專利名稱：鹽芥花時相關(guān)基因、編碼蛋白及其克隆方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC、編碼蛋白及其克隆方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生長在華東地區(qū)海灘鹽土上的本土植物鹽芥，可以在超過500mM NaCl的土壤中完成生活史，還能忍受-15℃的低溫，是科學(xué)家們研究植物抗逆性的寶貴資源。鹽芥屬十字花科，Thellungiella屬，具有作為模式材料的優(yōu)良特征1.個體小，與模式植物擬南芥相當；2.自花傳粉，需要時亦可方便地進行雜交；3.基因組簡單(基因組大小約為擬南芥的兩倍)；其基因序列與擬南芥基因序列具有很高的同源性。但美中不足的是，鹽芥的生命周期太長，實驗室培養(yǎng)條件下，從播種到開花需要10-12個月左右，經(jīng)過1個月左右的4℃低溫處理，即春化處理后，其生活史才能縮短到3-4個月。鹽芥過長的生命周期以及對春化作用的強烈依賴，不僅帶來操作上的不便，而且大大減慢了遺傳分析的進程。這是鹽芥作為模式研究材料的一大缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC。
本發(fā)明的目的之二在于提供鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC的編碼蛋白。
本發(fā)明的目的之三在于提供鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC的克隆方法。
本發(fā)明的目的之四在于提供一種在早花型擬南芥中表達鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC推遲早花型擬南芥的開花時間的方法。
本發(fā)明的目的之五在于提供一種抑止鹽芥中花時相關(guān)基因ThFLC縮短鹽芥開花時間的方法。
一定時期的低溫處理促進植物開花的現(xiàn)象稱為春化作用。自然界中存在一類植物，只有在營養(yǎng)生長階段經(jīng)歷一段時間低溫，才能夠在適宜的條件來臨時轉(zhuǎn)入生殖發(fā)育，啟動開花。如果沒有經(jīng)歷低溫，植物開花時間將大為推遲。春化處理的生理學(xué)研究表明植物感受低溫春化信號的部位是莖尖。春化處理與植物最終開花之間有一段時間間隔，表明春化作用實際上是使植物處于待命開花的狀態(tài)而非迅速誘導(dǎo)開花。春化處理后的植物能夠“記憶”此前的春化經(jīng)歷；換句話說，春化處理給予了植株開花的指令但植株只有在適宜的條件下才執(zhí)行指令。一旦低溫春化完成，轉(zhuǎn)至適宜的溫度條件下(沒有誘導(dǎo)信號)，細胞仍可以通過有絲分裂在當代忠實地保持和傳遞這種“記憶”，但春化效應(yīng)不能經(jīng)過減數(shù)分裂傳遞“遺傳”到下一代，子代的植物又恢復(fù)了對春化作用的要求。從這一層面上，春化作用具有表觀遺傳的特點(Michaels et al.，2000)。
模式植物擬南芥的FLOWERING LOCUS C(FLC)基因編碼一個含MADS域的轉(zhuǎn)錄因子，是主要的開花抑制因子，其表達量高低與擬南芥開花早晚呈負相關(guān)。春化作用主要通過降低FLCmRNA的水平而提前開花。作為主要的開花抑制基因，F(xiàn)LC的表達還受到多個其它基因的調(diào)控。FLC受到自主開花途經(jīng)的負調(diào)控，自主開花途經(jīng)基因突變體中FLC的表達量升高，突變體表現(xiàn)花期延遲(Michales and Amasino，2001)。春化作用對FLC mRNA表達水平的抑制具有表觀遺傳的特點低溫處理一定時期后，F(xiàn)LC mRNA表達量隨處理時間延長逐漸降低，春化處理完成后在溫暖的生長條件下，植株內(nèi)FLC的表達仍保持受抑制狀態(tài)。對擬南芥而言，春化處理實質(zhì)上是通過抑制FLC的表達而促進植物花芽分化，到子代，F(xiàn)LC重新恢復(fù)高水平的表達。
自然界中的擬南芥大部分為晚花生態(tài)型[late-flowering accession；又稱冬季型(winter annual)]，少數(shù)為早花生態(tài)型[early-flowering accession；或稱夏季型(summerannual)]。晚花生態(tài)型具有長的生命周期，春化處理促進開花。早花生態(tài)型無需春化處理即能抽穗開花。晚花表型主要由兩個顯性位點FRI和FLC協(xié)同控制(Lee etal，1994)。FRI和FLC對花時的調(diào)控，是協(xié)同增效作用，兩者缺一不可。FRI通過促進FLC mRNA的高水平表達抑制開花，另一方面，F(xiàn)LC的表達也只有在FRI存在的條件下才能積累到較高水平。春化作用可以解除晚花生態(tài)型的晚花表型春化作用對FLC負調(diào)控效果強于FRI對FLC的正調(diào)控效果，最終降低FLC的表達水平，從而促進冬季生態(tài)型開花。FRI或FLC任一位點發(fā)生突變都能削弱或克服晚花表型，表現(xiàn)提早開花。自然界中擬南芥的早花生態(tài)型即是由于FRI或FLC基因之一(或二者)發(fā)生突變(無效等位基因)進化而來。實驗室常用的擬南芥生態(tài)型，Landsberg erecta(Ler)、Wassilewskija(Ws)和Columnbia(Col)，均屬于早花生態(tài)型，其fri或flc基因功能缺失或被削弱。生命周期短是研究者們選擇這幾類生態(tài)型開展研究工作的重要原因。
鹽芥與擬南芥同屬十字花科，對鹽芥cDNA文庫克隆隨機測序結(jié)果顯示，鹽芥中參與光合作用等基礎(chǔ)新程代謝的基因與擬南芥對應(yīng)基因cDNA序列間的同源性達90％以上(Inan et al，2004)。表明鹽芥與擬南芥有很近的親緣關(guān)系，推測鹽芥存在與擬南芥相似的春化機制。
根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC，其特征在于該基因具有SEQ NO 4所示的堿基序列。
一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC編碼蛋白，其特征在于具有SEQ NO 5所示的氨基酸序列。
一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC的克隆方法，其特征在于該方法具有如下步驟a.以Arabidopsis FLC(AtFLC)序列為主要參考，避開保守的MADS盒序列設(shè)計引物L(fēng)P15’-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3’，LP25’-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3’；b.以鹽芥cDNA為模板，用RT-PCR方法擴增出鹽芥ThFLC保守的cDNA片段；c.設(shè)計3’-接頭引物，即5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’，借助3’-RACE的方法，以錨定引物和基因特異性引物L(fēng)P3，即5’-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3’獲得3’末端序列，借助限制性內(nèi)切酶StuI拼接得到鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC。
一種在早花型擬南芥中表達鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC推遲早花型擬南芥的開花時間的方法，其特征在于該方法是首先構(gòu)建基因表達載體ThFLC-pPZP211質(zhì)粒，再以傳統(tǒng)的Floral dip法轉(zhuǎn)化擬南芥，最后進行轉(zhuǎn)基因植株的篩選，即得到晚花型擬南芥。
一種抑制鹽芥中花時相關(guān)基因ThFLC縮短鹽芥開花時間的方法，其特征在于該方法具體為首先構(gòu)建基因沉默載體ThFLC-pART27質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，用卡那霉素作為篩選標記篩選轉(zhuǎn)基因植株，即得到早花型鹽芥。
綜上所述，鹽芥有很多符合作為遺傳研究模式系統(tǒng)的標準，是一種很好的耐鹽模式植物，但是它最大的弱點是生命周期長，自然界中沒有天然的早花鹽芥，這嚴重阻礙了科學(xué)家耐鹽機制的科研進程。擬南芥有早花和晚花兩種生態(tài)型，這兩個生態(tài)型的差別在于FLC和FRI這兩個關(guān)鍵基因。由于鹽芥和擬南芥具有很近的親緣關(guān)系，本發(fā)明借鑒擬南芥春化作用途徑花時調(diào)控分子機制，克隆鹽芥中與擬南芥FLC同源基因ThFLC全長cDNA序列；分析春化處理促進鹽芥開花與ThFLC表達量的關(guān)系；同時用功能補償方法在模式植物擬南芥中驗證了ThFLC功能(抑制開花)；豐富了我們對植物春化作用的認識；更進一步地，通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法，培育出不依賴于春化處理即能啟動生殖發(fā)育程序的早花鹽芥，加速以鹽芥為耐鹽模式材料的科研進程。
對ThFLC的基因工程應(yīng)用可以培育出改變開花時間的其它植物，包括重要的農(nóng)作物和花卉等。本發(fā)明的方法對于培育新型耐鹽快速生長的鹽芥和農(nóng)作物具有重要的實用價值和經(jīng)濟效益。另外本發(fā)明首次摸索農(nóng)桿菌floral dip法轉(zhuǎn)化鹽芥，并用卡那霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株，為鹽芥成為植物分子生物學(xué)研究新的模式植物奠定了基礎(chǔ)。


圖1為鹽芥經(jīng)過春化處理前后開花時的蓮座葉數(shù)目。
圖2為鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC在春化處理前后Northern表達分析。
圖3為將鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC導(dǎo)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因株的晚花表型。
圖4為擬南芥的早花表型。
圖5為鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC基因沉默載體結(jié)構(gòu)示意6為鹽芥的轉(zhuǎn)基因株的早花表型。
圖7為鹽芥的晚花表型。
具體實施例方式實施例一ThFLC全長編碼區(qū)的克隆與分析從genbank中調(diào)出不同物種中與開花有關(guān)的FLC基因組序列，cDNA序列，promoter序列，UTR序列，比較發(fā)現(xiàn)，它們在不同物種中有很高的同源性，以Arabidopsis FLC(AtFLC)序列為主要參考，避開保守的MADS盒序列設(shè)計引物L(fēng)P1(5’-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3’)LP2(5’-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3’)以鹽芥cDNA為模板，用RT-PCR方法擴增出鹽芥ThFLC保守的cDNA片段，測序結(jié)果表明該片段與AtFLC相應(yīng)序列有90％的同源性，說明該cDNA片段是鹽芥中FLC同源基因片段；由于該片段中已經(jīng)包含了啟始子ATG和部分5’-UTR序列，所以設(shè)計3’-接頭引物(5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’)，借助3’-RACE的方法，以錨定引物和基因特異性引物L(fēng)P3(5’-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3’)獲得3’末端序列。借助限制性內(nèi)切酶StuI拼接得到ThFLC全長編碼區(qū)，測序鑒定結(jié)果表明，cDNA全長是724bp，其中ORF是594bp，在71nt處有ATG，662nt是終止子TAG，Vector NTI8.0軟件的分析結(jié)果顯示，最長讀碼框編碼了一個含197個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為21.98kDa，等電點為7.15的堿性蛋白，命名為ThFLC。
利用BLAST程序?qū)hFLC預(yù)測得到的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，它與擬南芥FLC有高度同源性，其中核苷酸序列的同源性達到90.6％，氨基酸序列的同源性達到89.4％，并且與藍型油菜FLC序列也有很高的同源性，并且都有高度保守的MADS盒，這些說明花時基因FLC在春化依賴型的植物中是高度保守的，它在這些物種中可能有著相似的功能。
實施例二春化處理抑制ThFLC的表達為了研究春化處理與鹽芥開花時間及ThFLC表達量的關(guān)系，本發(fā)明做了以下驗證。
在長日照條件下，未經(jīng)春化處理的鹽芥等到長出大約400片蓮座葉才抽苔啟動開花，整個生命周期大約需要10個月時間，而經(jīng)過6周(5℃±1℃)的春化處理，大大地縮短了開花時間，蓮座葉大大減少(圖1)，只需要大約3個月時間就可以完成整個生活史，說明春化處理大大促進了鹽芥開花。
為了進一步說明春化促進鹽芥開花與ThFLC表達水平的關(guān)系，把7周鹽芥幼苗放到4℃冷庫冷處理6周，然后收集材料提取RNA(同時提取對照組RNA)，用1.2％含甲醛的變性瓊脂糖凝膠電泳分離40μg總RNA，在堿性條件下轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，實驗以ThFLC基因片段為探針，做Northern雜交發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，春化處理后ThFLC表達量明顯下降(圖2)。這些結(jié)果表明，春化抑制鹽芥晚花表型與ThFLC表達下降是一致的，說明鹽芥中存在著與春化處理促進擬南芥開花相似的分子機制。
實施例三ThFLC在模式植物擬南芥中的功能補償(一)用于擬南芥功能補償?shù)谋磉_載體的構(gòu)建借助引物引入法，在靶基因ThFLC的5’及3’端加上限制性內(nèi)切酶NcoI和XbaI酶切位點，引物如下(1)ThFLC(+)(加入NcoI酶切位點)5’-CATG GAAGGAAAAAACTAGAAATC-3’邊框內(nèi)為NcoI識別位點；
(2)ThFLC(-)(加入XbaI酶切位點)5’-CTAG CTAATTAAGCAGTGGGAGA-3’邊框內(nèi)為XbaI識別位點；用構(gòu)建好的TA克隆作為模板，以ThFLC(+)/(-)為引物進行PCR擴增得到全長ThFLC，用NcoI/XbaI分別雙酶切PCR產(chǎn)物和克隆載體pAVA321，回收目的片段，用T4連接酶連接，對陽性克隆進行酶切和測序鑒定。
然后用BamHI/KpnI分別雙酶切上步構(gòu)建的重組載體和雙元穿梭載體pPZP211，將含靶基因的片段插入到雙元載體的BamHI/KpnI兩個酶點之間，并進行PCR和酶切鑒定。檢測后-80℃保存質(zhì)粒及菌種；(二)傳統(tǒng)的Floral dip法轉(zhuǎn)化擬南芥(1)將已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌(GV3101菌株)(2)在準備轉(zhuǎn)化前兩天，用牙簽挑取單克隆于3ml LB(含相應(yīng)抗性)培養(yǎng)液中，250rpm，28℃過夜培養(yǎng)(3)將3ml菌液轉(zhuǎn)入50ml含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中，250rpm，28℃培養(yǎng)至OD值至少為1.0(4)6000rpm，離心10分鐘收集細胞，用適量infiltration media重懸沉淀，使轉(zhuǎn)化液終濃度的OD值為0.8(5)用槍頭將轉(zhuǎn)化液輕輕滴在植物剛開的花上，10分鐘后用清水沖洗(6)將轉(zhuǎn)化的材料放在避光處16小時以保持其濕度(7)隔天再加強轉(zhuǎn)化一次(8)收集干種子，在選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體。
(三)轉(zhuǎn)基因植株的篩選和表型觀察種子放于1.5ml EP管中，開口晾干，除去果莢皮等雜質(zhì)，只留種子。轉(zhuǎn)入目的基因和空載體的擬南芥種子滅菌后種于含50mg/L Kana的1/2MS培養(yǎng)基上，篩選抗性苗。轉(zhuǎn)基因植株長大后觀察其表型，與野生型相比，轉(zhuǎn)目的基因的植株出現(xiàn)明顯的晚花表型(圖3)，而轉(zhuǎn)空載體的抗性苗與野生型一樣，屬于典型的早花擬南芥(圖4)。這些說明ThFLC基因在進化過程中是非常保守的，它能夠補償近親模式植物擬南芥的早花表型，進一步證明了ThFLC抑制花時的功能。本發(fā)明推而廣之，ThFLC可以應(yīng)用于其它十字花科如油菜等其他植物開花機制的探索和作物改良的研究。
實施例四通過基因工程改造，培育早花(短生命周期)鹽芥(一)基因沉默載體的構(gòu)建應(yīng)用NTI VECTOR軟件分析鹽芥ThFLC與擬南芥AtFLC的編碼區(qū)核苷酸序列，選擇不含保守區(qū)段、長度合適的一段(位于ThFLC全長cDNA的271bp-579bp之間序列，用Primer Premier軟件設(shè)計兩對引物。
(1)ThFLC-KpnI引物(加入KpnI多克隆位點)5′端5’-GG GGTTCACACCATGAGCTA-3’邊框內(nèi)為KpnI識別位點；3′端5’-GG GAGAGTTACCGGAAGATT-3’邊框內(nèi)為KpnI識別位點。
(2)ThFLC-BamHI引物(加入BamHI多克隆位點)5′端5’-CG GGTTCACACCATGAGCTA-3’邊框內(nèi)為BamHI識別位點；3′端5’-CG GAGAGTTACCGGAAGATT-3’邊框內(nèi)為BamHI識別位點。
載體構(gòu)建具體步驟如下(結(jié)構(gòu)示意圖見圖5)A、PCR反應(yīng)以第一對引物進行高保真PCR反應(yīng)，用PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；B、酶切反應(yīng)KpnI酶切PCR回收產(chǎn)物，酶切完全后用快速膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物(K片斷)，同時用KpnI酶切pHANNIBAL載體，酶切完全后用SAP去磷酸反應(yīng)，然后用快速膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；C、連接反應(yīng)取適量的酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶16℃連接過夜；D、檢測連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂LB固體培養(yǎng)基平板(含50mg/L Kan)，37℃培養(yǎng)約16小時，挑單克隆，擴大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用鑒定引物進行PCR檢測，分別用限制性內(nèi)切酶AlwNI、StyI酶切檢測ThFLC插入片段，驗證K片斷是否正確插入到pHANNIBAL載體上，選取陽性克隆測序；E、第二片斷(B片斷)的插入以第二對引物、限制性內(nèi)切酶BamHI重復(fù)上述反應(yīng)；F、將經(jīng)檢測證明該基因的K片斷和B片斷以正確方向插入到pHANNIBAL載體上的重組子(ThFLC-pHANNIBAL)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提質(zhì)粒檢測后-80℃保存質(zhì)粒及菌種；G、基因沉默載體的構(gòu)建NotI酶切ThFLC-pHANNIBAL和pART27載體，回收酶切產(chǎn)物，進行連接反應(yīng)。NotI酶切ThFLC-pHANNIBAL產(chǎn)生兩個片斷，如果K和B片斷都已正確插入，大片斷長度分別為3579bp，回收該大片斷進行連接反應(yīng)；H、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，擴大培養(yǎng)(Kana、Spec抗性)，提質(zhì)粒，進行PCR、酶切檢測，回收PCR及酶切產(chǎn)物，測序驗證K、B片斷是否已正確插入pART27載體中，檢測外源片斷插入正確無誤的質(zhì)粒分別稱為ThFLC-pART27質(zhì)粒，保存菌種。
(二)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的準備(1)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的ThFLC-pART27質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101；(2)檢測從轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3101中提取質(zhì)粒，PCR及酶切檢測，驗證ThFLC-pART27質(zhì)粒是否已正確導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，保存檢測效果好的菌種，并劃板備用；(3)轉(zhuǎn)化用濃桿菌菌液的制備挑取農(nóng)桿菌GV3101單克隆，50ml液體LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)(加相應(yīng)的抗生素)，28℃，250rpm震蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.8左右，倒入大離心管中，3,000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用滲透培養(yǎng)基重懸，最終菌液OD600在0.8～1.0左右，即可用于轉(zhuǎn)化。
(三)Floral dip法轉(zhuǎn)化鹽芥臨轉(zhuǎn)化前在農(nóng)桿菌菌液中加入Silwet L-77(300μl/L)。用槍頭將菌液滴在鹽芥花序上，用保鮮膜封好保持濕度，25℃暗培養(yǎng)過夜后，再移至溫室正常培養(yǎng)，視情況可再浸染一次，鹽芥轉(zhuǎn)化效率相對較低、耐逆能力較強，可以多浸染一次。每周浸染一次，其間要注意農(nóng)桿菌對植株的影響(是否引起大量的花敗育)，來調(diào)整菌液濃度及浸染次數(shù)。
(四)卡那霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株種子放于1.5ml EP管中，開口晾干，除去果莢、皮等雜質(zhì)，只留種子。轉(zhuǎn)基因鹽芥種子滅菌后種于含50mg/L Kana的1/2MS培養(yǎng)基上，篩選抗性苗。鹽芥要放在23℃光照培養(yǎng)箱中，兩周發(fā)芽，一個月后移到23℃培養(yǎng)室。鹽芥對卡那霉素的抗性較大，需要在一個月后轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基，以保證營養(yǎng)的供應(yīng)，再一個月后就可以得到抗性苗。
(五)轉(zhuǎn)基因植株的表型轉(zhuǎn)基因植株長大后觀察其表型，與野生型相比，轉(zhuǎn)目的基因轉(zhuǎn)基因鹽芥出現(xiàn)明顯的早花表型(圖6)，而轉(zhuǎn)空載體抗性轉(zhuǎn)基因鹽芥與野生型一樣，仍然屬于典型的晚花鹽芥(圖7)。野生型和對照組鹽芥均需要大約10個月左右才能完成整個生命周期，而轉(zhuǎn)靶基因鹽芥大大縮短了從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)換，完成整個生活使只需要大約2-3個月時間，這樣便利了鹽芥遺傳學(xué)等其他生物學(xué)的研究。
序列表<110>上海大學(xué)
<120>鹽芥花時相關(guān)基因ThFLC、編碼蛋白及其克隆方法和應(yīng)用<160>11<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cgcttagtat ctccggcgac ttgaac26<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2gtagtgggag agtcaccgga agatt 25<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atgggaagga aaaaactaga aatcaa26
<210>4<211>724<212>DNA<213>鹽芥(Thellungiella halophila)<220>
<221>CDS<222>(71)...(664)<400>4gtatctccgg cgacttgaac cgtacctgag gatcaaatta gggcacggag gcctctcgga60gacagaagcc atg gga agg aaa aaa cta gaa atc aag cga att gag aac 109Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Apn1 5 10aaa agt agc cga caa gtc acc ttc tcc aaa cga cgc aac ggt ctc atc 157Lys Ser Ser Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Apn Gly Leu Ile15 20 25gag aaa gca cgt cag ctt tct gtt ctc tgc gat gca tcc gtc gct ctt 205Glu Lys Ala Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu30 35 40 45ctc gtt gtc tcc gcc tcc ggc aag ctc tac agc ttc tcc tcc ggc gat 253Leu Val Val Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp50 55 60aac ctg gtc aag atc ctt gat cga tat gga aaa caa cat gct gat gat 301Apn Leu Val Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp65 70 75ctt aag gcc ttg gat ctt cag tca aaa gct ctg agc tat ggt tca cac 349Leu Lys Ala Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ser His80 85 90cat gag cta cta gaa ctt gtg gaa agc cag ctt gtg gac tca agt gtc 397His Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Ser Gln Leu Val Asp Ser Ser Val95 100 105gat aat gcc agt gtc gat tcc ctc gct cag ctg gag gat cac ctt gag 445Asp Apn Ala Ser Val Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asp His Leu Glu110 115 120 125act gcc ctc tcc gta act aga gct agg aag aca gaa cta atg ttg aag 493
Thr Ala Leu Ser Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys130 135 140ctt gtt gat agc ctc aaa gaa aag gag aaa ttg ctg aaa aga gag aac 541Leu Val Asp Ser Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Arg Glu Apn145 150 155cag gtt ttg gct agc cag atg gag aag aat caa cat gtg gga gca gaa 589Gln Val Leu Ala Ser Gln Met Glu Lys Apn Gln His Val Gly Ala Glu160 165 170gct gat aat atg gag atg tcg cct gga caa atc tcc gac agc aat ctt 637Ala Asp Apn Met Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ser Apn Leu175 180 185ccg gta act ctc cca ctg ctt aat tag ccacctttaa ccggcggtta684Pro Val Thr Leu Pro Leu Leu Apn190 195aaccatcgta aacatgtatt tcaaaaaaat gaaaaaaaaa 724<210>5<211>197<212>PRT<213>鹽芥(Thellungiella halophila)<400>5Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Apn Lys Ser Ser1 5 10 15Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Apn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20 25 30Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35 40 45Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Apn Leu Val50 55 60Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65 70 75 80Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ser His His Glu Leu
85 90 95Leu Glu Leu Val Glu Ser Gln Leu Val Asp Ser Ser Val Asp Apn Ala100 105 110Ser Val Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asp His Leu Glu Thr Ala Leu115 120 125Ser Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Asp130 135 140Ser Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Arg Glu Apn Gln Val Leu145 150 155 160Ala Ser Gln Met Glu Lys Apn Gln His Val Gly Ala Glu Ala Asp Apn165 170 175Met Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ser Apn Leu Pro Val Thr180 185 190Leu Pro Leu Leu Apn195<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6catgccatgg gaaggaaaaa actagaaatc 30<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>7ctagtctaga ctaattaagc agtgggaga 29<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ggggtaccgg ttcacaccat gagcta 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9ggggtaccga gagttaccgg aagatt 26<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10cgggatccgg ttcacaccat gagcta 26
<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11cgggatccga gagttaccgg aagatt 2權(quán)利要求
1.一種鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC，其特征在于該基因具有SEQ NO 4所示的堿基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC編碼蛋白，其特征在于具有SEQ NO 5所示的氨基酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC的克隆方法，其特征在于該方法具有如下步驟a.以Arabidopsis FLC序列為主要參考，避開保守的MADS盒序列設(shè)計引物L(fēng)P1 5’-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3’，LP2 5’-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3’；b.以鹽芥cDNA為模板，用RT-PCR方法擴增出鹽芥ThFLC保守的cDNA片段；c.設(shè)計3’-接頭引物，即5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’，借助3’-RACE的方法，以錨定引物和基因特異性引物L(fēng)P3，即5’-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3’獲得3’末端序列，借助限制性內(nèi)切酶StuI拼接得到鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC。
4.一種在早花型擬南芥中表達鹽芥的花時相關(guān)基因ThFLC推遲早花型擬南芥的開花時間的方法，其特征在于該方法是首先構(gòu)建基因表達載體ThFLC-pPZP211質(zhì)粒，再以傳統(tǒng)的Floral dip法轉(zhuǎn)化擬南芥，用卡那霉素作為篩選標記篩選轉(zhuǎn)基因植株，最后進行轉(zhuǎn)基因植株的篩選，即得到晚花型擬南芥。
5.一種抑止鹽芥中花時相關(guān)基因ThFLC縮短鹽芥開花時間的方法，其特征在于該方法具體為首先借鑒轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，構(gòu)建植物高效沉默載體ThFLC-pART27質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化鹽芥，用卡那霉素作為篩選標記篩選轉(zhuǎn)基因植株，即得到早花型鹽芥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鹽芥花時相關(guān)基因ThFLC、編碼蛋白及其克隆方法和應(yīng)用。本發(fā)明借鑒擬南芥春化作用途徑花時調(diào)控分子機制，克隆鹽芥中與擬南芥FLC同源基因ThFLC全長cDNA序列；分析春化處理促進鹽芥開花與ThFLC表達量的關(guān)系；同時用功能補償方法在模式植物擬南芥中驗證了ThFLC功能(抑制開花)；豐富了我們對植物春化作用的認識；更進一步地，通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法，培育出不依賴于春化處理即能啟動生殖發(fā)育程序的早花鹽芥，加速以鹽芥為耐鹽模式材料的科研進程。
文檔編號C12N15/65GK1958795SQ200610026208
公開日2007年5月9日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者宋任濤, 許政暟, 李杉, 方巧云 申請人:上海大學(xué)