專利名稱：藻紅蛋白、晶體生產(chǎn)工藝及制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白、晶體制造工藝及制品，尤其涉及的是在一般條件下從藻類中提取的能發(fā)射強(qiáng)烈熒光的藻紅蛋白并將其轉(zhuǎn)化為晶體形態(tài)，并在科研、醫(yī)療、檢測(cè)、信電等領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
早在上個(gè)世紀(jì)初，國外就曾報(bào)道在藍(lán)藻和紅藻中存在具有強(qiáng)烈熒光性的紅色、紫羅蘭色和藍(lán)色蛋白質(zhì)。1910年，Kylin首次將這些色素蛋白定名為“藻色蛋白”(Phycochromo-proteins)。這種大量出現(xiàn)于紅藻，藍(lán)綠藻和隱藻中的捕光色素蛋白，就是目前亟待開發(fā)的藻膽蛋白(Phycobiliproteins，PBP)，它主要包括藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)，藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)，藻紅藍(lán)蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)四種。藻膽蛋白把捕獲的光能高效的傳遞給葉綠素，從而使藻類的光合作用得以發(fā)生。
與化學(xué)合成的熒光染料相比，藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)純天然來源，資源豐富，物理性質(zhì)穩(wěn)定，水溶性好，不與蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等發(fā)生非特異性吸附，安全且無毒性，對(duì)生態(tài)環(huán)境無污染。另外藻紅蛋白摩爾吸光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高，熒光發(fā)射波長大于550納米(nm)，強(qiáng)烈吸收光譜帶很寬，有利于選擇激發(fā)光源，克服了傳統(tǒng)熒光標(biāo)記物熒光背景大、易淬滅等缺點(diǎn)，大大提高了熒光檢測(cè)的靈敏性。
中國專利申請(qǐng)(01115003.3)公開了一種“R-藻紅蛋白在制備光療腫瘤的光敏劑中的應(yīng)用”。該發(fā)明采用體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，研究藻紅蛋白的光敏效應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的光敏殺傷作用。雖然在實(shí)驗(yàn)過程該發(fā)明具有殺滅和抑制腫瘤細(xì)胞作用，但是由于實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要求的條件比較苛刻，或許細(xì)胞培養(yǎng)液條件的不同而使細(xì)胞的死亡。而中國專利申請(qǐng)(02150927.1)公開了一種“熒光藻藍(lán)蛋白與熒光藻紅蛋白及其應(yīng)用”。該藻藍(lán)蛋白與藻紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)為通過硫醚鍵連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)——開鏈線性延展的四吡咯化合物，是從藻類中提取純化的，在適宜波長激發(fā)下能發(fā)射強(qiáng)烈熒光。該發(fā)明還公開了一系列該熒光藻藍(lán)蛋白與熒光藻紅蛋白的用途，包括在熒光檢測(cè)及免疫分析方面的用途，在制備抗癌抗腫瘤藥物或食物方面的用途，在制備抗輻射增強(qiáng)免疫力消炎藥物或食物方面的用途，在制備光子開關(guān)方面的用途，以及在制備食品或化妝品添加劑方面的用途。但是由于該藻紅蛋白是以凍干粉或者沉淀形式的存在，在一般的蛋白質(zhì)保藏條件下很容易失活，當(dāng)受到某些物理或化學(xué)因素作用時(shí)，容易引起生物活性的喪失，不能長期應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供制備藻紅蛋白溶液的方法，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比；只需通過兩種填充介質(zhì)的柱層析就能制備出不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供藻紅蛋白晶體的制備方法，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比；在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就可以完成，簡單易行。
本發(fā)明還針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的蛋白質(zhì)處在凍干粉狀態(tài)或者沉淀狀態(tài)，不能長期保存，生物活性容易喪失，不能長期利用，熒光活性低的缺點(diǎn)；提供一種能長期保存，所需的保藏條件要求小，熒光活性高的藻紅蛋白晶體。
本發(fā)明的上述技術(shù)問題主要是通過下述技術(shù)方案得以解決的一種藻紅蛋白溶液的制備方法，其特征在于，將藻細(xì)胞破碎后，通過過濾和高速冷凍離心分離，去除沉淀，收集上清，分級(jí)鹽析后收集藻紅蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液后依次經(jīng)過羥基磷灰石、葡聚糖凝膠Sephadex G-150(或Sephadex G-200)、羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石柱層析時(shí)使用濃度范圍為0.005-0.1摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫，控制流速在0.5-2.5毫升/分鐘，最后收集A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5、A565/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的藻紅蛋白溶液，制成不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
作為優(yōu)選，所述制備藻紅蛋白溶液的方法，其特征在于，所述藻紅蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用濃度范圍為0.005-0.05摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫。
作為優(yōu)選，所述制備藻紅蛋白溶液的方法，其特征在于，所述藻紅蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫流速控制在1.0-2.0毫升/分鐘。
《水生生物學(xué)報(bào)》在1996年第20卷第3期曾發(fā)表一篇《Rhodosorusmarinus中藻紅蛋白的純化及其性質(zhì)的研究》的文獻(xiàn)。文獻(xiàn)中藻紅蛋白的純化是將細(xì)胞破碎抽提液經(jīng)過兩次DEAE-52纖維素柱和兩次Bio-gelp300柱，收集到的藻紅蛋白最高純度僅為4.7；與之相比，本發(fā)明藻紅蛋白的純化是將細(xì)胞破碎抽提液經(jīng)過一次HA柱再過Sephadex G-100(或Sephadex G-200)，然后在過一次HA柱，操作過程簡單，生產(chǎn)周期較短，生產(chǎn)成本低，同時(shí)可以得到A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5、A565/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的藻紅蛋白溶液，制成不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液制品；制成的藻紅蛋白溶液產(chǎn)品性能更好，純度更高，更重要的是生產(chǎn)工藝非常簡單。
一種藻紅蛋白制備成晶體的方法，其特征在于，將一定純度的藻紅蛋白放在閉光封閉的環(huán)境中，加入0.05-0.2％氯化鎂和2-4％氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值使其在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.5～7.4的范圍內(nèi)，并線性梯度地加入硫酸銨并輕微攪動(dòng)，使其轉(zhuǎn)變成粗晶體，通過重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。晶體產(chǎn)品極大提高了藻紅蛋白的穩(wěn)定性，更大限度地提高產(chǎn)品的純度和保持產(chǎn)品的高生物活性。
作為優(yōu)選，所述的藻紅蛋白制備成晶體的方法，其特征在于，所述的在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.8～7.2的范圍內(nèi)。
一種藻紅蛋白晶體，分子結(jié)構(gòu)為通過硫醚鍵連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)—開鏈線性延展的四吡咯化合物，脫輔蛋白單體由α、β、γ三種亞基組成，在適宜波長激發(fā)下能發(fā)射強(qiáng)烈熒光，特征吸收峰為560～570納米(nm)，熒光激發(fā)峰為480～500納米(nm)，熒光發(fā)射峰為575～580納米(nm)。其特征在于所述的藻紅蛋白為晶體結(jié)構(gòu)。
作為優(yōu)選，所述的藻紅蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8埃()，c＝60.1埃()，α＝β＝γ＝90°。
通過分子替代的方法，使用藻藍(lán)蛋白(CPC)分子作為模型和精確的1.9埃()分辨率，測(cè)定藻紅蛋白晶體的結(jié)構(gòu)，雖然晶胞的參數(shù)是非常相似的和蛋白內(nèi)部的螺旋組成幾乎相同，但是藻藍(lán)蛋白(CPC)和藻紅蛋白晶體的組裝有很大的不同，六棱柱圍繞z軸旋轉(zhuǎn)-40度，因此，不同的欄間空白之間聯(lián)系形成了。由于柱子近似圓柱對(duì)稱，不同的組裝排列能夠容納在一個(gè)相似的晶胞內(nèi)。
作為優(yōu)選，所述的藻紅蛋白晶體的組裝為發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。
藻紅蛋白晶體的組裝有一個(gè)顯著的特征，發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。藻紅蛋白晶體的組裝使得位于β亞基的B50/61位點(diǎn)的藻尿膽素可能靠近位于相對(duì)稱的α亞基A139位點(diǎn)的藻紅膽素，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)重心之間的距離約13.0，相互方向基本垂直，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素K139和相對(duì)稱的β亞基藻紅膽素L158，兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間最近的距離是3.4，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的平行排列使得它們重心之間的距離有20.3。更多的，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素K139和相對(duì)稱的β亞基藻尿膽素L50/61，它們重心之間的距離是16.5，相互方向基本垂直，因此，藻紅蛋白晶體組裝在晶態(tài)條件下使得激發(fā)子相互作用成為可能。
作為優(yōu)選，所述的藻紅蛋白晶體的特征吸收峰為565納米(nm)，熒光激發(fā)峰為495納米(nm)，熒光發(fā)射峰為576納米(nm)。
本發(fā)明藻紅蛋白晶體具有能夠長期保存，所需的保藏條件要求小，熒光活性高的的特點(diǎn)，其制作方法在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就可以完成，簡單易行。并在科研、醫(yī)療、檢測(cè)、信電等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。


圖1為構(gòu)成藻紅蛋白晶體的藻紅膽素(Cys-PEB)的結(jié)構(gòu)式。
圖2為構(gòu)成藻紅蛋白晶體的藻尿膽素(PUB)的結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式
以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藻紅蛋白晶體的有益效果。
試驗(yàn)例1藻紅蛋白晶體在熒光檢測(cè)方面的應(yīng)用1.藻紅蛋白晶體與親和素的交聯(lián)制成熒光探針試驗(yàn)材料選本發(fā)明的藻紅蛋白晶體，分子量約229000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)，分子量312道爾頓；二硫代蘇糖醇(DTT)，分子量154道爾頓。
試驗(yàn)方法1)藻紅蛋白的衍生化取4.58毫克藻紅蛋白晶體溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與藻紅蛋白摩爾比約為10，常溫反應(yīng)150分鐘，經(jīng)葡聚糖(Sephadex G-50)凝膠層析柱(Φ1×17厘米)脫鹽，磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡和洗脫，收集藻紅蛋白溶液峰。
2)親和素的巰基化1毫升親和素(約2毫克/毫升，溶解于含有0.1摩爾/升氯化鈉、pH7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液中)，加入25微升上述3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與親和素摩爾比約為10，常溫反應(yīng)60分鐘，加入二硫蘇糖醇(DTT)使得其終濃度為25微摩爾/升，常溫反應(yīng)90分鐘，同上過葡聚糖凝膠層析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。
3)藻紅蛋白與親和素的交聯(lián)取衍生化的藻紅蛋白與巰基化的親和素混合，搖床低速(小于20轉(zhuǎn)/分鐘)振蕩，4℃反應(yīng)過夜。
4)停止反應(yīng)第3)步反應(yīng)溶液中加入100微升的50毫摩爾/升碘乙酸鈉封閉殘余巰基，常溫反應(yīng)30分鐘。
5)產(chǎn)物的純化第4)步產(chǎn)物經(jīng)丙烯葡聚糖(Sephacryl S-300HR)凝膠柱層析，收集第一個(gè)蛋白峰即為熒光藻紅蛋白標(biāo)記制品。
6)保存藻紅蛋白標(biāo)記制品，最后溶于磷酸鹽緩沖液(含有0.1摩爾/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩爾/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮化鈉(NaN3))，0～5℃保存。
2.藻紅蛋白標(biāo)記蛋白A試驗(yàn)材料藻紅蛋白晶體，分子量約229000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液；二硫蘇糖醇(DTT)pH7.4緩沖液；蛋白A；乙二胺四乙酸(DETA)；碘乙酰胺。
試驗(yàn)方法1)、藻紅蛋白的衍生化取4.58毫克藻紅蛋白晶體溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與藻紅蛋白摩爾比約為10，常溫反應(yīng)60分鐘，經(jīng)葡聚糖(SephadexG-50)凝膠層析脫鹽(Φ1×17厘米)，磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡和洗脫，收集藻紅蛋白溶液峰。
2)、蛋白A的巰基化0.5毫升蛋白A(2毫克/毫升)100mmol/L PBS(含有100mmol/L NaCl)pH7.4，加入上述3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)無水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)與蛋白摩爾比約為10，常溫反應(yīng)40分鐘，加入二硫蘇糖醇(DTT)使得其終濃度為25微摩爾/升，常溫反應(yīng)25分鐘，同上過葡聚糖凝膠層析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。
3)、藻紅蛋白與蛋白A的交聯(lián)取0.77毫克/毫升衍生化的熒光藻紅蛋白與0.27毫克/毫升巰基化的蛋白A等量混合，搖床低速(小于20轉(zhuǎn)/分鐘)振蕩，4℃反應(yīng)過夜。
藻紅蛋白標(biāo)記制品，最后溶于磷酸鹽緩沖液(含有0.1摩爾/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩爾/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮化鈉(NaN3))，0～5℃保存。
使用藻紅蛋白晶體標(biāo)記親和素和蛋白A的標(biāo)記率均在60％以上，而使用藻紅蛋白凍干粉或沉淀標(biāo)記親和素的標(biāo)記率一般為40％-50％，結(jié)果表明，使用藻紅蛋白晶體進(jìn)行分子標(biāo)記的效果明顯優(yōu)于藻紅蛋白凍干粉或沉淀的標(biāo)記。
試驗(yàn)例2藻紅蛋白晶體在免疫分析方面的應(yīng)用。
藻紅蛋白與抗體的交聯(lián)試驗(yàn)材料選本發(fā)明的藻紅蛋白晶體分子量約229000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖液(PBS)；PD-10柱(葡聚糖凝膠層析柱SephadexG-25M)，安瑪西亞Amersham公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)No.17-0851-01；NAP5柱(葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-25 DNA grade)，安瑪西亞Amersham公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)No 17-0853-02；琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Pierce公司，產(chǎn)品目錄號(hào)No.22360；N-乙基馬來酰胺(NEM)，Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)E-1271；二甲基亞砜(DMSO)，Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)No.27，685-5。
試驗(yàn)方法1)、藻紅蛋白晶體的預(yù)處理將藻紅蛋白晶體溶于1.0毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中，于透析緩沖液中透析除鹽。透析后的藻紅蛋白濃度調(diào)整到5-10毫克/毫升為宜。
2)、藻紅蛋白的衍生化將琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于無水二甲基亞砜(DMSO)配制成10毫克/毫升的母液，每毫克的藻紅蛋白添加11微升的琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60分鐘，使藻紅蛋白分子上的氨基與琥珀酰胺反應(yīng)生成衍生化的藻紅蛋白。
交換緩沖液預(yù)先平衡凝膠柱，將衍生化的藻紅蛋白過柱。
3)、抗體的處理二硫蘇糖醇(DTT)溶解于蒸餾水中，配制成1摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)母液，調(diào)整抗體的濃度，使其濃度至少為4毫克/毫升。
每毫升抗體溶液中加入20微升的二硫蘇糖醇(DTT)母液，室溫靜置反應(yīng)30分鐘，將抗體的二硫鍵打開形成巰基。
交換緩沖液預(yù)先平衡凝膠柱，將反應(yīng)液過柱，收集抗體部分。
4)、藻紅蛋白和抗體的共價(jià)交聯(lián)每毫克抗體加入3.2毫克的琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的藻紅蛋白，鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60分鐘，使藻紅蛋白分子上的馬來酰亞胺基和抗體上的巰基實(shí)現(xiàn)共價(jià)交聯(lián)。
10毫克的N-乙基馬來酰胺(NEM)溶解于1.0毫升的無水二甲基亞砜(DMSO)中制成N-乙基馬來酰胺(NEM)母液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
每毫克抗體中加入3.4微升N-乙基馬來酰胺(NEM)母液，鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)后，使抗體上的巰基封閉。
5)、交聯(lián)物的存儲(chǔ)將交聯(lián)物于存儲(chǔ)緩沖液中透析后保存于冰箱。
結(jié)果表明，當(dāng)使用藻紅蛋白的沉淀產(chǎn)品來實(shí)現(xiàn)該用途時(shí)，由于沉淀產(chǎn)品只是蛋白的硫酸銨沉淀物，在使用中存在一定的局限性和缺點(diǎn)，不能保證在實(shí)施熒光檢測(cè)及免疫分析標(biāo)記前藻紅蛋白的同一性，故對(duì)分析結(jié)果的精準(zhǔn)性產(chǎn)生一定影響。用藻紅蛋白的晶體來實(shí)現(xiàn)該用途，更好地解決了藻紅蛋白在此領(lǐng)域的缺陷，使標(biāo)記和分析更加精準(zhǔn)。將藻紅蛋白的晶體用于熒光檢測(cè)及免疫分析，或與其他物質(zhì)如抗體、生物素、親合素、免疫蛋白等結(jié)合，制成熒光探針或熒光標(biāo)記用于熒光檢測(cè)及分析。通過檢測(cè)其發(fā)出的熒光，可以用于熒光顯微檢測(cè)、熒光免疫測(cè)定、雙色或多色熒光分析、癌細(xì)胞表面抗原檢測(cè)、疾病檢測(cè)診斷、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分析。
試驗(yàn)例3藻紅蛋白晶體用于疾病的治療與預(yù)防。
試驗(yàn)材料選本發(fā)明的藻紅蛋白晶體分子量約229000道爾頓。
抑制腫瘤細(xì)胞生長運(yùn)用半固體瓊脂培養(yǎng)法和溴化3-(4，5)-二甲基-2-噻唑基-2，5二苯基四氮唑(噻唑藍(lán)，MTT)檢測(cè)法測(cè)定了藻紅蛋白晶體對(duì)人血癌細(xì)胞株HL-60，K-562和U-937生長的影響。體外培養(yǎng)條件下用不同濃度的藻紅蛋白晶體處理這3種腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示藻紅蛋白晶體對(duì)這三種腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，并存在濃度劑量效應(yīng)，高濃度抑制作用強(qiáng)。
(1)在較高濃度(100微克/毫升)時(shí)對(duì)HL-60細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用；(2)在濃度(100微克/毫升和30微克/毫升)時(shí)對(duì)K-562細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用；(3)在濃度(100微克/毫升)時(shí)對(duì)U-937細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用。
抗輻射作用從藻紅蛋白晶體抗輻射作用的機(jī)理來看，造血干細(xì)胞的損傷和恢復(fù)在造血型放射病中起著重要的作用，降低造血干細(xì)胞的放射敏感性或防止照射動(dòng)物體內(nèi)存活干細(xì)胞的繼續(xù)減少，促使其提前進(jìn)入增殖期，對(duì)照射動(dòng)物造血功能的恢復(fù)將起到有益的作用。預(yù)防性的給小鼠腹腔注射熒光藻紅蛋白晶體的溶解液，能顯著減輕輻射對(duì)小鼠外周血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的損傷，可促進(jìn)小鼠外周白細(xì)胞的恢復(fù)，亦能促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞、粒單系祖細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞的恢復(fù)和增殖。
免疫功能給注射有肝腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)小白鼠口服藻紅蛋白晶體后，實(shí)驗(yàn)組的小白鼠比對(duì)照組的小白鼠的成活率明顯提高；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的小白鼠的淋巴細(xì)胞活性明顯高于對(duì)照組以及正常小白鼠。因此，藻紅蛋白晶體能提高免疫系統(tǒng)功能，以抵抗各種疾病。
表1不同劑量組的藻紅蛋白晶體的治療效果

人類T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的受體，因此，綿羊紅細(xì)胞能粘于T細(xì)胞的周圍，形成玫瑰花樣的細(xì)胞團(tuán)，故名E玫瑰花形試驗(yàn)，形成此種玫瑰花結(jié)的T細(xì)胞稱為紅細(xì)胞玫瑰花形成細(xì)胞。人體T淋巴細(xì)胞E花環(huán)實(shí)驗(yàn)是鑒定與計(jì)數(shù)人外周血T淋巴細(xì)胞的功能和數(shù)量的常用方法，特別是活性細(xì)胞玫瑰花形成細(xì)胞(EaRFC)是一組對(duì)SRBC具有高度親和力的T細(xì)胞特殊亞組，是T細(xì)胞中具有免疫活性功能的效應(yīng)細(xì)胞。藻紅蛋白晶體能夠促進(jìn)PHA(Phytohemagglutinin，植物血球凝集素)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，能恢復(fù)T細(xì)胞受環(huán)磷酰胺損傷后E玫瑰花環(huán)形成能力，特別是對(duì)活性E花環(huán)(Ea)的形成能力有較好的恢復(fù)作用。因此藻紅蛋白晶體能提高免疫系統(tǒng)功能，以抵抗各種疾病。
消炎作用藻紅蛋白晶體具有強(qiáng)抗氧化性，是一種活性氧自由基消除劑，在一定程度上具有消炎作用。
藻紅蛋白晶體能消除葡萄糖氧化酶引起的炎癥。
藻紅蛋白晶體具有護(hù)肝功效能抑制Fe3+-抗壞血酸誘導(dǎo)的肝臟微粒體脂過氧化作用?？诜?0-300毫克/千克劑量的藻紅蛋白晶體即能產(chǎn)生明顯的消炎作用。其消炎活性不依賴于皮質(zhì)類固醇的釋放。且對(duì)急、慢性炎癥組織都有作用。
藻紅蛋白晶體能抑制紅細(xì)胞的裂解，其作用方式與trolox(維生素E類似物)和抗壞血酸(維生素C)的作用方式相同，但抗氧化性較trolox強(qiáng)16倍，較維生素C強(qiáng)20倍。藻紅蛋白晶體能通過消除水相中的過氧化物自由基來防止其誘導(dǎo)的紅細(xì)胞裂解。
總之，炎癥代謝產(chǎn)物，如白細(xì)胞三烯、氧自由基等能誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移進(jìn)入組織或黏附于血管內(nèi)皮，而中性白細(xì)胞的黏附和浸潤是炎癥反應(yīng)的核心。在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中，藻紅蛋白晶體通過清除活性氧物質(zhì)(ROS)，例如羥自由基(OH·)、烷氧自由基(RO·)和超氧化物自由基等，在一定程度上起到緩解炎癥的作用。
藻紅蛋白晶體用于直腸癌輔助治療常用的放療化療方法，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)人體正常組織大量殺傷，造成病人身體虛弱痛苦，易由于免疫力下降引發(fā)其他疾病。將具有抗癌、抗輻射、增強(qiáng)免疫力作用的藻紅蛋白晶體用于癌癥病人的輔助治療，可以起到良好的治療、恢復(fù)作用。
直腸癌病人術(shù)前放射治療采取俯臥位3-射野技術(shù)。放療總劑量為45Gy，每周5次，每次1.8Gy。全身化療靜脈滴入四氫葉酸同時(shí)進(jìn)行。
放療化療完成后四～六周，病人連續(xù)服用藻紅蛋白晶體1克/天，結(jié)果顯示癌細(xì)胞大量壞死，腫瘤直徑縮小40％，白細(xì)胞總數(shù)迅速上升，受損正常組織得到恢復(fù)，造血旺盛，免疫力上升。
放療化療完成后四～六周的病人分為2小組，每組125人，I組使用藻紅蛋白晶體，II組作為對(duì)照組半個(gè)月后進(jìn)行觀察。
從表2的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可以看出藻紅蛋白晶體用于直腸癌輔助治療方面明顯好于對(duì)照組(p＜0.01)表2兩種藥物治療結(jié)果比較

注藻紅蛋白晶體組和對(duì)照組相比X2＝67.7，P＜0.01。說明藻紅蛋白晶體與對(duì)照組相比有顯差別，說明藻紅蛋白晶體用于直腸癌輔助治療方面有很好的療效。
藻紅蛋白晶體抗癌的機(jī)理抗癌機(jī)制藻紅蛋白能被腫瘤細(xì)胞選擇性吸收到細(xì)胞膜中。根據(jù)對(duì)K-562細(xì)胞的作用研究發(fā)現(xiàn)，藻紅蛋白能引起原癌基因(c-myc)的含量的增高，而對(duì)BCL-2的表達(dá)量沒有影響。因此可見是原癌基因(c-myc)表達(dá)量的增高引起了細(xì)胞的凋亡，或存在另一種途徑抑制了K-562細(xì)胞的生長，從而達(dá)到抗癌的效果。藻紅蛋白可作為一種DNA穩(wěn)定因子起作用，通過影響合成DNA和RNA的機(jī)制，來抑制腫瘤細(xì)胞生長，或以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信息分子的改變來達(dá)到抗癌效果。
以上機(jī)理表明可以將藻紅蛋白晶體作為一種功效成分制成藥物或食物，用于癌癥、腫瘤疾病的治療與預(yù)防。
結(jié)果表明藻紅蛋白晶體不僅可以制備抗癌抗腫瘤藥物，還可將藻紅蛋白晶體作為一種功效成分或中間體，制備成藥物或食物用于癌癥、腫瘤的預(yù)防與治療；又可將藻紅蛋白晶體作為一種功效成分或中間體，制備成藥物或食物用于抗輻射、增強(qiáng)免疫力或消炎。
試驗(yàn)例5三種不同的藻紅蛋白狀態(tài)下的穩(wěn)定性之間的比較試驗(yàn)材料藻紅蛋白沉淀、藻紅蛋白凍干粉、藻紅蛋白晶體。
試驗(yàn)方法藻紅蛋白沉淀的適宜保存方法為4℃條件下，懸浮于150mM磷酸鈉，60％硫酸銨，pH7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中；藻紅蛋白凍干粉的適宜保存方法為4℃條件下保存。
本發(fā)明藻紅蛋白晶體的適宜保存方法為4℃條件下，懸浮于150mM磷酸鈉，60％硫酸銨，pH7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中。
將藻紅蛋白沉淀、凍干粉和晶體三種形態(tài)的產(chǎn)品于各自的適宜保存條件下保存，不同的保存時(shí)間取出，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成濃度為100ug/L的藻紅蛋白溶液，測(cè)定565納米波長下的吸光光度值，計(jì)算出相對(duì)吸光值。
表3三種不同的藻紅蛋白狀態(tài)下的穩(wěn)定性之間的比較 藻紅蛋白晶體在其適宜的條件下保存兩年后，相對(duì)吸光光度值的無變化，而藻紅蛋白以沉淀和凍干粉的形態(tài)保存兩年后，相對(duì)吸光光度值的降低量分別為65％和30％，這表明藻紅蛋白以晶體的形態(tài)保存明顯優(yōu)于沉淀和凍干粉形態(tài)。分析其原因，藻紅蛋白以晶體形態(tài)存在時(shí)，藻紅蛋白分子按照特定的規(guī)律排列于晶胞中，色素基團(tuán)包被于藻紅蛋白分子內(nèi)而受到保護(hù)，不易被氧化和微生物降解；而藻紅蛋白以沉淀和凍干粉的形態(tài)保存時(shí)，藻紅蛋白的分子為無序排列，色素蛋白大量暴露于分子外圍，容易被氧化或微生物降解而導(dǎo)致藻紅蛋白的變性，導(dǎo)致藻紅蛋白在565納米波長下的吸光光度值的降低。
實(shí)施例11、藻紅蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取適量藻紅蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻類)，用蒸餾水清洗兩次，于0℃條件下用組織破碎機(jī)研碎，置入燒杯中，加入pH值6.5、濃度0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)，攪拌均勻。于冰浴中1200W超聲破碎60分鐘，將破碎好的粗液于低溫條件下(0℃)靜置10小時(shí)，然后用至少三層的紗布過濾三次，去除大的細(xì)胞組織碎片，濾液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，8000轉(zhuǎn)/分鐘0℃下離心60分鐘，去掉沉淀，收集上清液；硫酸銨分級(jí)鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到30％飽和度，10℃的條件下靜置10小時(shí)，6000轉(zhuǎn)/分鐘0℃下離心60分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，0℃靜置10小時(shí)，6000轉(zhuǎn)/分鐘0℃離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.5)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為5毫升，然后以0.005-0.1摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH6.5，含0.1摩爾/升氯化鈉)洗脫，流速為2.5毫升/分鐘，洗脫總體積為1000毫升。用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液。對(duì)各管進(jìn)行光譜測(cè)定，將藻紅蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，加入固體硫酸銨至80％飽和度，于0℃條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-150)凝膠柱層析上述純化收集的藻紅蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)凝膠柱上，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值6.5)洗脫，控制流速在5毫升/分鐘，收集A565/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的藻紅蛋白合并，以6000轉(zhuǎn)/分鐘0℃下離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.5)溶解，在0.005摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中充分透析。將透析后的藻紅蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時(shí)相同，洗脫體積為1000毫升，收集A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5和A565/A280＞5.0的部分，制得不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
2.藻紅蛋白晶體的制備將A565/A280＞4.0、4.5或A565/A280＞5.0的藻紅蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動(dòng)調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH6.5。
將固體硫酸銨溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2微米的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛藻紅蛋白溶液中，并輕微攪動(dòng)，使溶液混合均勻，流速控制在1毫升/6分鐘，直到溶液中的藻紅蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(0℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用65％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的熒光藻紅蛋白晶體溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
將晶體產(chǎn)品存放于65％飽和度的硫酸銨磷酸鹽緩沖液溶液中，加入微量防腐劑(0.1％疊氮化鈉(NaN3))，于0℃條件下長期保存。
3.藻紅蛋白結(jié)構(gòu)的確定從條斑紫菜中分離得到的藻紅蛋白屬于藻膽蛋白的一種，它由α、β、γ三種亞基組成，其分子量分別是17000道爾頓、18000道爾頓和31700道爾頓。條斑紫菜中藻紅蛋白主要以穩(wěn)定的六聚體(αβ)6γ的形式存在，分子量為229000道爾頓。α亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)，β亞基含有1個(gè)藻紅膽素(PEB)和0.5個(gè)藻尿膽素(PUB)，γ亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)和3個(gè)藻尿膽素(PUB)。其發(fā)色基團(tuán)藻紅膽素(PEB)的殘基與脫輔基蛋白上的半胱氨酸通過硫醚鍵共價(jià)結(jié)合，其連接位點(diǎn)在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。
條斑紫菜藻紅蛋白在可見光區(qū)的495納米和565納米處有特征吸收峰，以565納米處為最大吸收峰。熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。條斑紫菜藻紅蛋白等電點(diǎn)約為4.2。
4.藻紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定藻紅蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通過分子替代的方法，使用藻藍(lán)蛋白分子作為模型和精確的1.9埃分別率，測(cè)定紅藻藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)，雖然晶胞的參數(shù)是非常相似的和蛋白內(nèi)部的螺旋組成幾乎相同，但是藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白晶體的組裝有很大的不同，六棱柱圍繞z軸旋轉(zhuǎn)-40度，因此，不同的欄間空白之間聯(lián)系形成了。由于柱子近似圓柱對(duì)稱，不同的組裝排列能夠容納在一個(gè)相似的晶胞內(nèi)。藻紅蛋白晶體的組裝有一個(gè)顯著的特征，發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。藻紅蛋白晶體的組裝使得位于β亞基的B50/61位點(diǎn)的藻尿膽素(PUB)可能靠近位于相對(duì)稱的α亞基A139位點(diǎn)的藻紅膽素(PEB)，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)重心之間的距離約13.0埃，相互方向基本垂直，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻紅膽素(PEB)L158，兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間最近的距離是3.4埃，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的平行排列使得它們重心之間的距離有20.3埃。更多的，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻尿膽素(PUB)L50/61，它們重心之間的距離是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻紅蛋白晶體組裝在晶態(tài)條件下使得激發(fā)子相互作用成為可能。
實(shí)施例21、藻紅蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取適量藻紅蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻類)，用蒸餾水清洗兩次，于2℃條件下用組織破碎機(jī)研碎，置入燒杯中，加入pH值6.8、濃度0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)，攪拌均勻。于冰浴中1200W超聲破碎60分鐘，將破碎好的粗液于低溫條件下(2℃)靜置10小時(shí)，然后用至少三層的紗布過濾三次，去除大的細(xì)胞組織碎片，濾液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，8000轉(zhuǎn)/分鐘2℃離心60分鐘，去掉沉淀，收集上清液；硫酸銨分級(jí)鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到30％飽和度，2℃的條件下靜置10小時(shí)，6000轉(zhuǎn)/分鐘2℃離心60分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，2℃靜置10小時(shí)，6000轉(zhuǎn)/分鐘2℃下離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為5毫升，然后在洗脫過程中以0.005-0.05摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH6.8，含0.1摩爾/升氯化鈉)洗脫，流速為2.0毫升/分鐘，洗脫總體積為1000毫升。用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液。對(duì)各管進(jìn)行光譜測(cè)定，將藻紅蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，加入固體硫酸銨至80％飽和度，于2℃條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-150)凝膠柱層析上述純化收集的藻紅蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)凝膠柱上，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)洗脫，控制流速在5毫升/分鐘，收集A565/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的藻紅蛋白合并，以6000轉(zhuǎn)/分鐘2℃離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解，在0.005摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中充分透析。將透析后的藻紅蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時(shí)相同，洗脫體積為1000毫升，收集A565/A280＞4.5和A565/A280＞5.0的部分，制得不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
2.藻紅蛋白晶體的制備將A565/A280＞4.0、4.5或A565/A280＞5.0的藻紅蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動(dòng)調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH6.8。
將固體硫酸銨溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2微米的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛藻紅蛋白溶液中，并輕微攪動(dòng)，使溶液混合均勻，流速控制在1毫升/6分鐘，直到溶液中的藻紅蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(0℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用65％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的熒光藻紅蛋白晶體溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
將晶體產(chǎn)品存放于65％飽和度的硫酸銨磷酸鹽緩沖液溶液中，加入微量防腐劑(0.1％疊氮化鈉(NaN3))，于低溫0℃條件下長期保存。
3.藻紅蛋白結(jié)構(gòu)的確定從條斑紫菜中分離得到的藻紅蛋白屬于藻膽蛋白的一種，它由α、β、γ三種亞基組成，其分子量分別是17000道爾頓、18000道爾頓和31700道爾頓。條斑紫菜中藻紅蛋白主要以穩(wěn)定的六聚體(αβ)6γ的形式存在，分子量為229000道爾頓。α亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)，β亞基含有1個(gè)藻紅膽素(PEB)和0.5個(gè)藻尿膽素(PUB)，γ亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)和3個(gè)藻尿膽素(PUB)。其發(fā)色基團(tuán)藻紅膽素(PEB)的殘基與脫輔基蛋白上的半胱氨酸通過硫醚鍵共價(jià)結(jié)合，其連接位點(diǎn)在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。
條斑紫菜藻紅蛋白在可見光區(qū)的495納米和565納米處有特征吸收峰，以565納米處為最大吸收峰。熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。條斑紫菜藻紅蛋白等電點(diǎn)約為4.2。
4.藻紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定藻紅蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通過分子替代的方法，使用藻藍(lán)蛋白分子作為模型和精確的1.9埃分別率，測(cè)定紅藻藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)，雖然晶胞的參數(shù)是非常相似的和蛋白內(nèi)部的螺旋組成幾乎相同，但是藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白晶體的組裝有很大的不同，六棱柱圍繞z軸旋轉(zhuǎn)-40度，因此，不同的欄間空白之間聯(lián)系形成了。由于柱子近似圓柱對(duì)稱，不同的組裝排列能夠容納在一個(gè)相似的晶胞內(nèi)。藻紅蛋白晶體的組裝有一個(gè)顯著的特征，發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。藻紅蛋白晶體的組裝使得位于β亞基的B50/61位點(diǎn)的藻尿膽素(PUB)可能靠近位于相對(duì)稱的α亞基A139位點(diǎn)的藻紅膽素(PEB)，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)重心之間的距離約13.0埃，相互方向基本垂直，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻紅膽素(PEB)L158，兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間最近的距離是3.4埃，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的平行排列使得它們重心之間的距離有20.3埃。更多的，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻尿膽素(PUB)L50/61，它們重心之間的距離是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻紅蛋白晶體組裝在晶態(tài)條件下使得激發(fā)子相互作用成為可能。
實(shí)施例31、藻紅蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取適量藻紅蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻類)，用蒸餾水清洗兩次，于低溫(5℃)條件下用組織破碎機(jī)研碎，置入燒杯中，加入pH值7.0、濃度0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)，攪拌均勻。于冰浴中1500W超聲破碎45分鐘，將破碎好的粗液于低溫條件下(5℃)靜置18小時(shí)，然后用至少三層的紗布過濾三次，去除大的細(xì)胞組織碎片，濾液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，8000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心45分鐘，去掉沉淀，收集上清液；硫酸銨分級(jí)鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到25％飽和度，5℃的條件下靜置18小時(shí)，8000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心45分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫5℃靜置18小時(shí)，8000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心45分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為18毫升，然后在洗脫過程中以0.005-0.06摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含0.15摩爾/升氯化鈉)洗脫，流速為0.5毫升/分鐘，洗脫總體積為800毫升。用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液。對(duì)各管進(jìn)行光譜測(cè)定，將藻紅蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，加入固體硫酸銨至80％飽和度，于5℃低溫條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-200)凝膠柱層析上述純化收集的藻紅蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)凝膠柱上，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)洗脫，控制流速在2.2毫升/分鐘，收集A565/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的藻紅蛋白合并，以8000轉(zhuǎn)/分鐘4℃離心45分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解，在0.005摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中充分透析。將透析后的藻紅蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時(shí)相同，洗脫體積為800毫升，收集A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5和A565/A280＞5.0的部分，制得不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
2.藻紅蛋白晶體的制備將A565/A280＞4.0、4.5或A565/A280＞5.0的藻紅蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動(dòng)調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH7.0。
將固體硫酸銨溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2微米的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛藻紅蛋白溶液中，并輕微攪動(dòng)，使溶液混合均勻，流速控制在0.5毫升/6分鐘，直到溶液中的藻紅蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體4遍。
將所得到的熒光藻紅蛋白晶體溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
將晶體產(chǎn)品存放于60％飽和度的硫酸銨磷酸鹽緩沖液溶液中，加入微量防腐劑(0.1％疊氮化鈉(NaN3))，于低溫(5℃)條件下長期保存。
3.藻紅蛋白結(jié)構(gòu)的確定從條斑紫菜中分離得到的藻紅蛋白屬于藻膽蛋白的一種，它由α、β、γ三種亞基組成，其分子量分別是17000道爾頓、18000道爾頓和31700道爾頓。條斑紫菜中藻紅蛋白主要以穩(wěn)定的六聚體(αβ)6γ的形式存在，分子量為229000道爾頓。α亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)，β亞基含有1個(gè)藻紅膽素(PEB)和0.5個(gè)藻尿膽素(PUB)，γ亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)和3個(gè)藻尿膽素(PUB)。其發(fā)色基團(tuán)藻紅膽素(PEB)的殘基與脫輔基蛋白上的半胱氨酸通過硫醚鍵共價(jià)結(jié)合，其連接位點(diǎn)在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。
條斑紫菜藻紅蛋白在可見光區(qū)的495納米和565納米處有特征吸收峰，以565納米處為最大吸收峰。熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。條斑紫菜藻紅蛋白等電點(diǎn)約為4.2。
4.藻紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定藻紅蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通過分子替代的方法，使用藻藍(lán)蛋白分子作為模型和精確的1.9埃分別率，測(cè)定紅藻藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)，雖然晶胞的參數(shù)是非常相似的和蛋白內(nèi)部的螺旋組成幾乎相同，但是藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白晶體的組裝有很大的不同，六棱柱圍繞z軸旋轉(zhuǎn)-40度，因此，不同的欄間空白之間聯(lián)系形成了。由于柱子近似圓柱對(duì)稱，不同的組裝排列能夠容納在一個(gè)相似的晶胞內(nèi)。藻紅蛋白晶體的組裝有一個(gè)顯著的特征，發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。藻紅蛋白晶體的組裝使得位于β亞基的B50/61位點(diǎn)的藻尿膽素(PUB)可能靠近位于相對(duì)稱的α亞基A139位點(diǎn)的藻紅膽素(PEB)，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)重心之間的距離約13.0埃，相互方向基本垂直，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻紅膽素(PEB)L158，兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間最近的距離是3.4埃，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的平行排列使得它們重心之間的距離有20.3埃。更多的，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻尿膽素(PUB)L50/61，它們重心之間的距離是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻紅蛋白晶體組裝在晶態(tài)條件下使得激發(fā)子相互作用成為可能。
實(shí)施例41、藻紅蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取適量藻紅蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻類)，用蒸餾水清洗兩次，于0℃條件下用組織破碎機(jī)研碎，置入燒杯中，加入pH值7.2、濃度0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)，攪拌均勻。于冰浴(0℃)中1800W超聲破碎60分鐘，將破碎好的粗液于低溫條件下(10℃)靜置10小時(shí)，然后用至少三層的紗布過濾三次，去除大的細(xì)胞組織碎片，濾液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分鐘7℃離心30分鐘，去掉沉淀，收集上清液；硫酸銨分級(jí)鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到30％飽和度，10℃的條件下靜置10小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分鐘7℃離心30分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(10℃)靜置24小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分鐘7℃下離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中充分透析。
第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為30毫升，然后在洗脫過程中以0.005-0.08摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH7.2，含0.15摩爾/升氯化鈉)洗脫，流速為1.0毫升/分鐘，洗脫總體積為600毫升。用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液。對(duì)各管進(jìn)行光譜測(cè)定，將藻紅蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(10℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-200)凝膠柱層析上述純化收集的藻紅蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)凝膠柱上，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值7.2)洗脫，控制流速在0.5毫升/分鐘，收集A565/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的藻紅蛋白合并，以10000轉(zhuǎn)/分鐘7℃離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.2溶解，在0.005摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中充分透析。將透析后的藻紅蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時(shí)相同，洗脫體積為600毫升，收集A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5和A565/A280＞5.0的部分，制得不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
2.藻紅蛋白晶體的制備將A565/A280＞4.0、4.5或A565/A280＞5.0的藻紅蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動(dòng)調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH7.2。
將固體硫酸銨溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2微米的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛藻紅蛋白溶液中，并輕微攪動(dòng)，使溶液混合均勻，流速控制在0.1毫升/6分鐘，直到溶液中的藻紅蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用50～60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體5遍。
將所得到的熒光藻紅蛋白晶體溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
將晶體產(chǎn)品存放于65％飽和度的硫酸銨磷酸鹽緩沖液溶液中，加入微量防腐劑(0.1％疊氮化鈉(NaN3))，于低溫(4℃)條件下長期保存。
3.藻紅蛋白結(jié)構(gòu)的確定從條斑紫菜中分離得到的藻紅蛋白屬于藻膽蛋白的一種，它由α、β、γ三種亞基組成，其分子量分別是17000道爾頓、18000道爾頓和31700道爾頓。條斑紫菜中藻紅蛋白主要以穩(wěn)定的六聚體(αβ)6γ的形式存在，分子量為229000道爾頓。α亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)，β亞基含有1個(gè)藻紅膽素(PEB)和0.5個(gè)藻尿膽素(PUB)，γ亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)和3個(gè)藻尿膽素(PUB)。其發(fā)色基團(tuán)藻紅膽素(PEB)的殘基與脫輔基蛋白上的半胱氨酸通過硫醚鍵共價(jià)結(jié)合，其連接位點(diǎn)在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。
條斑紫菜藻紅蛋白在可見光區(qū)的495納米和565納米處有特征吸收峰，以565納米處為最大吸收峰。熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。條斑紫菜藻紅蛋白等電點(diǎn)約為4.2。
4.藻紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定藻紅蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通過分子替代的方法，使用藻藍(lán)蛋白分子作為模型和精確的1.9埃分別率，測(cè)定紅藻藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)，雖然晶胞的參數(shù)是非常相似的和蛋白內(nèi)部的螺旋組成幾乎相同，但是藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白晶體的組裝有很大的不同，六棱柱圍繞z軸旋轉(zhuǎn)-40度，因此，不同的欄間空白之間聯(lián)系形成了。由于柱子近似圓柱對(duì)稱，不同的組裝排列能夠容納在一個(gè)相似的晶胞內(nèi)。藻紅蛋白晶體的組裝有一個(gè)顯著的特征，發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。藻紅蛋白晶體的組裝使得位于β亞基的B50/61位點(diǎn)的藻尿膽素(PUB)可能靠近位于相對(duì)稱的α亞基A139位點(diǎn)的藻紅膽素(PEB)，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)重心之間的距離約13.0埃，相互方向基本垂直，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻紅膽素(PEB)L158，兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間最近的距離是3.4埃，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的平行排列使得它們重心之間的距離有20.3埃。更多的，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻尿膽素(PUB)L50/61，它們重心之間的距離是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻紅蛋白晶體組裝在晶態(tài)條件下使得激發(fā)子相互作用成為可能。
實(shí)施例51、藻紅蛋白的制備細(xì)胞破碎稱取適量藻紅蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻類)，用蒸餾水清洗兩次，于4℃條件下用組織破碎機(jī)研碎，置入燒杯中，加入pH值7.4、濃度0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(PBS)，攪拌均勻。于冰浴中1800W超聲破碎60分鐘，將破碎好的粗液于低溫條件下(4℃)靜置10小時(shí)，然后用至少三層的紗布過濾三次，去除大的細(xì)胞組織碎片，濾液置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分鐘10℃離心30分鐘，去掉沉淀，收集上清液；硫酸銨分級(jí)鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達(dá)到30％飽和度，10℃的條件下靜置10小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分鐘10℃下離心30分鐘，棄去沉淀。上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(10℃)靜置24小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分鐘10℃下離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中充分透析第一次羥基磷灰石柱層析將透析后的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為30毫升，然后在洗脫過程中以0.005-0.050摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液(pH7.4，含0.15摩爾/升氯化鈉)洗脫，流速為1.8毫升/分鐘，洗脫總體積為600毫升。用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液。對(duì)各管進(jìn)行光譜測(cè)定，將藻紅蛋白含量和純度較高的收集液合并在一起，加入固體硫酸銨至80％飽和度，于低溫(5℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-200)凝膠柱層析上述純化收集的藻紅蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)凝膠柱上，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)洗脫，控制流速在0.5毫升/分鐘，收集A565/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數(shù)次鹽析濃縮后的藻紅蛋白合并，以10000轉(zhuǎn)/分鐘2℃下離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用少量磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解，在0.005摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中充分透析。將透析后的藻紅蛋白加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時(shí)相同，洗脫體積為600毫升，收集A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5和A565/A280＞5.0的部分，制得不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
2.藻紅蛋白晶體的制備將A565/A280＞4.0、4.5或A565/A280＞5.0的藻紅蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恒低溫條件(溫度控制在10℃)的超凈工作上。溶液中加入0.2％(質(zhì)量/體積)的氯化鎂和4％(質(zhì)量/體積)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動(dòng)調(diào)控裝置調(diào)節(jié)液體的pH值始終穩(wěn)定在pH7.4。
將固體硫酸銨溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中制備成100％飽和度的硫酸銨溶液，并用0.2微米的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛藻紅蛋白溶液中，并輕微攪動(dòng)，使溶液混合均勻，流速控制在0.1毫升/6分鐘，直到溶液中的藻紅蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(7℃)預(yù)冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然后用50～60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體5遍。
將所得到的熒光藻紅蛋白晶體溶解于0.005摩爾/升的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，按照以上結(jié)晶的方法和步驟，實(shí)施重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
將晶體產(chǎn)品存放于65％飽和度的硫酸銨磷酸鹽緩沖液溶液中，加入微量防腐劑(0.1％疊氮化鈉(NaN3))，于低溫(5℃)條件下長期保存。
3.藻紅蛋白結(jié)構(gòu)的確定從條斑紫菜中分離得到的藻紅蛋白屬于藻膽蛋白的一種，它由α、β、γ三種亞基組成，其分子量分別是17000道爾頓、18000道爾頓和31700道爾頓。條斑紫菜中藻紅蛋白主要以穩(wěn)定的六聚體(αβ)6γ的形式存在，分子量為229000道爾頓。α亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)，β亞基含有1個(gè)藻紅膽素(PEB)和0.5個(gè)藻尿膽素(PUB)，γ亞基含有2個(gè)藻紅膽素(PEB)和3個(gè)藻尿膽素(PUB)。其發(fā)色基團(tuán)藻紅膽素(PEB)的殘基與脫輔基蛋白上的半胱氨酸通過硫醚鍵共價(jià)結(jié)合，其連接位點(diǎn)在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。
條斑紫菜藻紅蛋白在可見光區(qū)的495納米和565納米處有特征吸收峰，以565納米處為最大吸收峰。熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。條斑紫菜藻紅蛋白等電點(diǎn)約為4.2。
4.藻紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的確定藻紅蛋白晶體的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通過分子替代的方法，使用藻藍(lán)蛋白分子作為模型和精確的1.9埃分別率，測(cè)定紅藻藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)，雖然晶胞的參數(shù)是非常相似的和蛋白內(nèi)部的螺旋組成幾乎相同，但是藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白晶體的組裝有很大的不同，六棱柱圍繞z軸旋轉(zhuǎn)-40度，因此，不同的欄間空白之間聯(lián)系形成了。由于柱子近似圓柱對(duì)稱，不同的組裝排列能夠容納在一個(gè)相似的晶胞內(nèi)。藻紅蛋白晶體的組裝有一個(gè)顯著的特征，發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。藻紅蛋白晶體的組裝使得位于β亞基的B50/61位點(diǎn)的藻尿膽素(PUB)可能靠近位于相對(duì)稱的α亞基A139位點(diǎn)的藻紅膽素(PEB)，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)重心之間的距離約13.0埃，相互方向基本垂直，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻紅膽素(PEB)L158，兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間最近的距離是3.4埃，這兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的平行排列使得它們重心之間的距離有20.3埃。更多的，有一個(gè)短的距離是發(fā)色團(tuán)藻紅膽素(PEB)K139和相對(duì)稱的β亞基藻尿膽素(PUB)L50/61，它們重心之間的距離是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻紅蛋白晶體組裝在晶態(tài)條件下使得激發(fā)子相互作用成為可能。
權(quán)利要求
1.一種藻紅蛋白溶液的制備方法，其特征在于，將藻細(xì)胞破碎后，通過過濾和高速冷凍離心分離，去除沉淀，收集上清，分級(jí)鹽析后收集藻紅蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液后依次經(jīng)過羥基磷灰石、葡聚糖凝膠Sephadex G-150或Sephadex G-200、羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石柱層析時(shí)使用濃度范圍為0.005-0.1摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫，控制流速在0.5-2.5毫升/分鐘，最后收集A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5、A565/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的藻紅蛋白溶液，制成不同純度級(jí)別的藻紅蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藻紅蛋白溶液的制備方法，其特征在于，所述藻紅蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用濃度范圍為0.005-0.05摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藻紅蛋白溶液的制備方法，其特征在于，所述藻紅蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用線性梯度磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫流速控制在1.0-2.0毫升/分鐘。
4.一種藻紅蛋白晶體的制備方法，其特征在于，將一定純度的藻紅蛋白放在閉光封閉的環(huán)境中，加入0.05-0.2％氯化鎂和2-4％氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值使其在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.5～7.4的范圍內(nèi)，線性梯度地加入硫酸銨并輕微攪動(dòng)，使其轉(zhuǎn)變成粗晶體，通過重結(jié)晶，再結(jié)晶，即得最后的晶體產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藻紅蛋白晶體的制備方法，其特征在于，所述的在晶體的成長過程中始終穩(wěn)定在pH6.8～7.2的范圍內(nèi)。
6.一種藻紅蛋白晶體，分子結(jié)構(gòu)為通過硫醚鍵連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)---開鏈線性延展的四吡咯化合物，脫輔蛋白單體由α、β、γ三種亞基組成，在適宜波長激發(fā)下能發(fā)射強(qiáng)烈熒光，特征吸收峰為560～570nm，熒光激發(fā)峰為480～500nm，熒光發(fā)射峰為575～580nm。其特征在于所述的藻紅蛋白為晶體結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種藻紅蛋白晶體，其特征在于，所述的的晶胞參數(shù)為a＝b＝189.8，c＝60.1，α＝β＝γ＝90°。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種藻紅蛋白晶體，其特征在于，所述的藻紅蛋白晶體的組裝為發(fā)色團(tuán)和蛋白通過藻紅膽素K139和相對(duì)稱的β亞基半胱氨酸殘基L159和谷氨酰胺L159連接；蛋白和蛋白之間通過α亞基和β亞基的螺旋G和螺旋H之間的環(huán)連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種藻紅蛋白晶體，其特征在于，所述的藻紅蛋白晶體的特征吸收峰為565nm，熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種藻紅蛋白晶體，其特征在于，所述的藻紅蛋白晶體的特征吸收峰為565nm，熒光激發(fā)峰為495nm，熒光發(fā)射峰為576nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白、晶體制造工藝及制品，尤其涉及的是在一般條件下從藻類中提取的能發(fā)射強(qiáng)烈熒光的藻紅蛋白并將其轉(zhuǎn)化為晶體形態(tài)，本發(fā)明藻紅蛋白晶體具有能夠長期保存，所需的保藏條件要求小，熒光活性高的特點(diǎn)，其制作方法在普通的實(shí)驗(yàn)條件下就可以完成，簡單易行。并在科研、醫(yī)療、檢測(cè)、信電等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1786024SQ20041008952
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者駱建華, 劉維國, 劉俊 申請(qǐng)人:劉維國