專利名稱：一種鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于螺旋藻開發(fā)應(yīng)用的技術(shù)背景技術(shù)螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍藻門(Cyanophyta)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學(xué)研究，1997，15(4)369-374]，因其富含優(yōu)質(zhì)蛋白和多種生物活性物質(zhì)而受到國內(nèi)外的極大關(guān)注，目前已在大量研究的基礎(chǔ)上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，并應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥保健、飼料、精細化工等領(lǐng)域。該屬中的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是國內(nèi)外在商業(yè)化養(yǎng)殖生產(chǎn)與開發(fā)中應(yīng)用最廣泛的品種。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產(chǎn)實踐表明，鈍頂螺旋藻種下有許多品系，它們對溫度、光質(zhì)、光照強度，以及培養(yǎng)液的鹽度、pH和營養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要求與適應(yīng)性存有顯著差異[水生生物學(xué)報，1999，23(1)59-64]。目前國內(nèi)外幾乎都采用開放或半封閉、跑道型循環(huán)式培養(yǎng)池這一較粗放的養(yǎng)殖生產(chǎn)模式，許多環(huán)境因子，特別是溫度和光照強度，難以人為調(diào)控，有些鈍頂螺旋藻品系在實驗室或生產(chǎn)小試中雖然表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)性能，但進入生產(chǎn)池后，因難以適應(yīng)環(huán)境因子的較大變化而無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，選育品性兼優(yōu)的品系一直是螺旋藻養(yǎng)殖生產(chǎn)與開發(fā)中最重要的環(huán)節(jié)與技術(shù)要點之一。
目前國內(nèi)外鑒別螺旋藻品系優(yōu)劣的常規(guī)方法是，先在實驗室作多種環(huán)境因子交叉組合培養(yǎng)試驗，根據(jù)所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標作初步篩選；再依次轉(zhuǎn)接到室外約5m2、50m2及500m2的培養(yǎng)池中于不同季節(jié)與氣候及營養(yǎng)條件下進行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗，進而篩選出優(yōu)良藻株。這一方法雖然實用，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，建立既實用，又簡便、耗時少、低成本的螺旋藻品系優(yōu)劣的鑒別新方法，以滿足當(dāng)前國內(nèi)外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的實際需要。
本發(fā)明是在長期研究螺旋藻分子遺傳學(xué)背景，并在研究螺旋藻品系優(yōu)劣的分子標記基因-cpcHID操縱子基因的基礎(chǔ)上，建立起一種鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的新方法。
cpcHID操縱子基因為藍藻等少數(shù)藻類所特有，其編碼的3種棒狀多肽在藻膽體裝配中起連接作用。我們通過設(shè)計特定的引物，利用PCR等分子生物學(xué)方法克隆并測定了4株鈍頂螺旋藻品系(分別為Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5)的cpcHID操縱子基因序列，進而利用生物信息學(xué)及分子系統(tǒng)分類學(xué)等分析顯示，依據(jù)cpcHID操縱子基因序列的差異位點數(shù)和相似程度，這4株品系被分成有顯著差異的兩大類。即Sp-3和Sp-5為一類；Sp-1和Sp-2為一類。長期的實驗研究與生產(chǎn)實踐表明，這4株鈍頂螺旋藻品系在溫度、光照等環(huán)境因子能自動調(diào)控的實驗室培養(yǎng)試驗中均表現(xiàn)優(yōu)良，但只有Sp-3和Sp-5這兩株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，Sp-1和Sp-2因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種。由此可見，cpcHID操縱子基因序列特征與螺旋藻生產(chǎn)性狀存在著相關(guān)性。因此，應(yīng)用cpcHID操縱子基因可以作為鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的分子標記，即被鑒別品系的cpcHID操縱子基因序列若與Sp-3和Sp-5的聚成一類，則可能生產(chǎn)性狀優(yōu)良；若與Sp-1、Sp-2的聚成一類，則可能不可應(yīng)用于生產(chǎn)。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點應(yīng)用CPCHID操縱子基因序列鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的新方法與常規(guī)方法相比，不僅簡單快速、標準明確，而且成本低，并適合大規(guī)模、高通量篩選。


圖1為4株用于構(gòu)建生產(chǎn)性狀鑒別標準的螺旋藻品系的系統(tǒng)發(fā)生樹示意圖；圖2為被鑒別藻株Sp-10在所建鑒別標準中的歸類圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的詳細技術(shù)方案可以通過以下步驟實施1、選用材料用于構(gòu)建鑒別標準的4株鈍頂螺旋藻品系為公知的Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5(浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存)，在溫度、光照等環(huán)境因能自動調(diào)控的實驗室培養(yǎng)試驗中均表現(xiàn)優(yōu)良，其中Sp-3和Sp-5對環(huán)境適應(yīng)能力強，在大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用；而Sp-1和Sp-2因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種。
2、選用的試劑和儀器Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；克隆載體pMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成。其它試劑均為分析純。序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀。
3、PCR引物設(shè)計與擴增利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件得到上、下游引物分別為PF5′-CAATACATCTTCGCCGATTT-3′、PR5′-CGTATTATCGGTAGTCATCGG-3′。25μLPCR反應(yīng)體系中含引物PF和PR各0.5μmol/L，4種dNTP各1μmol/L，2.5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2.5μL，50ng基因組DNA[提取方法參考“海洋與湖沼”，2002，33(2)203-208]。反應(yīng)程序94℃5min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃8min。
4、PCR產(chǎn)物的克隆及測序?qū)⒔?jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質(zhì)粒進行測序。
測得Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5基因組DNA的cpcHID操縱子基因序列如SEQNO1。
5、序列比對與系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建對SEQNO1的Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5多重序列比對采用Clustal X 1.81軟件，其系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建采用Phylip 3.65軟件包。
本發(fā)明的結(jié)果分析基于cpcHID操縱子基因序列的差異位點數(shù)分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5的基因組DNA分別經(jīng)cpcHID操縱子基因的特定引物PCR擴增與克隆，并測得相應(yīng)的SEQNO1序列。
運用Clustal X 1.81軟件對上述4株螺旋藻品系的cpcHID操縱子序列的多重序列比對分析結(jié)果中Sp-1、Sp-2這兩個品系與Sp-3或Sp-5兩兩之間的堿基差異位點被標為下劃線；“*”表示4個品系的cpcHID操縱子序列的相同位點，如SEQNO2所示。
統(tǒng)計得到品系間堿基的差異位點數(shù)。
由表1可知，Sp-1和Sp-2之間的差異位點數(shù)為0；Sp-3和Sp-5之間的差異位點數(shù)也僅為4；然而Sp-1或Sp-2與Sp-3和Sp-5兩兩之間的差異位點數(shù)為分別為58和59。進一步將上述4株品系的cpcHID操縱子基因序列的多重序列比對結(jié)果導(dǎo)入Phylip 3.65軟件包的dnamlk程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果如附圖1所示，4株品系可分為兩大類Sp-3和Sp-5為另一類；Sp-1和Sp-2為一類，這與上述差異位點數(shù)分析的結(jié)果相吻合。長期的實驗研究實踐表明，這4株鈍頂螺旋藻品系在溫度、光照等環(huán)境因子能自動調(diào)控的實驗室培養(yǎng)試驗中均表現(xiàn)優(yōu)良，但只有Sp-3和Sp-5這兩株品系在實際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，Sp-1和Sp-2因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種。根據(jù)上述，cpcHID操縱子基因序列特征與螺旋藻生產(chǎn)性狀存在相關(guān)性，因此，cpcHID操縱子基因可以作為鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的分子標記，即被鑒別品系的cpcHID操縱子基因序列若與Sp-3和Sp-5的聚成一類，則可能生產(chǎn)性狀優(yōu)良；若與Sp-1、Sp-2的聚成一類，則不可應(yīng)用于生產(chǎn)。
表1 4株品系的cpcHID操縱子基因序列的差異位點數(shù)

作為實施例，我們選取了Sp-10這株品系來驗證本發(fā)明的實用性。Sp-10雖然在實驗室培養(yǎng)試驗中表現(xiàn)良好，但在實際生產(chǎn)中卻由于適應(yīng)性差而不能用作生產(chǎn)良種。通過克隆并測定Sp-10的cpcHID操縱子基因序列如SEQNO3。
利用生物信息學(xué)及分子系統(tǒng)分類學(xué)等分析表明，該品系的cpcHID操縱子基因序列與Sp-1和Sp-2的聚成一類，如圖2所示。該例子進一步說明，cpcHID操縱子基因作為一種分子標記來比對鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣是可行的。證明本發(fā)明的鑒別方法是可以實現(xiàn)的。
SEQNO1Sp-1的cpcHID操縱子基因序列1 CAATACATCT TCGCCGATTT CTCCAGCCGG GAGCGGACAA GCTCTGGTGG GGGCTAATGG61TGGCTCGCGC GGTCAATTGT ATCGTGTGGT AGTAGTACAA AAGCCCACAC AGTTGACACC121 GAGAATGCGT AAAGCTACAG CAGAGTATAC AGTAGCCTAC GAGCAACTTT CAGGACAGTT181 GCAGCGGATC AACCGCATGG GCGGACGGGT CATCAGCGTG ACCCCTGCTT AGAACAGCAA241 GTTGTTAACT GTTAACCAGT TAATAACAAT AGCATAATCA AGTTAGATTG TCTAGGACTA301 AATCCGCAAG TAATTCGGTT GTGATCATAG GAGGATTTTA GTGGCCATTA CAACCCAAGC361 GTCTCGGTTA GGGACAACAG CTTTCCAGGA GAGTTCTCTG GTAGAGTTGC GCCCCAATTG421 GAGTCGTGAC AATGCCCAAG AGGTAATTCG TGCGGTATAC CGTCAATTAC TGGGTAATGA481 TTATCTGATG AGTTCTGAGC GCCTCACGAG TGCGGAGTCA CTGTTGTGCG ATGGTAGCAT541 CACAGTACGG GAGTTGGTGC GGTGTGTGGC GAAGTCAGAG CTTTATAAAA AGAAATTCTT601 TTACCCGAAT TTCCAGACCC GTGTAATTGA ACTAAATTAC AAACACCTGT TGGGTCGGGC661 TCCCTATGAT GAGTCAGAGG TGGTTTTCCA CTTAGACTTA TATCAAAACG AAGGGTACGA721 TGCCGATATC GATTCTTATA TTGATTCTCC AGAATATCTG GAGAGCTTCG GCGAAAATAT781 TGTTCCCTAC TACCGTGGTT TCGAGACTCA GCGGGGACAG AAAACGGTTG GTTTTACCCG841 GATGTTCCGC CTGTATCGGG GTTATGCTAA TAGTGATAGC GCTCAAGGTG AAGGCACTAT901 GTCTCGTCTG GCGCAGGAAC TAGGTGCTAA CCGCGCTTCT GTGGTAGTGG CTCCTTCTGG961 GGATTCGGAT GGTTGGTCCT ATCGTCCATC TGGACAGAGT GTGGCTCCTA GCACTGGATT
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1 CAATACATCT TCGCCGATTT CTCCAGCCGG GAGCGGACAA GCTCTGGTGG GGGCTAATGG61TGGCTCGCGC GGTCAATTGT ATCGTGTGGT AGTAGTACAA AAGCCCACAC AGTTGACACC121 GAGAATGCGT AAAGCTACAG CAGAGTATAC AGTAGCCTAC GAGCAACTTT CAGGACAGTT181 GCAGCGGATC AACCGCATGG GCGGACGGGT CATCAGCGTG ACCCCTGCTT AGAACAGCAA241 GTTGTTAACT GTTAACCAGT TAATAACAAT AGCATAATCA AGTTAGATTG TCTAGGACTA301 AATCCGCAAG TAATTCGGTT GTGATCATAG GAGGATTTTA GTGGCCATTA CAACCCAAGC361 GTCTCGGTTA GGGACAACAG CTTTCCAGGA GAGTTCTCTG GTAGAGTTGC GCCCCAATTG421 GAGTCGTGAC AATGCCCAAG AGGTAATTCG TGCGGTATAC CGTCAATTAC TGGGTAATGA481 TTATCTGATG AGTTCTGAGC GCCTCACGAG TGCGGAGTCA CTGTTGTGCG ATGGTAGCAT541 CACAGTACGG GAGTTGGTGC GGTGTGTGGC GAAGTCAGAG CTTTATAAAA AGAAATTCTT601 TTACCCGAAT TTCCAGACCC GTGTAATTGA ACTAAATTAC AAACACCTGT TGGGTCGGGC661 TCCCTATGAT GAGTCAGAGG TGGTTTTCCA CTTAGACTTA TATCAAAACG AAGGGTACGA721 TGCCGATATC GATTCTTATA TTGATTCTCC AGAATATCTG GAGAGCTTCG GCGAAAATAT781 TGTTCCCTAC TACCGTGGTT TCGAGACTCA GCGGGGACAG AAAACGGTTG GTTTTACCCG841 GATGTTCCGC CTGTATCGGG GGTATGCTAA TAGTGATAGC GCTCAAGGTG AAGGCACTAT901 GTCTCGTCTG GCGCAGGAAC TAGGTGCTAA CCGCGCTTCT GTGGTAGTGG CTCCTTCTGG961 GGATTCGGAT GGTTGGTCCT ATCGTCCATC TGGACAGAGT GTGGCTCCTA GCACTGGATT1021 CAGCCAAGGT GGAGTTCTGC AAGCGGGACG GACTTACCGT GTAGAGGTTT CTGGAATCCG1081 TGAGCGCCGT TATCCCAGAG TACGTCGTTG CAGTAAGGCT TTTATTGTTC CTTATGATCA1141 GCTTTCGGCA CAACTGAGGG AAATTCAGCG CCAAGGTGGC ACAATTGCCA GCATTACGCC1201 TATTTAGAAT GGCAAGAGAA AACTTGATTG TTTTGGGAGA TTAATAGGGA CAATGTTGGG1261 TTACATCAGT GCCGGAAAAA TGGGCAGTAG TCCTTCGGGC GCTCGCTTCT TCAAATATGA1321 AGTGGTGGGA ATGCGTCAGA ATGACGAAAC CGACAAGACA GAATATCAGA TTCGCTCGAG1381 TGGGAGTCAA TTTGTAATTG TTCCTTACAA TAGGATGAAT CAGGAAATGC GGCGGATTAA1441 CCGCATGGGT GGTAAAATTG TTAGCATTGA GCCGATGACT ACCGATAATA CG
權(quán)利要求
1.一種鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法，其特征是4株鈍頂螺旋藻品系Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5分別具有SEQNO1的cpcHID操縱子基因序列；將被鑒別螺旋藻品系的cpcHID操縱子基因序列與上述4序列比對鑒別其生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。
2.按權(quán)利要求1所述鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法，其特征是采用下列操作步驟1、選用材料選取4株鈍頂螺旋藻品系中的Sp-1、Sp-2、Sp-3、Sp-5，其中Sp-3和Sp-5對環(huán)境適應(yīng)能力強，在大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用；而Sp-1和Sp-2因適應(yīng)能力差而不能用作生產(chǎn)良種；2、選用的試劑和儀器Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；克隆載體pMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成，其它試劑均為分析純，序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀；
3.PCR引物設(shè)計與擴增利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件得到上游引物PF5′-CAATACATCTTCGCCGATTT-3′，下游引物PR5′-CGTATTATCGGTAGTCATCGG-3′，25μL PCR反應(yīng)體系中含引物PF和PR各0.5μmol/L，4種dNTP各1μmol/L，2.5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2.5μL，50ng基因組DNA，反應(yīng)程序94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃ 8min；
4.PCR產(chǎn)物的克隆及測序?qū)⒔?jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質(zhì)粒進行測序，測得Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5基因組DNA的CPMID操縱子基因序列(SEQNO1)；
5.序列比對與系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建對上述Sp-1、Sp-2、Sp-3和Sp-5的的多重序列比對采用Clustal X 1.81軟件，其系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建采用Phylip 3.65軟件包，以此cpcHID操縱子基因作為一種分子標記來比對鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。
全文摘要
一種鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法。選取4株鈍頂節(jié)旋藻品系中的Sp－1、Sp－2、Sp－3和Sp－5。利用上游引物PF5′－CAATACATCTTCGCCGATTT－3′，下游引物PR5′－CGTATTATCGGTAGTCATCGG－3′。在PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃ 8min。將經(jīng)DNA凝膠回收純化的PCR產(chǎn)物連接到PMD18－T載體上進行篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質(zhì)粒進行測序。將上述4株cpcHID操縱子基因序列與被鑒別藻株的相應(yīng)序列進行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，以此鑒別螺旋藻品系性狀的優(yōu)劣。
文檔編號C12Q1/68GK1904071SQ20061005223
公開日2007年1月31日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者汪志平, 楊靈勇, 曹學(xué)成, 黃暉 申請人:浙江大學(xué)