專利名稱：SjADA編碼基因、其構(gòu)建方法及其體外融合表達(dá)產(chǎn)物和表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲腺苷脫氨酶(SjADA)的編碼基因，及其在宿主細(xì)胞中的融合表達(dá)及純化。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是由于人或哺乳動物感染了血吸蟲所引起的一種人畜共患寄生蟲病。在世界范圍內(nèi)其患病人數(shù)僅次于瘧疾，是第二大熱帶寄生蟲病(Ross，et al.，Clin.Microbiol.Rev.2001，14(2)270-295)。據(jù)1998年WHO血吸蟲病專家咨詢報告，估計全世界有76個國家和地區(qū)流行血吸蟲病，被感染的人口達(dá)2億，受威脅人群5-6億，其中有癥狀的約1.2億人，重癥和傷殘2000萬人，每年死亡2萬人，嚴(yán)重影響著人類的健康和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。我國曾經(jīng)是日本血吸蟲病流行最嚴(yán)重的國家之一，通過半個世紀(jì)的努力，我國血吸蟲防治工作取得了巨大成就。然而近年來，在我國血吸蟲病的流行區(qū)，疫情有所回升，并正逐步向城市蔓延，血防工作面臨嚴(yán)峻形勢。血吸蟲病的嚴(yán)重疫情引起了黨和國家領(lǐng)導(dǎo)的高度重視，國家衛(wèi)生部已將其與艾滋病、乙型肝炎、肺結(jié)核共同列為我國須重點防治的4個重大傳染病。
感染人體的血吸蟲共有19種，主要的病原為曼氏血吸蟲(Schistosoma.mansoni)、日本血吸蟲(S.japonicum)、埃及血吸蟲(S.haematobium)、間插血吸蟲(S.intercalatum)和湄公血吸蟲(S.mekongi)等。血吸蟲生活史比較復(fù)雜，包括在哺乳動物終宿主體內(nèi)的有性世代和在中間宿主螺體內(nèi)的無性世代的世代交替，其生活史分蟲卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童蟲和成蟲6個階段。
血吸蟲病被世界衛(wèi)生組織列為再現(xiàn)傳染病，是一種極易再感染、并卷土重來的寄生蟲病。在我國和亞洲，日本血吸蟲是引起嚴(yán)重血吸蟲疾病的主要病原。由于日本血吸蟲動物宿主多、成蟲壽命長、感染后的伴隨免疫和治愈后的免疫力差、中間宿主釘螺不易控制等原因，分布于亞洲的日本血吸蟲感染引起的病情最重，防治難度最大。
目前血吸蟲病主要的防治策略是化療，化療是控制血吸蟲病患病率的重要措施之一，但連續(xù)群體化療在血吸蟲未消滅地區(qū)只能暫時降低發(fā)病，而不能阻斷傳播。雖然，高效低毒的吡喹酮使血吸蟲病化療有了突破性進(jìn)展，但是長期反復(fù)使用同一化學(xué)藥物，有可能導(dǎo)致產(chǎn)生抗藥性(Ismail M，et al.，Trop.Med.Hyg.1999；60932-935；肖樹華等，中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1995；13(4)241-248)。此外，吡喹酮是一個對血吸蟲成蟲有效而對童蟲無效的治療藥物，雖可降低人群的感染率，但不能防止重復(fù)感染。我國在七十年代末和八十年代初發(fā)現(xiàn)青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯具有抗血吸蟲的作用，該類藥物對各個蟲期的血吸蟲均有一定效果，特別是對血吸蟲童蟲有很強的殺滅作用，已于二十世紀(jì)末被發(fā)展成為預(yù)防血吸蟲病的藥物(肖樹華等，中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1995；13(4)241-248；肖樹華等，中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1995；13(3)170-173；吳鈴娟等，中國血吸蟲病防治雜志，1997；9(5)284-286；吳鈴娟等，中國血吸蟲病防治雜志，1996；8(5)267-269)。蒿甲醚和青蒿琥酯的問世為血吸蟲病的早期治療提供了條件，但殺成蟲的效果不佳。因此，WHO/TDR于2002年提出要發(fā)展一個既具有殺滅成蟲又有殺童蟲效果的治療血吸蟲病(抗血吸蟲成蟲)的新藥。目前，雖然國內(nèi)外已有部分實驗室開始進(jìn)行此項研究，但多種原因(Kohn AB，et al.，J.Bio.Chem.2001；276(40)36873-36876；MeshnickSR，et al.，Int.J.Parasitol.2002；321655-1660；Olliaro PL，et al.，Trends Parasitol.2001；17(3)122-126)制約了新藥的研制，至今尚無理想的二線侯選藥物的報道。因此，專家認(rèn)為抗日本血吸蟲新藥的研究需要技術(shù)創(chuàng)新，發(fā)掘新的藥物靶點將有助于新藥的開發(fā)。
自上世紀(jì)20年代初期，國際上就開始了血吸蟲疫苗的研究和探索。最近，WHO/TDR對最有希望的血吸蟲疫苗候選分子進(jìn)行獨立檢測，結(jié)果表明保護(hù)力均不到40％，只有部分保護(hù)力的疫苗在疫區(qū)使用可能最終導(dǎo)致疫苗無效，因此如何提高候選抗原分子的保護(hù)力水平仍是一個值得重視的問題。
現(xiàn)有研究表明，血吸蟲的嘌呤代謝與其終宿主存在明顯差異，血吸蟲的成蟲(Senft AW CG(1983)，Pharmacol Ther.20(3)341-56；Huang Zuo-yue，et al.，中華醫(yī)學(xué)雜志，1984；97(9)698-706)及幼蟲(Dovey HF，et al.，Mol Biochem Parasitol.11157-67)都不能利用簡單化合物從頭合成嘌呤核苷酸，而只能完全依賴補救途徑合成嘌呤核苷酸。宿主的紅血球，含有豐富的腺嘌呤核苷酸，為血吸蟲嘌呤代謝補救途徑提供了嘌呤來源。由于血吸蟲與其終宿主在種系發(fā)生上存在巨大差異，其嘌呤代謝補救途徑中的某些酶可能與其終宿主有明顯差別，利用這個特點可以設(shè)計針對血吸蟲某些酶的特異性抑制劑或“破壞性底物”(Kouni MH，et al.，Pharmacol Ther.2003 Sep；99(3)283-309.Review.)；同時，嘌呤轉(zhuǎn)運作為血吸蟲嘌呤合成補救途徑的第一步，與其終宿主也有著明顯不同(Levy MG et al.(1975).J Parasitol.61(4)627-32)。由此可見，血吸蟲嘌呤代謝途徑中的某些轉(zhuǎn)運蛋白和酶都可能是抗血吸蟲新化療的潛在靶點。目前，嘌呤合成的補救途徑已經(jīng)為抗寄生蟲的化療提供了許多成功的藥物靶點(Kouni MH，et al.，Pharmacol Ther.2003 Sep；99(3)283-309.Review；Nelson DJ，et al.，Adv Exp Med Biol.1979；122B7-12；Carlson HE，et al.，ClinEndocrinol(Oxf).1981 Nov；15(5)491-8)，因此，研究日本血吸蟲嘌呤代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶將有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點用于篩選抗血吸蟲病化合物。
血吸蟲嘌呤代謝補救途徑中，腺嘌呤核苷先是通過脫氨反應(yīng)(腺嘌呤核苷脫氨酶，adenosine deaminase，ADA)生成次黃嘌呤核苷(inosine)，再通過一系列的補救途徑反應(yīng)生成腺嘌呤和鳥嘌呤核苷酸(purine nucleotides)。由此可見，腺嘌呤核苷脫氨酶是嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶。腺苷脫氨酶(ADA)又稱腺苷氨基水解酶(adenosineaminohydrolase)，其酶學(xué)委員會編號為EC 3.5.4.4。ADA能不可逆地催化腺苷(adenosine，Ado)和2’脫氧腺苷(2’-deoxyadenosine，dado)的脫氨反應(yīng)，將這兩種核苷分別轉(zhuǎn)換為肌苷(inosine)和2’脫氧肌苷(2’-deoxyinosine)。ADA催化的酶促反應(yīng)的最佳pH接近中性范圍(Cristalli G，et al.，Med Res Rev.2001 Mar；21(2)105-28.Review)。ADA不僅在體內(nèi)合成AMP的過程中發(fā)揮重要作用，而且是GMP的合成過程中必不可少的關(guān)鍵酶。其缺失在小鼠和果蠅中可致死，在人中會導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺陷綜合癥(SCID)(Giblett ER，et al.，Lancet.1972 Nov 18；2(7786)1067-9)。因而，體外克隆和表達(dá)ADA編碼基因為進(jìn)一步研究其功能及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。但迄今為止，尚無人對此做過深入研究。
2003年10月，巴西和中國兩國學(xué)者分別同時在《Nature genetics》雜志發(fā)表了針對曼氏和日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組研究的重大進(jìn)展，發(fā)布了大量關(guān)于曼氏血吸蟲和日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)信息和分析結(jié)果(Hu W，et al.，Nat.Genet.2003，35(2)139-147；Verjovski-Almeida S，et al.，Nat.Genet.2003，35(2)148-157)。
本發(fā)明者在上述日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行深入研究，通過PCR擴(kuò)增出日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA全基因，并在大腸桿菌中融合表達(dá)此基因，得到融合蛋白，經(jīng)酶活力測定后，確認(rèn)所得融合蛋白具有日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA活性，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA的編碼基因序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供獲得SjADA編碼基因序列的方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供體外表達(dá)SjADA編碼基因的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的第四個目的是提供重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的第五個目的是提供一種供重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的第六個目的是提供融合蛋白硫氧還蛋白(Trx)-日本血吸蟲腺苷脫氨酶(SjADA)。
本發(fā)明的第七個目的是提供融合蛋白Trx-SjADA的制備方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面提供的日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA編碼基因序列為序列表中SEQ ID NO.1所示序列(GenBank DQ273968)。
本發(fā)明第二方面提供的獲得SjADA編碼基因序列的方法是以含日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA基因序列的cDNA克隆SJM2AHD10為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明的第三方面提供的體外表達(dá)SjADA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒是pET32-a(+)-SjADA。
本發(fā)明第四方面提供重組表達(dá)質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA的構(gòu)建方法，包括將質(zhì)粒載體pET 32-a(+)與SjADA編碼基因進(jìn)行連接的步驟。
本發(fā)明第五方面提供一種供重組表達(dá)質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
本發(fā)明第六方面提供一種在宿主細(xì)胞中表達(dá)的融合表達(dá)產(chǎn)物Trx-SjADA，其氨基酸序列包含序列表中SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本發(fā)明第七方面提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白Trx-SjADA的方法，包括以下步驟1)將重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，得到表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白Trx-SjADA；2)螯和的瓊脂糖FF樹脂(Chelating Sepharose FF)親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物Trx-SjADA。
發(fā)明詳述本發(fā)明者首先通過對日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，將所得產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pUC57構(gòu)建成測序用重組pUC57-SjADA，通過轉(zhuǎn)化篩選，抽提重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序鑒定；隨后將純化了的質(zhì)粒pUC57-SjADA與質(zhì)粒pET 32-a(+)通過酶切、回收及連接，構(gòu)建成SjADA基因原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA；將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)并抽提重組質(zhì)粒，所得質(zhì)粒經(jīng)PCR、測序及酶切鑒定確認(rèn)后，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞大腸肝菌中表達(dá)；取表達(dá)量較高的克隆，發(fā)酵制備菌體，破碎所得菌體；由于構(gòu)建的融合蛋白含6個組氨酸尾(6×Histag)，可選用Chelating Sepharose FF親和層析純化融合蛋白，然后再復(fù)性。最終得到純化的融合蛋白Trx-SjADA，通過測定其酶活力，顯示所得融合蛋白具有SjADA的活性。完成了SjADA基因的體外克隆表達(dá)及純化。
1.日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA全基因序列的擴(kuò)增以含日本血吸蟲SjADA基因序列的cDNA克隆SJM2AHD10為模板，SEQ IDNO.3為5’引物，SEQ ID NO.4為3’引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit)回收純化。
將純化的SjADA基因PCR產(chǎn)物片段和pUC 57質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切連接，構(gòu)建成SjADA基因測序用重組質(zhì)粒pUC57-SjADA。將此質(zhì)粒通過CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后涂布于含X-Gal的LB瓊脂平板上，挑選白色單菌落，培養(yǎng)后收集菌體，用迷你-MTM質(zhì)粒DNA抽提系統(tǒng)試劑盒(Mini-MTM PlasmidDNA Extraction System)抽提菌體中所含重組質(zhì)粒，質(zhì)粒純化后由上海Sangon公司測定SiADA編碼基因的全長序列。
2.構(gòu)建可在宿主細(xì)胞中表達(dá)SjADA編碼基因的重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA純化的質(zhì)粒pUC57-SjADA和質(zhì)粒pET 32-a(+)分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I進(jìn)行酶切，用QIAquick PCR Purification Kit回收純化。根據(jù)純化后的目的基因片段和載體酶切片段的濃度進(jìn)行連接，構(gòu)建成SjADA編碼基因原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA。將此質(zhì)粒通過CaCl2法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上，隨機(jī)挑取上述平板上的菌落，培養(yǎng)后收集菌體，抽提菌體中所含重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR鑒定、測序鑒定及酶切鑒定。
3.重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA在大腸肝菌中的表達(dá)通過鈣轉(zhuǎn)化將上述抽提所得pET 32-a(+)-SjADA重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后涂布于含Amp的LB瓊脂平板上。隨機(jī)挑取上述平板上的菌落，培養(yǎng)菌液至對數(shù)生長期，加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳鑒定誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
4.制備Trx-SjADA融合蛋白取表達(dá)融合蛋白Trx-SjADA量較高的凍存菌種于含Amp的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜之后，轉(zhuǎn)種至同樣含Amp的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌液至對數(shù)生長期，加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)，最后收取菌體。在上述菌體中加入緩沖液超聲裂解細(xì)菌，離心后保留上清夜與沉淀，由SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果。根據(jù)上述結(jié)果，用變性劑裂解所得沉淀，離心后用Chelating Sepharose FF親和層析樹脂進(jìn)行純化。SDS-PAGE檢驗純化結(jié)果。
5.鑒定Trx-SjADA的酶活力利用國產(chǎn)酶活力測定試劑盒(50T，購自南京建成生物工程研究所)測定腺苷脫氨酶融合蛋白的酶活力。
原理腺苷脫氨酶ADA催化腺嘌呤核苷水解，產(chǎn)生次黃嘌呤核苷和氨，對產(chǎn)生的氨進(jìn)行顯色反應(yīng)，從而可以計算樣品中ADA的活性。


圖1是日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA全基因序列的擴(kuò)增結(jié)果。
圖2是重組質(zhì)粒pUC57-SjADA的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果。
圖3是重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA的限制性內(nèi)切酶鑒定結(jié)果。
圖4是重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)結(jié)果。
圖5是重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中的表達(dá)結(jié)果。
圖6是融合蛋白Trx-SjADA在大腸桿菌BL21(DE3)中發(fā)酵培養(yǎng)后表達(dá)及破菌結(jié)果。
圖7是融合蛋白Trx-SjADA的純化結(jié)果。
具體實施方案下面用實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
主要試劑

主要儀器設(shè)備

試驗材料含日本血吸蟲SjADA基因(1056bp)序列的cDNA克隆、編號為SJM2AHD10，保藏于中國人類基因組南方研究中心和中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所。宿主菌株大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、質(zhì)粒pUC57、質(zhì)粒pET-32a(+)，均購自Invitrogen。
實施例1日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA基因的克隆1)設(shè)計引物，擴(kuò)增SjADA的序列根據(jù)含SjADA基因的cDNA克隆的編碼序列，經(jīng)引物表達(dá)軟件(Primer Express)分析設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司合成一對引物，序列分別為P15′CTGGGTACCGACGACGACGACAAGATGTGGCTACCTTTGGAT；P25′GTGCTCGAGCTATTATGTTTTGGAGTGA；引物P1(序列表中SEQ ID NO.3所示)為SjADA基因5’端引物，其中引入了Kpn I酶切位點GGTACC及腸激酶識別序列；引物P2(序列表中SEQ ID NO.4所示)為SjADA基因3’端引物，其中引入Xho I酶切位點CTCGAG。
2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)
a)反應(yīng)混和液模板1.5μl；5’引物P1(SEQ ID NO.3)2μl；3’引物P2(SEQ ID NO.4)2μl；dNTP2.5μl；10×Pfu緩沖液5μl；Pfu DNA多聚酶0.5μl；去離子水36.5μl。
b)反應(yīng)條件預(yù)變性95℃5min；退火56℃1min；復(fù)性72℃2min。循環(huán)30次，最后一個循環(huán)復(fù)性再延長8min。
日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA全基因序列的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。其中，泳道M為PCR參照分子量(100bp ladder)；泳道1為SjADA的PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示，泳道1所示PCR產(chǎn)物條帶大小約為1.1Kb，與預(yù)計結(jié)果相符。
實施例2 SjADA基因PCR產(chǎn)物的測序驗證1)pUC57-SjADA測序質(zhì)粒的構(gòu)建用QIAquick PCR Purification Kit純化實施例1所得的SjADA基因PCR產(chǎn)物。分別測定純化的SjADA基因PCR產(chǎn)物片段和pUC 57質(zhì)粒載體的OD值，并計算PCR產(chǎn)物片段和載體片段的濃度，按PCR產(chǎn)物片段濃度∶載體片段濃度為3∶1的摩爾比進(jìn)行酶切連接。
a)反應(yīng)混和液限制性內(nèi)切酶Sma I1μl；T4 DNA連接酶1μl；10×lig緩沖液1μl；去離子水；pUC5780ng；SjADA基因PCR產(chǎn)物60ng。
b)反應(yīng)條件將上述反應(yīng)混和液共計15μl于0.5ml離心管(Eppendorf管)中22℃反應(yīng)2-4小時。
2)轉(zhuǎn)化篩選將重組質(zhì)粒pUC57-SjADA用CaCl2法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌體加入1ml LB培養(yǎng)液中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)1hr后，涂布于含X-Gal的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃孵育箱中培養(yǎng)過夜。
挑選白色單菌落，于10ml LB培養(yǎng)液，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)4hr，離心取菌體，并用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System抽提菌體中所含重組質(zhì)粒，質(zhì)粒純化后由上海Sangon公司測定SjADA基因全長序列。
重組質(zhì)粒pUC57-SjADA限制性內(nèi)切酶的鑒定結(jié)果見圖2。其中，泳道M1為PCR參照分子量1(200bp ladder)；泳道1為經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切的pUC57-SjADA；泳道2為未酶切的pUC57-SjADA；泳道M2為PCR參照分子量2(100bp ladder)。結(jié)果顯示，泳道1中有一條大小約1.1Kb的條帶，與預(yù)計結(jié)果相符。測序鑒定結(jié)果顯示，與預(yù)計結(jié)果一致。
實施例3日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA基因原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pET32-a(+)-SjADA的構(gòu)建1)酶切將純化的質(zhì)粒pUC57-SjADA和質(zhì)粒pET 32-a(+)分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I進(jìn)行雙酶切。
a)反應(yīng)混和液模板10μl；Kpn I1μl；Xho I1μl；BSA0.5μl；Kpn I緩沖液1.5μl；去離子水1μl。
b)反應(yīng)條件將上述反應(yīng)混和液共計15μl，于1.5ml Eppendorf管中37℃水浴過夜。
2)純化用QIAquick PCR Purification Kit回收純化酶切后的SjADA基因和質(zhì)粒pET 32-a(+)。
3)連接構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒測定純化后的目的基因片段和載體酶切片段的OD值，并計算各片段的濃度，按目的片段濃度∶載體片段濃度為3∶1的摩爾比進(jìn)行連接。
a)反應(yīng)混和液T4 DNA連接酶1μl；10×1μl；去離子水；pET 32-a(+)80ng；SjADA基因60ng。
b)反應(yīng)條件將上述反應(yīng)混和液共計10μl于1.5ml Eppendorf管中12℃-14℃連接過夜。
實施例4 SjADA表達(dá)載體的鑒定用CaCl2法將重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，即取1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入50μl感受態(tài)細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)化后的菌體中加入1ml LB培養(yǎng)液，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)1小時后，涂布于含100μg/ml Amp的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃孵育箱中培養(yǎng)過夜。
1)重組質(zhì)粒的測序鑒定測序引物為T7引物和T7終止引物(購自Invitrogen公司)，由上海Sangon公司測定重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA中的SjADA基因的全長序列。測序鑒定結(jié)果表明，與預(yù)計結(jié)果一致。
2)重組質(zhì)粒的酶切鑒定隨機(jī)挑取培養(yǎng)皿中的SjADA陽性克隆，加入含100μg/ml Amp的2×YT液體培養(yǎng)基5ml，37℃、300rpm培養(yǎng)過夜。用Mini-MTM Plasmid DNA ExtractionSystem抽提并純化質(zhì)粒。對所抽提的質(zhì)粒進(jìn)行Kpn I和Xho I雙酶切鑒定。
重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA的限制性內(nèi)切酶的鑒定結(jié)果見圖3。其中，泳道M1為PCR參照分子量1(2、1kb ladder)；泳道1為未酶切的pET 32-a(+)-SjADA；泳道2為經(jīng)Kpn I和Xho I酶切的pET 32-a(+)-SjADA；泳道M2為PCR參照分子量2(200bp ladder)。結(jié)果顯示泳道2中有一條大小約1.1Kb的條帶且條帶的大小與預(yù)計結(jié)果相符。
實施例5 SjADA的重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)1)轉(zhuǎn)化根據(jù)實施例4的鑒定結(jié)果，將相應(yīng)的實施例3所得的pET32-a(+)-SjADA重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中。
a)反應(yīng)體系將2μl重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA加入到含50μl鈣轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的1.5ml Eppendorf管中。
b)反應(yīng)過程冰浴30min后，37℃熱休克5min，立即冰浴2min。每管加入預(yù)溫至37℃的LB培養(yǎng)基，37℃、300rpm培養(yǎng)1小時后，取100μl涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃孵育箱中培養(yǎng)過夜。
2)誘導(dǎo)從上述培養(yǎng)皿中隨機(jī)挑取Amp抗性SjADA陽性克隆接種于20ml含100μg/mlAmp的2×YT液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)菌液至OD600＝0.6。其中，10ml加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.5mM，另10ml不加誘導(dǎo)物IPTG作為對照。對照菌液與待誘導(dǎo)菌液繼續(xù)于37℃、250rpm中培養(yǎng)4小時。各取1ml于4℃、4,000g離心10min沉淀菌體。
SDS-PAGE電泳檢驗誘導(dǎo)結(jié)果用50μl PBS緩沖液懸浮上述所得菌體，取出15μl，加入3μl 6×電泳樣品緩沖液，混勻后熱變性3min，取出2μl作SDS-PAGE電泳。
SDS-PAGE的濃度積層膠4％，分離膠15％。
電泳條件積層膠70V，分離膠120V。
電泳結(jié)束后將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R250染液中固定并染色，隨后在乙醇-冰醋酸脫色液中脫色。
重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)結(jié)果見圖4。其中，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道2為未誘導(dǎo)表達(dá)的pET 32-a(+)-SjADA；泳道3-10為誘導(dǎo)表達(dá)后的pET 32-a(+)-SjADA。
重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中的表達(dá)結(jié)果見圖5。其中，泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2-5為誘導(dǎo)表達(dá)后的pET 32-a(+)-SjADA；泳道6為未誘導(dǎo)表達(dá)的pET 32-a(+)-SjADA。
結(jié)果顯示，在兩種宿主細(xì)胞中進(jìn)行的誘導(dǎo)表達(dá)，于分子量約為56kDa處，誘導(dǎo)后的菌體均較誘導(dǎo)前的菌體呈現(xiàn)出明顯表達(dá)條帶，此處即為SjADA基因產(chǎn)物與硫氧還蛋白(Trx)的融合體，分子量大小與預(yù)期結(jié)果相符。根據(jù)此結(jié)果篩選表達(dá)量較高的克隆，8％甘油管凍存于-80℃冰箱中。
實施例6融合蛋白Trx-SjADA的制備1)發(fā)酵制備菌體根據(jù)實施例5所得結(jié)果，分別取在兩種宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白Trx-SjADA量較高的凍存菌種接種于20ml含100μg/ml Amp的2×YT液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。第2天將其轉(zhuǎn)種到1000ml含100μg/ml Amp的2×YT液體培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)菌液至OD600＝0.6后，分別取1ml菌液不加誘導(dǎo)物IPTG作為對照，隨后分別加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.5mM。對照菌液與待誘導(dǎo)菌液繼續(xù)于37℃、250rpm培養(yǎng)4小時。隨后，4℃、8,000rpm離心10min，收得細(xì)菌沉淀存于-20℃。
2)破菌在上述所得細(xì)菌沉淀中，按菌體濕重∶緩沖液＝1∶10的比例分別加入20ml預(yù)冷的PBS(pH8.0)緩沖液超聲裂解細(xì)菌(每次20sec，共計2min)。于4℃、6,000rpm離心30min，收集沉淀。
融合蛋白Trx-SjADA在大腸桿菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS中發(fā)酵培養(yǎng)后的表達(dá)及破菌結(jié)果見圖6。其中，泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2為BL21(DE3)pLysS誘導(dǎo)表達(dá)全菌；泳道3為BL21(DE3)pLysS未誘導(dǎo)全菌；泳道4為BL21(DE3)pLysS表達(dá)破菌上清；泳道5為BL21(DE3)pLysS表達(dá)破菌沉淀；泳道6為BL21(DE3)未誘導(dǎo)全菌；泳道7為BL21(DE3)表達(dá)破菌沉淀；泳道8為BL21(DE3)表達(dá)破菌上清；泳道9為BL21(DE3)表達(dá)全菌。
表達(dá)結(jié)果顯示，在兩種宿主細(xì)胞中進(jìn)行的誘導(dǎo)表達(dá)，于分子量約為56kDa處，誘導(dǎo)后的菌體均較誘導(dǎo)前的菌體呈現(xiàn)出明顯表達(dá)條帶，此處即為SjADA基因產(chǎn)物與硫氧還蛋白(Trx)的融合體，大小與預(yù)期結(jié)果相符。
破菌結(jié)果顯示，a)重組融合蛋白表達(dá)后以包涵體形式存在于菌體中；b)重組融合蛋白的表達(dá)量在大腸肝菌BL21(DE3)中較在BL21(DE3)pLysS中要好，且表達(dá)較穩(wěn)定。因此，選用在大腸肝菌BL21(DE3)中表達(dá)的融合蛋白繼續(xù)下一步純化工作。
3)包涵體裂解純化用少量去離子水重懸實施例6中步驟2)所得沉淀，加入含8M Urea的Tris緩沖液(pH8.0，含0.1％巰基乙醇)中，室溫攪拌1小時以上。于4℃、10,000rpm離心15min(去除沉淀)，取上清液直接用于純化。
4)包涵體溶解液親和純化a)純化用樹脂Chelating Sepharose FF親和層析樹脂；b)純化用緩沖液平衡緩沖液A含10mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris(pH8.0)、8M Urea；洗脫緩沖液B含200mM咪唑、200mM NaCl、20mM Tris(pH8.0)、8M Urea。
c)純化步驟樹脂的平衡取5倍柱體積的緩沖液A平衡樹脂；樣品上柱將實施例6中步驟3)所得上清液與樹脂結(jié)合；洗滌用緩沖液A淋洗層析樹脂，直至基線平穩(wěn)；洗脫用緩沖液B洗脫融合蛋白，收集洗脫峰。
d)復(fù)性步驟采用透析復(fù)性方法，透析袋截留分子量為10KD。將洗脫液稀釋至蛋白濃度約為0.2mg/ml，裝入透析袋中，透析過夜，復(fù)性緩沖液為0.1M Tris緩沖液(pH 8.0)。第二天離心收集上清液。
融合蛋白Trx-SjADA的純化結(jié)果見圖7。其中，泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2為上樣前溶解沉淀樣品；泳道3為洗脫峰，即純化的蛋白；泳道4為洗脫峰尖，即純化的蛋白；泳道5-7為穿透峰。結(jié)果顯示，經(jīng)洗脫得到的純化蛋白，其分子量為56kDa，與理論值一致。
同時，用BandScan 4.5凝膠成像分析軟件對所得純化蛋白(如圖7所示)進(jìn)行純度分析，結(jié)果顯示泳道2所示目標(biāo)蛋白灰度百分比為70.80％；泳道3所示目標(biāo)蛋白灰度百分比為82.40％；泳道4所示目標(biāo)蛋白灰度百分比為84.10％。因此，所得蛋白的純度為84％左右。
實施例7 SjADA酶活力的測定1)蛋白含量測定用蛋白質(zhì)含量測定試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定樣品的蛋白濃度。操作過程參照試劑盒說明書。
蛋白含量的測定結(jié)果顯示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得實施例6所得純化后的融合蛋白Trx-SjADA的濃度為1.16mg/ml。
2)腺苷脫氨酶ADA活力測定利用國產(chǎn)酶活力測定試劑盒(50T)測定腺苷脫氨酶(ADA)融合蛋白的酶活力。操作過程參照測試盒說明書。取由大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的含Trx-SjADA融合蛋白的純化產(chǎn)物20μl，測定其中腺苷脫氨酶的酶活力，做三次重復(fù)測試。以每毫克蛋白在37℃時和底物作用60分鐘后產(chǎn)生1μg氨氮為一個酶活性單位來計算，得到所測融合蛋白Trx-SjADA樣品中腺苷脫氨酶的酶活力為60.73±6.25U/毫克蛋白。(正常參考值人血清0-25U/ml)上述結(jié)果顯示融合蛋白Trx-SjADA具有腺苷脫氨酶活性。
序列表SEQUENCE LISTING<110>中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所華東理工大學(xué)上海生物信息技術(shù)研究中心<120>SjADA編碼基因、其構(gòu)建方法及其體外融合表達(dá)產(chǎn)物和表達(dá)方法<130>CN061004<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1059<212>DNA<213>人工合成<400>1atgtggctac ctttggattt gtttgggatt aacttgcatg tccatctaga tggttccatt 60aggccagaaa cgttgtttga gttatcaaat gataaaatat ccaaacctca gtttaaaacc120ttggaagagc tcaaagacaa gttaacgcct aaaaagccac acagtttaaa agacttcctg180aaagcttttg agataataat accattaatt gctggtaaga aagaggtttt ggcgcgtata240tgtgaagaat tcgtagaaga ttgtgtacaa cgtggtggtt tatgttatgc ggaaacaaga300tattgtccat ttttactggc cgactctaga tttaatgcag aagaagttct gaaaacaatt360cttgattcgc ttaacagagc tagtaaaaaa cacggcattg aagttcgttc cattttatcc420atcatgagac atatgcctga gacagcttca gaaacattag aattggccaa aaattatcaa480ccacatggag ttgttgcaat cgacgttgca ggcgatgatt cagttttgaa atcgcaacgt540ttaccgaatg aaatagttca aacatttgaa gaagctaaaa aggctggtat tcatcgtacg600gttcatgttg gtgaaaatag tccagcaagt agtgtatatg aagcagtcaa tattctacac660gctgaacgta ttggtcatgg gtatcatata ctagatgatg aaaaggctta taaatcttta720cttcaagcag gtgtacattt cgaggtatgc ccatcatcga gttttgttac gggttctgtc780gactctaaaa ttttaaataa ccatcctgta catcgtttca ttgaagataa agctaacttc840tctattaata ccgatgatcc aacattaaca gagagatggg atatacaaga agcacaatat900tgtttagaaa cattaggtat aaaacctagt caattaataa atgctaatta taatgctgca960atgtcagcat ttcttactac ttctgaaaaa gaaatcttaa tttcccatat aaatattaga 1020tcaagaaata gaataatcga aattcactcc aaaacataa 1059<210>2<211>352<212>PRT<213>人工合成<400>2Met Trp Leu Pro Leu Asp Leu Phe Gly Ile Asn Leu His Val His Leu1 5 10 15Asp Gly Ser Ile Arg Pro Glu Thr Leu Phe Glu Leu Ser Asn Asp Lys20 25 30Ile Ser Lys Pro Gln Phe Lys Thr Leu Glu Glu Leu Lys Asp Lys Leu35 40 45
序列表Thr Pro Lys Lys Pro His Ser Leu Lys Asp Phe Leu Lys Ala Phe Glu50 55 60Ile Ile Ile Pro Leu Ile Ala Gly Lys Lys Glu Val Leu Ala Arg Ile65 70 75 80Cys Glu Glu Phe Val Glu Asp Cys Val Gln Arg Gly Gly Leu Cys Tyr85 90 95Ala Glu Thr Arg Tyr Cys Pro Phe Leu Leu Ala Asp Ser Arg Phe Asn100 105 110Ala Glu Glu Val Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ser Leu Asn Arg Ala Ser115 120 125Lys Lys His Gly Ile Glu Val Arg Ser Ile Leu Ser Ile Met Arg His130 135 140Met Pro Glu Thr Ala Ser Glu Thr Leu Glu Leu Ala Lys Asn Tyr Gln145 150 155 160Pro His Gly Val Val Ala Ile Asp Val Ala Gly Asp Asp Ser Val Leu165 170 175Lys Ser Gln Arg Leu Pro Asn Glu Ile Val Gln Thr Phe Glu Glu Ala180 185 190Lys Lys Ala Gly Ile His Arg Thr Val His Val Gly Glu Asn Ser Pro195 200 205Ala Ser Ser Val Tyr Glu Ala Val Asn Ile Leu His Ala Glu Arg Ile210 215 220Gly His Gly Tyr His Ile Leu Asp Asp Glu Lys Ala Tyr Lys Ser Leu225 230 235 240Leu Gln Ala Gly Val His Phe Glu Val Cys Pro Ser Ser Ser Phe Val245 250 255Thr Gly Ser Val Asp Ser Lys Ile Leu Asn Asn His Pro Val His Arg260 265 270Phe Ile Glu Asp Lys Ala Asn Phe Ser Ile Asn Thr Asp Asp Pro Thr275 280 285Leu Thr Glu Arg Trp Asp Ile Gln Glu Ala Gln Tyr Cys Leu Glu Thr290 295 300Leu Gly Ile Lys Pro Ser Gln Leu Ile Asn Ala Asn Tyr Asn Ala Ala305 310 315 320Met Ser Ala Phe Leu Thr Thr Ser Glu Lys Glu Ile Leu Ile Ser His325 330 335Ile Asn Ile Arg Ser Arg Asn Arg Ile Ile Glu Ile His Ser Lys Thr340 345 350
序列表<210>3<211>42<212>DNA<213>人工合成<400>3ctgggtaccg acgacgacga caagatgtgg ctacctttgg at 42<210>4<211>28<212>DNA<213>人工合成<400>4gtgctcgagc tattatgttt tggagtga 28
權(quán)利要求
1.日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA編碼基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1所示序列。
2.SjADA編碼基因的制備方法，其特征在于以含日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA基因序列的cDNA克隆SJM2AHD10為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
3.重組表達(dá)質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA。
4.重組表達(dá)質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA的構(gòu)建方法，其特征在于包括將質(zhì)粒載體pET32-a(+)與SjADA編碼基因的連接步驟。
5.一種用權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒pET 32-a(+)-SjADA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
7.融合蛋白Trx-SjADA，其特征在于包含序列表中SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
8.融合蛋白Trx-SjADA的制備方法，其特征在于包括將重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-a(+)-SjADA轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于還包括Trx-SjADA的純化。
10.如權(quán)利要求9所述的純化方法，其特征在于用Chelating Sepharose FF親和層析純化。
全文摘要
本發(fā)明提供日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA的基因序列及其獲得方法、可在宿主細(xì)胞中表達(dá)SjADA的表達(dá)質(zhì)粒pET 32－a(+)－SjADA及其獲得方法、在宿主細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白Trx－SjADA及其獲得方法。所述融合蛋白Trx－SjADA具有日本血吸蟲腺苷脫氨酶SjADA活性。
文檔編號C12N9/10GK1884549SQ200610026650
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日
發(fā)明者楊忠, 胡薇, 李亦學(xué), 馮正, 魏東芝 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所, 華東理工大學(xué), 上海生物信息技術(shù)研究中心