專利名稱：缺氧誘導(dǎo)因子1反義寡核苷酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物領(lǐng)域，涉及一種缺氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia inducible growthfactor-1，HIF-1)的反義寡核苷酸，以及在制備抑制肝癌腫瘤血管生長的藥物中應(yīng)用，也可在制備抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
防治腫瘤的轉(zhuǎn)移是改善腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)移是一種高度選擇的多步驟的非隨機(jī)過程，有多種復(fù)雜因素相互作用和相互依賴，在其過程中，血管生成具有重要作用。新生血管形成決定了癌細(xì)胞能否發(fā)展成為臨床可測(cè)及的腫瘤，能否轉(zhuǎn)移和導(dǎo)致機(jī)體死亡。對(duì)腫瘤而言，獲得并維持本身的血供，即腫瘤血管生長、轉(zhuǎn)移并具有致死性的先決條件。血管生長在惡性腫瘤的生理與病理過程中起著至關(guān)重要的作用。對(duì)于惡性腫瘤，癌細(xì)胞通過新生的血管獲得必要的養(yǎng)分，帶走大量的新陳代謝產(chǎn)物，同時(shí)癌細(xì)胞穿過新生的毛細(xì)血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
腫瘤血管生長過程中包含著血管擴(kuò)張、通透性增加，基底膜及血管周圍基質(zhì)降解，局部血管組織解離，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖并形成管腔，新生血管的成熟等步驟。誘導(dǎo)腫瘤血管生成的能力不是腫瘤與生俱來的。多數(shù)腫瘤在發(fā)生后以無血管的方式在組織中存在數(shù)月甚至數(shù)年而不生長，維持在0.2-2mm大小，只有一部分腫瘤可以成功地啟動(dòng)血管生成，獲得血管長入而進(jìn)一步發(fā)展。Folkman等據(jù)此提出了腫瘤誘導(dǎo)血管生成“開關(guān)”的概念。
腫瘤生長過程中引起局部微環(huán)境的變化可以成為血管生成的啟動(dòng)因素，目前研究得最多的、獲得證據(jù)最具有說服力的是缺氧在這個(gè)過程中的作用。缺氧將上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，控制這種上調(diào)的機(jī)制和一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子---缺氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxiainducible factor-1，HIF-1)有關(guān)。HIF-1最早在1992年由Semenza發(fā)現(xiàn)的一種異源二聚復(fù)合物轉(zhuǎn)錄因子，由α亞基和β亞基組成，基因定位于14q21-q24，蛋白和核酸序列分析表明HIF-1的兩個(gè)亞單位HIF-1α和HIF-1β同屬于bHLH(basic-helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族。HIF-1和VEGF啟動(dòng)子中的缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia response element，HRE)結(jié)合而上調(diào)其表達(dá)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在許多和血管生長有關(guān)的基因的啟動(dòng)子中都存在HRE，包括內(nèi)皮細(xì)胞受體Flt-1、Tie-2、血管生成素(Angiopoietin，Ang)和NO合成酶等。同時(shí)，有些抑癌基因如p53、PTEN和VHL的失活通過HIF-1的作用促進(jìn)血管生長，說明HIF-1實(shí)際上不僅僅是受缺氧特異調(diào)控的，而是腫瘤血管生成中一個(gè)普遍而重要通路。因此，針對(duì)調(diào)節(jié)血管生長因子的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1成為抗血管生成的新的靶向分子，在抑制內(nèi)皮細(xì)胞活性、增殖和移行等，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，干擾基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的生物合成及重塑，破壞毛細(xì)血管的生成等步驟中發(fā)揮作用。
反義基因治療應(yīng)用反義核酸與細(xì)胞內(nèi)的核酸相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平抑制或封閉靶標(biāo)基因的表達(dá)，阻斷異常信號(hào)傳導(dǎo)，以達(dá)到治療效果。反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODN)是人工合成的單鏈小片段核苷酸，能特異性地抑制靶標(biāo)基因表達(dá)，也有文獻(xiàn)報(bào)道，利用血管生長因子的VEGF的反義寡核苷酸抑制血管的生長和生長，提示利用AS-ODN技術(shù)抗血管生成可行。也有研究表明，HIF-1反義寡核苷酸注射于用于檢驗(yàn)免疫治療腫瘤療效的荷瘤小鼠腫瘤周圍，將提高免疫治療腫瘤的療效，提示阻斷缺氧誘導(dǎo)途徑將增加NK介導(dǎo)的抗腫瘤免疫治療效果。國內(nèi)也有研究報(bào)道在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，HIFAS-ODN能抑制肺癌細(xì)胞生長，人大腸癌移植瘤及HBx誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長。上述研究均提示利用HIF-1為靶點(diǎn)治療腫瘤的可行性。
目前，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有抑制腫瘤血管生長的HIF-1反義寡核苷酸制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種HIF-1的反義寡核苷酸，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列ACGCAGAATATATTCCATGAA。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供HIF-1的反義寡核苷酸在制備抑制腫瘤血管生長藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供HIF-1的反義寡核苷酸在制備抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明的HIF-1反義寡核苷酸可以與HIF-1mRNA形成mRNA-DNA雜交雙鏈，有效地抑制缺氧條件下HIF-1mRNA的表達(dá)，且可以抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖，可在制備抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明的反義寡核苷酸以HIF-1為靶點(diǎn)，可以抑制肝癌和腫瘤血管生長，從而防治腫瘤的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，為腫瘤治療提供新的途徑。


圖1為HIF1-AS對(duì)HepG2細(xì)胞中HIF1mRNA的瓊脂糖電泳分析。
圖2為HIF1-AS對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的特異性抑制作用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。根據(jù)HIF-1mRNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)和合成若干條HIF-1硫代AS-ODN，以脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞后，用Northern-blot和Wwstern-blot方法觀察于缺氧環(huán)境下HIF-1在HepG2中mRNA和蛋白的表達(dá)，篩選出有效的HIF-1mRNA AS-ODN序列。該反義序列是由20個(gè)核苷酸所構(gòu)成的短鏈寡聚脫氧核糖核酸。
實(shí)施例1 HIF-1mRNA反義寡核苷酸的制備采用AKTA Oligo Pilot II合成儀以DMT-ON形式自動(dòng)合成，合成過程中儀器自動(dòng)對(duì)每步合成的硫代率和偶聯(lián)率進(jìn)行檢測(cè)。合成完畢，每克合成產(chǎn)物加入30ml 25％濃氨水，60℃脫保護(hù)15h即得粗品溶液。粗品溶液使用陰離子交換HPLC一步純化法使脫DMT、分離及純化在同一柱上一次完成。純化產(chǎn)品經(jīng)反相柱脫鹽并用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙腈蒸除后，由冰凍干燥機(jī)凍干。
硫代寡核苷酸呈白色粉末狀，純度98.68％，易溶于水。
實(shí)施例2 HIF-1-AS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞中靶向mRNA的抑制作用實(shí)驗(yàn)程序?qū)⑷烁伟┘?xì)胞HepG2在含10％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含青、鏈霉素各100KU/L)，于37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，將HepG2細(xì)胞接種到6孔板(1×105細(xì)胞/孔/2ml)。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁且豐度達(dá)到40～60％時(shí)，進(jìn)行寡核酸的轉(zhuǎn)染，HIF-AS取二個(gè)濃度0.4、0.8umol/L，同時(shí)設(shè)置0.4umol/L正義鏈對(duì)照組。
六孔板轉(zhuǎn)染后維持缺氧狀態(tài)48h，按照TrizolRNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總的RNA，紫外分光光度計(jì)定量，OD260/280在1.8～2.0之間，RNA甲醛變性電泳顯示無降解，-70℃保存。
再通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA2ug RNA，0.5ug/mL oligodT 1ul，補(bǔ)水至9ul，70℃10min，立即冰上放置5min；然后加入逆轉(zhuǎn)錄體系(5×RT buffer4ul，25mM MgCl24ul，10mM dNTP 1ul，RNase 0.5ul，AMV 1.5U)補(bǔ)水至20ul，42℃1h，72℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
PCR反應(yīng)體系PCR mix 15ul，20umol/L，上、下游引物各0.5ul(見SEQID NO.2核苷酸序列(F)CATTACCCACCGCTGAAACGCC，SEQ ID NO.2核苷酸序列(R)CTGGGACTATTAGGCTCAGGTG)，cDNA 1ul，Taq酶0.5ul，去離子水補(bǔ)充至20ul。PCR擴(kuò)增條件94℃4分鐘，94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。進(jìn)行雙重PCR，以β-actin為內(nèi)參，產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖電泳。
分析HIF-1AS轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正義鏈對(duì)照組和突變鏈對(duì)照組。缺氧狀態(tài)維持48h后提取總的RNA反轉(zhuǎn)錄，并且以看家基因β-actin為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙重PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。參見圖1，正義鏈對(duì)HepG2細(xì)胞中HIF-1mRNA的表達(dá)沒有顯著影響，與反義鏈HIF-1AS相比具有顯著性差異；HIF-1AS可以顯著抑制相應(yīng)mRNA的表達(dá)，當(dāng)濃度達(dá)到0.4umol/L時(shí)對(duì)靶基因mRNA的抑制已經(jīng)趨于飽和，增加濃度到0.8umol/L時(shí)，mRNA的抑制沒有太大變化。圖1中，1和2是指HIF1-AS濃度分別為0.8umol/L和0.4umol/L，3是指正義鏈濃度為0.4umol/L，4是指人肝癌細(xì)胞HepG2，5為標(biāo)記，3-actin317bp，HIF1 195bp。
實(shí)施例3 HIF-1AS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)程序人肝癌HepG2細(xì)胞株用含10％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(含青、鏈霉素各100KU/L)培養(yǎng)，培養(yǎng)皿置于37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每三天換液一次，0.25％胰蛋白酶液消化，傳代和收集細(xì)胞。
取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用含10％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配制成2～2.5×104/ml濃度的細(xì)胞懸液，按每孔3000個(gè)細(xì)胞(100ul)加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁。
培養(yǎng)至細(xì)胞豐度達(dá)到40％～60％時(shí)，吸棄各孔中的培養(yǎng)液。在無血清無雙抗?fàn)顟B(tài)下，按脂質(zhì)體(Lipofectin)說明書進(jìn)行HIF-1AS的轉(zhuǎn)染。HIF-1AS設(shè)置0.2、0.4、0.8、1.0umol/L四個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)置正義鏈寡核苷酸0.4umol/L對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，吸棄各孔培養(yǎng)液，加入100ul含血清的正常培養(yǎng)液。置于37℃、5％CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。
繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入20ulMTS，置于37℃、5％CO2孵箱90分鐘后，用多功能酶標(biāo)儀(Wallac美國)在490nm測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。
分析參見圖2，HIF-1AS可以顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，當(dāng)濃度達(dá)到1.0umol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)89.66％；與正義鏈相比，相同濃度的HIF-1AS可以特異性的抑制HepG2細(xì)胞的增殖，具有顯著性差異；根據(jù)實(shí)驗(yàn)脂質(zhì)體對(duì)照組對(duì)細(xì)胞增殖基本沒有抑制左右。圖2中1、2、3、和4分別指HIF1-AS濃度為0.2umol/L，0.4umol/L，0.8umol/L和1.0umol/L，5是指正義鏈濃度為0.4umol/L，6是指脂質(zhì)體組。
以上對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>缺氧誘導(dǎo)因子1反義寡核苷酸及其用途<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1acgcagaata tattccatga 20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cattacccac cgctgaaacg cc22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgggactat taggctcagg tg2權(quán)利要求
1.一種缺氧誘導(dǎo)因子1的反義寡核苷酸，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列ACGCAGAATATATTCCATGAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺氧誘導(dǎo)因子1的反義寡核苷酸在制備抑制肝癌腫瘤血管生長藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺氧誘導(dǎo)因子1的反義寡核苷酸在制備抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的缺氧誘導(dǎo)因子1的反義寡核苷酸的應(yīng)用，其特征是所述的缺氧誘導(dǎo)因子1的反義寡核苷酸是與藥用敷料組合制成藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種HIF－1的反義寡核苷酸，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列ACGCAGAATATATTCCA TGAA。本發(fā)明的HIF－1反義寡核苷酸可以與HIF－1mRNA形成mRNA－DNA雜交雙鏈，有效地抑制缺氧條件下HIF－1mRNA的表達(dá)，且可以抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖。應(yīng)用本發(fā)明的反義寡核苷酸以HIF－1為靶點(diǎn)，可以抑制肝癌腫瘤血管生長，從而防治腫瘤的轉(zhuǎn)移。也可在制備抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1884295SQ200610052290
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月4日
發(fā)明者陳衛(wèi)星 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)