專利名稱：丙酮酸脫羧酶在生物合成l－苯基乙酰基甲醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物酶的應(yīng)用，更特別的，本發(fā)明涉及重組丙酮酸脫羧酶在生物合成L-苯基乙?；状贾械膽?yīng)用。
背景技術(shù)：
麻黃素是一種重要的原料藥，在對心血管系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)、平滑肌系統(tǒng)以及其它方面均有重要作用，在國內(nèi)國際原料藥市場均存在較大的需求。中國是世界最大的天然麻黃素生產(chǎn)國，天然麻黃素的生產(chǎn)方法是從麻黃草中提取，國內(nèi)的麻黃草資源主要集中在內(nèi)蒙、寧夏和新疆地區(qū)。但是，為了提取麻黃素，大量采集麻黃草已經(jīng)嚴(yán)重破壞了草場、田野的生態(tài)平衡，同時天然麻黃素在麻黃草中的含量也有所下降。因此，為保護(hù)環(huán)境及可持續(xù)發(fā)展，開發(fā)新的麻黃素生產(chǎn)方法十分必要。
現(xiàn)有技術(shù)中新的麻黃素生產(chǎn)方法有化學(xué)全合成和半生物合成。目前國際上麻黃素的主要生產(chǎn)國家之一德國就采用化學(xué)全合成方法合成麻黃素。化學(xué)全合成方法與從麻黃草中提取相比較，雖然具有質(zhì)量穩(wěn)定、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)條件惡劣，環(huán)境污染嚴(yán)重，并且存在消旋化合物的拆分問題。半生物合成技術(shù)就是將有機(jī)化學(xué)合成與現(xiàn)代生物合成技術(shù)結(jié)合，印度就是采用酵母發(fā)酵獲得丙酮酸脫羧酶，合成L-麻黃素的關(guān)鍵原料(L-PAC)，然后再進(jìn)一步合成麻黃素，這種生產(chǎn)方法成本低、反應(yīng)后處理簡單、污染少，最大的優(yōu)點(diǎn)是生物合成的產(chǎn)物是手性的。酵母活細(xì)胞合成和純化的丙酮酸脫羧酶合成各有優(yōu)缺點(diǎn)酵母活細(xì)胞合成可以利用自身糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸，而不用另外添加，但芳香族副產(chǎn)物多，L-PAC產(chǎn)量低且回收麻煩；純化的酶合成具有L-PAC產(chǎn)量高，副產(chǎn)物少，但是天然酶的提純、回收無疑增加了生產(chǎn)成本。
因此，本技術(shù)領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種生產(chǎn)成本低、易于回收、比活高且質(zhì)量穩(wěn)定的丙酮酸脫羧酶，以及開發(fā)一種能夠高效地應(yīng)合成L-PAC的方法，為化學(xué)合成麻黃素提供了一種穩(wěn)定、高性能的底物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種易于回收、比活高且質(zhì)量穩(wěn)定的丙酮酸脫羧酶。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述丙酮酸脫羧酶的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述丙酮酸脫羧酶制備L-苯基乙酰基甲醇的方法。
在本發(fā)明的一個方面，提供一種催化劑，所述催化劑用于生物合成L-苯基乙?；状?，所述催化劑為固定化的催化劑，包括固相載體和固定于所述固相載體上的丙酮酸脫羧酶。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸脫羧酶是重組丙酮酸脫羧酶。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的固相載體為EUPERGITC(DEGUSSA)。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備所述的用于生物合成L-苯基乙?；状嫉拇呋瘎┑姆椒ǎ韵虏襟E按照1g干重的載體加1.5-2.5ml(如2ml)10-70U/ml(優(yōu)選30-60U/ml；如50U/ml)丙酮酸脫羧酶酶液、3-5ml(如4ml)0.4-0.6M(如0.5M)磷酸鉀緩沖液的比例混合，于4-8℃放置24-48小時，除去未固定的酶及雜質(zhì)，獲得固定化的催化劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸脫羧酶是重組丙酮酸脫羧酶。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的固相載體為EUPERGITC(DEGUSSA)。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種用所述的催化劑合成L-苯基乙?；状嫉姆椒?，包含步驟將pH值為5.5-7.0，苯甲醛濃度為150-250mM(優(yōu)選175-225mM，比如200mM)、丙酮酸鹽濃度為150-250mM(優(yōu)選175-225mM，比如200mM)的混合水溶液，與權(quán)利要求1所述的催化劑接觸，其中固定化的丙酮酸脫羧酶的濃度達(dá)到5-50U/ml，在10-20℃下反應(yīng)0.5-5小時，從而形成L-苯基乙?；状?。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，加入磷酸鉀緩沖液使磷酸鉀濃度達(dá)到20-60mM。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為13-17℃。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，PH值5.5-6.5。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，反應(yīng)進(jìn)行1-3小時。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述水溶液中，苯甲醛和丙酮酸鹽的摩爾比為0.8∶1.2-1.2∶0.8。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，將苯甲醛、丙酮酸鹽以1∶1的比例混合在水中，加入丙酮酸脫羧酶使之濃度達(dá)到10-20U/ml，加入磷酸鉀緩沖液使之濃度達(dá)到35-45mM，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為15-17℃，PH值5.5-6.5，反應(yīng)進(jìn)行1-3小時。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在反應(yīng)體系中還加入乙醇(作為增溶劑)，使之濃度達(dá)到1-3mol/L。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸鹽為丙酮酸鈉。
在本發(fā)明的第四方面，提供所述的丙酮酸脫羧酶催化劑的用途，用于制備L-苯基乙?；状肌?br> 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1.PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中，泳道1DNA分子量標(biāo)記(Maker)，泳道2PDC的基因片斷。
圖2.PDC的表達(dá)，其中，泳道1蛋白質(zhì)分子量Maker，泳道2誘導(dǎo)表達(dá)前，泳道3誘導(dǎo)表達(dá)后。
圖3.A反應(yīng)溫度對L-PAC產(chǎn)量的影響。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，400mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時。
圖4反應(yīng)溫度對L-PAC產(chǎn)量的影響(II)。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時。
圖5.反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響(I)。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液，反應(yīng)3小時，16℃。
圖6.反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響(II)。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液，反應(yīng)3小時，16℃。
圖7.乙醇助溶對L-PAC產(chǎn)量的影響。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，7U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時，16℃。
圖8.苯甲醛在反應(yīng)體系內(nèi)的分散狀態(tài)對L-PAC產(chǎn)量的影響。
圖9.PDC的活性對L-PAC產(chǎn)量的影響。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，400mM丙酮酸鈉，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時，15℃。
圖10.PDC的活性對L-PAC產(chǎn)量的影響。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，rScPDC 7U/ml，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時，15℃。
圖11.反應(yīng)時間對L-PAC產(chǎn)量的影響(II)。反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉或400mM丙酮酸鈉，PDC 10U/ml，30μM TPP，3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，15℃。
圖12.固定化酶反應(yīng)器的示意圖，其中，1為pH監(jiān)控和補(bǔ)丙酮酸裝置；2為補(bǔ)充底物裝置，其中有磁力攪拌裝置；3為收集產(chǎn)物的裝置，可在收集產(chǎn)物的容器置于冰盒中；4和5為泵；反應(yīng)器外層設(shè)置冷卻水裝置，6為冷卻水進(jìn)口，7為冷卻水出口。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和探索，首次將丙酮酸脫羧酶(PDC)固定在合適的載體上，從而制得了固定化的丙酮酸脫羧酶。使用本發(fā)明的固定化的丙酮酸脫羧酶，可以在每批生物催化反應(yīng)后方便地回收酶，實(shí)現(xiàn)酶的反復(fù)利用，降低生物合成的成本。并且，本發(fā)明人對利用苯甲醛和丙酮酸鹽在丙酮酸脫羧酶的催化下生成L-苯基乙?；状嫉墓に嚥襟E進(jìn)行了條件優(yōu)化，使得能耗大大降低，丙酮酸鹽的轉(zhuǎn)化率大大提高?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
丙酮酸脫羧酶可用于本發(fā)明的丙酮酸脫羧酶為自然存在的丙酮酸脫羧酶，或者為采用基因工程技術(shù)獲得的重組丙酮酸脫羧酶。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明人應(yīng)用現(xiàn)代基因工程技術(shù)，用大腸桿菌高效表達(dá)丙酮酸脫羧酶，獲得重組丙酮酸脫羧酶，所述重組丙酮酸脫羧酶具有比活高，質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人還將之成功的應(yīng)用于生物合成L-苯基乙?；状?L-PAC)，為化學(xué)合成麻黃素提供了一種高性能的底物。
PDC在自然界中分布情況是廣泛存在于植物、真菌中，有一些細(xì)菌中也有，動物體內(nèi)沒有。根據(jù)文獻(xiàn)資料以及本發(fā)明人可獲得的菌種，本發(fā)明人分別克隆了幾種來自細(xì)菌和酵母的PDC基因，并分別以大腸桿菌和酵母作為宿主菌表達(dá)。經(jīng)比較脫羧活性和生物轉(zhuǎn)化活性，選定最佳的重組PDC，并對其生化特征作了較全面的研究，確定可作為工業(yè)化的用途。
固定化載體在本發(fā)明中，丙酮酸脫羧酶的固定化，即用固體材料將丙酮酸脫羧酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用。一般的酶固定化技術(shù)可分為吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法，通常根據(jù)酶和載體的性質(zhì)的不同進(jìn)行選擇。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，固定化丙酮酸脫羧酶所用的載體為EUPERGITC(DEGUSSA)。通過聚甲基丙烯酸表面帶有的環(huán)氧基團(tuán)打開后與酶分子形成共價結(jié)合實(shí)現(xiàn)酶的固定化。
本發(fā)明人將PDC固定在合適的載體上，可以在每批生物催化反應(yīng)后方便的回收酶，從而實(shí)現(xiàn)酶的反復(fù)利用，降低生物合成的成本。一個改進(jìn)后重新設(shè)計的固定化酶反應(yīng)器可通過連續(xù)添加原料和提取產(chǎn)物并回收未用完的原料使固定化酶反應(yīng)的效率大為提高，生產(chǎn)成本具竟?fàn)巸?yōu)勢。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，固定化所用的載體為EUPERGITC(DEGUSSA)，固定化的緩沖液為0.4-0.6M磷酸鉀緩沖液(KH2PO4/K2HPO4)(PH6.0±0.5)。按1g干重的載體加1.5-2.5ml酶液、3-5ml 0.4-0.6M磷酸鉀緩沖液(PH6.0)的比例混合于適當(dāng)大小的可密封的容器中，溫和的混勻，于4℃-8℃放置24-48小時，如果液體體積較大，在固定過程中可以溫和攪拌。固定好后，將其全部加到有砂芯的漏斗中，濾去液體，待液體自然滴干后使用10倍樹脂體積0.5M KH2PO4/K2HPO4(PH6.0)沖洗至少6次，以便去除未固定的酶及雜質(zhì)。最后，用真空泵抽約70秒，去除樹脂中的殘留水，以便精確稱重。固定化好的酶可以存放在4℃冰箱，存于0.1M KH2PO4/K2HPO4(PH6.0)中，加入2％的異丙酮作為防腐劑。
采用上述的方法，固定化好的丙酮酸脫羧酶，其酶活性非常高，保持在35-45％，并且便于回收，以及反復(fù)使用。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明將PDC固定在合適的載體上，可以在每批生物催化反應(yīng)后方便地回收酶，從而實(shí)現(xiàn)酶的反復(fù)利用，降低生物合成的成本。
(2)本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)最佳溫度為15℃，而現(xiàn)有技術(shù)中的反應(yīng)在4℃進(jìn)行，反應(yīng)條件更易于達(dá)到，并且大大降低生產(chǎn)能耗。
(3)本發(fā)明的丙酮酸鈉的轉(zhuǎn)化率在較佳的反應(yīng)條件下可高達(dá)80％，與現(xiàn)有技術(shù)中的一般的水平(低于50％)相比，降低了底物帶來的成本。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因克隆與表達(dá)根據(jù)以下PDC基因序列TTTTTCCGACCNAAACCNGGTTTCCGTTGAATCTGCTGACTTGATTTTGTCTGTCGGTGC
TTTGTTGTCTGATTTCAACACCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACCACATGAAGATCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAATTCGTTTTGCAAAAGTTGTTGACCACTATTGCTGACGCCGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTGCTGTCCCAGCTAGAACTCCAGCTAACGCTGCTGTCCCAGCTTCTACCCCATTGAAGCAAGAATGGATGTGGAACCAATTGGGTAACTTCTTGCAAGAAGGTGATGTTGTCATTGCTGAAACCGGTACCTCCGCTTTCGGTATCAACCAAACCACTCTCCCAAACAACACCTACGGTATCTCTCAAGTCTTATGGGGTTCCATAGGTTTCACCACTGGTGCTACCTTGGGTGCTGCTTTCGCTGCTGAAGAAATTGATCCAAAGAAGAGAGTTATCTTATTCATTGGTGACGGTTCTTTGCAATTGACTGTTCAAGAAATCTCCACCATGATCAGATGGGGCTTGAAGCCATACTTGTTCGTCTTGAACAACGATGGTTACACCATTGAAAAGTTGATTCACGGTCCAAAGGCTCAATACAACGAAATTCAAGGTTGGGACCACCTATCCTTGTTGCCAACTTTCGGTGCTAAGGACTATGAAACCCACAGAGTCGCTACCACCGGTGAATGGGACAAGTTGACCCAAGACAAGTCTTTCAACGACAACTCTAGATCAGAATGATTGAAATCATGTTGCCAGTCTTCGATGCTCCACAAAACTTGGTTGAACAAGCTAAGTTGACTGCTGCTACCAACGCTAACAATAAGGATCCGAATTCGACTCCGTCGACANGCTGGCGGCNGCACTCGAAATCAAACG(SEQ ID NO1)，(其中，N選自A、C、T或G中的一種)；或根據(jù)從生物信息服務(wù)國家中心(National Center of BiotechnologyInformation Service)獲得的序列g(shù)i|1360374|emb|Z73216.1|SCYLR044C；通過常規(guī)方法設(shè)計如下特異性引物PM2-a(SEQ ID NO2)ATGC CATATG TCT GAA ATT ACT TTG GG；PM2-b(SEQ ID NO3)ACGT GGATCC TTA TTG CTT AGC GTT GGT AG。
利用常規(guī)的PCR擴(kuò)增技術(shù)得到PDC的基因片斷，經(jīng)電泳檢測是正確的片斷。結(jié)果見圖1，其中，泳道1為DNA分子量Maker，泳道2為正確的PDC基因片斷。
將基因片斷克隆至表達(dá)載體PET25b(+)(購自Novagen公司，Madison，WI)的NdeI/BamHI酶切位點(diǎn)，采用常規(guī)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)PDC。菌體培養(yǎng)采用的基為胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl g/L，PH7.4。加入誘導(dǎo)劑(IPTG)前培養(yǎng)于37℃，加入誘導(dǎo)劑后培養(yǎng)于25℃。
結(jié)束培養(yǎng)后離心收集菌體，重懸于1/20原始培養(yǎng)液體積的0.5MKH2PO4/K2HPO4(PH6.0)的緩沖液(含有30μM TPP，0.5mM MgSO4，以下若不特別說明，所有磷酸鉀緩沖液中都包含這兩種濃度的輔因子)。
上述菌體的蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果見圖2，其中，泳道1為蛋白質(zhì)分子量Maker，泳道2為誘導(dǎo)表達(dá)前的蛋白表達(dá)，泳道3誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白表達(dá)。
實(shí)施例2脫羧活性的測定2.1脫羧活性的測定的機(jī)理一個酶活力單位(1U)定義為在25℃，PH6.0時，可以將1.0μmol丙酮酸脫羧轉(zhuǎn)化為乙醛的酶活力。直接測定丙酮酸的消耗或乙醛的生成比較困難，可以將乙醛的還原與NADH的氧化偶聯(lián)，當(dāng)NADH被氧化為NAD后，其在340nm處吸光度值降低，用分光光度計測定在340nm吸光度的變化值，與標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸脫羧酶(Sigma Lot.61k7500)對照，為重組PDC脫羧活性定量。
脫羧活性的測定的機(jī)理如下

2.2脫羧活性測定的方法按照表1的脫羧活性測定反應(yīng)體系進(jìn)行測定。
表1.脫羧活性測定反應(yīng)體系的組成

反應(yīng)體系按表1配制，每個反應(yīng)體系5ml，25℃孵育20分鐘。測定340nm處吸光度的變化。
用標(biāo)準(zhǔn)酶作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，可以取0.08U/5ml、0.04U/5ml、0.02U/5ml、0.01U/5ml、0.005U/5ml五點(diǎn)。樣品稀釋至0.02U/5ml左右。
實(shí)施例3生物合成L-PAC3.1生物合成L-PAC以及后續(xù)合成L-麻黃素的機(jī)理如下 3.2生物合成L-PAC反應(yīng)的檢測3.2.1氣相色譜-質(zhì)譜樣品處理500μl反應(yīng)液用等體積二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。
儀器型號GC-17A，GCMS-QP5050(SHIMADZU)柱子型號DB-1 0.25μm*0.25mm*30m載氣He氣操作條件40℃(保持2min)，40℃→180℃(10℃/min)，180℃→280℃(30℃/min)，280℃(保持5min)3.2.2核磁共振樣品處理500μl反應(yīng)液用等體積二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。用無水硫酸鎂除去水分，氘代氯仿處理。
儀器型號Varian Mercury-Vx 300MHz核磁共振儀3.2.3高效液相色譜儀器型號HP1100柱子型號Zorbax SB C18操作條件流動相為甲醇和水，并且甲醇∶水＝80∶20，流速為1ml/min；UV254nm檢測。
3.2.4α-萘酚顯色500μl反應(yīng)液用等體積二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。取50μl(約含L-PAC 30～400μg)溶于50％的乙醇，加1ml 0.5％(m/v)和1ml α-萘酚溶液(1gα-萘酚溶于20ml，2.5mol/L的NaOH)混合?；旌衔飶氐渍袷?，置暗處反應(yīng)30分鐘，用分光光度計測580nm下吸光度。30分鐘時顏色完全顯現(xiàn)，而后保持穩(wěn)定30分鐘。
3.2.5薄層層析用于及時跟蹤反應(yīng)情況固定相硅膠 展開劑二氯甲烷∶甲醇(20∶1)檢測方法紫外燈下觀察(L-PAC和苯甲醛均可被觀察到)和鉬酸銨-硫酸顯色法。
鉬酸銨-硫酸溶液配制方法20g鉬酸銨溶于100ml水，滴加20ml 98％硫酸，加水至300ml。將層析板在鉬酸銨-硫酸溶液中浸一下，熱風(fēng)吹干，L-PAC即顯藍(lán)色，苯甲醛不顯色。
3.3生物合成L-PAC反應(yīng)條件的優(yōu)化3.3.1反應(yīng)溫度對L-PAC產(chǎn)量的影響為了了解反應(yīng)溫度對L-PAC產(chǎn)量的影響，本發(fā)明人試驗(yàn)了4℃-25℃范圍內(nèi)。
(1)反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，400mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時。反應(yīng)溫度對L-PAC產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3和表2。
(2)反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時。反應(yīng)溫度對L-PAC產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖4和表3。
因此可以看到從4℃-17℃，隨著反應(yīng)溫度的升高，L-PAC產(chǎn)量也升高；從17℃-25℃，隨著溫度升高，L-PAC產(chǎn)量顯著下降。L-PAC的產(chǎn)量在15℃-17℃達(dá)到高峰。本發(fā)明人選定15℃-17℃為最佳的反應(yīng)溫度范圍。在此溫度范圍內(nèi)，不但可以得到最高的L-PAC產(chǎn)量，而且與4℃相比，滿足了工業(yè)上將低能耗的要求。在反應(yīng)溫度方面，本發(fā)明人的重組PDC比天然酶占有優(yōu)勢。
表2

表3

3.3.2反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響為了了解反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響，本發(fā)明人試驗(yàn)了PH5-PH8范圍內(nèi)反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響。緩沖體系PH值由調(diào)節(jié)K2HPO4與KH2PO4的比例達(dá)到。
(1)反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液，反應(yīng)3小時，16℃。反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響(I)結(jié)果見圖5和表4。
(2)反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，20U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液，反應(yīng)3小時，16℃。反應(yīng)PH值對L-PAC產(chǎn)量的影響(II)見圖6和表5。
因此可以看到16℃反應(yīng)時PH6.0為最佳的反應(yīng)PH值。在PH6.0正負(fù)0.5的范圍內(nèi)，L-PAC產(chǎn)量可保持較令人滿意的水平。PH值小于5.5或大于7.0時，L-PAC產(chǎn)量顯著下降。
表4

表5

3.3.3苯甲醛在反應(yīng)體系內(nèi)的分散狀態(tài)對L-PAC產(chǎn)量的影響苯甲醛僅微溶于水(溶解度0.3g/100ml)，直接加入水相中會以大油珠狀態(tài)存在，因此限制了苯甲醛與酶的結(jié)合機(jī)率。向反應(yīng)體系內(nèi)添加有機(jī)溶劑增加苯甲醛的溶解度，就可能增加L-PAC的產(chǎn)量。PDC擁有憎水底物結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對于L-PAC的生成可能十分重要。苯甲醛易溶于乙醇，乙醇又比水的極性弱，使苯甲醛更易于同酶的憎水位點(diǎn)結(jié)合。同時據(jù)報道PDC對乙醇有一定的耐受性，因此本發(fā)明人選定乙醇作為增溶劑。
反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，7U/ml PDC，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時，16℃。乙醇助溶對L-PAC產(chǎn)量的影響見圖7和表6。
因此可以看到，L-PAC的產(chǎn)量在乙醇濃度1mol/L到3mol/L時，隨乙醇濃度增加而增加。在乙醇濃度3mol/L時，L-PAC產(chǎn)量比乙醇1mol/L時提高了21％。繼續(xù)提高乙醇濃度，L-PAC的產(chǎn)量急劇下降。綜合數(shù)據(jù)，本發(fā)明人選定2mol/L乙醇助溶。
表6

但加乙醇并不能徹底解決苯甲醛的溶解度問題，本發(fā)明人采用超聲波乳化，幫助苯甲醛在反應(yīng)體系內(nèi)均勻分散，收到了良好的效果。效果的改善情況見圖8。
3.3.4PDC的酶量對L-PAC產(chǎn)量的影響本發(fā)明人試驗(yàn)了苯甲醛為200Mm時，PDC的酶量對L-PAC產(chǎn)量的影響。
反應(yīng)體系組成如下200mM苯甲醛，400mM丙酮酸鈉，30μM TPP，0.3mMMgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時，15℃。
結(jié)果見圖9和表7。由此可以看到，L-PAC產(chǎn)量并不是隨PDC活性的增加而線性增加，在5U/ml后L-PAC產(chǎn)量的增幅減小。考慮到酶的成本，可以選定10-20U/ml。
表7

3.3.5磷酸鉀緩沖液濃度對L-PAC產(chǎn)量的影響考慮到鹽離子濃度對反應(yīng)成本及廢水處理的影響，本發(fā)明人研究了磷酸鉀緩沖液濃度對L-PAC產(chǎn)量的影響。
反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，rScPDC 7U/ml，30μM TPP，0.3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，反應(yīng)3小時，15℃。結(jié)果見圖10和表8。
由此可以看到，不加磷酸鉀緩沖液時L-PAC產(chǎn)量很低。因此選取40mM濃度較佳，確保緩沖能力。
表8

3.3.6反應(yīng)時間對L-PAC產(chǎn)量的影響本發(fā)明人研究了2hr-7hr范圍內(nèi)隨時間延長L-PAC產(chǎn)量的情況，以便及時收獲產(chǎn)物。
反應(yīng)體系組成200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉或400mM丙酮酸鈉，PDC10U/ml，30μM TPP，3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，15℃。反應(yīng)時間對L-PAC產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖11和表9。
由此可以看到，當(dāng)?shù)孜锱浔葹?∶1(200mM苯甲醛∶200mM丙酮酸鈉)，加入酶量為10U/ml時，15℃反應(yīng)兩小時產(chǎn)量最高，自兩小時后，L-PAC產(chǎn)量緩慢下降。則反應(yīng)兩小時就可以收獲產(chǎn)物，可達(dá)L-PAC 24g/L。
表9

綜上，當(dāng)生物轉(zhuǎn)化條件為200mM苯甲醛，200mM丙酮酸鈉，PDC 10U/ml，30μM TPP，3mM MgSO4.7H2O，40mM磷酸鉀緩沖液(PH6.0)，15℃反應(yīng)2小時，L-PAC產(chǎn)量可高于20g/L(如24g/L)。
實(shí)施例4丙酮酸脫羧酶的固定化將PDC固定在合適的載體上，可以在每批生物催化反應(yīng)后方便地回收酶，從而實(shí)現(xiàn)酶的反復(fù)利用，降低生物合成的成本。
本實(shí)施例中，固定化所用的載體為EUPERGITC(DEGUSSA)(表面帶有環(huán)氧基團(tuán)的聚甲基丙烯酸)，固定化的緩沖液為0.5M KH2PO4/K2HPO4(含有30μM TPP，0.5mM MgSO4，PH6.0)。按1g干重的載體加2ml酶液，4ml 0.5M磷酸鉀緩沖液(PH6.0)的比例混合于適當(dāng)大小的可密封的容器中，溫和地混勻，于4-8℃放置24-48小時。如果液體體積較大，在固定過程中可以溫和攪拌。固定好后，將其全部加到有砂芯的漏斗中，濾去液體，待液體自然滴干后使用10倍樹脂體積0.5M KH2PO4/K2HPO4(PH6.0)沖洗至少6次，以便除去固定的酶及雜質(zhì)。最后，用真空泵抽約70秒，去除樹脂中的殘留水，以便精確稱重。
固定化好的酶可以存放在4℃冰箱，存于0.1mM KH2PO4/K2HPO4(PH6.0)中，加入2％的異丙酮作為防腐劑。
丙酮酸脫羧酶固定化后，其酶活性仍保持在35-45％。
實(shí)施例5固定化的丙酮酸脫羧酶生產(chǎn)L-PAC固定化的丙酮酸脫羧酶用于生產(chǎn)L-PAC，整個反應(yīng)可在很短的時間內(nèi)完成。丙酮酸脫羧酶脫羧活性和L-PAC的合成速率與非固定化的丙酮酸脫羧酶催化反應(yīng)相仿，但由于采用了固定化酶的形式，產(chǎn)物可被連續(xù)性地被從反應(yīng)器中提取出去，高濃度產(chǎn)物對丙酮酸脫羧酶的抑制大為減低，從而大大提高了L-PAC的合成效率。
并且，經(jīng)過本發(fā)明人試驗(yàn)，固定化的丙酮酸脫羧酶可被反復(fù)使用6-7次。未被消耗的底物也可被回收后進(jìn)一步利用。
固定化酶反應(yīng)器示意圖見圖12。
綜合上述所有因素，固定化的丙酮酸脫羧酶用于生產(chǎn)L-PAC具有提高產(chǎn)量和降低成本的優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海單抗制藥技術(shù)有限公司<120>丙酮酸脫羧酶在生物合成L-苯基乙酰基甲醇中的應(yīng)用<130>057979<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>943<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n is a，c，g，or t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n is a，c，g，or t<220>
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tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag ttgacccaag acaagtcttt780caacgacaac tctagatcag aatgattgaa atcatgttgc cagtcttcga tgctccacaa840aacttggttg aacaagctaa gttgactgct gctaccaacg ctaacaataa ggatccgaat900tcgactccgt cgacangctg gcggcngcac tcgaaatcaa acg 943<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.一種催化劑，所述催化劑用于生物合成L-苯基乙?；状?，其特征在于，所述催化劑為固定化的催化劑，包括固相載體和固定于所述固相載體上的丙酮酸脫羧酶。
2.如權(quán)利要求1所述的催化劑，其特征在于，所述的丙酮酸脫羧酶是重組丙酮酸脫羧酶。
3.如權(quán)利要求1所述的催化劑，其特征在于，所述的固相載體為EUPERGITC。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的用于生物合成L-苯基乙?；状嫉拇呋瘎┑姆椒?，其特征在于，包含以下步驟按照1g干重的載體加1.5-2.5ml 10-70U/ml丙酮酸脫羧酶酶液、3-5ml0.4-0.6M磷酸鉀緩沖液的比例混合，于4-8℃放置24-48小時，除去未固定的酶及雜質(zhì)，獲得固定化的催化劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的丙酮酸脫羧酶是重組丙酮酸脫羧酶。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的固相載體為EUPERGITC。
7.一種用權(quán)利要求1所述的催化劑合成L-苯基乙?；状嫉姆椒?，其特征在于，包含步驟將pH值為5.5-7.0，苯甲醛濃度為150-250mM、丙酮酸鹽濃度為150-250mM的混合水溶液，與權(quán)利要求1所述的催化劑接觸，其中固定化的丙酮酸脫羧酶的濃度達(dá)到5-50U/ml，在10-20℃下反應(yīng)0.5-5小時，從而形成L-苯基乙酰基甲醇。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述水溶液中，苯甲醛和丙酮酸鹽的摩爾比為0.8∶1.2-1.2∶0.8。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的丙酮酸鹽為丙酮酸鈉。
10.如權(quán)利要求1所述的催化劑的用途，其特征在于，用于制備L-苯基乙酰基甲醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種催化劑，所述催化劑用于生物合成L－苯基乙?；状迹⑶?，所述催化劑為固定化的催化劑，包括固相載體和固定于所述固相載體上的丙酮酸脫羧酶(PDC)。本發(fā)明將PDC固定在合適的載體上，可以在每批生物催化反應(yīng)后方便地回收酶，從而實(shí)現(xiàn)酶的反復(fù)利用，降低生物合成的成本。
文檔編號C12P7/22GK101078010SQ200610026750
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者陳克勤, 岳寧, 邱薇, 鄭建紅, 包維麗, 徐琳娟, 黃大慶 申請人:上海單抗制藥技術(shù)有限公司