專利名稱：虎紋捕鳥蜘蛛毒素的提取與應用的制作方法
技術領域：
生物化學與分子生物學技術。
現(xiàn)有技術天然生物毒素在神經(jīng)生物學、神經(jīng)遞質受體和離子通道等基礎研究中已成為十分重要的工具試劑，同時在藥理學、臨床醫(yī)學等領域也有重要應用。蜘蛛毒是天然動物毒素的一個重要領域，由于其含量少和采毒的相對困難，對它的研究和開發(fā)沒有如蛇毒和蝎毒那樣深入和廣泛。目前國內外已做過分離純化工作的蜘蛛毒有漏斗蛛(A.robustus和A.aperta)、平甲蛛(L，reclusa)、黑寡婦蛛(L，tredecimgutatus)以及我國的穴居狼蛛(L，singoriansis)等，但只有很少數(shù)分離純化的毒素完成了化學結構測定。虎紋捕鳥蜘蛛(Selenocosmia huwena)是最近在我國發(fā)現(xiàn)的蜘蛛新種，本專利發(fā)明人摸索出一種新的有效采取其毒液的方法，并通過反相與離子交換高效液相色譜分離純化了虎紋捕鳥蛛毒素-I，完成了其化學結構測定，從其化學結構分析它是一種不同于任何已知動物毒素(包括已知蜘蛛毒素)的一種新的神經(jīng)毒素。
發(fā)明的目的本研究開發(fā)的目的是從蜘蛛毒中分離出在神經(jīng)生物學、藥理學和臨床醫(yī)療學的基礎研究和應用中有價值的新的神經(jīng)毒素分子。上述huwentoxin-I毒素的化學結構和性質證明它符合我們原定研究的目的。
發(fā)明的內容和方案虎紋捕鳥蜘蛛是在我國云南廣西交界的山區(qū)發(fā)現(xiàn)的新種，從野外捕來之后在實驗室飼養(yǎng)1-2年之后進行采毒。
1.粗毒的采取;2.粗毒的分離純化;3.進行藥理學性質和生理活性測定等。
特點與應用上述huwentoxin-I的化學結構不同于目前已知的所有天然毒素的結構，經(jīng)過檢測，證明其為一新的神經(jīng)毒素，不與已知其他毒素同源。在目前已知化學結構的蜘蛛毒素中它是首個確定含有三對二硫鍵的毒素。
由于該毒素能不可逆阻斷神經(jīng)肌肉接頭傳遞，因而可以作為一種試劑工具應用在膽堿能的突觸傳遞和突觸后膜受體的神經(jīng)生物學研究中，同時在藥理學研究中也有應用前景。
實施例(1)毒液的采集和huwentoxin-I的分離純化將3-4根長為4厘米內徑為1.5毫米的透明塑料軟管捆成一束作為誘物，用大鑷子從側面夾住蜘蛛胸部，蜘蛛便張開螯爪，這時將軟管束誘物送入螯爪下，它即用觸肢抱住軟管束，將螯爪有力地刺入軟管內射出毒液。由于每只蜘蛛的兩個螯爪通常并不同時射毒，而且每次每個螯爪不一定射出全部毒液，因而上述過程需進行多次。射毒后從螯爪下慢慢抽出軟管束，用微量注射器將其中的毒液抽出，經(jīng)冰凍干燥后得到的白色(略帶黃色)干粉即為粗毒。
將1-3毫克上述粗毒溶于200微升雙蒸水中，上樣到事先用0.1%三氯乙酸平衡好的C4反相色譜柱中(美國Waters公司出品，Delta pak，C4300 A，30×0.46cm)，用0%-70%乙腈梯度洗脫，柱溫45℃，時間120分鐘，流速0.7ml/min。洗脫結果共分到約23個紫外吸收峰(220nm)(見附圖-1)，其中的A峰即含有huwnetoxin-I，收集A峰洗脫液，冰凍干燥后溶于雙蒸水中，上樣到事先用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)平衡的WCX-1離子交換高效液相色譜柱中(日本島津公司，5×0.4 cm)，用0%-45% 1M乙酸鈉(pH 7.0)，溶液梯度洗脫，時間30分鐘，流速0.8ml/min，結果得到兩個紫外吸收峰(220nm)(見附圖-2)，其中第二個峰即為huwentoxin-I。將第二峰收集液用國產(chǎn)YWG-C18柱脫鹽后，冰凍干燥即為純凈的產(chǎn)品。用上述方法得到的huwentoxin-I用SDS凝膠電泳和等電點聚焦電泳測試皆為一條區(qū)帶。
huwentoxin-I經(jīng)MilliGen 6600型蛋白質順序分析儀多次測定，以及系統(tǒng)二硫鍵定位法測定出其化學結構如下

上述化學結構除得到氨基酸組成分析、羧肽酶Y降解分析實驗的驗證外，另外在質譜儀上做了質譜分析，質譜測出其準確分子量為3749.3±1，與按順序分析結果計算得出的分子量3750完全吻合，并確證6個半胱氨酸殘基是以三對二硫鍵形式存在。
用小白鼠膈神經(jīng)-膈肌標本研究了huwentoxin-I的藥理學性質。將神經(jīng)肌肉標本放在標本槽內，槽內溫度維持在30-32℃，用臺氏液灌流，并通過95% CO2和5% CO2的混合氣體，50-70個氣泡/分鐘，并用電子刺激器產(chǎn)生的方波脈沖通過吸力電極刺激神經(jīng)或直接刺激肌肉，脈沖寬度0.2毫秒，刺激頻率為每分鐘12次，用半導體應變片張力傳感器將肌肉收縮的機械能轉化為電信號，經(jīng)放大后用筆描記錄儀記錄。待收縮穩(wěn)定后，換用濃度為1×10-5g/ml的huwentoxin-I(用臺氏液配制)灌流標本，觀察對肌肉收縮的影響。結果表明在上述濃度的毒素作用下，肌肉收縮幅度逐漸減小，最后停止在舒張狀態(tài)，但對直接刺激仍能產(chǎn)生正常的收縮反應，表明神經(jīng)肌肉接頭傳遞被阻斷(見附圖3)。在五例標本中，接頭傳遞完全阻斷所需時間13.4+1.3分鐘，沖洗半小時不能恢復，說明阻斷是不可逆的。如用筒箭毒與huwentoxin-I的混合液灌流標本，則可防止阻斷作用的出現(xiàn)，表明毒素的作用在突觸后，與箭毒有競爭性關系。
huwnentoxin-I對小鼠的毒性實驗結果為腹腔注射LD50為0.70mg/kg體重，腦內注射LD50為9.40μg/kg。
上述結果證明huwnetoxin-I是一種較強的哺乳動物神經(jīng)肌肉接頭傳遞的不可逆阻斷劑。


圖1 虎紋捕鳥蛛毒素經(jīng)C4反相高效液相色譜分離的圖譜其中A峰為虎紋捕鳥蛛毒素-I(HWTX-I)所在峰圖2 含有虎紋捕鳥蛛毒素-I的組份經(jīng)WCX-I離子交換柱的進一步分離純化其中第二峰為純凈的HWTX-I圖3 虎紋捕鳥蛛毒素-I對小鼠膈神經(jīng)膈肌的生理活性實驗1.未加毒前的肌肉收縮反應，A為間接刺激，B為直接刺激2.加入濃度為10-5g/ml HWTX-I后的肌肉收縮反應，A、B、C、D分別為加毒后8、10、12、14分鐘3.加毒傳遞阻斷后肌肉對直接刺激的反應
權利要求
1.一種從虎紋捕鳥蜘蛛中提新型哺乳動神經(jīng)毒素的虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅰ(huwentoxin-Ⅰ)的方法，其特征在于所述方法包括1)毒液的采集將3-4根長為4厘米內徑為1.5毫米的透明塑料軟管捆成一束作為誘物，用大鑷子從側面夾住蜘蛛胸部，蜘蛛便張開螯爪，這時將軟管束誘物送入螯爪下，它即用觸肢抱住軟管束，將螯爪有力地刺入軟管內射出毒液，上述過程可進行多次，使蜘蛛每個螯爪的毒液全部射出，射毒后從螯爪下慢慢抽出軟管束，用微量注射器將其中的毒液抽出，經(jīng)冰凍干燥后得到的白色(略帶黃色)干粉即為粗毒；2)粗毒的純化將1-3毫克上述粗毒溶于200微升雙蒸水中，上樣到事先用0.1%三氯乙酸平衡好的C4反相色譜柱中(美國Waters公司出品，Deltapak，C4300A，30×0.46cm)，用0%-70%乙腈梯度洗脫，柱溫45℃，時間120分鐘，流速0.7ml/min，洗脫結果共分到約23個紫外吸收峰(220nm)(見附圖-1)，其中的A峰即含有huwnetoxin-Ⅰ，收集A峰洗脫液，冰凍干燥后溶于雙蒸水中，上樣到事先用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)平衡的WCX-1離子交換高效液相色譜柱中(日本島津公司，5×0.4cm)，用0%-45%1M乙酸鈉(pH7.0)溶液梯度洗脫，時間30分鐘，流速0.8ml/min，結果得到兩個紫外吸收峰(220nm)(見附圖2)，其中第二個峰即為huwentoxin-Ⅰ，將第二峰收集液用國產(chǎn)YWG-C18柱脫鹽后，冰凍干燥即為純凈的產(chǎn)品，用上述方法得到的huwentoxin-Ⅰ用SDS凝膠電泳和等電點聚焦電泳測試皆為一條區(qū)帶；huwentoxin-Ⅰ經(jīng)MilliGen 6600型蛋白質順序分析儀多次測定，以及系統(tǒng)二硫鍵定位法測定出其化學結構如下
3)用小白鼠膈神經(jīng)-膈肌標本研究了huwentoxin-Ⅰ的藥理學性質；將神經(jīng)肌肉標本放在標本槽內，槽內溫度維持在30-32C，用臺氏液灌流，并通以95%CO2和5%CO2的混合氣體，50-70個氣泡/分鐘，并用電子刺激器產(chǎn)生的方波脈沖通過吸力電極刺激神經(jīng)或直接刺激肌肉，脈沖寬度0.2毫秒，刺激頻率為每分鐘12次，用半導體應變片張力傳感器將肌肉收縮的機械能轉化為電信號，經(jīng)放大后用筆描記錄儀記錄；待收縮穩(wěn)定后，換用濃度為1X10-5g/ml的huwentoxin-Ⅰ(用臺氏液配制)灌流標本，觀察對肌肉收縮的影響；結果表明在上述濃度的毒素作用下，肌肉收縮幅度逐漸減小，最后停止在舒張狀態(tài)，但對直接刺激仍能產(chǎn)生正常的收縮反應，表明神經(jīng)肌肉接頭傳遞被阻斷(見附圖-3)；在五例標本中，接頭傳遞完全阻斷所需時間為13.4+1.3分鐘，沖洗半小時不能恢復，說明阻斷是不可逆的；如用筒箭毒與huwnetoxin-Ⅰ的混合液灌流標本，則可防止阻斷作用的出現(xiàn)，表明毒素的作用在突觸后，與箭毒有競爭性關系；huwentoxin-Ⅰ對小鼠的毒性實驗結果為腹腔注射LD50為0.70mg/kg體重，腦內注射LD50為9.40μg/kg；上述結果證明huwentoxin-Ⅰ是一種較強的哺乳動物神經(jīng)肌肉接頭傳遞的不可逆阻斷劑。
2.根據(jù)權利要求12)中所述的化學結構式，其特征在于，上述化學結構除得到氨基酸組成分析、羧肽酶Y降解分析實驗的驗證外，另外在質譜儀上做了質譜分析，質譜測出其準確分子量為3749.3±1，與按順序分析結果計算得出的分子量3750完全吻合，并確證6個半胱氨酸殘基是以三對二硫鍵形式存在。
3.根據(jù)權利要求1所述的虎紋捕鳥蛛毒素-I(huwentoxin-I)，其特征在于它是由33個氨基酸殘基組成的多肽毒素，含有三對二硫鍵。
4.根據(jù)權利要求1所述虎紋捕鳥蛛毒素-I(huwentoxin-I)，其特征在于，它能作為阻止哺乳動物神經(jīng)肌肉接頭傳遞的試劑，應用于神經(jīng)生物學和藥理學研究和有關臨床實驗。
5.根據(jù)權利要求1所述虎紋捕鳥蛛毒素-I(huwentoxin-I)，其特征在于，它具有以下生物化學性質其分子量為3750道爾頓，分子量的測定方法為在質譜儀(美國Millipore)上用快原子轟擊法測定;其等電點為pI＝8.95，用等電聚焦電泳法測定;其最大紫外吸收波長為280nm;其對小鼠經(jīng)腹腔注射的半至死量為LD50＝0.70mg/kg體重，對小鼠腦內注射的半至死量為，9.4ug/kg體重。
全文摘要
“虎紋捕鳥蛛毒素-I”為一新型哺乳動物神經(jīng)毒素，它是從我國虎紋捕鳥蜘蛛中經(jīng)反相和離子交換高效液相色譜提純的，其化學結構為由33個氨基酸殘基以特定的順序組成的多肽，含有三對鏈內二硫鍵。它能不可逆地阻斷哺乳動物神經(jīng)肌肉接頭傳遞，可作為工具試劑應用于神經(jīng)生物學和藥理學研究中。
文檔編號C07K14/435GK1079475SQ9310472
公開日1993年12月15日 申請日期1993年5月10日 優(yōu)先權日1993年5月10日
發(fā)明者梁宋平, 張東裔, 周培愛 申請人:湖南師范大學, 北京大學