專利名稱：重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－VEGF165/GS115的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤即癌癥，是威脅人類健康的最嚴重的疾病之一。惡性實體腫瘤的常規(guī)治療包括手術摘除、化學治療、放射治療等，這些治療方法存在易復發(fā)，對人體的毒副作用大，會誘導抗藥性產生等不理想之處。生命科學基礎研究的突破和生物技術的發(fā)展，為惡性腫瘤的最終攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世紀70年代初，F(xiàn)olkman博士提出“腫瘤增殖具有血管依賴性”的觀點，即體積超過1mm3～2mm3的腫瘤需要新生血管維持營養(yǎng)和氧氣的供給并且排出代謝產物，還需要新生血管提供轉移的通道。從這個觀點出發(fā)，提出一種治療腫瘤的新策略，即不直接從正面攻擊腫瘤，而是阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應，間接地抑制腫瘤生長，使其處于休眠狀態(tài)。這就是抗血管生成療法，也被形象地稱為腫瘤的“餓死療法”。
抗血管生成療法是近幾年來腫瘤生物治療研究的熱點，與以往的方法相比，有著顯著的優(yōu)越性①廣泛的抑瘤譜；②不易產生耐藥性；③無明顯毒副作用；④藥物易于到達靶部位；⑤可同時治療腫瘤的轉移；⑥與化療和放療有協(xié)同作用。目前已發(fā)現(xiàn)了多種血管生成抑制劑，有數(shù)百種藥物進入了臨床試驗階段，大多數(shù)處于二期臨床，有十幾種藥物進入了三期臨床，它們都顯示出了初步療效和光明的治療前景。
血管抑素(Angiostatin)是人纖溶酶原(Plasminogen)的kringle 1-kringle4區(qū)域，具有抑制血管內皮細胞增殖的能力。目前血管抑素已進入一期臨床試驗。其中Kl(Kringle 1)不僅能有效抑制內皮細胞的增殖，還具有結合賴氨酸的能力(可以用賴氨酸親和柱純化蛋白)。
血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一種特異作用于血管內皮細胞的強有力的多功能細胞因子。它強烈而特異地促使內皮細胞分裂增殖、增生、轉移，增加血管通透性并促進新血管生成。它促進血管內皮細胞的有絲分裂作用是通過存在于內皮細胞表面VEGF的特異性受體所介導的。VEGF是一種分子量為46kDa的二聚體糖蛋白，由兩個分子量相同(23kDa)的亞基經(jīng)二硫鍵結合而成。VEGF是由多個成員組成的家族，不同形式的VEGF是同一基因不同方式的mRNA水平剪接而形成的。根據(jù)VEGF含有的氨基酸數(shù)量的不同，一共有4種不同的VEGFs形式，它們分別是VEGF165，VEGF165，VEGF189和VEGF206。其中，VEGF165和VEGF165是分泌型的蛋白質。
VEGF可在很多正常成人和動物組織中表達，但一般水平較低。在病理情況下，特別是在腫瘤細胞中，VEGF無論是在mRNA水平還是在蛋白質水平均有過量表達，VEGF能靶向性地結合到內皮細胞的VEGFR(血管內皮生長因子受體)上，從而促進血管新生。
本發(fā)明構建了一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115，目的是通過畢赤酵母表達體系得到重組蛋白K1-VEGF165，利用VEGF165的靶向性，將具有血管生成抑制活性的K1蛋白運送到血管內皮細胞周圍，從而抑制血管新生。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制備方法，目的是利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)對重組基因pPICZαA-K1-VEGF165進行表達，期望得到一種多靶點、多功能、高效的抗腫瘤血管生成基因重組融合蛋白K1-VEGF165。
為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建融合基因K1-VEGF165包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和VEGF165基因；1段連接臂是連接K1基因和VEGF165基因的柔性連接臂(Gly)3；其構建方法包括如下步驟(1)重組質粒pPICZαA-K1的構建；(2)重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的構建；上述的重組質粒pPICZαA-K1的構建方法為以K1的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約300bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建的方法為提取人臍靜脈內皮細胞的總RNA，設計引物進行RT-PCR，得到VEGF165的cDNA。以VEGF165的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約500bp的VEGF165基因，VEGF165片段用KpnI和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165；轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。
畢赤酵母是真核表達系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(PAOX1)，在甲醇的誘導下能表達外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取與純化。畢赤酵母能通過發(fā)酵罐發(fā)酵生產大量的目的蛋白，不需要外加熱源，成本低，規(guī)模大。


圖1為重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建流程圖具體實施方式
本發(fā)明主要包括兩大部分重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建，重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的構建。
具體方案敘述如下1重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建和鑒定融合基因K1-VEGF165包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和VEGF165基因；1段連接臂是連接K1基因和VEGF165基因的柔性連接臂(Gly)3。實驗操作時，參見圖1，將K1基因和VEGF165基因通過連接臂(Gly)3連接，構建重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165。
1.1重組質粒pPICZαA-K1的構建和鑒定根據(jù)K1的核苷酸序列設計K1的上下游引物上游引物5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；下游引物5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。
以K1的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約300bp的K1片段，回收純化擴增產物。K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。重組質粒pPICZαA-K1用EcoRI和Kpn I雙酶切，得到300bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，K1基因的序列正確。
1.2構建重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165根據(jù)VEGF165的核苷酸序列設計其上下游引物上游引物5’-TTTGGTACCGCACCCATGGCAGAAGGAG-3’；下游引物5’-GGGTCTAGATTCCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。
提取人臍靜脈內皮細胞的總RNA，利用VEGF165的上下游引物，通過一步法RT-PCR得到VEGF165的cDNA。以VEGF165的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約500bp的VEGF165基因。VEGF165片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165用EcoRI和NotI雙酶切，得到800bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，K1-VEGF165基因的序列正確。
2重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的構建和鑒定重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。挑選Zeocin濃度為1000ug/ml平板上長出的克隆。用玻璃珠法提取重組酵母的染色體組，以其為模板，以K1的上游引物和VEGF165的下游引物進行PCR擴增，得到800bp大小的片段，說明融合基因K1-VEGF165成功地整合到了酵母染色體上。
3重組菌株的遺傳穩(wěn)定性將重組酵母菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115傳代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍穩(wěn)定地整合在染色體上。
最終獲得的重組融合基因K1-VEGF165的核苷酸序列為GCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGAATCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCA
GAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTTATTTCCCACTCGTCTTCAGAGTACAGAAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCTTTTTACTCTTCAGATTTTCTCGGACTCCCGCGCATCGTCGTACACTTCAAACACCCGAGCACAGCATACTAAATTCCCCTCGTTC
權利要求
1.一種重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建融合基因K1-VEGF165包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和VEGF165基因；1段連接臂是連接K1基因和VEGF165基因的柔性連接臂(Gly)3；其構建方法包括如下步驟(1)重組質粒pPICZαA-K1的構建；(2)重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VE6F165/GS115的構建。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-K1的構建方法為根據(jù)K1的核苷酸序列設計K1的上下游引物上游引物5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；下游引物5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。以K1的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約300bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165的構建的方法為根據(jù)VEGF165的核苷酸序列設計其上下游引物上游引物5’-TTTGGTACCGCACCCATGGCAGAAGGAG-3’；下游引物5’-GGGTCTAGATTCCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。提取人臍靜脈內皮細胞的總RNA，設計引物進行RT-PCR，得到VEGF165的cDNA。以VEGF165的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約500bp的VEGF165基因，VEGF165片段用KpnI和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165；轉化大腸桿菌TOPI0F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
4.根據(jù)權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-VEGF165的制備方法，其特征在于所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-K1-VEGF165用SacI線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－VEGF165/GS115的制備方法。該方法包括以下步驟重組質粒pPICZαA－K1－VEGF165的構建(包括重組質粒pPICZαA－K1的構建、重組質粒pPICZαA－K1－VEGF165的構建)、重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－VEGF165/GS115的構建。畢赤酵母是真核表達系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(P
文檔編號C12N15/62GK1955278SQ20061002620
公開日2007年5月2日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權日2006年4月28日
發(fā)明者黃筱穎, 陳宇光 申請人:上海大學