產(chǎn)量，20.6％，提示該條件可能是回收酶切小片段的最佳酶切條件。
以100μg融合蛋白/3unit凝血酶比例加入凝血酶，在22℃下酶切24小時后，只有0.1％的融合蛋白沒有被酶切SDS-PAGE結(jié)果見圖7，其中，1標準分子量marker，2未經(jīng)酶切的GST-CTX M VIIA融合蛋白，3酶切4小時的結(jié)果，4酶切8小時的結(jié)果，5酶切12小時的結(jié)果，6酶切16小時的結(jié)果，7酶切20小時的結(jié)果，8酶切24小時的結(jié)果。表明在此條件下融合蛋白可被酶切完全。但酶切所得小片段的產(chǎn)量與前兩種酶切條件下所得產(chǎn)量相比有明顯的降低(酶切24小時時達到最大含量15.7％)，也說明了該酶切條件可能會影響小片段的穩(wěn)定性。
以100μg融合蛋白/4unit凝血酶比例加入凝血酶，在22℃下酶切24小時后，有1.1％的融合蛋白沒有被酶切，SDS-PAGE結(jié)果見圖8，其中，1標準分子量marker，2未經(jīng)酶切的GST-CTX M VIIA融合蛋白，3酶切4小時的結(jié)果，4酶切8小時的結(jié)果，5酶切12小時的結(jié)果，6酶切16小時的結(jié)果，7酶切20小時的結(jié)果，8酶切24小時的結(jié)果。，而在此條件下酶切所得小片段的產(chǎn)量為18.4％)，也支持了了該酶切條件可能會影響小片段的穩(wěn)定性的說法。
綜合以上酶切動力學(xué)實驗結(jié)果，融合蛋白GST-CTX M VIIA在不同酶濃度、不同酶工作時間等條件下的酶切效率(以未酶切融合蛋白含量計算)參見圖9，表明該凝血酶在PBS緩沖體系下在22℃以100μg融合蛋白/3unit凝血酶的酶濃度酶切16小時可以使90％以上的GST-CTX M VIIA融合蛋白酶切。
而小片段CTX M VIIA突變體卻在22℃以100μg融合蛋白/2unit凝血酶的酶濃度酶切20小時時獲得最大的回收率20.6％(以小片段的含量計算)，參見圖10。
2.3.2分子篩純化CTX M VIIA突變體多肽片段用經(jīng)22μm無菌濾器濾過的去離子水以1ml/min的流速用Sephacryl S-100HR預(yù)裝柱在AKTA Purifier蛋白純化儀上，對酶切后混合物進行分離、純化及脫鹽。根據(jù)OD215、OD280及電導(dǎo)等數(shù)值的變化，參見圖11。在洗脫體積30-50ml及90-105ml處有兩個洗脫峰，根據(jù)洗脫峰的出峰位置比較標準洗脫曲線，在洗脫體積30-50ml處的洗脫峰分子量大概在25000-30000附近，為GST蛋白；而在洗脫體積90-105ml處的洗脫峰分子量在2000-3000范圍，為純化的CTX M VIIA突變體。
實施例二基因重組的CTX M VIIA突變體的質(zhì)譜鑒定，我們將純化的CTX M VIIA突變體收集液凍干，送至中科院上海生化細胞所，通過MALDI-TOF-MS做分子量鑒定。結(jié)果證明帶兩個N-端多余氨基酸殘基Gly和Ser的CTX M VIIA突變體的分子量為2783，與理論值相符；結(jié)果參見圖12。
實施例三大鼠熱尾法(Hot-tail flick)用于測定CTX M VIIA突變體的鎮(zhèn)痛活性。健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±20g，10％的水合氯醛進行麻醉，側(cè)腦室埋管，每日注射青霉素，飼養(yǎng)一周后進行藥理試驗。調(diào)節(jié)恒溫水浴53±0.5℃，給藥半小時測痛域。正常鼠痛域一般為2s，痛域5s為完全鎮(zhèn)痛。挑選合格動物30只，隨機分成6組，經(jīng)套管給藥，通過大鼠熱尾法實驗證明得到的CTX M VIIA突變體具有很強的鎮(zhèn)痛作用(見圖13)。圖13中PBS為生理鹽水組；Morphine(L)為低劑量嗎啡組(25μg/kg)；Morphine(H)為高劑量嗎啡組(250μg/kg)；GST-CTX為GST-CTX M VIIA融合蛋白組(25μg/kg)；CTX(L)為低劑量CTX M VIIA突變體組(2.5μg/kg)；CTX(H)為高劑量CTX MVIIA突變體組(25μg/kg)。分別測定給藥后不同時間小鼠的平均痛閾值，按以下公式計算痛閾提高的百分率痛閾提高百分率＝(用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值)/用藥前平均痛閾值。
結(jié)果參見圖13結(jié)果表明CTX M VIIA突變體(2.5μg/Kg)的鎮(zhèn)痛效果與GST-CTX M VIIA融合蛋白組(25μg/Kg)或嗎啡(250μg/Kg)的鎮(zhèn)痛效果相當?？紤]到重組CTX M VIIA突變體的分子量(2783)，GST-CTX M VIIA的分子量(29000左右)，嗎啡的分子量(285)，按摩爾鎮(zhèn)痛效果比較，這種CTX M VIIA突變體的鎮(zhèn)痛效力與GST-CTX M VIIA融合蛋白的鎮(zhèn)痛效力相當，但比嗎啡要強800倍。
綜上所述，我們用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中成功地表達了GST-CTX MVIIA融合蛋白，經(jīng)凝血酶酶切后，可純化得到CTX M VIIA突變體；這種方法可以生產(chǎn)新型的CTX M VIIA突變體，制備工藝簡單，每升發(fā)酵液最后可得到約50mg CTX M VIIA突變體，生產(chǎn)成本較低；動物實驗證明這種重組CTX MVIIA突變體具有很高的鎮(zhèn)痛活性，其鎮(zhèn)痛效力是嗎啡的800倍，可用于鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)。
以上對本發(fā)明較佳實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>ω-芋螺毒素M VIIA突變體及制備和應(yīng)用<160>2<210>1<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計，用于鎮(zhèn)痛<400>1Gly Ser Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met
1 5 10Tyr Asp Cys Cys Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys15 20 25(該多肽分子中C3與C18、C10與C22、C17與C27分別形成三對二硫鍵，C-端為非酰胺化Cys)<210>2<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)E.coli偏愛的密碼子而設(shè)計，用于編碼ω-芋螺毒素M VIIA突變體的結(jié)構(gòu)基因序列<400>1ggatcctgca aaggtaaagg tgcgaaatgc tctcgtctga tgtacgactg ctgcaccggt 60tcttgccgtt ctggtaaatg c 8權(quán)利要求
1.一種ω-芋螺毒素M VII A突變體，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列Gly-Ser-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys 27，該多肽有機化合物分子中Cys3與Cys18、Cys10與Cys22、Cys17與Cys27之間分別形成三對二硫鍵，C-端為非酰胺化Cys。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ω-芋螺毒素M VII A突變體，具有SEQ IDNO2的編碼突變體的DNA序列g(shù)gatcctgca aaggtaaagg tgcgaaatgc tctcgtctga tgtacgactg ctgcaccggt 60tcttgccgtt ctggyaaatg c 81。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ω-芋螺毒素M VII A突變體的制備方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)(1)在轉(zhuǎn)化有表達質(zhì)粒pGEX-2T/CTX M VII A的大腸桿菌BL21中，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷來誘導(dǎo)表達谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與ω-芋螺毒素M VIIA的融合蛋白；(2)用GST親和層析的方法采用Glutathione-Agarose親和柱純化融合蛋白，用還原型谷胱甘肽和50mM Tris-HCl進行洗脫，pH8.0，獲得高純度的GST-CTX M VIIA融合蛋白；(3)純化后GST-CTX M VIIA融合蛋白在PBS溶液中透析后用凝血酶進行酶切，酶切后產(chǎn)物經(jīng)過Sephacryl S-100HR凝膠柱進行分離、純化；(4)對純化得到的CTX M VIIA突變體先用0.1％的β-巰基乙醇把CTXM VIIA突變體的二硫鍵打開，再用磷酸鹽緩沖液透析過夜，空氣氧化，從而形成正確的二硫鍵配對，獲得目的產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組ω-芋螺毒素M VII A突變體的制備方法，其特征是步驟(3)所述的用凝血酶酶切GST-CTX MVIIA融合蛋白獲得CTXM VIIA突變體，最適酶切反應(yīng)條件為在PBS溶液中，將100μg融合蛋白加2單位的凝血酶，22℃酶切20小時，獲得CTX M VIIA突變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ω-芋螺毒素M VII A突變體的制備方法，其特征是步驟(3)所述的酶切產(chǎn)物CTX M VIIA突變體用分子篩層析純化CTX MVIIA突變體，填料選用Sephacryl S-100HR，用經(jīng)22μm無菌濾器濾過的去離子水以1ml/min的流速用Sephacryl S-100HR預(yù)裝柱在AKTA蛋白純化儀上，對酶切后混合物進行分離、純化及脫鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ω-芋螺毒素M VIIA突變體在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組ω－芋螺毒素M VIIA(CTX M VIIA)突變體，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，采用與谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達的方法，在已構(gòu)建的pGEX－2T/CTX M VIIA原核表達質(zhì)粒基礎(chǔ)上，在大腸桿菌中用IPTG誘導(dǎo)表達GST－CTX M VIIA融合蛋白，經(jīng)GST親和層析的方法純化融合蛋白，用凝血酶進行酶切產(chǎn)生CTX M VIIA的突變體，產(chǎn)物經(jīng)過凝膠柱進行分離純化；為獲得正確的二硫鍵配對，先用還原劑將突變體的二硫鍵配打開，再用PBS透析過夜，空氣氧化獲得目的產(chǎn)物。本發(fā)明方法，操作簡單、質(zhì)量穩(wěn)定、成本較低，可在制備無成癮型的鎮(zhèn)痛藥物中應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK1876176SQ200610052400
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日
發(fā)明者詹金彪, 夏錚, 王峰, 徐小蓉, 黃建松 申請人:浙江大學(xué)