專利名稱：一種篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于螺旋藻開發(fā)應(yīng)用的技術(shù)背景技術(shù)螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍(lán)藻門(Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學(xué)研究，1997，15(4)369-374]，因其富含優(yōu)質(zhì)蛋白和多種生物活性物質(zhì)而受到國內(nèi)外的極大關(guān)注，目前已在大量研究的基礎(chǔ)上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，并應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥保健、飼料、精細(xì)化工等領(lǐng)域。該屬中的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是國內(nèi)外在商業(yè)化養(yǎng)殖生產(chǎn)與開發(fā)中應(yīng)用最廣泛的品種。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產(chǎn)實踐表明，鈍頂螺旋藻種下有許多品系，它們對溫度、光質(zhì)、光照強度，以及培養(yǎng)液的鹽度、pH和營養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要求與適應(yīng)性存有顯著差異[水生生物學(xué)報，1999，23(1)59-64]。目前國內(nèi)外幾乎都采用開放或半封閉、跑道型循環(huán)式培養(yǎng)池這一較粗放的養(yǎng)殖生產(chǎn)模式，許多環(huán)境因子，特別是溫度和光照強度，難以人為調(diào)控，有些鈍頂螺旋藻品系在實驗室或生產(chǎn)小試中雖然表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)性能，但進入生產(chǎn)池后，因難以適應(yīng)環(huán)境因子的較大變化而無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，選育品性兼優(yōu)的品系一直是螺旋藻養(yǎng)殖生產(chǎn)與開發(fā)中最重要的環(huán)節(jié)與技術(shù)要點之一。
目前國內(nèi)外適篩選合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的方法是，先在實驗室作多種環(huán)境因子交叉組合培養(yǎng)試驗，根據(jù)所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標(biāo)作初步篩選；再依次轉(zhuǎn)接到室外約5m2、50m2及500m2的培養(yǎng)池中于不同季節(jié)與氣候及營養(yǎng)條件下進行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗，進而篩選出優(yōu)良藻株。這一方法雖然實用，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。因此，迫切需要建立既實用，又簡便、耗時少、低成本的優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的篩選新方法，以滿足當(dāng)前國內(nèi)外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的實際需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種適合大規(guī)模生產(chǎn)的篩選優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的新方法。
16S-23S rRNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally Transcribed Spacer，ITS)是存在于所有生物基因組中的一類古老的序列。我們通過設(shè)計其特定的引物，利用PCR等分子生物學(xué)方法克隆并測定了7株鈍頂螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5、Sp-9、Sp-10和Sp-15的16S-23S rRNAITS序列，進而利用生物信息學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)等分析顯示，這7株品系的16S-23S rRNA ITS序列不盡相同，依據(jù)16S-23S rRNA ITS序列的相似程度，7株品系可以分為兩大類其中Sp-3、Sp-5和Sp-15為一類；Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10為另一類。長期的實驗研究與實踐表明，上述7株鈍頂螺旋藻品系在溫度、光照等環(huán)境因子能自動調(diào)控的實驗室培養(yǎng)試驗中均表現(xiàn)優(yōu)良，但只有Sp-3、Sp-5和Sp-15這3株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中也表現(xiàn)優(yōu)良，而Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種。由此可見，16S-23S rRNA ITS序列特征與螺旋藻生產(chǎn)性狀存在相關(guān)性，因此，16S-23S rRNA ITS序列有望作為篩選優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的分子標(biāo)記，即候選品系的16S-23S rRNA ITS序列若與Sp-3、Sp-5、Sp-15的聚成一類，則可能生產(chǎn)性狀優(yōu)良，適合大規(guī)模生產(chǎn)；若與Sp-1、Sp-2、Sp-9、Sp-10的聚成一類，則可能不可應(yīng)用于生產(chǎn)。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明所建立的篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單快速、標(biāo)準(zhǔn)明確，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。


圖1為7株品系的系統(tǒng)發(fā)生樹示意圖；圖2為10株品系的系統(tǒng)發(fā)生樹示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的技術(shù)方案可以通過以下步驟實現(xiàn)1、選用材料為公知的7株鈍頂節(jié)旋藻品系，即Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5、Sp-9、Sp-10和Sp-15(浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存)。其中，Sp-3、Sp-5和Sp-15對環(huán)境適應(yīng)能力強，在大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用，而Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種；2、試劑和儀器Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；克隆載體pMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成。其它試劑均為分析純。序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀；3、PCR引物設(shè)計與擴增利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件得到上游引物SF5′-TTAGGGAGACCTACTTCAGGACA-3′，下游引物SR5′-TACATTGGAATTGTCTTTACGA-3′。25μL PCR反應(yīng)體系中含引物PF和PR各0.5μmol/L，4種dNTP各1μmol/L，2.5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2.5μL，100ng基因組DNA[提取方法參考——海洋與湖沼，2002，33(2)203-208]。反應(yīng)程序94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 5min；4、PCR產(chǎn)物的克隆及測序?qū)⒔?jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1，藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質(zhì)粒進行測序。
5、序列比對與系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建多重序列比對采用Clustal X 1.81軟件，系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建采用Phylip 3.65軟件包，經(jīng)過比對，如果被篩選的鈍頂螺旋藻品系能與Sp-3、Sp-5和Sp-15三株聚成，則該品系性能優(yōu)良，適合大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖。
結(jié)果與分析基于16S-23S rRNA ITS序列的差異位點數(shù)分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5、Sp-9、Sp-10和Sp-15的基因組DNA分別經(jīng)16S-23S rRNA ITS序列的特定引物PCR擴增與克隆，并測得相應(yīng)的序列。如SEQNO1及SEQNO2的16S-23SrRNA ITS序列所示；運用Clustal X 1.81軟件對7株品系的16S-23S rRNA ITS序列作多重序列比對分析，并統(tǒng)計得到品系間堿基的差異位點數(shù)。由表1可知，Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10兩兩之間的差異位點數(shù)為0；Sp-3、Sp-5和Sp-15兩兩之間的差異位點數(shù)也為0；然而Sp-1、Sp-2、Sp-9、Sp-10這4個品系與Sp-3、Sp-5、Sp-15兩兩之間的差異位點數(shù)為46。進一步地，將上述7株品系的16S-23S rRNA ITS表1 7株品系的16S-23S rRNAITS序列的差異位點數(shù)

序列的多重序列比對結(jié)果導(dǎo)入Phylip 3.65軟件包的dnamlk程序進行系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建。結(jié)果如圖1所示，7株品系可分為兩大類Sp-3、Sp-5和Sp-15為一類；Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10為一類，這與上述差異位點數(shù)分析的結(jié)果相吻合。
長期的實驗研究表明，上述7株鈍頂螺旋藻品系在溫度、光照等環(huán)境因子能自動調(diào)控的實驗室培養(yǎng)試驗中均表現(xiàn)優(yōu)良，但只有Sp-3、Sp-5和Sp-15這3株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中運用得比較廣泛，而Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種。由此可見，16S-23S rRNA ITS序列特征與螺旋藻生產(chǎn)性狀存在相關(guān)性，因此，16S-23S rRNA ITS序列可以作為篩選優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的分子標(biāo)記，即候選品系的16S-23S rRNA ITS序列若與Sp-3、Sp-5、Sp-15的聚成一類，則可能生產(chǎn)性狀優(yōu)良；若與Sp-1、Sp-2、Sp-9、Sp-10的聚成一類，則可能不可應(yīng)用于生產(chǎn)。
作為實例，我們選取了Sp-6、Sp-12和Sp-16這3株品系來驗證本發(fā)明的實用性，其中，Sp-12和Sp-16這兩個品系是適用于大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖的良種，而Sp-6因適應(yīng)性差而不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。通過克隆并測定這3株品系的16S-23S rRNA ITS序列利用生物信息學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)等分析表明，如SEQNO2和附圖2所示，Sp-12和Sp-16的16S-23S rRNAITS序列與Sp-3、Sp-5和Sp-15的聚成一類，且序列完全一致，而Sp-6的16S-23S rRNA ITS序列與Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10的聚成一類，且序列完全一致。上述結(jié)果進一步說明，16S-23S rRNA ITS序列可以作為一種分子標(biāo)記來篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系。
SEQNO1 7株螺旋藻品系的16S-23S rRNAITS序列的多重序列比對分析結(jié)果其中Sp-1、Sp-2、Sp-9、Sp-10這4個品系與Sp-3、Sp-5、Sp-15兩兩之間的差異位點被標(biāo)下劃線；“*”表示7個品系的16S-23S rRNAITS序列的相同位點。
Sp-1 1 TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-2TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-9TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-10 TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-3TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCATSp-5TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCATSp-15 TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCAT***************** ** **** ** * * ** ******* *************Sp-1 61 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-2CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-9CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-10 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTA
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Sp-10CTGTAGATGTTAATCTAGGACTAGATAGCTGGACATAAGTTCCAGTCAGAACCTTGAAAASp-3 CTTTAGATGTTAGTCTGAGATTGGATAGCTGGACATCTGTTCCAGTCAGAACCTTGAAAASp-5 CTTTAGATGTTAGTCTGAGATTGGATAGCTGGACATCTGTTCCAGTCAGAACCTTGAAAASp-15CTTTAGATGTTAGTCTGAGATTGGATAGCTGGACATCTGTTCCAGTCAGAACCTTGAAAA** ********* *** ** * ************* **********************Sp-1 421 CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTASp-2 CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTASp-9 CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTASp-10CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTASp-3 CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTASp-5 CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTASp-15CTGCATAGAGAAAAGCATAATGGTGTAGGAAAACGTCGTAAAGACAATTCCAATGTA*********************************************************SEQNO2 該10株螺旋藻品系的16S-23S rRNAITS序列的多重序列比對分析結(jié)果Sp-6 1 TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-1 TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-2 TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-9 TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-10TTAGGGAGACCTACTTCAGGACATCGTGCGATGATAATAATAGCCGAGTCTTGAGGTCATSp-3 TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCATSp-5 TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCATSp-15TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCATSp-12TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCATSp-16TTAGGGAGACCTACTTCGAGATATCGCGCCTTAACAACTATAGCCGTGTCTTGAGGTCAT***************** ** **** ** * * ** ******* *************Sp-6 61 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-1 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-2 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-9 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-10CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-3 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-5 CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-15CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-12CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTASp-16CCTTAGGTCGGATGGGGCGGTCAGAGAGCTTTCAAACTTTAGGGTTCGTGTTATGGGCTA************************************************************Sp-6 121 TTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCCCTGGTTCAAGTCCAGGSp-1 TTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCCCTGGTTCAAGTCCAGG
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權(quán)利要求
1.一種篩選優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的方法，其特征是7株鈍頂螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5、Sp-9、Sp-10、Sp-15具有SEQNO1的16S-23S rRNA ITS序列；將候選品系的16S-23SrRNA ITS序列與上述品系序列多重比對，篩選優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系。
2.按權(quán)利要求1所述篩選優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的方法，其特征是采用下列操作步驟(1)選用材料為7株鈍頂節(jié)旋藻品系，即Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5、Sp-9、Sp-10和Sp-15其中，Sp-3、Sp-5和Sp-15對環(huán)境適應(yīng)能力強，在大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用，而Sp-1、Sp-2、Sp-9和Sp-10因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種；(2)試劑和儀器Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；克隆載體pMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成，其它試劑均為分析純，序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀；(3)PCR引物設(shè)計與擴增利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件得到上游引物SF5′-TTAGGGAGACCTACTTCAGGACA-3′，下游引物SR5′-TACATTGGAATTGTCTTTACGA-3′，25μL PCR反應(yīng)體系中含引物PF和PR各0.5μmol/L，4種dNTP各1μmol/L，2.5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2.5μL，100ng基因組DNA，反應(yīng)程序94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 5min；(4)PCR產(chǎn)物的克隆及測序?qū)⒔?jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1，藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質(zhì)粒進行測序，如表SEQNO1及表SEQNO2的16S-23S rRNA ITS序列所示；(5)序列比對與系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建多重序列比對采用Clustal X 1.81軟件，系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建采用Phylip 3.65軟件包，經(jīng)過比對，如果被篩選的鈍頂螺旋藻品系能與Sp-3、Sp-5和Sp-15三株聚成一類，則該品系性能優(yōu)良，適合大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖。
全文摘要
一種篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)螺旋藻品系的方法。通過設(shè)計16S－23S rRNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的引物，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆并測定7株鈍頂螺旋藻品系Sp－1、Sp－2、Sp－3、Sp－5、Sp－9、Sp－10和Sp－15的16S－23S rRNAITS序列SEQ NO1。依據(jù)各序列的相似程度，將7株品系中Sp－3、Sp－5和Sp－15分一類；Sp－1、Sp－2、Sp－9和Sp－10分為另一類；再將候選品系的16S－23SrRNAITS序列進行比對，若與Sp－3、Sp－5、Sp－15聚成一類，則性狀優(yōu)良，適合大規(guī)模生產(chǎn)；若與Sp－1、Sp－2、Sp－9、Sp－10聚成一類則不可應(yīng)用于生產(chǎn)開發(fā)。
文檔編號C12Q1/68GK1900315SQ20061005223
公開日2007年1月24日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者汪志平, 楊靈勇, 陳曉燕, 李雪斌 申請人:浙江大學(xué)