專利名稱：虎紋捕鳥蛛毒素-xvi的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種虎紋捕鳥蛛毒素。
背景技術：
痛覺是一種與組織損傷或潛在的損傷相關的不愉快的情感體驗和主觀感覺，它 是感覺神經(jīng)系統(tǒng)的功能，是機體自我保護的一種反射機制。多肽類鈣通道抑制劑廣泛存在 于蜘蛛、芋螺和蝎子等有毒動物的毒液中，具有開發(fā)成治療人類疾病的鎮(zhèn)痛新藥的應用前 景。例如，ω-芋螺毒素MVIIA是研究比較清楚的脊椎動物神經(jīng)元N-型鈣通道阻斷劑，通 過堵塞其受體孔道而達到目的。ziconotide (合成的ω-芋螺毒素MVIIA)作為一種治療 嚴重慢性疼痛的新型非阿片類新藥已于2004年被美國食品和藥物管理局獲準出售。因此， 全世界都將精力轉(zhuǎn)移到開發(fā)不以阿片類受體為靶點的強效鎮(zhèn)痛藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在于提供一種能明顯抑制哺乳動物N-型鈣通道的虎紋捕鳥蛛毒 素-XVI。本發(fā)明虎紋捕鳥蛛毒素-XVI，是從虎紋捕鳥蛛粗毒中經(jīng)離子交換和反相高效液相 色譜分離提純得到的，其多肽的氨基酸序列如下Cys lie Gly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn Asp Pro Arg Cys Cys Ser Gly Leu Val Cys Leu Lys Pro Thr Leu His Gly lie Trp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Cys Tyr Lys Lys0本發(fā)明提供的這種虎紋捕鳥蛛毒素-XVI (HWTX-XVI)其一級結(jié)構(gòu)由39個氨基酸 殘基組成，其中含6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵，分子量為4437. 4 Da,該毒素純化凍干 粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明；對大 鼠背根神經(jīng)元N-型鈣通道的半數(shù)最大抑制濃度為60 nmol/L,它是一種很強的選擇性作用 于N-型鈣通道的抑制劑，具有低毒性和可逆性，能有效抑制哺乳動物N-型鈣通道，有希望 成為開發(fā)治療N —型鈣通道相關疾病的先導分子。


圖1是虎紋捕鳥蛛粗毒陽離子交換HPLC圖譜。箭頭表示目的峰，縱坐標表示洗脫 峰在觀0 nm的吸收值，橫坐標表示洗脫時間。圖2是虎紋捕鳥蛛粗毒目的陽離子交換峰反相HPLC圖譜?！?”表示目的峰，縱坐 標表示各個洗脫峰在觀0 nm下的吸收值，橫坐標表示洗脫時間。圖3是HWTX-XVI的反相HPLC圖譜。圖 4 是 HWTX-XVI 的 MALDI-T0F 質(zhì)譜圖譜。圖5是1 uM HWTX-XVI對大鼠輸精管收縮的影響。1 uM HWTX-XVI能快速抑制低 頻率電刺激誘導的大鼠輸精管收縮，而且這種抑制作用是可逆的。圖6是HWTX-XVI抑制大鼠輸精管收縮的濃度依從性。濃效曲線均用Hill方程進行擬合得出IC5Q。方程y=l-(l-/max)/(1 + ([χ] /IC50),中，ζ代表毒素濃度，IC5tl代表毒 素半數(shù)有效抑制濃度，~是Hill常數(shù)。圖7是10 mM HWTX-XVI對低電壓激活鈣電流的影響。圖8是10 mM HWTX-XVI能明顯抑制高電壓激活鈣電流。圖9是HWTX-XVI不能進一步阻斷GVIA —不敏感的電流。圖10是在細胞外液中存在HWTX-XVI時，GVIA不能抑制電流。圖11是MVIIA可阻斷部分HWTX-XVI不敏感鈣電流。圖12是HWTX-XVI對鈣通道電流-電壓關系(I_V curve)的影響。圖13是HWTX-XVI抑制N-型鈣通道的濃度依賴性。圖中每個點的數(shù)據(jù)來自于5 8個實驗細胞，用平均值士標準誤(mean士S. E.)來表示。濃度曲線均用Hill方程進行擬 合得出IC5Q。方程y=l_(l_fmax)/(1 + ([χ] /IC50),中，ζ代表毒素濃度，IC5tl代表毒素半 數(shù)有效抑制濃度，~是Hill常數(shù)。圖14是HWTX-XVI抑制N-型鈣通道的時間依從性。
具體實施例方式1、實驗1. 1虎紋捕鳥蛛粗毒的分離純化虎紋捕鳥蛛粗毒的分離純化分三步進行(1)陽離子交換柱層析，在Waters650E色譜 系統(tǒng)上進行，層析柱子采用Waters P-I型陽離子交換柱(10 mmXIOO mm)。稱取10 mg粗 毒，溶于1 mL雙蒸水，并于臺式高速離心機(國產(chǎn))上離心10 min (轉(zhuǎn)速為10，000 rpm)， 沉淀不溶物。取上清液進樣，在配備有486紫外檢測器的Waters 650 E高級蛋白質(zhì)純化 系統(tǒng)上，采用Waters CM (300 nm)填料，使用常壓自裝柱(10 mm X 100 mm)進行陽離子 交換層析。采用四元梯度洗脫(A)0. lmol/L磷酸二氫鈉；(B)O. 1 mol/L磷酸氫二鈉；(C) 1.0 mol/L氯化鈉；(D)雙蒸水(ddH20)。其中A液和B液用來調(diào)節(jié)洗脫液的pH值，采用氯 化鈉梯度洗脫。在觀0 nm波長室溫檢測并收集所有被洗脫峰，找出目的峰后再進一步進行 反相脫鹽處理。脫鹽純化在Waters 515 pump & Empower高效液相色譜工作站，2487檢測 器上進行。采用分離柱為Phenomenex C18柱(4. 6 mm X 250 mm)。一次進樣200 300 mL。先用100% ddH20 (含0. 1%TFA)沖洗20 min，將混在樣品中的鹽分洗滌干凈(紫外檢測 吸收值為零)之后，用乙腈(含0.1%TFA)溶液進行梯度洗脫。流速為3.0 mL/min，檢測波長 為觀0/215 nm，柱溫為室溫。收集每個洗脫峰，用質(zhì)譜鑒定它們所含成分的分子量，找出含 有HWTX-XVI的洗脫峰并進行冷凍干燥。最后，目的樣品再在Waters 515 pump & Empower 高效液相色譜工作站，2487檢測器，或者反相HPLC純化系統(tǒng)(Waters公司，AlIiance 2690 HPLC & Millennium32高效液相色譜工作站)，996 PDA檢測器上進行純化。分離柱為 Phenomenex (18柱(4.6 匪 X 250 mm);洗脫液分別為A液(0. 1 % TFA/H20)、B液(0. TFA/CAN),流速為1.0 mL/min，檢測波長為觀0/215 nm，柱溫箱溫度為40°C。收集洗脫峰， 并用MALDI-T0F質(zhì)譜儀鑒定樣品的純度，目的樣品的凍干粉末置于-20°C冰箱儲存?zhèn)溆谩?. 2 MALDI-T0F質(zhì)譜分析和氨基酸序列測定MALDI-T0F質(zhì)譜分析在美國應用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的Voyager-DE STR型的 MALDI-T0F Mass(Matrix-assisted Laser desorption/ionization time-of-flight)MiH儀上進行。用 50 % 乙腈、50 %水、0. 1 % TFA混合液制備 CCA(ff如acid)基質(zhì)(5mg/mL)，然后分別取1. Oml樣品與5ml CCA基質(zhì)液混合，再取0. 5ml混合液 在質(zhì)譜儀的樣品盤上分別點樣，室溫下自然風干后測定各樣品的分子量。采用反射模式， 離子源加速電壓為20 kV，N2激光波長337nm，脈沖寬度3ns，離子延遲提取150ns，真空度 4' ΙΟ"7 Torr,質(zhì)譜信號單次掃描累加100次，正離子模式。氨基酸序列分析是應用Edman降解原理，在Perkin Elmer Procise 491A型氣相 測序儀(美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品)上進行的。一般不直接使用天然毒素進行測序， 而選用經(jīng)碘乙酰胺烷基化修飾后的毒素肽作為測序樣品，因為沒有經(jīng)碘乙酰胺修飾的半胱 氨酸(cysteine)在214 nm波長檢測下沒有吸收值，觀察不到信號，不便于準確定位多肽中 半胱氨酸的位置，而經(jīng)修飾的半胱氨酸的PTH-CM-Cys出峰信號明顯，在線HPLC檢測能夠得 到多肽序列中半胱氨酸的位置。根據(jù)毒素分子量大小推測其含有氨基酸殘基的個數(shù)，然后 設定實際測序循環(huán)數(shù)，即1個空白循環(huán)+1個標準循環(huán)+氨基酸殘基數(shù)目。1. 3生物活性測定 1.3. 1大鼠輸精管實驗大鼠輸精管標本制備方法大鼠經(jīng)斷頭處死后立即取出長約2厘米的輸精管，并置 于預先用 95% O2/ 5% CO2 飽和的克氏液(mM :NaCl 119.0，KCl 4. 7, CaCl2 2. 5, MgSO4 1.2，NaHCO3 2. 5, KH2PO4 1.2，glucose 11，EDTA 0· 026，pH 7.3)中，輕柔的擠出輸精管的 內(nèi)容物。將輸精管的兩端分別與32 °C恒溫的5 ml浴槽的底部和換能器連接，立即將標 本置于浴槽中，通過Ig砝碼定標輸精管的拉伸長度。通過分布于浴槽兩端的電極向輸精 管施加脈沖電場刺激(波寬0. 14 ms，強度100V，周期15 s)誘導輸精管收縮。在平衡 30min后進行藥理學試驗。通過測定HWTX — XVI阻斷電刺激誘導的輸精管收縮的時間，確 定HWTX— XVI的生物學活性。1. 3. 2大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的急性分離培養(yǎng)挑選出生4周左右、體重120 200 g的SD大白鼠，斷頸處死后，用剪子迅速取出脊椎 并剪成2 3段，再沿與肋骨平面垂直的方向?qū)⒆倒芗糸_，并浸泡在盛有少量培養(yǎng)液的燒杯 中；用鑷子撕破附在椎管內(nèi)壁上的一層黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交匯處的背根神經(jīng)纖 維。在胸腰椎段，可挑選18個左右并置入盛有2 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；在解剖顯微鏡下， 用維娜斯剪和尖頭鑷子分離出神經(jīng)節(jié)。剝離包在節(jié)外的絮狀物和軸索后，放入盛有約0. 5 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用吸管吸去液體，將分離好的所有神經(jīng)節(jié)剪碎，越碎越好。剪碎之后， 轉(zhuǎn)入消化液，在MO、震蕩頻率110 rpm的環(huán)境中進行酶解消化反應20 min。期間每隔10 min取出用移液槍吸打數(shù)次；向消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解處理過程。無菌操作將 消化得到的細胞液轉(zhuǎn)入離心管中進行離心(800 rpm,5 min)，去上清，加入8 mL含10%小牛 血清的長期培養(yǎng)液。重懸細胞后分成3 4皿，放入培養(yǎng)箱(5%C02、95%空氣)中，37°C培 養(yǎng)3 4 h貼壁。使用Ba2+作為Ca2+的電荷替代物，鈣通道電流(Ica)的大小通過測得IBa 值來確定。實驗中的細胞外液(in mM) 160 TEA-Cl, 10 HEPES, 2 BaCl2, 10 glucose, 禾口 200nM TTX,用 TEA-OH 調(diào)節(jié) pH 到 7. 4;細胞內(nèi)液(in mM) 120 CsCl, 5 Mg-ATP, 0.4 Na2-GTP, 10 EGTA, 20 HEPES-CsOH,調(diào)節(jié) pH 到 7. 2。1. 3. 3膜片鉗電生理活性實驗膜片鉗實驗均在室溫(25士ΓΟ進行，采用全細胞膜片鉗技術。挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的DRG細胞作為實驗細胞。電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用放大器EPC9 (HEKA 公司，German)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8. 0軟件。 玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管(南京泉水教學實驗器材廠)。玻璃電極兩步拉制而成， 經(jīng)拋光儀(Narishige，Japan)拋光后電極尖端直徑約為3 mm，充灌電極液后電極電阻為 1-3ΜΩ。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過 2°C。采用SigmaPlot 9. O軟件分析實驗結(jié)果。2、實驗結(jié)果2. 1 HWTX-XVI的分離純化二維色譜是一種非常有效的分離純化的方法，通過陽離子交換HPLC以及反相HPLC兩 步分離，我們從虎紋捕鳥蛛粗毒中成功分離到HWTX-XVI。圖1是虎紋捕鳥蛛粗毒的陽離子 交換HPLC圖譜，在觀0 nm波長下檢測，可觀察到8個非常明顯的洗脫峰，其中第2個峰是 目的峰，經(jīng)MALDI-T0F質(zhì)譜鑒定該峰內(nèi)含有多種組分。收集此峰后，在Waters 515 pump & Empower高效液相色譜工作站上進行脫鹽處理和反相HPLC分離純化，所得圖譜見圖2，出現(xiàn) 多個主峰。收集目的峰并冷凍干燥后，在Alliance系統(tǒng)上進行再次反相HPLC(見圖3)。圖 中顯示含HWTX-XVI洗脫峰為單一峰，通過質(zhì)譜鑒定純度達到98%以上。質(zhì)譜結(jié)果表明為純 度較高的目標毒素虎紋捕鳥蛛毒素-XVI (huwentoxin-XVI，HWTX-XVI )，分子量4437. 4 Da (見圖4)。HWTX-XVI的序列測定在491-A測序儀上進行。2.2 HWTX-XVI對整體動物和大鼠輸精管的影響小鼠腹腔注射大劑量(5 mg/kg體重)的HWTX-XVI后，未觀察到異常的生理反應。同樣 美洲蜚蠊腹腔注射200 mg/g HWTX-XVI也未發(fā)現(xiàn)異常的生理反應。與空白對照相反，1 uM HWTX-XVI能快速抑制低頻率電刺激誘導的大鼠輸精管收縮，而且這種抑制作用是可逆的， 用空白溶液沖洗標本后，輸精管的收縮能在數(shù)分鐘后恢復到對照水平(圖幻。我們進一步 檢測了不同濃度HWTX-XVI對大鼠輸精管收縮的抑制作用，發(fā)現(xiàn)HWTX-XVI對大鼠輸精管收 縮的抑制呈濃度依賴性，它的半數(shù)有效抑制濃度(IC5tl)是85 士 6 nM (圖6)。上述結(jié)果表 明HWTX-XVI能抑制大鼠輸精管交感神經(jīng)末梢上的N-型鈣通道。2.3 HWTX-XVI對大鼠背根神經(jīng)細胞電壓門控鈣通道的影響我們選用大鼠背根神經(jīng)神經(jīng)元作為研究對象檢測了 HWTX-XVI對大鼠DRG細胞電壓門 控鈣通道的作用。根據(jù)生理和藥理學特性電壓門控鈣通道可分為N、L、P/Q、R、T型。根據(jù)其 通道激活電壓閾值可分為兩類高電壓激活(HVA)鈣通道和低電壓(LVA)激活鈣通道。其中 HVA鈣通道包括N-, L-，P/Q-，R-型鈣通道，而T-型鈣通道屬于LVA鈣通道。10 uM HWTX-XVI 對低閾值激活鈣通道沒有明顯影響(見圖7)，但能抑制約45%的高電壓激活鈣通道(見圖 8)，表明HWTX-XVI能抑制部分高電壓激活鈣通道。為了研究HWTX — XVI對于HAV鈣通道 的選擇性，我們采用各種HAV鈣通道的專一性抑制劑分離電流，如GVIA是一種ω-芋螺 毒素，專一性阻斷N-型鈣電流，而nifedipine能專一性抑制L 一型鈣電流，而剩余電流通 過加入Ni2+阻斷。在本實驗中，細胞外液中加入3 uM GVIA能夠阻斷43. 6士3. 8%的N-型 鈣電流，繼續(xù)加入10 uM nifedipine可進一步抑制41 士 4. 7%的L 一型鈣電流，剩余的鈣電 流為P/Q—型和R—型，可被Ni2+完全抑制。在細胞外液加入3 uM GVIA阻斷N-型鈣電流 后，加入10 uM HWTX— XVI對于剩余的電流沒有抑制作用，而加入nifedipine和Ni2+時 電流能被完全抑制(圖9)；與之類似，在細胞外液中先加入10 uM HWTX-XVI后，繼續(xù)加入3uM GVIA對于HWTX-X-不敏感的電流沒有影響(圖10)。這一結(jié)果表明HWTX-XVI選擇性阻 斷GVIA-敏感的N-型鈣電流。另一種芋螺毒素MVIIA( ω-conotoxin MVIIA)，是一種既能 抑制N-型鈣離子通道，同時也能抑制P/Q-型鈣離子通道的抑制劑。采用相同方法比較了 HWTX-XVI與MVIIA的抑制作用，在先加入10 uM HWTX-XVI后，3 uM MVIIA能夠繼續(xù)阻斷 部分剩余電流，這與MVIIA的相關研究結(jié)果是一致的，MVIIA在較高濃度能夠部分阻斷P/Q 型鈣電流(圖11)，由此推斷HWTX-XVI對于HAV鈣通道選擇性高于MVIIA。在細胞周圍加 入10 uM的HWTX-XVI，再以相同的去極化脈沖誘導電流-電壓關系曲線，HWTX-XVI不影響 鈣電流的起始激活電壓、最大電流激活電壓和逆轉(zhuǎn)電位，說明毒素與通道的相互作用沒有 改變通道對離子通透的選擇性(圖12)。鑒于HWTX-XVI專一性阻斷N-型鈣電流，在本實驗中GVIA被用于分離N-型電流， 即每一細胞在測試的最后都加入3 uM GVIA完全阻斷N—型電流，以此作為N-型鈣電流 被100%抑制，而不同濃度的HWTX-XVI阻斷強度與它相比得出相對的阻斷比率，通過這種 方法我們獲得了 HWTX-XVI阻斷N-型鈣電流的濃效曲線(圖13)。HWTX-XVI抑制N-型鈣電 流具有濃度依賴性，它的半數(shù)有效抑制濃度(IC5tl)是60 士 5 nM (圖13)。HWTX-XVI抑制 N-型鈣電流呈現(xiàn)時間依賴性，10 uM HWTX-XVI能夠迅速阻斷N-型電流(τ。n =觀.3士2. 3 s)，但要相對慢于MAIIA和GVIA的阻斷速率(τ。n分別為17. 4 士 3. 1 s和15.4 士 2.2s)。 在HWTX-XVI完全阻斷N-型電流后，通過外液灌流2 min內(nèi)能夠恢復至對照的92 % ( τ。ff = 64.8 士 3.2 s)，MVIIA完全阻斷通過4 min的灌流能夠恢復約41%的電流，而GVIA的阻斷 效應幾乎不能恢復(圖14)?？傊诒狙芯恐形覀儚幕⒓y捕鳥蛛毒液分離和鑒定到了一種新型的鈣通道毒 素。HWTX-XVI能夠阻斷大鼠DRG神經(jīng)元上GVIA敏感的N —型鈣通道，它的低毒性和可逆性 使之有希望成為開發(fā)治療N —型鈣通道相關疾病的先導分子?；⒓y捕鳥蛛毒素-XVI的氨基酸序列為CysIleGly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn AspProArgCysCysSerGly15 1015LeuValCys Leu Lys Pro Thr Leu His Gly lie TrpTyrLysSerTyrTyrCys2025 3035TyrLysLys0
權(quán)利要求
1. 一種虎紋捕鳥蛛毒素-XVI，其特征在于該毒素是從虎紋捕鳥蛛粗毒中經(jīng)離子交換 和反相高效液相色譜分離提純得到的，其多肽的氨基酸序列如下Cys lie Gly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn Asp Pro Arg Cys Cys Ser Gly Leu Val Cys Leu Lys Pro Thr Leu His Gly lie Trp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Cys Tyr Lys Lys0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種虎紋捕鳥蛛毒素-XVI，是從虎紋捕鳥蛛粗毒中經(jīng)離子交換和反相高效液相色譜分離提純得到的，其一級結(jié)構(gòu)由39個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵，分子量為4437.4Da；該毒素純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明；對大鼠背根神經(jīng)元N-型鈣通道的半數(shù)最大抑制濃度為60nmol/L，是一種很強的選擇性作用于N-型鈣通道的抑制劑。
文檔編號C07K14/435GK102050874SQ201010565098
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者張東裔, 曾雄智, 梁宋平, 肖玉成, 鄧梅春 申請人:中國人民解放軍國防科學技術大學, 湖南師范大學