專利名稱：選擇性地分離和純化rna的方法以及分離和純化核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于選擇性地分離和純化RNA的方法。此外，本發(fā)明涉及用于分離和純化核酸的方法。具體地說，本發(fā)明涉及從含有RNA和DNA的核酸混合物中分離和純化RNA或DNA的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及這樣一種方法，該方法使用核酸分離純化柱和壓力差產(chǎn)生裝置，從含有RNA和DNA的核酸混合物中分離和純化RNA或DNA，其中所述核酸分離純化柱包含有具有至少兩個開口的容器，并且所述核酸分離純化柱在該容器之內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜。
背景技術(shù)：
各種形式的核酸應(yīng)用于各個領(lǐng)域。例如，在重組核酸技術(shù)領(lǐng)域中，需要將核酸以探針、基因組核酸和質(zhì)粒核酸的形式使用。
此外，在診斷學(xué)領(lǐng)域中，核酸以各種形式應(yīng)用于各種目的。例如，在檢測和診斷人類病原體時，常常使用核酸探針。同樣，核酸也用于檢測遺傳性病癥。核酸還用于檢測食品污染物。此外，基于從繪制基因圖譜到克隆和重組表達(dá)的各種原因，也常常用核酸對所關(guān)心的核酸進(jìn)行定位、識別和分離。
在許多情況下，只有極微量的核酸可以利用，因此分離和純化過程費時費力。這些費時費力的操作有時可能會導(dǎo)致核酸損失。
在從來自于血清、尿和細(xì)菌培養(yǎng)物的樣品中純化核酸時，還會碰到污染和假陽性結(jié)果的問題。
關(guān)于廣為人知的分離和純化方法，有這樣一種方法，其中將核酸吸附到二氧化硅、二氧化硅聚合物(silica polymer)、硅酸鎂或類似的固相上，隨后通過實施洗滌、解吸附和類似的操作對核酸進(jìn)行分離和純化(參見例如專利文獻(xiàn)JPA-7-51065)。該方法具有優(yōu)異的分離性能，但是，該方法在方便性、快速性和自動化適應(yīng)性方面還存在不足，并且該方法存在如下問題由于該方法所使用的工具和裝置不符合自動化和小型化的要求，所以很難在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)過程中制造出性能相同的所述工具和裝置(特別是吸附介質(zhì))；并且由于所述工具和裝置不便于加工，所以它們難以被加工成各種形狀。此外，由于材料具有脆性而要求其達(dá)到一定的厚度或更厚以獲得機(jī)械強(qiáng)度，所以特別是在用脫氧核糖核酸酶使DNA降解以便從含有DNA和RNA的混合樣品中選擇性地回收RNA時，存在著例如這樣的缺點為了使脫氧核糖核酸酶在固相上均勻地發(fā)生作用，脫氧核糖核酸酶溶液的量必須達(dá)到一定的值或更高。由于脫氧核糖核酸酶相對較貴，所以在選擇性地回收RNA的情況中，這將成為問題，而據(jù)預(yù)計，今后回收RNA的需求將會大幅增加。
此外，簡單有效地分離和純化核酸的方法之一是使用一種使核酸吸附到固相上的溶液和一種使核酸從固相膜解吸附的溶液，所以有這樣一種分離和純化核酸的方法，該方法包括以下步驟將核酸吸附到固相上以及使核酸從該固相上解吸附，所述固相在其表面上含有帶羥基的有機(jī)聚合物(參見專利文獻(xiàn)JPA-2003-128691和JPA-2004-49108)。但是該方法還需要作更多改進(jìn)。
其它相關(guān)的用于分離和純化核酸的已知方法的實例是使用離心作用的方法、使用磁珠的方法和使用濾膜的方法。此外，人們已經(jīng)提出了使用上述方法的核酸分離純化裝置。例如，有一種使用濾膜的核酸分離純化裝置，其中把若干帶有濾膜的濾管固定在臺架上，并把含有核酸的樣品溶液注入濾管中，在該裝置內(nèi)，將密封劑施加在臺架的底部，并用氣囊密封，以便減小內(nèi)壓；同時，從排出側(cè)抽吸含有核酸的樣品溶液，使樣品溶液從所有濾管中通過，從而將核酸吸附到濾膜上；然后，注入洗滌液、回收液，并在減壓條件下再次抽吸，從而也進(jìn)行了洗滌和解吸附操作。人們已經(jīng)提出了一種采取上述步驟的自動裝置(例如，參見日本專利No.2832586)。

發(fā)明內(nèi)容
然而，在分離和純化核酸的相關(guān)方法中，還沒有具體公開從混合物溶液(其中，DNA和RNA以混合狀態(tài)存在)中高效高精確性地分離和純化DNA或RNA的方法。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供更廉價的、用于從含有RNA和DNA的核酸混合物中選擇性地分離和純化RNA的方法，該方法包括將試驗樣品中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，以及通過洗滌和類似的操作，使RNA解吸附。更具體地說，本發(fā)明提供更廉價且在純度方面優(yōu)異的方法，用于從DNA和RNA的混合樣品中選擇性地回收RNA，其中該方法使用的核酸吸附性多孔膜具有優(yōu)異的分離能力、良好的洗滌效率、簡單快速的可使用性和良好的自動操作適用性，并且分離能力基本相同的所述多孔膜能夠被批量生產(chǎn)出來。
此外，本發(fā)明的第二個目的是提供更廉價的分離和純化方法，該方法從RNA和DNA的混合樣品中選擇性地回收RNA或DNA。
為了解決上述第一個問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)通過使用選擇性地分離和純化RNA的方法就可以解決上述問題。該方法包括以下步驟使用核酸分離純化柱，將含有RNA和DNA的核酸混合物吸附到多孔膜上以及使所述混合物從多孔膜解吸附。其中，所述核酸分離純化柱包含有具有兩個開口的容器，并且所述核酸分離純化柱在該容器之內(nèi)容納有多孔膜。其中，所述方法包括用脫氧核糖核酸酶使多孔膜中的DNA降解的步驟，特別是可以在以下條件下實施該步驟每1cm2的核酸吸附性多孔膜使用130μL或更少的脫氧核糖核酸酶溶液；由此完成本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明包括以下內(nèi)容(1)一種從含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中選擇性地分離和純化RNA的方法，該方法使用包含具有至少兩個開口的容器的核酸分離純化柱，并且該柱在所述容器中容納有溶液能穿過的核酸吸附性多孔膜，其中，所述方法包括以下步驟(1-a)將核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；(1-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期間，用洗滌液洗滌所述核酸吸附性多孔膜；
(1-c)對所述核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理；(1-d)用洗滌液洗滌所述核酸吸附性多孔膜；以及(1-e)用回收液使RNA從所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，從而從該柱排出回收液，其中，在步驟(1-c)中，每1cm2的所述核酸吸附性多孔膜使用總量為130μL或更少的脫氧核糖核酸酶溶液。
(2)如上述(1)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中脫氧核糖核酸酶溶液中的脫氧核糖核酸酶濃度為10KunitzU/mL到10000Kunitz U/mL。
(3)如上述(1)或(2)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜包含有機(jī)聚合物，核酸通過基本沒有離子鍵參與的微弱的相互作用被吸附到該有機(jī)聚合物上。
(4)如上述(3)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜具有羥基。
(5)如上述(1)到(4)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜包含由乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物經(jīng)皂化而得到的有機(jī)材料。
(6)如上述(1)到(5)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不對稱的正面區(qū)域和背面區(qū)域。
(7)如上述(1)到(6)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸混合物溶液是這樣的溶液該溶液是通過向?qū)⒑怂崛芙庠噭┘尤朐囼灅悠分胁⑴c該試驗樣品混合而得到的混合物溶液中，另外再加入水溶性有機(jī)溶劑而得到的。
(8)如上述(7)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述試驗樣品是培養(yǎng)的細(xì)胞。
(9)如上述(8)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述培養(yǎng)細(xì)胞是漂浮型細(xì)胞。
(10)如上述(8)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述培養(yǎng)細(xì)胞是粘著型細(xì)胞。
(11)如上述(7)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述試驗樣品是動物組織。
(12)如上述(7)到(11)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，在加入所述核酸溶解試劑之前或之后，將所述試驗樣品均化。
(13)如上述(7)到(12)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸溶解試劑包含以下試劑中的至少一種離液鹽、核酸穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液以及消泡劑。
(14)如上述(13)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述離液鹽是鹽酸胍和硫氰酸胍中的至少一種。
(15)如上述(7)到(14)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述水溶性有機(jī)溶劑包含以下試劑中的至少一種甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體。
(16)如上述(1)到(15)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述洗滌液是這樣的溶液其包含選自甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體中的至少一種醇，其中，所述洗滌液所包含的所述至少一種醇其含量為1重量％到100重量％。
(17)如上述(1)到(16)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述回收液是濃度為0.5 mol/L或更低的鹽溶液。
(18)如上述(1)到(17)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，
其中，壓力差產(chǎn)生裝置是以可拆裝的方式與核酸分離純化柱的一個開口連接的泵。
(19)一種用于實施上述1到18中的任意一項所述方法的成套用具，該成套用具由核酸分離純化柱和試劑構(gòu)成。
(20)一種用于自動實施上述1到18中的任意一項所述方法的裝置。
(21)一種用于自動使用如上述19所述的成套用具的裝置。
此外，為了解決上述第二個問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)在包括以下步驟的分離和純化核酸的方法中，可以通過使用醇濃度為50重量％或更低的洗滌液來洗脫DNA，從而選擇性地分離和純化RNA或DNA，所述步驟為將含有RNA和DNA的核酸混合物吸附到多孔膜上以及使該混合物從多孔膜上解吸附，由此完成本發(fā)明。此外，在本發(fā)明中，通過使用鹽濃度為0.5M或更低的溶液作為回收液，可以高純度高收率地分離和純化RNA。此外，為了達(dá)到本發(fā)明的效果，優(yōu)選使用這樣的多孔膜作為本發(fā)明中的多孔膜，其中，核酸是通過基本沒有離子鍵參與的微弱的相互作用被吸附到該多孔膜上的。此外，優(yōu)選使用包含具有兩個開口的容器的核酸分離純化柱，其中，該核酸分離純化柱在所述容器的內(nèi)部容納有包含有機(jī)聚合物的多孔膜。也就是說，本發(fā)明包括以下內(nèi)容(22)一種選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，該方法包括以下步驟(2-a)通過使含有RNA和DNA的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而將核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；(2-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期間，使洗滌液穿過所述核酸吸附性多孔膜，從而對所述核酸吸附性多孔膜進(jìn)行洗滌；以及(2-c)通過使回收液穿過所述核酸吸附性多孔膜，從而使核酸從所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，其中，所述洗滌液包含濃度為50重量％或更低的水溶性有機(jī)溶劑，并且所述洗滌液不含離液鹽
(23)如上述(22)所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液包含濃度為5重量％到40重量％的水溶性有機(jī)溶劑。
(24)如上述(22)或(23)所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含有機(jī)聚合物的多孔膜，核酸通過基本沒有離子鍵參與的微弱的相互作用被吸附到該有機(jī)聚合物上。
(25)如上述(22)到(24)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含帶有羥基的有機(jī)聚合物的多孔膜。
(26)如上述(22)到(25)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜是這樣的多孔膜其包含由乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物經(jīng)皂化而得到的有機(jī)材料。
(27)如上述(22)到(26)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不對稱的正面區(qū)域和背面區(qū)域。
(28)如上述(22)到(27)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述樣品溶液是這樣的溶液該溶液是通過向含有細(xì)胞或病毒的試驗樣品經(jīng)核酸溶解試劑處理而得到的溶液中，加入水溶性有機(jī)溶劑而得到的。
(29)如上述(28)所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述試驗樣品是培養(yǎng)細(xì)胞。
(30)如上述(28)所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述試驗樣品是動物組織。
(31)如上述(28)到(30)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，在加入所述核酸溶解試劑之前或之后，將所述試驗樣品均化。
(32)如上述(28)所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸溶解試劑包含以下試劑中的至少一種離液鹽、核酸穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液以及消泡劑。
(33)如上述(32)所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述離液鹽是鹽酸胍和硫氰酸胍中的至少一種。
(34)如上述(22)到(33)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述水溶性有機(jī)溶劑是選自甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體中的至少一種醇。
(35)如上述(22)到(34)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液是這樣的溶液其包含選自甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體中的至少一種醇，并且該醇的含量為5重量％到50重量％。
(36)如上述(22)到(35)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述洗滌液包含水溶性鹽。
(37)如上述(36)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述水溶性鹽的濃度為10mmol/L或更高。
(38)如上述(36)或(37)所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述水溶性鹽的濃度為10mmol/L到1mol/L。
(39)如上述(22)到(38)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液是氯化物的含量為10mmol/L到1mol/L的溶液。
(40)如上述(22)到(39)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述回收液是這樣的溶液該溶液能夠使被吸附的RNA從所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且該溶液的鹽濃度為0.5mol/L或更低。
(41)如上述(22)到(40)中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，在步驟(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，通過使用以下裝置使所述含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液穿過所述核酸吸附性多孔膜，所述裝置為(i)核酸分離純化柱，該核酸分離純化柱包含具有至少兩個開口的容器，并且該核酸分離純化柱在所述容器內(nèi)容納有溶液能穿過的核酸吸附性多孔膜；以及(ii)壓力差產(chǎn)生裝置。
其中，所述壓力差產(chǎn)生裝置是以可拆裝的方式與核酸分離純化柱的一個開口連接的泵。
(42)一種用于實施上述(22)到(41)中的任意一項所述方法的成套用具，該成套用具由核酸分離純化柱和試劑構(gòu)成。
(43)一種用于自動實施上述(22)到(41)中的任意一項所述方法的裝置。


圖1是根據(jù)實施例1-1以及對比例1-1、1-2和1-3，用1％的瓊脂糖凝膠使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳而得到的照片。
圖2是根據(jù)對比例1-2，用1％的瓊脂糖凝膠使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳而得到的照片。
圖3是根據(jù)實施例1-1和對比例1-1，用1％的瓊脂糖凝膠使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳而得到的照片。
圖4是根據(jù)實施例1-3和對比例1-5，采用MOPS-甲酰胺電泳方法使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳而得到的照片。
圖5是根據(jù)實施例1-4和對比例1-6，用1％的瓊脂糖凝膠使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳而得到的照片。
圖6是根據(jù)實施例1-5和對比例1-7、以及實施例1-6和對比例1-8，用1％的瓊脂糖凝膠使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳而得到的照片。
圖7是對經(jīng)實施例2-2-1和實施例2-2-2純化的核酸進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果的照片。
RNA表示RNA衍生帶；DNA表示DNA衍生帶；E10表示實施例1-1脫氧核糖核酸酶溶液的量為10μL(26μL/cm2)；E20表示實施例1-1脫氧核糖核酸酶溶液的量為20μL(52μL/cm2)；E40表示實施例1-1脫氧核糖核酸酶溶液的量為40μL(104μL/cm2)；E80表示參考例1-1脫氧核糖核酸酶溶液的量為80μL(208μL/cm2)；C1表示對比例1-1脫氧核糖核酸酶溶液的量為0μL；C2-10表示對比例1-2脫氧核糖核酸酶溶液的量為10μL(26μL/cm2)；C2-20表示對比例1-2脫氧核糖核酸酶溶液的量為20μL(52μL/cm2)；C2-80表示對比例1-2脫氧核糖核酸酶溶液的量為80μL(208μL/cm2)；C3表示對比例1-3脫氧核糖核酸酶溶液的量為0μL；M表示RNA分子量標(biāo)記；1表示實施例1-3；2表示對比例1-5；3表示實施例1-4脫氧核糖核酸酶溶液的量為10μL(26μL/cm2)；4表示對比例1-6脫氧核糖核酸酶溶液的量為80μL(208μL/cm2)；M2表示1kb Plus梯帶；5表示實施例1-5中的小鼠脾臟，其中脫氧核糖核酸酶溶液的量為10μL(26μL/cm2)；6表示對比例1-7的小鼠脾臟，其中脫氧核糖核酸酶溶液的量為80μL(208μL/cm2)；7表示實施例1-6中的小鼠肝臟，其中脫氧核糖核酸酶溶液的量為10μL(26μL/cm2)；8表示對比例1-8中的小鼠肝臟，其中脫氧核糖核酸酶溶液的量為80μL(208μL/cm2)；M3表示1kb Plus梯帶。
本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的選擇性地分離和純化核酸的第一種方法使用包含具有至少兩個開口的容器的核酸分離純化柱，其中，所述核酸分離純化柱在該容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，并且含有DNA和RNA的核酸混合物溶液可以穿過所述多孔膜，該方法包括至少以下步驟(1-a)將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上(以下稱為“吸附步驟”)；(1-b)在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，用洗滌液對該膜進(jìn)行洗滌(以下稱為“洗滌步驟1”)；(1-c)對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理(在核酸吸附性多孔膜上進(jìn)行脫氧核糖核酸酶反應(yīng))；(1-d)使用洗滌液對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行洗滌(以下稱為“洗滌步驟2”)；以及(1-e)用回收液使RNA從核酸吸附性多孔膜的內(nèi)部解吸附，并由所述柱的容器排出RNA(以下稱為“回收步驟”)。
在步驟(1-a)、(1-b)、(1-c)、(1-d)和(1-e)中的每一步中，優(yōu)選的是，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗滌液、脫氧核糖核酸酶溶液或回收液在加壓狀態(tài)下穿過核酸吸附性多孔膜；更優(yōu)選的是，向核酸分離純化柱的第一個開口注入核酸混合物溶液、洗滌液、脫氧核糖核酸酶溶液或回收液，并采用與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接的壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使每一種注入的溶液穿過核酸吸附性多孔膜，并由核酸分離純化柱的另一個開口排出，其中，該核酸分離純化柱包含具有至少兩個開口的容器，在該容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜。優(yōu)選的是，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗滌液、脫氧核糖核酸酶溶液或回收液在加壓狀態(tài)下穿過上述的多孔膜，從而使裝置可以實現(xiàn)小型化和自動化。由泵產(chǎn)生的加壓狀態(tài)優(yōu)選為10kPa到300kPa，并且更優(yōu)選為40kPa到200kPa。
更優(yōu)選的是，可以通過使用容納有上述核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱、以如下步驟來分離和純化RNA。
即，步驟(1-1)，向包含具有至少兩個開口的容器的核酸分離純化柱的第一個開口注入含有DNA和RNA的核酸混合物溶液，其中，核酸分離純化柱在所述容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，溶液可以穿過該膜；步驟(1-2)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的含有DNA和RNA的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的含有DNA和RNA的核酸混合物溶液從核酸分離純化柱的另一個開口排出，由此將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；步驟(1-3)，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入洗滌液；步驟(1-4)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗滌液從另一個開口排出，由此在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，洗滌該膜；步驟(1-5)，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入脫氧核糖核酸酶溶液，從而對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理；步驟(1-6)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的脫氧核糖核酸酶溶液穿過核酸吸附性多孔膜，并從另一個開口排出所注入的脫氧核糖核酸酶溶液；步驟(1-7)，向核酸分離純化柱的第一個開口注入洗滌液；步驟(1-8)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗滌液從另一個開口排出，由此在RNA被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，洗滌該膜；步驟(1-9)，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入回收液；以及步驟(1-10)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的回收液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的回收液從另一個開口排出，并由此使RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且將解吸附的RNA排出核酸分離純化柱的容器。
在上述的RNA分離和純化步驟中，從第一次注入核酸混合物溶液到在核酸分離純化柱外得到RNA，這一過程可以在基本上少于20分鐘的時間內(nèi)結(jié)束。在非常充分的條件下，該過程可以在少于2分鐘的時間內(nèi)結(jié)束。
此外，在上述RNA的分離和純化步驟中，可回收得到其純度與紫外光-可見光分光光度計(260nm/280nm)的吸收度測量值1.8到2.2相對應(yīng)的RNA。并且可以穩(wěn)定地得到幾乎不含雜質(zhì)污染物的高純度RNA。在非常充分的條件下，可回收得到其純度與紫外光-可見光分光光度計(260nm/280nm)的吸收度測量值約2.0相對應(yīng)的RNA。
此外，分離和純化核酸的第二種方法包括至少以下步驟步驟(2-a)，通過使含有RNA和DNA的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；步驟(2-b)，在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，通過使洗滌液穿過該膜，從而洗滌核酸吸附性多孔膜；以及步驟(2-c)，通過使回收液穿過核酸吸附性多孔膜，從而使核酸從多孔膜上解吸附。
在步驟(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，優(yōu)選的是，通過使用壓力差產(chǎn)生裝置，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗滌液或回收液穿過核酸吸附性多孔膜。在步驟(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，更優(yōu)選的是，向包含具有至少兩個開口的容器的核酸分離純化柱的第一個開口注入含有核酸的樣品溶液、洗滌液或回收液。其中，核酸分離純化柱在該容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，并且使用與所述柱的所述第一個開口連接的壓力差產(chǎn)生裝置，使所述柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使每一種注入的溶液都穿過核酸吸附性多孔膜，并從另一個開口排出。優(yōu)選的是，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗滌液或回收液在加壓狀態(tài)下穿過上述多孔膜，從而可以實現(xiàn)裝置的小型化和自動化。由泵產(chǎn)生的加壓狀態(tài)優(yōu)選為10kPa到300kPa，并且更優(yōu)選為40kPa到200kPa。
更優(yōu)選的是，可以使用容納有上述核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱、以如下步驟來分離和純化RNA和DNA。
即，步驟(2-1)，向包含具有至少兩個開口的容器的核酸分離純化柱的第一個開口注入含有DNA和RNA的核酸混合物溶液。其中，核酸分離純化柱在所述容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，溶液可以穿過該膜；步驟(2-2)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使所注入的含有DNA和RNA的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的混合物溶液從核酸分離純化柱的另一個開口排出，由此將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；步驟(2-3)，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入洗滌液；步驟(2-4)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗滌液從另一個開口排出，由此在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，洗滌該膜；步驟(2-5)，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入回收液；以及步驟(2-6)，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，從而使注入的回收液穿過核酸吸附性多孔膜，并使注入的回收液從另一個開口排出，由此使核酸從核酸吸附性多孔膜上解吸附，并將解吸附的核酸排出核酸分離純化柱的容器。
在上述的分離和純化核酸的步驟中，從第一次注入含有核酸的樣品溶液到在核酸分離純化柱外得到核酸，這一過程可以在基本上少于20分鐘的時間內(nèi)結(jié)束。在非常充分的條件下，該過程可以在少于2分鐘的時間內(nèi)結(jié)束。
此外，在上述分離和純化核酸的步驟中，可回收這樣的核酸在含有DNA的情況下，可回收得到其純度與紫外光-可見光分光光度計(260nm/280nm)的吸收度測量值1.6到2.0相對應(yīng)的核酸；在含有RNA的情況下，可回收得到其純度與紫外光-可見光分光光度計(260nm/280nm)的吸收度測量值1.8到2.2相對應(yīng)的核酸。并且可以穩(wěn)定地得到幾乎不含雜質(zhì)污染物的高純度核酸。此外，可回收得到紫外光-可見光分光光度計(260nm/280nm)的吸收度測量值為約1.8的DNA和吸收度測量值為約2.0的RNA。
此外，在上述兩種方法的步驟中，壓力差產(chǎn)生裝置的實例包括泵以及類似的能夠增大壓力的裝置(例如注射器、移液管和Perista泵)、或蒸發(fā)器以及類似的能夠減小壓力的裝置。在這些裝置中，注射器和泵分別適用于手動操作和自動操作。
此外，移液管具有易于單手操作的優(yōu)點。優(yōu)選的是，壓力差產(chǎn)生裝置以可拆裝的方式與核酸分離純化柱的一個開口連接。
此外，在上述兩種方法的步驟中，還可以優(yōu)選進(jìn)行的操作是，使用壓力差產(chǎn)生裝置使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成減壓狀態(tài)，該壓力差產(chǎn)生裝置與分離純化柱的另一個開口連接。此外還可以優(yōu)選進(jìn)行的操作是，對核酸分離純化柱進(jìn)行離心操作。
試驗樣品與含有DNA和RNA的核酸混合物溶液本發(fā)明所使用的試驗樣品不受限制，只要試驗樣品中含有核酸即可，例如，其在診斷領(lǐng)域中包括作為試驗樣品收集的體液(例如全血、血漿、血清、尿、排泄物、精液和唾液)，或者植物(或其一部分)、動物(或其一部分)、細(xì)菌、病毒、培養(yǎng)的細(xì)胞以及由生物材料(例如上述樣品的裂解產(chǎn)物和勻漿)制成的溶液。培養(yǎng)細(xì)胞包括漂浮型細(xì)胞和粘著型細(xì)胞。漂浮型細(xì)胞是指這樣的細(xì)胞其漂浮在培養(yǎng)液中進(jìn)行生長和增殖，并且不必粘著在容器壁上，例如，舉出HL60，U937和HeLaS3等作為代表性的細(xì)胞株。粘著型細(xì)胞是指粘著在容器的底面上在培養(yǎng)液中進(jìn)行生長和增殖的細(xì)胞。例如，舉出NIH3T3、HEK293、HeLa、COS和CHO等作為代表性的細(xì)胞株。作為試驗樣品而使用的動物(或其一部分)可以是其組織。例如，可以使用由動物解剖或活體解剖而得到的組成生物個體的所有組織，例如，肝臟、腎臟、脾臟、腦、心臟、肺或胸腺。
使用含有試劑的水溶液處理這些試驗樣品。所述試劑能分解細(xì)胞膜和核膜，并溶解核酸，所以稱之為核酸溶解試劑。由此可以使細(xì)胞膜和核膜分解，并且使核酸分散到水溶液中，從而得到核酸混合物溶液。
優(yōu)選的是，按以下操作步驟得到核酸混合物溶液(I)向容器中注入試驗樣品；
(II)向容器中加入核酸溶解試劑，并由此將試驗樣品與核酸溶解試劑混合，從而得到混合物溶液；以及(III)向上述得到的混合物溶液中加入水溶性有機(jī)溶劑。
核酸溶解試劑的實例包括選自離液鹽(chaotropic salt)、核酸穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液以及消泡劑中的至少一種。
關(guān)于離液鹽，已知的離液鹽都可以使用而不受任何特別限定。例如，可以使用胍鹽、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀。特別優(yōu)選的是胍鹽。胍鹽的實例包括鹽酸胍、異硫氰酸胍和胍的硫氰酸鹽(硫氰酸胍)，并且特別優(yōu)選的是鹽酸胍或胍的硫氰酸鹽。這些鹽可單獨使用，或者兩種或多種組合使用。
核酸溶解試劑中的離液鹽的濃度優(yōu)選為0.5mol/L或更高，更優(yōu)選為0.5mol/L到8mol/L，甚至更優(yōu)選為1mol/L到6mol/L。
可以使用諸如脲之類的離液物質(zhì)來代替離液鹽。
核酸溶解試劑中優(yōu)選含有核酸穩(wěn)定劑。由于核酸穩(wěn)定劑可以穩(wěn)定試驗樣品中的核酸，所以優(yōu)選使用核酸穩(wěn)定劑。更優(yōu)選的是，核酸穩(wěn)定劑與選自離液鹽、表面活性劑、緩沖劑和消泡劑中的任何一個或多個共存。通過如此混合，可以提高最終得到的RNA回收率和回收效率，從而可以使試驗樣品用量最少化并使操作加速。
關(guān)于核酸穩(wěn)定劑，可舉出這樣的試劑其可以發(fā)生反應(yīng)使核酸酶的活性失活。根據(jù)試驗樣品的不同，存在這樣的情況其中含有核酸酶(能夠使核酸降解)，結(jié)果當(dāng)核酸被均化時，核酸酶與核酸發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致回收量顯著降低。為了達(dá)到避免這種情況發(fā)生的目的，可以使具有使核酸酶失活的功能的穩(wěn)定劑與核酸溶解溶液共存。結(jié)果，核酸的回收率和回收效率提高，而使得試驗樣品的用量最少化并使操作加速。
關(guān)于具有使核酸酶活性失活的功能的核酸穩(wěn)定劑，可使用通常被用作還原劑的化合物。還原劑的實例包括氫化化合物，例如，氫原子、碘化氫、硫化氫、氫化鋁鋰和硼氫化鈉；高正電性金屬，例如，堿金屬、鎂、鈣、鋁和鋅，或它們的汞合金；有機(jī)氧化物，例如，醛類、糖類、甲酸和草酸；以及巰基化合物。在這些物質(zhì)當(dāng)中，巰基化合物是優(yōu)選的。巰基化合物的實例包括N-乙酰半胱氨酸、巰基乙醇和烷基硫醇或類似的化合物。巰基化合物可以單獨使用或者兩種或多種組合使用。
在核酸溶解試劑中，核酸穩(wěn)定劑的濃度優(yōu)選為0.1重量％到20重量％，并且更優(yōu)選為0.3重量％到15重量％。在核酸溶解試劑中，巰基化合物的濃度優(yōu)選為0.1重量％到20重量％，并且更優(yōu)選為0.5重量％到15重量％。
表面活性劑(例如)包括非離子型表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和兩性表面活性劑。
在本發(fā)明中，可優(yōu)選使用非離子型表面活性劑和陽離子表面活性劑。
非離子型表面活性劑包括聚氧亞乙基烷基苯基醚類表面活性劑、聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑和脂肪酸烷醇酰胺，并且優(yōu)選為聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑。在聚氧亞乙基(POE)烴基醚類表面活性劑中，更優(yōu)選的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亞烷基癸醚、POE脫水山梨糖醇單月桂酸酯、POE脫水山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。
陽離子表面活性劑包括溴化十六烷基三甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨和氯化十六烷基吡啶。
這些表面活性劑可以單獨使用或者兩種或多種組合使用。在核酸溶解試劑中，表面活性劑的濃度優(yōu)選為0.1重量％到20重量％。
所使用的核酸溶解試劑的pH優(yōu)選為3到8，其pH更優(yōu)選為4到7，其pH進(jìn)一步優(yōu)選為5到7。
關(guān)于緩沖液，可使用常規(guī)pH緩沖液(緩沖液)。優(yōu)選使用生化pH緩沖液。這種緩沖液的實例包括含有以下物質(zhì)的緩沖液檸檬酸鹽、磷酸鹽或乙酸鹽、Tris-HCl、TE(Tris-HCl/EDTA)、TBE(三羥甲基氨基甲烷硼酸鹽(Tris-Borate)/EDTA)、TAE(三羥甲基氨基甲烷乙酸鹽(Tris-Acetate)/EDTA)；以及GUD緩沖液。GUD緩沖液的實例包括MES(2-嗎啉代乙磺酸)、Bis-Tris(雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷)、HEPES(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪基-1，4-雙(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-環(huán)已基-3-氨基丙磺酸)、TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。
在第一種方法所用的核酸溶解試劑中，上述這些緩沖液的濃度優(yōu)選為1mmol/L到500mmol/L。在第二種方法所用的核酸溶解試劑中，上述這些緩沖液的濃度也優(yōu)選為1mmol/L到500mmol/L。
關(guān)于消泡劑，可舉出如下試劑硅類消泡劑(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有機(jī)硅乳液、改性聚硅氧烷和有機(jī)硅復(fù)合物等)、醇類消泡劑(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亞烷基二醇等)、醚類消泡劑(例如，庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山梨糖醇等)、脂肪和油類消泡劑(例如，動物油和植物油等)、脂肪酸類消泡劑(例如，硬脂酸、油酸和棕櫚酸等)、金屬皂類消泡劑(例如，硬脂酸鋁和硬脂酸鈣等)、脂肪酸酯類消泡劑(例如，天然蠟和磷酸三丁酯等)、磷酸鹽酯類消泡劑(例如，辛基磷酸鈉等)、胺類消泡劑(例如，二戊基胺等)、酰胺類消泡劑(例如，硬脂酸酰胺等)和其它消泡劑(例如，硫酸鐵和礬土等)。這些消泡劑可以單獨使用或者兩種或多種組合使用。特別優(yōu)選的是，將硅類消泡劑和醇類消泡劑這兩種化合物組合在一起使用。
在核酸溶解試劑中，消泡劑的濃度優(yōu)選為0.1重量％到10重量％。
此外，核酸溶解試劑可含有水溶性有機(jī)溶劑。水溶性有機(jī)溶劑的實例包括丙酮、三氯甲烷、醇類和二甲基甲酰胺。優(yōu)選的是，使用這些試劑的作用是使核酸溶解試劑中所含的各種試劑的溶解度增加。在這些試劑中，醇類是優(yōu)選的。關(guān)于醇，可使用伯醇、仲醇和叔醇中的任意一種。更優(yōu)選的是，可使用甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體。這些水溶性有機(jī)溶劑可以單獨使用或者兩種或多種組合使用。在核酸溶解試劑中，這些水溶性有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為1重量％到20重量％。
優(yōu)選的是，在加入核酸溶解試劑之前或之后，將試驗樣品均化。此外，優(yōu)選的是，將加入核酸溶解試劑后所得到的溶液均化。通過均化，可較好地改善自動化適應(yīng)性?？赏ㄟ^以下方式進(jìn)行均化處理，例如，超聲波處理、使用尖銳的突出物進(jìn)行處理、通過高速攪拌進(jìn)行處理、通過推壓使樣品穿過微孔進(jìn)行處理以及使用珠子(例如，玻璃珠、不銹鋼珠和二氧化鋯珠子)進(jìn)行處理。
對實施這些處理沒有特殊的限定。例如，可使用以下任何器材混合器(例如，渦流混合器)、勻漿器(例如，轉(zhuǎn)子-定子式勻漿器、Potter勻漿器和Dounce勻漿器)、玻珠研磨機(jī)、研杵、弗氏壓碎器、研磨機(jī)和漿式勻漿器等。當(dāng)在加入核酸溶解試劑之前、在將試驗樣品放入液氮之后進(jìn)行均化時，可使用研缽和研杵、玻珠研磨機(jī)、壓碎機(jī)或粉碎機(jī)進(jìn)行研磨或粉碎。
對均化后的待分析物與核酸溶解試劑所用的混合方法沒有特殊的限定。例如，在混合時，使用攪拌器或混合器在30rpm到3000rpm的條件下混合1秒到3分鐘是優(yōu)選的。通過這樣混合，可以極大地增加經(jīng)分離和純化的RNA或核酸的最終收率。另一方面，翻轉(zhuǎn)混合(rollover-mixing)5到30次也是優(yōu)選的。此外，移液操作10到50次也可以混勻，在這種情況下，通過簡單的操作，就可以提高經(jīng)分離和純化的RNA和核酸的最終收率，因此是優(yōu)選的。
當(dāng)試驗樣品是類似于培養(yǎng)的細(xì)胞或酵母等時，每10個到1×108個細(xì)胞用50μL到1000μL的核酸溶解試劑進(jìn)行處理是優(yōu)選的。當(dāng)試驗樣品是類似于動物或植物或某生物的組織時，每0.1mg到200mg的組織用50μL到1000μL的核酸溶解試劑進(jìn)行處理是優(yōu)選的。在試驗樣品是細(xì)菌的情況下，每0.1mL到10mL的細(xì)菌培養(yǎng)物用50μL到1000μL的核酸溶解試劑進(jìn)行處理是優(yōu)選的。在不超出柱體積并且達(dá)到完全溶解試驗樣品的條件下，可改變核酸溶解試劑的體積。
向混合物溶液中另外加入水溶性有機(jī)溶劑是優(yōu)選的，所述混合物溶液是通過將核酸溶解試劑加入試驗樣品中并與試驗樣品混合而得到的。關(guān)于水溶性有機(jī)溶劑，使用醇類化合物是優(yōu)選的，但不限于該類化合物。關(guān)于醇類化合物，可使用伯醇、仲醇和叔醇中的任意一種，并且優(yōu)選使用甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體。這些水溶性有機(jī)溶劑可單獨使用或者兩種或多種組合使用。在核酸溶解試劑中，這些水溶性有機(jī)溶劑最終的濃度優(yōu)選為5重量％到90重量％。
例如，在加入水溶性有機(jī)溶劑后進(jìn)行混合時，優(yōu)選在以下條件下使用攪拌裝置攪拌速度為30rpm到3000rpm，攪拌時間為1秒到3分鐘。通過這樣混合，可提高經(jīng)分離和純化的RNA或核酸的最終收率。將試管顛倒5到30次也是優(yōu)選的。此外，移液操作10到50次也可混勻，在這種情況下，通過簡單的操作，就可以提高經(jīng)分離和純化的RNA和核酸的最終收率，因此是優(yōu)選的。
此外，優(yōu)選的是，所得到的核酸混合物溶液的表面張力為0.05J/m2或更低，粘度為1mPa到10000mPa，以及其比重為0.8到1.2。通過使用滿足此范圍要求的溶液，在使核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜后，可以容易地實施去除核酸混合物溶液廢液的操作。將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜的步驟(1-a)和(2-a)(吸附步驟)以下對本發(fā)明所使用的核酸吸附性多孔膜以及將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜的步驟(1-a)和(2-a)進(jìn)行描述。
使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜，其中溶液可從該多孔膜的內(nèi)部通過。在本文中，“溶液可從其內(nèi)部通過”是指當(dāng)在與多孔膜的一面接觸的空間和與該多孔膜的另一面接觸的空間之間存在壓力差時，溶液可從高壓空間向低壓空間流動而穿過所述多孔膜；另一方面是指當(dāng)向所述多孔膜施加離心力時，溶液可以沿著離心力的方向穿過該多孔膜。
本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜是通過該膜與核酸之間的相互作用來吸附核酸，其中，基本沒有離子鍵的參與。這意味著在使用多孔膜的情況下，沒有發(fā)生離子化，因此推測，核酸和多孔膜是通過改變周圍的極性來互相吸引的。因此，核酸吸附性多孔膜優(yōu)選具有優(yōu)異的分離能力和良好的洗滌效率，并且優(yōu)選能夠分離和純化核酸。更優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜是具有親水性基團(tuán)的多孔膜，并且推測，核酸的親水性基團(tuán)和多孔膜的親水性基團(tuán)通過改變周圍的極性而互相吸引。
其中，親水性基團(tuán)是指能在其與水之間發(fā)生相互作用的極性基團(tuán)(原子團(tuán))，并且與吸附核酸有關(guān)的所有基團(tuán)(原子團(tuán))都是合適的。關(guān)于親水性基團(tuán)，其與水之間相互作用的強(qiáng)度約為中等強(qiáng)度(參見由共立出版株式會社出版的《化學(xué)大詞典》中所述的術(shù)語“親水性基團(tuán)”中的“親水性不太強(qiáng)的基團(tuán)”)是合適的，其實例包括羥基、羧基、氰基和氧化亞乙基。優(yōu)選羥基。
其中，具有親水性基團(tuán)的多孔膜是指構(gòu)成多孔膜的材料其本身具有親水性基團(tuán)，或者是對構(gòu)成多孔膜的材料進(jìn)行處理或涂敷，從而引入親水性基團(tuán)。任意一種有機(jī)或無機(jī)材料都適合于作為構(gòu)成多孔膜的材料。例如，可使用如下多孔膜由其本身具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜；通過對構(gòu)成多孔膜的、且不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料進(jìn)行處理，從而向其中引入親水性基團(tuán)而得到的多孔膜；通過對構(gòu)成多孔膜的、且不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料進(jìn)行涂敷，從而向其中引入親水性基團(tuán)而得到的多孔膜；由其本身具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜；通過對構(gòu)成多孔膜的、且不含親水性基團(tuán)的無機(jī)材料進(jìn)行處理，從而向其中引入親水性基團(tuán)而得到的多孔膜；通過對構(gòu)成多孔膜的、且不含親水性基團(tuán)的無機(jī)材料進(jìn)行涂敷，從而向其中引入親水性基團(tuán)而得到的多孔膜。然而，為了簡化步驟，優(yōu)選使用有機(jī)材料(例如有機(jī)聚合物)作為構(gòu)成多孔膜的材料。
具有親水性基團(tuán)的多孔膜材料的實例包括聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯、醋酸纖維素和乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物，所述實例適合于構(gòu)成多孔膜。但具體而言，可以優(yōu)選使用由具有羥基的有機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜，特別是由具有羥基的有機(jī)聚合物構(gòu)成的多孔膜。
關(guān)于由具有羥基的有機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜，具有多糖結(jié)構(gòu)的材料是優(yōu)選的，并且更優(yōu)選使用由乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物構(gòu)成的有機(jī)聚合物多孔膜。可優(yōu)選使用的乙酰值互不相同的醋酸纖維素混合物的實例包括三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物；三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物；三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物；以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。特別是，可以更優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。特別是，三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合比(質(zhì)量比)優(yōu)選為99∶1到1∶99，并且更優(yōu)選為90∶10到50∶50。
更優(yōu)選的是，具有羥基的有機(jī)材料是日本專利申請公開No.2003-128691中披露的醋酸纖維素的皂化反應(yīng)物。在本文中所使用的醋酸纖維素的皂化反應(yīng)物是指乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物經(jīng)過了皂化處理，并且其可優(yōu)選使用的實例包括三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化反應(yīng)物，三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化反應(yīng)物，三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化反應(yīng)物，以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化反應(yīng)物。特別優(yōu)選的是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化反應(yīng)物。三醋酸纖維素與二醋酸纖維素的混合比(質(zhì)量比)優(yōu)選為99∶1到1∶99，并且更優(yōu)選為90∶10到50∶50。這樣就可以根據(jù)表面皂化處理的程度(表面皂化度)來控制多孔膜的表面上的羥基含量(密度)。
為了提高核酸分離的效能，優(yōu)選的是，使多孔膜的表面上具有含量(密度)更高的羥基。經(jīng)皂化反應(yīng)得到的有機(jī)材料其皂化度優(yōu)選為5％到100％，并且更優(yōu)選為10％到100％。
此外，為了增大其表面上具有羥基的有機(jī)聚合物的表面積，優(yōu)選的是，對醋酸纖維素的表面進(jìn)行皂化處理。
其正面區(qū)域和背面區(qū)域彼此對稱的多孔膜是合適的，但是可優(yōu)選使用其正面區(qū)域和背面區(qū)域不對稱的多孔膜。
在本文中，皂化處理是指醋酸纖維素與皂化處理液(例如，氫氧化鈉溶液)接觸。結(jié)果，醋酸纖維素酯衍生物的酯基與皂化處理液接觸而被水解，并且引入羥基，從而形成再生纖維素。因此，所制備的再生纖維素與起始纖維素二者在晶形方面是不同的。為了改變表面皂化度，通過改變氫氧化鈉的濃度或氫氧化鈉的處理時間來實施皂化處理。通過NMR、IR或XPS(例如，檢測羧基峰值的減少程度)來確定表面皂化度。
向不含羥基的有機(jī)材料的多孔膜引入羥基的方法是把在聚合物主鏈或側(cè)鏈上具有羥基的接枝聚合物鏈鍵合到多孔膜上。用于將接枝聚合物鏈鍵合到多孔膜有機(jī)材料中的方法包括以下兩種例如，使接枝聚合物鏈與多孔膜化學(xué)鍵合的方法；以及使用多孔膜作為起始件，使具有雙鍵(能發(fā)生聚合反應(yīng))的化合物聚合，從而形成接枝聚合物鏈的方法。
首先，在多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)鍵合的方法中，使用在聚合物的末端或側(cè)鏈上具有能夠與多孔膜發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)這樣的聚合物，所述聚合物通過其官能團(tuán)與多孔膜的官能團(tuán)之間的化學(xué)反應(yīng)而被接枝。對能與多孔膜發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)沒有特別限定，只要它能與多孔膜的官能團(tuán)反應(yīng)即可，并且其實例包括硅烷偶聯(lián)基(例如烷氧基硅烷)、異氰酸基、氨基、羥基、羧基、磺酸基、磷酸基、環(huán)氧基、烯丙基、甲基丙烯?；捅；?。
特別有用的在聚合物末端或側(cè)鏈上具有反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物的實例包括在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有環(huán)氧基的聚合物以及在其末端具有異氰酸基的聚合物。對在此使用的聚合物沒有特別限定，只要其具有參與吸附核酸的親水性基團(tuán)即可，其示例性的實例包括聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基丙烯酸羥乙酯和它們的鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧乙烯以及類似物。
通過使用多孔膜作為起始點、使具有可聚合的雙鍵的化合物進(jìn)行聚合而形成接枝聚合物鏈的方法通常被稱為表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指這樣一種方法其中通過等離子體輻射、光輻射、加熱或類似的方法，在基材表面上形成活性部位，從而將與多孔膜接觸的、具有雙鍵的可聚合化合物通過聚合反應(yīng)而連接到多孔膜上。
用于形成與基材相連的接枝聚合物鏈的化合物必須同時具有可聚合的雙鍵和參與吸附核酸的親水性基團(tuán)這兩個特征?？梢允褂镁哂杏H水性基團(tuán)的聚合物、具有親水性基團(tuán)的低聚物和具有親水性基團(tuán)的單體中的任何一種作為這種化合物，只要其分子中具有雙鍵即可。特別有用的化合物是具有親水性基團(tuán)的單體。
可以用以下單體作為具有親水性基團(tuán)的、特別有用的單體的示例性實例。例如，特別適合使用的是丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯、單甲基丙烯酸甘油酯以及類似的具有羥基的單體。此外，還適合使用的是丙烯酸、甲基丙烯酸以及類似的具有羧基的單體，或其堿金屬鹽和胺鹽。
關(guān)于另一種把親水性基團(tuán)引入到由不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料構(gòu)成的多孔膜中的方法，可以用具有親水性基團(tuán)的材料進(jìn)行涂敷。對用于涂敷的材料沒有特別限定，只要其具有參與核酸吸附的親水性基團(tuán)即可。但是為了易于操作，所述材料優(yōu)選為有機(jī)材料的聚合物。聚合物的實例包括聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基丙烯酸羥乙酯以及它們的鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它們的鹽、聚氧乙烯、醋酸纖維素以及乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物，但優(yōu)選為具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物。
可供選用的另一種方式是可將醋酸纖維素或乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物涂敷到不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜上，然后對所涂敷的醋酸纖維素或乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物進(jìn)行皂化處理。在這種情況下，皂化率優(yōu)選為約至少5％到至多100％，皂化率更優(yōu)選為約至少10％到至多100％。
關(guān)于具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料的多孔膜，可舉例為含有二氧化硅化合物的多孔膜。關(guān)于含有二氧化硅化合物的多孔膜，可舉例為玻璃濾膜，也可舉例為日本專利No.3,058,3442所述的二氧化硅多孔薄膜。這種二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制備把能夠形成雙分子層的陽離子兩性物質(zhì)的展開液分散到基材上，通過除去液體膜中的溶劑，而在基材上制成兩性物質(zhì)的多層雙分子層薄膜，使多層雙分子層薄膜與含有二氧化硅化合物的溶液接觸，然后取出并移走所述的多層雙分子層薄膜。
關(guān)于向不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜引入親水性基團(tuán)的方法，存在著如下方法一種方法是把多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)鍵合；以及另一種方法是使用分子內(nèi)具有雙鍵的、含有親水性基團(tuán)的單體，并使用多孔膜作為起始點進(jìn)行聚合而形成接枝聚合物鏈。
在通過化學(xué)鍵合作用將多孔膜和接枝聚合物鏈連接起來時，可向無機(jī)材料中引入能夠與接枝聚合物鏈的末端官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)，并且使接枝聚合物鏈被化學(xué)鍵合到該官能團(tuán)上。此外，當(dāng)接枝聚合物鏈?zhǔn)鞘褂梅肿觾?nèi)具有雙鍵的、含有親水性基團(tuán)的單體并使用多孔膜作為起始點而聚合形成的時候，將在具有雙鍵的化合物進(jìn)行聚合時作為起始點的官能團(tuán)插入到無機(jī)材料中。
關(guān)于具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物以及分子內(nèi)具有雙鍵并含有親水性基團(tuán)的單體，使用在上述關(guān)于向不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜中引入親水性基團(tuán)的方法中所述的具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物以及分子內(nèi)具有雙鍵并含有親水性基團(tuán)的單體是合適的。
向不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜中引入親水性基團(tuán)的另一種方法是在其上涂敷具有親水性基團(tuán)的材料。涂敷所用的材料不受限制，只要其具有參與核酸吸附的羥基即可；但為了易于操作，優(yōu)選為有機(jī)材料的聚合物。聚合物的實例包括聚丙烯酸羥乙酯和聚甲基丙烯酸羥乙酯以及它們的鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及其鹽、聚氧乙烯、醋酸纖維素以及乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物。
對于不含親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜，將醋酸纖維素或乙酰值互不相同的醋酸纖維素混合物涂敷于其上，然后可以將經(jīng)涂敷的醋酸纖維素和乙酰值互不相同的醋酸纖維素混合物皂化。在這種情況下，表面皂化度優(yōu)選為至少5％到至多100％。表面皂化度更優(yōu)選為至少10％到至多100％。
不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜的實例包括由鋁和類似的金屬、玻璃、水泥、陶和類似的陶瓷制成的多孔膜，或者由新型陶瓷、硅和活性炭等逐步加工(stepping)而制成的多孔膜。
溶液可從其內(nèi)部通過、并且其厚度為10μm到500μm的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜的厚度為50μm到250μm。為了容易洗滌，核酸吸附性多孔膜的厚度優(yōu)選為較薄。
最小孔徑為0.22μm或更大的、溶液可從其內(nèi)部通過的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜的最小孔徑為0.5μm或更大。此外，優(yōu)選使用最大孔徑與最小孔徑之比為2或更大的多孔膜。結(jié)果，可得到足夠的用于吸附核酸的表面積，并且孔不容易被堵。最大孔徑與最小孔徑之比更優(yōu)選為5或更大。
孔隙率為50％到95％的、溶液可從其內(nèi)部通過的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的；孔隙率更優(yōu)選為65％到80％。此外，泡點為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的；泡點更優(yōu)選為0.2kgf/cm2到4kgf/cm2。
壓力損失為0.1kPa到100kPa的、溶液可從其內(nèi)部通過的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。結(jié)果，核酸吸附性多孔膜在加壓狀態(tài)下，可獲得均勻的壓力。壓力損失更優(yōu)選為0.5kPa到50kPa。在本文中，術(shù)語“壓力損失”是指水每通過100μm的膜厚所需的最小壓力。
溶液可從其內(nèi)部通過的并且水的滲濾量(水在1kg/cm2的壓力、25℃下通過時的滲濾量)為每1分鐘每1cm2的膜1mL到5000mL的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。水的滲濾量(水在1kg/cm2的壓力、25℃下通過時的滲濾量)更優(yōu)選為每1分鐘每1cm2的膜5mL到1000mL。
溶液可從其內(nèi)部通過的并且核酸吸附量為每1mg的多孔膜0.1μg或更多的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的。核酸吸附量更優(yōu)選為每1mg的多孔膜0.9μg或更多。
其所含的纖維素衍生物具有下述特征的、可使溶液從其內(nèi)部通過的核酸吸附性多孔膜是優(yōu)選的，所述纖維素衍生物的特征為在將邊長為5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中時，該纖維素衍生物在1小時以內(nèi)(不含1小時)不溶解，但是在48小時以內(nèi)(不含48小時)溶解。此外，具有下述特征的纖維素衍生物是優(yōu)選的，所述特征為在將邊長為5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中時，該纖維素衍生物在1小時以內(nèi)(不含1小時)溶解，但是在將所述膜浸在5mL二氯甲烷中時，該纖維素衍生物在24小時以內(nèi)(不含24小時)不溶解。其中更優(yōu)選的是這樣的纖維素衍生物在將邊長為5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中時，該纖維素衍生物在1小時以內(nèi)(不含1小時)溶解，但是在將所述膜浸在5mL二氯甲烷中時，該纖維素衍生物在24小時以內(nèi)(不含24小時)不溶解。
在核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜時，優(yōu)選的是，使核酸混合物溶液從多孔膜的一側(cè)流到另一側(cè)，從而使溶液與多孔膜均勻接觸。在核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜時，為了使孔不容易被堵，優(yōu)選的是，使核酸混合物溶液以從較大孔徑向較小孔徑的方式穿過核酸吸附性多孔膜。
當(dāng)核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜時，流速優(yōu)選為每單位膜面積(cm2)2μL/秒到1500μL/秒，從而使溶液與多孔膜達(dá)到合適的接觸時間。如果溶液與多孔膜的接觸時間太短，則不能得到充分的分離和純化的效果；而如果時間太長，則從可操作性來說不是優(yōu)選的。流速優(yōu)選為每單位膜面積(cm2)5μL/秒到700μL/秒。
此外，溶液可從其內(nèi)部通過的核酸吸附性多孔膜可以以一層的方式被使用，但也可以以多層的方式使用。核酸吸附性多孔膜的多層可以彼此相同或互不相同。
多層核酸吸附性多孔膜可以包含無機(jī)材料核酸吸附性多孔膜和有機(jī)材料核酸吸附性多孔膜的組合。例如，其可以是玻璃濾膜和再生纖維素多孔膜的組合。此外，多層核酸吸附性多孔膜可以包含無機(jī)材料核酸吸附性多孔膜和有機(jī)材料核酸吸附性多孔膜的組合，例如，其可以是玻璃濾膜和尼龍(或聚砜)多孔膜的組合。
可優(yōu)選使用這樣的核酸分離純化柱該核酸分離純化柱包含具有至少兩個開口的容器，并且核酸分離純化柱在該容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可穿過該多孔膜。此外，可優(yōu)選使用這樣的核酸分離純化柱該核酸分離純化柱包含具有至少兩個開口的容器，并且核酸分離純化柱在該容器內(nèi)容納有多層核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可穿過該多孔膜。在這種情況下，具有至少兩個開口的、并容納有多層核酸吸附性多孔膜的容器可彼此相同或互不相同。
除了包含具有至少兩個開口的容器以外，核酸分離純化柱應(yīng)該不包含其它組件，其中，核酸分離純化柱在所述容器內(nèi)容納有核酸吸附性多孔膜，如上所述，溶液可以穿過該膜?？墒褂玫娜萜鞑牧系膶嵗ㄋ芰?，例如，聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯。此外，優(yōu)選使用可生物降解的材料。此外，容器可以是透明的或有顏色的。
可使用這樣的核酸分離純化柱，該柱具有用于區(qū)分各個核酸分離純化柱的裝置。用于區(qū)分各個核酸分離純化柱的裝置可包括條形碼、二維條形碼、磁帶和IC卡。
此外，可使用具有這種結(jié)構(gòu)的核酸分離純化柱，所述結(jié)構(gòu)使得可以很容易地從所述具有至少兩個開口的容器中取出核酸吸附性多孔膜。
在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，使用洗滌液對該膜進(jìn)行洗滌的步驟(1-b)和(2-b)以下描述步驟(1-b)和(2-b)在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期間，使用洗滌液對該膜進(jìn)行洗滌。
以下首先描述本發(fā)明的第一種方法中的洗滌步驟(1-b)。通過洗滌步驟，使最終獲得的RNA的回收率和純度提高，并且使含有所需RNA的試驗樣品的用量達(dá)到最少。此外，通過自動進(jìn)行洗滌步驟和回收步驟，可以簡單快速地實施所述步驟。為了加快速度，可以通過洗滌一次來完成洗滌步驟。如果純度更為重要，則優(yōu)選進(jìn)行多次洗滌。
在洗滌步驟中，使用試管、移液管、自動注入裝置或具有類似功能的供料裝置，將洗滌液提供給容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱。將洗滌液從核酸分離純化柱的第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)供入，并且使用與所述第一個開口連接的壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵和電動移液管等)。由此使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜，并從不同于所述第一個開口的另一個開口排出洗滌液。此外，洗滌液可由第一個開口供入并由該第一開口排出。此外，洗滌液可由不同于所述第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)的另一個開口供入，并由該同一開口排出。在這些方式中，非常優(yōu)選的方式如下洗滌液由核酸分離純化柱的第一個開口供入、穿過核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一個開口的另一個開口排出，這是因為該方式具有優(yōu)異的洗滌效率。
在洗滌操作中，洗滌液的量優(yōu)選為2μL/mm2或更多。當(dāng)使用大量的洗滌液時，可改善洗滌效果，但為了保持可操作性并防止樣品被排出，其用量優(yōu)選為200μL/mm2或更少。
在洗滌過程中，在使洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜時，流速優(yōu)選為每單位膜面積(cm2)2μL/秒到1500μL/秒，更優(yōu)選為每單位膜面積(cm2)5μL/秒到700μL/秒。通常，降低流速以延長時間，從而使洗滌進(jìn)行得更充分。但是，優(yōu)選的是，通過使用本發(fā)明的上述范圍，可以使分離和純化RNA的步驟快速地實施，而不會降低洗滌效率。
在洗滌步驟中，洗滌液的溫度優(yōu)選為4℃到70℃。此外，更優(yōu)選的是，洗滌液溫度為室溫。在進(jìn)行洗滌步驟的同時可對核酸分離純化柱通過超聲波或機(jī)械振動進(jìn)行攪動。另一方面，可通過實施離心操作來進(jìn)行洗滌。
在洗滌步驟中，洗滌液優(yōu)選為這樣的溶液其含有水溶性有機(jī)溶液和水溶性鹽中的至少一種。洗滌液必須具有的能力是能夠洗出核酸混合物溶液中的雜質(zhì)，該雜質(zhì)是與核酸一起被吸附到核酸吸附性多孔膜上的。在這一方面，洗滌液必須具有這樣的成分該成分僅使雜質(zhì)從核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不會使核酸解吸附。為達(dá)到所述目的，由于核酸極難溶于水溶性有機(jī)溶劑(例如醇類)，因此水溶性有機(jī)溶劑適合于保留核酸而使其它物質(zhì)解吸附。此外，加入水溶性鹽可以增強(qiáng)核酸的吸附效果，因此可以使除去雜質(zhì)和不需要物質(zhì)的操作的選擇性得以提高。
關(guān)于洗滌液中所含的水溶性有機(jī)溶劑，可以使用醇類。醇類的實例包括甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇和丁醇。對于丙醇而言，異丙醇和正丙醇中的任何一種都是合適的；對于丁醇而言，直鏈或支鏈中的任何一種都是合適的?？梢允褂盟龃贾械膬煞N或多種。在這些醇中，乙醇是優(yōu)選的。
在洗滌液中，水溶性有機(jī)溶劑的量優(yōu)選為1重量％到100重量％，并且更優(yōu)選為5重量％到40重量％。在此范圍內(nèi)，DNA污染物不會增多，并且目的RNA不會從多孔膜上解吸附。因此，RNA可以以優(yōu)選的高純度和高收率的方式得到。
然而，對于水溶性鹽來說，鹵化物的鹽是優(yōu)選的，并且在鹵化物中，氯化物是優(yōu)選的。此外，具有單價或二價陽離子的水溶性鹽是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是堿金屬鹽和堿土金屬鹽。在這些金屬鹽中，鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽是優(yōu)選的，并且鈉鹽是最優(yōu)選的。
當(dāng)洗滌液中含有水溶性鹽時，水溶性鹽的濃度優(yōu)選為至少10mmol/L，其上限為不影響雜質(zhì)溶解性的程度，該濃度優(yōu)選為0.1mol/L到1mol/L，但該濃度不受此限定。特別是，氯化鈉的濃度優(yōu)選為20mmol/L或更高。
洗滌液的特征是其中不含離液物質(zhì)。所以，可減少離液物質(zhì)混入回收步驟(1-e)中的可能性。在離液物質(zhì)混入回收步驟(1-e)中的情況下，該物質(zhì)通常會抑制RT-PCR反應(yīng)或類似的酶反應(yīng)。因此，考慮到之后的酶反應(yīng)，理想的情況是洗滌液中不含離液物質(zhì)。此外，離液物質(zhì)具有腐蝕性和有害性，鑒于這些性質(zhì)，為了安全起見，不要求實驗人員使用離液物質(zhì)是特別有利的。
在本文中，離液物質(zhì)是指上文所述的脲、氯化胍、異硫氰酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀等。
其次，以下描述本發(fā)明的第二種方法中的洗滌步驟(2-b)。
根據(jù)本發(fā)明，洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜，由此將DNA洗脫出來，并且僅使RNA吸附在多孔膜上，因此允許試驗樣品(其中含有所需核酸)的用量較少。也就是說，當(dāng)洗滌液被滴加到多孔膜上時，可以將DNA分離出來。
本發(fā)明的洗滌液是含有水溶性有機(jī)溶劑的水溶液，水溶性有機(jī)溶劑的濃度為50重量％或更低，并且其濃度優(yōu)選為1重量％到50重量％。洗滌液必須具有的能力是能夠洗掉樣品溶液中的雜質(zhì)，該雜質(zhì)是與核酸一起被吸附在核酸吸附性多孔膜上的。在這一方面，洗滌液必須具有這樣的成分該成分僅使雜質(zhì)從核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不會使核酸解吸附。
在洗滌液中水溶性有機(jī)溶劑的比例過高的情況下，洗滌步驟不能洗脫出DNA。因此，在回收液回收的RNA溶液中，DNA污染物增加。此外，在洗滌步驟中水溶性有機(jī)溶劑太少的情況下，不僅會使DNA從多孔膜上解吸附，還會使RNA從多孔膜上解吸附，這將使回收液中的RNA含量降低。在這一方面，洗滌液中水溶性有機(jī)溶劑的含量為50重量％或更低，并且優(yōu)選為5重量％到40重量％。
例如，洗滌液中含有的水溶性有機(jī)溶劑包括醇類，例如，甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇和丁醇。在這些醇中，優(yōu)選的是乙醇。
本發(fā)明的洗滌液還優(yōu)選含有水溶性鹽。關(guān)于水溶性鹽，諸如鹵化物的鹽是優(yōu)選的。并且在這些鹵化物中，氯化物是優(yōu)選的。此外，含有一價陽離子或二價陽離子的水溶性鹽是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是堿金屬鹽和堿土金屬鹽。在這些金屬鹽中，鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽是優(yōu)選的，并且鈉鹽是最優(yōu)選的。
當(dāng)洗滌液中含有水溶性鹽時，水溶性鹽的濃度優(yōu)選為至少10mmol/L，其上限為不影響雜質(zhì)溶解性的程度，該濃度優(yōu)選為1mol/L或更少，并且更優(yōu)選為0.1mol/L，但該濃度不受此限定。更優(yōu)選的是，水溶性鹽為氯化鈉，氯化鈉的含量為20mmol/L或更高。
此外，洗滌液的特點是其中不含離液物質(zhì)。所以，可減少洗滌步驟后離液物質(zhì)被混入回收步驟(2-c)中的可能性。在離液物質(zhì)混入回收步驟(2-c)中的回收步驟中，該物質(zhì)有時會抑制PCR反應(yīng)或類似的酶反應(yīng)。因此，考慮到之后的酶反應(yīng)，理想的情況是洗滌液中不含離液物質(zhì)。此外，離液物質(zhì)具有腐蝕性和有害性，鑒于這些方面，為了操作的安全性，實驗人員在不必要時不使用離液物質(zhì)是特別有利的。由于洗滌液中不含離液物質(zhì)，所以可回收得到其純度與紫外光-可見光分光光度計(260nm/230nm)所測得的吸收度測量值大于1.5相對應(yīng)的RNA或核酸。此外，可回收得到紫外光-可見光分光光度計(260nm/230nm)吸收度測量值約為2.0的RNA或核酸。
在本文中，離液物質(zhì)是指上文所述的脲、氯化胍、異硫氰酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸鈉、碘化鈉和碘化鉀等。
在洗滌步驟中，使用試管、移液管、自動注入裝置或具有類似功能的供料裝置，將洗滌液提供給容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱。將洗滌液從核酸分離純化柱的第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)供入，并且使用與所述第一個開口連接的壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵和電動移液管等)。由此使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜，并從不同于所述第一個開口的另一個開口排出洗滌液。此外，洗滌液可由第一個開口供入并由該第一開口排出。此外，洗滌液可由不同于所述第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)的另一個開口供入，并由該同一開口排出。在這些方式中，非常優(yōu)選的方式如下洗滌液由核酸分離純化柱的第一個開口供入、穿過核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一個開口的另一個開口排出，這是因為該方式具有優(yōu)異的洗滌效率。
在洗滌步驟中，洗滌液的量優(yōu)選為2μL/mm2或更多。當(dāng)使用大量洗滌液時，可改善洗滌效果，但為了保持可操作性并防止樣品被排出，其用量優(yōu)選為200μL/mm2或更少。
在洗滌操作中，在使洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜時，流速優(yōu)選為每單位膜面積(cm2)2μL/秒到1500μL/秒，更優(yōu)選為5μL/秒到700μL/秒。當(dāng)洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜的流速被降低時，可進(jìn)行充分地洗滌。但是，加速核酸分離和純化的操作是重要的，因此選擇上述范圍。
在洗滌步驟中，洗滌液的溫度優(yōu)選為4℃到70℃。此外，更優(yōu)選的是洗滌液的溫度為室溫。此外，在洗滌步驟中，還可以在通過機(jī)械振動和超聲波或者通過離心操作來攪動核酸分離純化柱的條件下進(jìn)行洗滌。
由于洗滌液對柱或者類似的容器具有高度的潤濕性，所以在核酸分離純化過程中的洗滌步驟期間，洗滌液常常保留在容器中，結(jié)果洗滌步驟之后的回收步驟受到洗滌液污染，從而導(dǎo)致核酸純度降低并使隨后步驟中的反應(yīng)性降低。因此，在本發(fā)明的第一種方法和第二種方法中，當(dāng)使用柱或類似的容器進(jìn)行核酸的吸附和解吸附時，重要的是，在吸附或洗滌中使用的溶液、特別是洗滌液不能保留在柱內(nèi)，這樣它就不會對以下的步驟產(chǎn)生影響。
因此，為了防止洗滌步驟中使用的洗滌液對隨后步驟中使用的回收液造成污染，并由此保持柱內(nèi)的洗滌液殘留量為最小，洗滌液的表面張力小于0.035J/m2是理想的。當(dāng)表面張力小時，可改善洗滌液對柱的潤濕性能并且可控制殘留溶液的體積。
然而，為了提高洗滌效率，可增加水的比例，但在這種情況下，洗滌液的表面張力增大并且殘留溶液的量增多。當(dāng)洗滌液的表面張力為0.035J/m2或更大時，可通過增強(qiáng)柱的斥水性從而控制殘留溶液的量。通過增強(qiáng)柱的斥水性，而形成液滴，并且可通過液滴的向下流動來控制殘留溶液的量。用于增強(qiáng)斥水性的方法的實例包括在柱表面上涂敷防水劑(例如硅)；在柱成形時，混入防水劑(例如硅)；以及類似的方法，但不限于此。
此外，通過自動進(jìn)行洗滌和回收操作，可以更容易更快速地進(jìn)行操作。為了加速操作，可通過洗滌一次來完成洗滌步驟。但是如果純度更重要，則優(yōu)選為洗滌數(shù)次。
使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜，可以使本發(fā)明的第一種方法和第二種方法中的洗滌步驟簡化。(1)可使洗滌液穿過核酸吸附性多孔膜的次數(shù)減少到一次；(2)可在室溫下實施洗滌步驟；(3)在洗滌后，也可以立即將回收液注入到柱內(nèi)；(4)也可將上述(1)、(2)和(3)中的一個或兩個或多個組合起來。在相關(guān)方法中，為了快速地除去洗滌液中所含的有機(jī)溶劑，經(jīng)常需要干燥步驟。但是由于本發(fā)明中所使用的核酸吸附性多孔膜是薄膜，因此可以省略干燥步驟。
在RNA和核酸的分離和純化的相關(guān)方法中，存在以下的問題在實施洗滌步驟時，洗滌液經(jīng)常濺散并附著在其它部位上，從而造成樣品玷污(污染)。通過設(shè)計核酸分離純化柱的形狀和廢水容器的形狀，可以抑制洗滌步驟中的這類污染，其中，在所述柱內(nèi)，核酸吸附性多孔膜被容納在具有兩個開口的容器中。
對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟(1-c)以下描述對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟(1-c)(使脫氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上發(fā)生反應(yīng)的步驟)。為了從含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中選擇性地分離和純化RNA，使混合物溶液穿過容納有核酸吸附性多孔膜(核酸被吸附在其上(吸附步驟))的核酸分離純化柱，然后進(jìn)行洗滌(洗滌步驟1)，并進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟。
對脫氧核糖核酸酶沒有特別限定，并可使用任何脫氧核糖核酸酶。例如，可使用來自于動物(例如牛)的胰脫氧核糖核酸酶I、以及重組或合成的脫氧核糖核酸酶。
對于進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理情況中的脫氧核糖核酸酶溶液(以下也稱為脫氧核糖核酸酶反應(yīng)溶液)，可加入適合于使脫氧核糖核酸酶活化的二價陽離子，例如，Mg2+、Ca2+或Mn2+。為了使RNA或核酸保持吸附在核酸吸附性多孔膜上，一價陽離子(例如，Na+、Li+或K+)可與脫氧核糖核酸酶共存。此外，為了調(diào)節(jié)脫氧核糖核酸酶反應(yīng)的pH，優(yōu)選加入常規(guī)緩沖液。該緩沖液的實例包括Tris-HCl、HEPES(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、磷酸鹽、硼酸鹽和檸檬酸鹽。
在本發(fā)明的方法中，對核酸分離純化柱內(nèi)容納的核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟在以下條件下實施每1cm2的核酸吸附性多孔膜使用總量為130μL或更少的脫氧核糖核酸酶溶液。市售可得的(例如)RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司制造)需要80μL的脫氧核糖核酸酶溶液(每1cm2的核酸吸附性多孔膜使用208μL的脫氧核糖核酸酶溶液)。因此，本發(fā)明可以成本更加有效地進(jìn)行純化。此外，在對核酸分離純化柱內(nèi)容納的核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟中，脫氧核糖核酸酶的濃度優(yōu)選為至少10Kunitz U/mL到至多10000Kunitz U/mL，并且更優(yōu)選為至少50Kunitz U/mL到至多5000Kunitz U/mL。此外，此處使用的表示活性的計量單位Kunitz U被定義為“1Kunitz U是指在25℃、pH5.0并使用DNA作為底物的條件下，使1mL反應(yīng)溶液每一分鐘的吸收度測量值A(chǔ)260增加0.001這樣的脫氧核糖核酸酶活性”。此外，在對核酸分離純化柱中的核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟中，處理時間優(yōu)選為5秒到360分鐘，但這取決于含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中的DNA的量以及處理用脫氧核糖核酸酶的濃度；處理時間更優(yōu)選為30秒到180分鐘。此外，在對核酸分離純化柱中的核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的步驟中，適合的溫度為4℃或更高，并且優(yōu)選的溫度為10℃到50℃，為了提高反應(yīng)效率，較高的溫度(例如，50℃到70℃)也是可以的。此外，表達(dá)方式“使脫氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上發(fā)生作用”是指脫氧核糖核酸酶與核酸吸附性多孔膜上吸附有核酸的部分發(fā)生反應(yīng)，表達(dá)方式“在核酸吸附性多孔膜上”不限于僅指在核酸吸附性多孔膜的上面，而且還包括多孔膜的孔內(nèi)，或者膜背面上的出口處或類似的地方。
使用洗滌液對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行洗滌的步驟(1-d)(洗滌步驟2)在實施步驟(1-c)之后，使用洗滌液來進(jìn)行洗滌核酸吸附性多孔膜的步驟(1-d)。根據(jù)步驟(1-b)實施步驟(1-d)?？梢詫⒉襟E(1-d)實施一次或多次。
使用回收液使RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附，并將RNA排出核酸分離純化柱的容器的步驟(1-e)(回收步驟)以下描述通過使RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附來回收RNA的過程(1-e)。
在回收過程中，使用試管、移液管、自動注入裝置或具有類似功能的供料裝置將回收液供給容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱。將回收液由核酸分離純化柱的第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)供入，并且使用與所述第一個開口連接的壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵和電動移液管等)。由此使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使回收液穿過核酸吸附性多孔膜，并從不同于所述第一個開口的另一個開口排出回收液。此外，回收液可由第一個開口供入并由該第一個開口排出。此外，回收液可由不同于所述第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)的另一個開口供入，并由該同一開口排出。在這些方式中，非常優(yōu)選的方式如下回收液由核酸分離純化柱的第一個開口供入、穿過核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一個開口的另一個開口排出，這是因為該方式具有優(yōu)異的回收效率。
考慮到由試驗樣品制備的核酸混合物溶液的體積，可通過控制回收液的體積來進(jìn)行RNA的解吸附。含有經(jīng)分離和純化的核酸的回收液的用量與所使用的試驗樣品的量有關(guān)。概括而言，回收液通常的用量為幾十微升到幾百微升，但是由于試驗樣品的用量極少，或者另一方面，需要分離和純化大量的RNA，所以回收液的量可在1微升到幾十毫升之間變化。
關(guān)于回收液，可優(yōu)選使用經(jīng)純化的蒸餾水、Tris/EDTA緩沖液以及類似的溶液。此外，當(dāng)將回收的核酸進(jìn)行RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))時，可使用用于RT-PCR的緩沖液(例如，含有最終濃度為75mmol/L的KCl、50mmol/L的Tris-HCl、3.0mmol/L的MgCl2以及10mmol/L的DDT的水溶液)。
回收液的pH優(yōu)選為pH1到pH10，更優(yōu)選為pH2到pH7。特別是離子強(qiáng)度和鹽濃度會對被吸附RNA的洗脫產(chǎn)生影響?；厥找旱碾x子強(qiáng)度優(yōu)選為500mmol/L。鹽濃度優(yōu)選為0.5mol/L或更低，鹽濃度更優(yōu)選為0.01mmol/L到50mmol/L。由此使RNA的收率提高，并且可回收大量的RNA。
參照含有核酸的初始樣品溶液的體積來減小回收液的體積，可以得到含有濃縮核酸的回收液。優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶100到99∶100，并且更優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶10到9∶10。由此，可以方便地濃縮RNA，而無需在核酸分離純化之后的步驟中實施濃縮操作。通過這些方法，可提供一種用于得到RNA溶液的方法，該溶液中的RNA濃度比試驗樣品中的高。
此外，在另一方面，通過在回收液的體積大于含有核酸的初始樣品溶液的體積的條件下使RNA解吸附，可得到含有所需濃度的RNA的回收液，并且可得到RNA的濃度適合于下步操作(例如，RT-PCR或類似的操作)的回收液。優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶1到50∶1，并且更優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶1到5∶1。由此可得到這樣的優(yōu)點，即避免在核酸分離純化之后進(jìn)行繁瑣的濃度調(diào)整操作。此外，通過使用足量的回收液，可以使從多孔膜回收的RNA的回收率提高。
并且，通過隨著目的不同而改變回收液的溫度，可以方便地回收RNA。例如，可以通過將回收液的溫度改變?yōu)?℃到10℃之后，使RNA從多孔膜上解吸附，由此通過抑制核糖核酸酶的活性，來阻止RNA降解，而不是加入能夠抑制酶的降解作用的某種試劑或采取能夠抑制酶的降解作用的特殊操作，因此可以方便有效地得到RNA溶液。
此外，在回收液的溫度被設(shè)定為10℃到35℃時，可在通常的室溫條件下進(jìn)行RNA的回收，并通過使其解吸附來分離和純化RNA，而無需復(fù)雜的步驟。
此外，在另一方面，通過將回收液的溫度升高到較高溫度(例如，35℃到70℃)，可方便地使RNA從多孔膜上解吸附，并具有高回收率，而無需借助于復(fù)雜的操作。
對回收液注入的次數(shù)沒有限定，注入次數(shù)可以是一次或兩次或多次。通常，在方便快捷地分離和純化RNA時，可通過注入一次的回收方式來進(jìn)行此操作，但是在回收大量RNA時，在某些情況下，回收液可被注入兩次或多次。
在回收步驟中，可將RNA回收液配制成在后續(xù)步驟中可以使用的組合物。經(jīng)分離和純化的RNA有時被應(yīng)用于RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法中。在此情況下，經(jīng)分離和純化的RNA溶液必須使用適合于RT-PCR方法的緩沖液來進(jìn)行稀釋。通過在這種方法的回收步驟中使用適合于RT-PCR方法的緩沖液，可方便快捷地轉(zhuǎn)入隨后的RT-PCR步驟。
并且，在回收步驟中，可加入用于阻止RNA(被回收在RNA回收液中)降解的穩(wěn)定劑。作為穩(wěn)定劑，可加入抗菌劑、殺真菌劑、核酸降解抑制劑以及類似的試劑。作為核酸酶抑制劑，可舉例為EDTA及類似的試劑。此外，作為另一個實施方案，可預(yù)先向回收容器中加入穩(wěn)定劑。
并且，對回收步驟中所使用的回收容器沒有特別限定，可使用由在260nm處沒有吸收的原料制成的回收容器。在此情況下，無需把回收的RNA溶液轉(zhuǎn)移到其它容器就可測量該溶液的濃度。關(guān)于在260nm處沒有吸收的原料，例如，可使用石英玻璃和類似的原料，但該原料不限于此。
在上述方法中使用的用于選擇性地分離和純化RNA的核酸分離純化柱以及步驟(1-a)到(1-e)中的每一步所使用的試劑可作為成套用具使用。
如上文所公開，對于通過使用在具有至少兩個開口的容器中容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱、以及壓力差產(chǎn)生裝置，從含有核酸的試驗樣品中分離和純化RNA的方法，其中可使用自動裝置來實施該方法。所述自動裝置可自動進(jìn)行該方法所包括的步驟。此外，可以使用可自動使用上述成套用具的自動裝置來實施所述方法。結(jié)果，不僅可使操作簡化并加速，而且不管操作者的技能如何，都可以得到特定水平的RNA。
自動裝置的實例如下該裝置通過使用核酸吸附性多孔膜被裝在容器(該容器具有至少兩個開口)中的核酸分離純化柱以及壓力差產(chǎn)生裝置從含有核酸的試驗樣品中自動進(jìn)行分離和純化RNA的步驟。但本發(fā)明的自動裝置不限于此。
如下一種用于選擇性地分離和純化RNA、并自動實施分離和純化操作的自動裝置是優(yōu)選的，該操作包括以下步驟使用容納有核酸吸附性多孔膜(溶液可從其內(nèi)部通過)的核酸分離純化柱；將含有DNA和RNA的核酸混合物溶液注入核酸分離純化柱中，從而通過加壓將核酸混合物溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；然后，向核酸分離純化柱內(nèi)注入洗滌液，從而通過加壓除去雜質(zhì)；向核酸分離純化柱內(nèi)注入脫氧核糖核酸酶，從而對核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理，并且通過加壓使脫氧核糖核酸酶穿過核酸吸附性多孔膜的內(nèi)部；然后，向核酸分離純化柱內(nèi)注入洗滌液，從而通過加壓除去DNA的降解產(chǎn)物；然后，向核酸分離純化柱內(nèi)注入回收液，從而使被吸附的RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且將解吸附的RNA與回收液一起回收；其中該自動裝置包括支承機(jī)構(gòu)，用于支撐核酸分離純化柱；廢液容器，用于容納核酸混合物溶液殘余物和脫氧核糖核酸酶洗脫液以及洗滌液；以及回收容器，用于容納含有回收RNA的回收液；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于將壓縮空氣引入核酸分離純化柱；以及注入機(jī)構(gòu)，用于向核酸分離純化柱內(nèi)注入洗滌液、脫氧核糖核酸酶和回收液。
所述支承機(jī)構(gòu)優(yōu)選包括被安裝在主體裝置上的立架；承載于立架上并可上下移動的柱支架，該柱支架支承著核酸分離純化柱；以及用于支承廢液容器和回收容器的容器支架，該廢液容器和回收容器在柱支架的下方相對于核酸分離純化柱可互換位置。
所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)優(yōu)選包括從下緣部噴射壓縮空氣的氣嘴；壓頭，用于承載氣嘴、并用于使氣嘴可以相對于由柱支架支承的核酸分離純化柱而上下移動；以及位于壓頭中的定位裝置，該定位裝置對位于支承機(jī)構(gòu)的臺架中的核酸分離純化柱進(jìn)行定位。
此外，所述的注入機(jī)構(gòu)優(yōu)選包括注入洗滌液的洗滌液注入嘴；注入脫氧核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶注入嘴；注入回收液的回收液注入嘴；注入嘴移動板，該移動板能夠在由支承機(jī)構(gòu)支承的核酸分離純化柱上依次移動并支承洗滌液注入嘴、脫氧核糖核酸酶注入嘴和回收液注入嘴；洗滌液供給泵，用于從容納有洗滌液的洗滌液瓶子中抽吸洗滌液并把洗滌液供給洗滌液注入嘴；脫氧核糖核酸酶供給泵，用于從容納有脫氧核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶瓶子中抽吸脫氧核糖核酸酶并把脫氧核糖核酸酶供給脫氧核糖核酸酶注入嘴；以及回收液供給泵，用于從容納有回收液的回收液瓶子中抽吸回收液并把回收液供給回收液注入嘴。
本發(fā)明的自動裝置(例如上述自動裝置)可以具有緊湊的結(jié)構(gòu)，該自動裝置包括核酸分離純化柱；支承機(jī)構(gòu)，用于支承廢液容器和回收容器；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于把壓縮空氣引入核酸分離純化柱中；以及注入機(jī)構(gòu)，其分別把洗滌液、脫氧核糖核酸酶和回收液注入核酸分離純化柱中；自動進(jìn)行以下分離和純化RNA的步驟的機(jī)構(gòu)，所述步驟為向容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱內(nèi)注入含有核酸的核酸混合物溶液，從而通過加壓將核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；注入洗滌液，從而除去雜質(zhì)；向核酸分離純化柱內(nèi)注入脫氧核糖核酸酶，從而使脫氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上發(fā)生作用，并通過加壓使脫氧核糖核酸酶穿過核酸吸附性多孔膜的內(nèi)部；注入洗滌液，從而通過加壓除去DNA的降解產(chǎn)物；注入回收液，從而使被吸附的RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附，并回收解吸附的RNA，該機(jī)構(gòu)可以在短時間內(nèi)、高效自動地從含有核酸的混合物溶液中分離和純化RNA。
此外，當(dāng)支承機(jī)構(gòu)包括立架、柱支架(該柱支架可上下移動，并支承核酸分離純化柱)以及容器支架(該容器支架支承廢液容器和回收容器，并可使所述容器交換位置)時，就可固定核酸分離純化柱和上述這兩個容器，并可使廢液容器和回收容器容易地互換。
此外，當(dāng)壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)包括氣嘴、用于上下移動氣嘴的壓頭以及用于確定核酸分離純化柱的位置的定位裝置時，通過簡單的機(jī)構(gòu)就可穩(wěn)妥地供給壓縮空氣。
此外，當(dāng)注入機(jī)構(gòu)包括洗滌液注入嘴、脫氧核糖核酸酶注入嘴、回收液注入嘴、能夠在核酸分離純化柱上依次移動的注入嘴移動板、通過從洗滌液瓶子中抽吸洗滌液從而把洗滌液供給洗滌液注入嘴的洗滌液供給泵以及通過從回收液瓶子中抽吸回收液從而把回收液供給回收液注入嘴的回收液供給泵時，就可以通過簡單的機(jī)構(gòu)依次注入洗滌液和回收液。
使用回收液使RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附，以及回收RNA的步驟(2-c)通過使RNA從核酸吸附性多孔膜上解吸附來回收RNA的步驟(2-c)如下所示。
在回收步驟中，使用試管、移液管、自動注入裝置或具有相似功能的供料裝置，可將回收液供入容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱中。將回收液由核酸分離純化柱的第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)供入，并且使用與所述第一個開口連接的壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵和電動移液管等)，由此，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使回收液穿過核酸吸附性多孔膜，并從不同于所述第一個開口的另一個開口排出回收液。此外，回收液可由第一個開口供入并由該第一個開口排出。此外，回收液可由不同于所述第一個開口(含有核酸的核酸混合物溶液已通過該開口注入)的另一個開口供入，并由該同一開口排出。在這些方式中，非常優(yōu)選的方式如下回收液由核酸分離純化柱的第一個開口供入、穿過核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一個開口的另一個開口排出，這是因為該方式具有優(yōu)異的回收效率。
考慮到由試驗樣品制備的含有核酸的樣品溶液的體積，可通過控制回收液的體積來使核酸解吸附。含有經(jīng)分離和純化的核酸的回收液的用量與被回收的試驗樣品的用量有關(guān)。一般情況下，回收液通常的用量為幾十微升到幾百微升，但是由于試驗樣品的用量極少，或者另一方面，需要分離和純化大量的核酸，所以回收液的量可在1微升到幾十毫升之間變化。
關(guān)于回收液，可優(yōu)選使用經(jīng)純化的蒸餾水、Tris/EDTA緩沖液以及類似的溶液。此外，在使回收的核酸進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))時，可使用用于PCR的緩沖液(例如，含有最終濃度為50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl以及1.5mmol/L的MgCl2的水溶液)。
回收液的pH優(yōu)選為pH2到pH11，更優(yōu)選為pH5到pH9。此外，回收液的離子強(qiáng)度優(yōu)選為500mmol/L或更低。更優(yōu)選的是，鹽濃度為50mmol/L到0.1mmol/L。特別是離子強(qiáng)度和鹽濃度會對吸附核酸的洗脫產(chǎn)生影響。優(yōu)選的是，回收液的離子強(qiáng)度為290mmol/L或更低，并且鹽濃度為90mmol/L或更低。由此使核酸的回收百分率提高，并且由此可回收大量的核酸。
通過參照含有核酸的初始樣品溶液的體積來減小回收液的體，可得到含有濃縮核酸的回收液。優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶100到99∶100，并且更優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶10到9∶10。由此，可以方便地濃縮核酸，而無需在核酸分離純化之后的步驟中實施濃縮操作。通過這些方法，可提供一種用于得到核酸溶液的方法，該溶液中的核酸濃度比試驗樣品中的高。
此外，在另一方面，通過在回收液的體積大于含有核酸的初始樣品溶液的體積的條件下使核酸解吸附，可得到具有所需濃度的核酸回收液，并且可得到核酸濃度適合于下步操作(例如，PCR或類似的操作)的回收液。優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶1到50∶1，并且更優(yōu)選的是，(回收液的體積)∶(樣品溶液的體積)＝1∶1到5∶1。由此可得到這樣的優(yōu)點，即避免在核酸分離純化之后進(jìn)行繁瑣的濃度調(diào)整操作。此外，通過使用足量的回收液，可以提高從多孔膜回收的核酸的回收率。
此外，通過隨著目的不同而改變回收液的溫度，可以方便地回收核酸。例如，通過將回收液的溫度改變?yōu)?℃到10℃之后，使核酸從多孔膜上解吸附，由此通過抑制核酸酶的活性，來阻止核酸降解，而不是通過加入能夠抑制酶的降解作用的某種試劑或采取能夠抑制酶的降解作用的特殊操作，因此可方便有效地得到核酸溶液。
此外，在回收液的溫度被設(shè)定為10℃到35℃時，可在通常的室溫條件下進(jìn)行核酸的回收，并通過使核酸解吸附來進(jìn)行分離和純化，而無需復(fù)雜的步驟。
此外，作為另一種方法，通過將回收液的溫度升高到較高溫度(例如，35℃到70℃)，可方便地使核酸從多孔膜上解吸附，并具有高回收率，而無需借助于復(fù)雜的操作。
對回收液注入的次數(shù)沒有限定，并且可以注入一次或兩次或多次。通常，在方便快捷地分離和純化核酸時，可通過單一一次的回收來進(jìn)行此操作，但是在回收大量核酸時，在某些情況下，回收液被注入兩次或多次。
在回收步驟中，可將核酸回收液配制成在后續(xù)步驟中可以使用的組合物。經(jīng)分離和純化的核酸通常使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法擴(kuò)增。在此情況下，經(jīng)分離和純化的核酸溶液必須使用適合于PCR方法的緩沖液來進(jìn)行稀釋。通過在這種方法的回收步驟中使用適合于PCR方法的緩沖液，可以方便快捷地轉(zhuǎn)入隨后的PCR步驟中。
并且，在回收步驟中，可加入用于阻止核酸(被回收在核酸回收液中)降解的穩(wěn)定劑。作為穩(wěn)定劑，可加入抗菌劑、殺真菌劑、核酸酶抑制劑以及類似的試劑。作為核酸酶抑制劑，可舉例出EDTA及類似的試劑。此外，作為另一個實施方案，可預(yù)先向回收容器中加入穩(wěn)定劑。
此外，對回收步驟中所使用的回收容器沒有特別限定，可使用由在260nm處沒有吸收的原料制成的回收容器。在此情況下，無需把溶液轉(zhuǎn)移到其它容器就可測量回收的核酸溶液的濃度。作為在260nm處沒有吸收的原料，例如，可使用石英玻璃和類似的原料，但該原料不限此。
如上文所公開，對于通過使用其中核酸吸附性多孔膜被裝在容器(該容器具有至少兩個開口)中的核酸分離純化柱、以及壓力差產(chǎn)生裝置，來從含有核酸的試驗樣品中分離和純化核酸的方法，其中可使用自動裝置來實施該方法。所述自動裝置可自動進(jìn)行該方法所包括的步驟。結(jié)果，不僅可使操作簡化并加速，而且不管操作者的技能如何，都可以得到特定水平的核酸。
自動裝置的實例如下該裝置通過使用其中核酸吸附性多孔膜被裝在容器(該容器具有至少兩個開口)中的核酸分離純化柱、以及壓力差產(chǎn)生裝置，而從含有核酸的試驗樣品中自動進(jìn)行分離和純化核酸的步驟。但本發(fā)明的自動裝置不限于此。
用于選擇性地分離和純化核酸、并自動實施分離和純化操作的自動裝置，其操作包括以下步驟使用容納有核酸吸附性多孔膜(溶液可從其內(nèi)部通過)的核酸分離純化柱；將含有核酸的核酸混合物溶液注入核酸分離純化柱中，從而通過加壓使核酸混合物溶液中的核酸被吸附到核酸吸附性多孔膜上；然后，向核酸分離純化柱內(nèi)注入洗滌液，從而通過加壓除去雜質(zhì)；向核酸分離純化柱內(nèi)注入回收液，從而使被吸附的核酸從核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且將解吸附的核酸與回收液一起回收；該自動裝置的特征在于其包括支承機(jī)構(gòu)，用于支撐核酸分離純化柱；廢液容器，用于容納樣品溶液的洗脫液和洗滌液；以及回收容器，用于容納含有回收核酸的回收液；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，用于將壓縮空氣引入核酸分離純化柱；以及注入機(jī)構(gòu)，用于向核酸分離純化柱內(nèi)注入洗滌液和回收液。
實施例通過以下實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。
實施例1(1-1)核酸分離純化柱的制備制備核酸分離純化柱，該柱具有容納核酸吸附性多孔膜的部分(內(nèi)徑為7mm)。
(1-2)關(guān)于核酸吸附性多孔膜，使用經(jīng)皂化的三醋酸纖維素多孔膜，并且將核酸吸附性多孔膜裝在如上述(1-1)中制備的核酸分離純化柱的核酸吸附性多孔膜的容納部分中。
實施例1-1(1-3)核酸溶解試劑、洗滌液和回收液的制備根據(jù)以下所示的配方，制備核酸溶解試劑A-1、洗滌液A-1和回收液A-1。
(核酸溶解試劑A-1)鹽酸胍(由Life Technologies公司生產(chǎn))382gTris(由Life Technologies公司生產(chǎn)) 12.1g
TritonX-100(由ICN生物化學(xué)公司生產(chǎn))10g蒸餾水定容到1000ml在使用核酸溶解試劑A-1之前，即刻加入1.0體積％的2-巰基乙醇。
(洗滌液A-1)10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5) 30體積％的乙醇(回收液A-1)1mmol/L Tris-HCl(pH 6.5)(1-4)核酸混合物溶液的制備在3 7℃下、在5％CO2的存在下對人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL60)培養(yǎng)液(RPMI1640-10％胎牛血清)進(jìn)行溫育。將細(xì)胞制成含有1×106個細(xì)胞時，用不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液洗滌。將制備的300g細(xì)胞在4℃下使用水平轉(zhuǎn)子(swing rotor)離心5分鐘，使飄浮細(xì)胞沉淀，并除去上清液。通過輕叩而使細(xì)胞懸浮，向其中加入350μL的核酸溶解試劑A-1，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。然后，向其中加入350μL的70體積％的乙醇，并使用渦流混合器攪拌5秒種，由此得到實施例1-1使用的核酸混合物溶液。
(1-5)分離和純化RNA的操作將由上述(1-4)得到的核酸混合物溶液注入容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱(由(1-1)和(1-2)制備)的第一個開口中，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(260kPa)，通過使所注入的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而使注入的核酸混合物溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，并由另一個開口排出所述溶液。在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入500μL的洗滌液A-1，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(260kPa)，從而使注入的洗滌液A-1穿過核酸吸附性多孔膜，并由另一個開口排出所述溶液(洗滌步驟1)。在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，將10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液(使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNase-Free DNaseSet341Kunitz U/mL，并根據(jù)其附帶的使用說明制成脫氧核糖核酸酶溶液)施加到多孔膜上，并讓酶作用15分鐘。以相同的方式重復(fù)2次洗滌操作(洗滌步驟2)。此外，在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入100μL的回收液A-1，并將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(260kPa)，從而使注入的回收液A-1穿過核酸吸附性多孔膜，并由另一個開口排出所述溶液，由此回收洗脫液。
此外，以相同的方式實施分離和純化RNA的操作，但是將脫氧核糖核酸酶溶液的量由10μL改變?yōu)?0μL和40μL。此外，作為參考例，以相同的方式實施分離和純化RNA的操作，但是將脫氧核糖核酸酶溶液的量由10μL改變?yōu)?0μL。
對比例1-1除了不施加脫氧核糖核酸酶溶液以外，以與實施例1-1相同的操作方式來提取RNA。在這種情況下，關(guān)于洗滌步驟，僅將洗滌步驟1以相同的方式重復(fù)3次，這與實施例1-1中洗滌步驟1和2總共重復(fù)3次不同。
對比例1-2按照與使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNeasy Mini Kit的試劑盒所述同樣的程序，以與實施例1-1相同的操作方式從培養(yǎng)細(xì)胞(1×106個)中提取RNA。根據(jù)以下3種方案來采用脫氧核糖核酸酶溶液的用量，所述方案為80μL(208μL/cm2)、以及20μL(52μL/cm2)和10μL(26μL/cm2)。
對比例1-3
除了不施加脫氧核糖核酸酶溶液以外，以與對比例1-2相同的操作方式來提取RNA。此時，根據(jù)不進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理的RNeasy Mini Kit的方案來實施所述操作。
(1-6)回收核酸的瓊脂糖凝膠電泳圖1到圖3顯示了根據(jù)實施例1-1和對比例1-1、1-2和1-3，使用1％的瓊脂糖凝膠使含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳的結(jié)果。
在對比例1-2中，需要80μL(208μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液。但在實施例1-1中，即使脫氧核糖核酸酶溶液的用量比對比例1-2中的少，也可以使DNA降解。并且在實施例1-1中沒有檢測到對比例1-1中所檢測到的DNA衍生帶。令人驚奇的是，在使用僅為10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液的情況下，本發(fā)明也可以使DNA降解。
由上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中，即使脫氧核糖核酸酶溶液的用量很少，也可以通過使含有DNA和RNA的混合物溶液中的DNA降解來選擇性地回收RNA。
實施例1-2使用Hela細(xì)胞作為粘著型細(xì)胞，通過如下的在盤(on-dish)溶解法得到核酸混合物溶液。
在培養(yǎng)細(xì)胞用的平板上，在37℃下、在5％CO2的存在下，在培養(yǎng)液(MEM-10％胎牛血清)中溫育Hela細(xì)胞。在從培養(yǎng)細(xì)胞用的平板上除去培養(yǎng)液后，每1.5×106個Hela細(xì)胞加入350μL的核酸溶解試劑A-1，以得到細(xì)胞被溶解的溶液。通過移液操作攪動該溶液，并將該溶液回收到另一個容器中。
向所得的回收溶液中加入350μL的70體積％乙醇。并使用渦流混合器進(jìn)行攪拌，從而得到核酸混合物溶液。對得到的核酸混合物溶液實施分離和純化RNA的操作，該操作與實施例1-1中的(1-5)相同。此外，在分離和純化RNA的操作中，脫氧核糖核酸酶溶液的用量為10μL。
實施例1-3使用Hela細(xì)胞作為粘著型細(xì)胞，在按如下方式進(jìn)行胰蛋白酶消化后，得到核酸混合物溶液。
在溫育粘著型細(xì)胞用的容器上，在37℃下、在5％CO2的存在下，在培養(yǎng)液(MEM-10％胎牛血清)中溫育Hela細(xì)胞。在從容器中除去培養(yǎng)液后，加入0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行處理，從而使粘著型細(xì)胞呈片狀從細(xì)胞培養(yǎng)容器上剝落下來，并計數(shù)細(xì)胞數(shù)目。使用用于離心細(xì)胞的離心機(jī)，使混合物在1000轉(zhuǎn)下離心3分鐘，由此除去上清液以收集Hela細(xì)胞。離心后，向每5×105個細(xì)胞中加入350μL核酸溶解試劑A-1。使用渦流混合器強(qiáng)力攪拌該溶液達(dá)1分鐘，以便溶解細(xì)胞。向所述溶液中加入350μL的70體積％乙醇，并使用渦流混合器攪拌5秒鐘，以得到核酸混合物溶液。對得到的核酸混合物溶液實施分離和純化RNA的操作，該操作與實施例1-1中的(1-5)相同。此外，在分離和純化RNA的操作過程中所使用的脫氧核糖核酸酶溶液的量為10μL。
對比例1-4使用市售的RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生產(chǎn))試劑盒，根據(jù)與該試劑盒所述相同的操作程序，進(jìn)行從實施例1-2的核酸混合物溶液中分離和純化RNA的操作。此外，在分離和純化RNA的操作過程中，使用80μL的脫氧核糖核酸酶溶液。
對比例1-5使用實施例1-3中的核酸混合物溶液，以與對比例1-4相同的操作方式來實施分離和純化RNA的操作過程。
對實施例1-2和實施例1-3，以及對比例1-4和對比例1-5中的含有回收核酸的回收液中的RNA回收量進(jìn)行測量。使用260nm波長處的吸收度進(jìn)行測量。結(jié)果顯示在表1-1中。
表1-1

然后，使用MOPS-甲酰胺電泳，使實施例1-3和對比例1-5中的含有回收核酸的回收液進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示在圖4中。
在圖4中，與泳道2所代表的使用市售可得的純化用試劑盒的對比例1-5比較，對實施例1-3中的回收核酸進(jìn)行電泳而得到的泳道1具有其純度和對比例1-5中的相同、但卻沒有RNA降解物的高質(zhì)量RNA。
此外，如表1-2所示，與使用市售可得的試劑盒的對比例比較而言，使用本發(fā)明的選擇性地分離和純化RNA的方法的實施例，其得到的RNA的質(zhì)量與之相同，但回收量更大。
實施例1-4(1-7)核酸溶解試劑B-1(B-1-1和B-1-2)、洗滌液B-1以及回收液B-1的制備根據(jù)以下所示的配方，制備核酸溶解試劑、洗滌液和回收液。
(核酸溶解試劑B-1-1)硫氰酸胍(由和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)) 3.5mol/LBisTris(由日本株式會社同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)) 0.25mol/L使用鹽酸制成pH6.5的溶液在使用核酸溶解試劑B-1-1之前，加入1.0體積％的2-巰基乙醇。
(核酸溶解試劑B-1-2)
土溫20(由和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)) 15重量％BisTris(由日本株式會社同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))0.1mol/L使用鹽酸制成pH6.0的溶液(洗滌液B-1)Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/L氯化鈉 0.5mol/L乙醇 10體積％(回收液B-1)Tris-HCl(pH6.5) 1mmol/L(1-8)核酸混合物溶液的制備將在液氮條件下速凍的小鼠肝臟切成小塊，并取5mg在1.5ml的試管中溫育。向試管中加入350μL的核酸溶解試劑B-1-1，并將其放入轉(zhuǎn)子-定子勻漿器(商品名為Polytron，由KINEMATICA公司制造)中，直到混合物變均勻。然后在室溫下，將溶液在8000×g的條件下離心3分鐘。并將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml試管中(盡量不帶組織碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解試劑B-1-2，并使用渦流混合器攪拌15秒鐘。此外，將175μL的99.5體積％或更高純度的乙醇加入其中，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。
(1-9)分離和純化RNA的操作將由上述(1-8)得到的核酸混合物溶液注入包括核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱(如上述(1-1)和(1-2)所述)中，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與該柱的第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(260kPa)，通過使所注入的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而使核酸混合物溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，并從另一個開口排出所述溶液。此外，在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入500μL的洗滌液B-1，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與該柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(120kPa)，從而使注入的洗滌液B-1穿過核酸吸附性多孔膜，并從另一個開口排出所述溶液(洗滌步驟1)。在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，將10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液(使用由Promega公司生產(chǎn)的RQ1 RNase-FreeDNase 500 Kunitz U/mL，該反應(yīng)溶液中含有40mM的Tris-HCl(pH8.0)、5mM的HEPES、10mM的MgSO4、5mM的MgCl2、6mM的CaCl2，以及25％的甘油)施加到所述多孔膜上，并讓酶作用5分鐘。洗滌操作(洗滌步驟2)以相同的方式重復(fù)兩次。此外，在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入100μL的回收液B-1，并且將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(120kPa)，從而使注入的回收液B-1穿過核酸吸附性多孔膜，并從另一個開口排出所述溶液，由此回收洗脫液。
對比例1-6使用RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生產(chǎn))試劑盒，按照與該試劑盒所述相同的操作程序，利用步驟(1-8)中的小鼠肝臟來進(jìn)行RNA的提取。根據(jù)該方案，脫氧核糖核酸酶溶液的用量為80μL(208μL/cm2)。
對實施例1-4和對比例1-6中得到的含有回收核酸的回收液測量RNA的回收量。使用在260nm波長處的吸收度進(jìn)行測量。結(jié)果顯示在表1-2中。
表1-2

使用1％瓊脂糖電泳，使含有實施例1-4和對比例1-6中的回收核酸的回收液進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示在圖5中。
在圖5所示的電泳結(jié)果中，泳道4所代表的對比例1-6需要80μL(208μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液，但泳道3所代表的實施例1-4表明，使用僅為10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液就使DNA降解了。與對比例1-6比較而言，實施例1-4得到了純度與之相同的、但是卻沒有RNA降解物的高質(zhì)量RNA。
此外，根據(jù)表1-2，與使用市售可得的純化用試劑盒的對比例比較而言，使用本發(fā)明的選擇性地分離和純化RNA的方法的實施例得到了質(zhì)量與之相同而回收量更大的RNA。
由上所述，可以發(fā)現(xiàn)，即使在使用動物組織作為試驗樣品的情況下，使用少量脫氧核糖核酸酶溶液也可以使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中的DNA降解，由此選擇性地回收RNA。
實施例1-5(1-10)核酸混合物溶液的制備將在液氮條件下速凍的小鼠脾臟切成小塊，并取10mg在2ml的Safe Lock試管(由Eppendorf公司制造)中進(jìn)行溫育。向試管中加入350μL的核酸溶解試劑B-1-1以及直徑為5mm的二氧化鋯小球。使用被設(shè)定為20Hz的TissueLyzer勻漿器(由Qiagen公司制造)均化3分鐘，共進(jìn)行兩次，使所述溶液均勻化。在室溫下，將該溶液在8000×g的條件下離心3分鐘。并將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml試管中(盡量不帶組織碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解試劑B-1-2，并使用渦流混合器攪拌15秒鐘。此外，將175μL的99.5體積％或更高純度的乙醇加入其中，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。
(1-11)分離和純化RNA的操作以與(1-9)相同的操作方式來回收RNA。以相同的方式，將10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液(使用由Promega公司生產(chǎn)的RQ1 RNase-Free DNase 500 Kunitz U/mL)施加到所述膜上。
對比例1-7使用RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生產(chǎn))試劑盒，按照與該試劑盒所述相同的操作程序，利用與步驟(1-10)相同的小鼠脾臟的均化方式來實施RNA的提取。根據(jù)該方案，使用80μL(2081μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液。
使用1％瓊脂糖電泳，使含有實施例1-5和對比例1-7中的回收核酸的回收液進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示在圖6中。
在圖6的電泳結(jié)果中，泳道6代表使用80μL(208μL/cm2)脫氧核糖核酸酶溶液的對比例1-7，其中條帶很微弱而且可識別出基因組DNA條帶，然而由泳道5所代表的實施例1-5表明，使用僅為10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液就使DNA降解了。與對比例1-7比較而言，在使用少量脫氧核糖核酸酶溶液的實施例1-5中，RNA的回收純度更令人滿意。
實施例1-6(1-12)核酸混合物溶液的制備將在液氮條件下速凍的小鼠肝臟切成小塊，并取5mg溫育在1.5ml的試管中。向試管中加入350μL的核酸溶解試劑B-1-1，并通過與專用馬達(dá)相連的PELLET PESTLES(由Kimble/Kontes公司制造)對上述溶液進(jìn)行均化。在室溫下，將該溶液在8000×g的條件下離心3分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml試管中(盡量不帶組織碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解試劑B-1-2，并使用渦流混合器攪拌15秒鐘。此外，將175μL的99.5％或更高純度的乙醇加入其中，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。
(1-13)分離和純化RNA的操作以與(1-9)相同的操作方式來回收RNA。以相同的方式，將10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液(使用由Promega公司生產(chǎn)的RQ1 RNase-Free DNase 500 Kunitz U/mL)施加到所述膜上。
對比例1-8使用RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生產(chǎn))試劑盒，按照與該試劑盒所述相同的操作程序，利用與步驟(1-12)相同的小鼠肝臟的均化方式來實施RNA的提取。根據(jù)該方案，使用80μL(208μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液。
使用1％瓊脂糖電泳，使含有實施例1-6和對比例1-8中的回收核酸的回收液進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示在圖6中。
在圖6的電泳結(jié)果中，泳道8代表的對比例1-8需要80μL(208μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液，但泳道7所代表的實施例1-6表明，使用僅為10μL(26μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液就使DNA降解了。與對比例1-8比較，實施例1-6得到了純度與之相同但卻沒有RNA降解物的高質(zhì)量RNA。
實施例1-7(1-14)核酸混合物溶液的制備將在液氮條件下速凍的小鼠肝臟切成小塊，并取10mg在2ml的Safe Lock試管(由Eppendorf公司制造)中進(jìn)行溫育。向試管中加入350μL如表1-3所示的核酸溶解試劑X，此外還加入直徑為5mm的二氧化鋯小球。使用被設(shè)定為20Hz的TissueLyzer勻漿器(由Qiagen公司制造)均化3分鐘，共進(jìn)行兩次。然后在室溫下，將該溶液在10000×g的條件下離心3分鐘。并將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml試管中(盡量不帶組織碎片)。向上清液中加入如表1-3所示的核酸溶解試劑Y，并使用渦流混合器攪拌15秒鐘。此外，將具有如表1-3所示濃度的高純度乙醇加入其中，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。
表1-3

“由Qiagen公司生產(chǎn)的RLT”表示使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNeasy Mini Kit RLT溶液。
(1-15)分離和純化RNA的操作將由上述(1-14)得到的核酸混合物溶液注入到包括核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱(如上述(1-1)和(1-2)所述)中，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與該柱的第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(120kPa)，通過使所注入的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而使注入的核酸混合物溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，并從另一個開口排出所述溶液。此外，在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入750μL如表1-4所示的洗滌液X，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與該柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(120kPa)，從而使注入的洗滌液X穿過核酸吸附性多孔膜，并從另一個開口排出所述溶液(洗滌步驟1)。在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，將40μL(104μL/cm2)的脫氧核糖核酸酶溶液(使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNase-Free DNase Set 341 Kunitz U/mL)施加到所述多孔膜上。使用洗滌液Y重復(fù)進(jìn)行兩次洗滌操作(洗滌步驟2)。此外，在取下壓力差產(chǎn)生裝置后，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入100μL如表1-4所示的回收液X，并且將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與核酸分離純化柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)(120kPa)，從而使注入的回收液X穿過核酸吸附性多孔膜，并從另一個開口排出所述溶液，由此回收洗脫液。
表1-4

“由Qiagen公司生產(chǎn)的RW1”表示使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNeasy Mini Kit RW1溶液。
“由Qiagen公司生產(chǎn)的RPE”表示使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNeasy Mini Kit RPE溶液。
“不含核糖核酸酶的水”表示使用由Qiagen公司生產(chǎn)的RNeasyMini Kit RW1中的RNase-Free水。
實施例1-7中回收的RNA的回收量顯示在表1-5中。
表1-5

由實施例1-7的結(jié)果證明，通過使用40μL(104μL/cm2)脫氧核糖核酸酶溶液，即使在上述核酸溶解試劑、洗滌液和回收液的任意組合的情況下，也可有效地回收全部RNA。
實施例2(2-1)核酸分離純化柱的制備制備核酸分離純化柱，該柱具有容納核酸吸附性多孔膜的部分(內(nèi)徑為7mm)。
(2-2)使用經(jīng)皂化的三醋酸纖維素多孔膜作為核酸吸附性多孔膜，并且將核酸吸附性多孔膜裝在如上述(2-1)中制備的核酸分離純化柱的核酸吸附性多孔膜的容納部分中。
實施例2-1(2-3)核酸溶解試劑和洗滌液的制備根據(jù)以下所示的配方，制備核酸溶解試劑和洗滌液。
(核酸溶解試劑A-2)鹽酸胍(由Life Technology公司生產(chǎn))382gTris(由Life Technology公司生產(chǎn)) 12.1gTriton X-100(由ICN生物化學(xué)公司生產(chǎn)) 10g蒸餾水 定容到1000ml在使用核酸溶解試劑A-2之前，即刻加入1.0體積％的2-巰基乙醇。
(洗滌液A-2)10mM Tris-HCl20％到50％的乙醇(2-4)純化核酸的操作制備人骨髓白血病細(xì)胞(HL60)的培養(yǎng)液。將細(xì)胞制備成含有1×106個細(xì)胞，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗滌。使用水平轉(zhuǎn)子將所制備的300g細(xì)胞在4℃下離心5分鐘，使飄浮細(xì)胞沉淀，除去上清液，通過輕叩而使細(xì)胞懸浮。向上清液中加入350μL的核酸溶解試劑，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。然后，向其中加入350μL的70％的乙醇，并使用渦流混合器攪拌5秒種。攪拌后，將所述溶液注入容納有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱(由上述(2-1)和(2-2)制各)的第一個開口中，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，通過使所注入的含有核酸樣品溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而使注入的含有核酸樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，并由核酸分離純化柱的另一個開口排出所述溶液。然后，將500μL含有20％到50％乙醇的洗滌液A-2由核酸分離純化柱的所述第一個開口注入，隨后將壓力差產(chǎn)生裝置與所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使注入的洗滌液A-2穿過核酸吸附性多孔膜，并由另一個開口排出所述溶液。該操作被重復(fù)3次。此外，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注入100μL的回收液A-2，然后將壓力差產(chǎn)生裝置與該柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使注入的回收液A-2穿過核酸吸附性多孔膜，并由另一個開口排出所述溶液，由此回收洗脫液。
(實施例和對比例)除了洗滌液中的乙醇濃度如表2-1和2-2所示(Trix-HCl的濃度是固定的)以外，在與上述相同的條件下實施每一步操作。
(2-5)被回收核酸的瓊脂糖凝膠電泳在由上述每一種試劑回收得到的洗滌液和回收液中，由1％瓊脂糖凝膠電泳來計算它們的熒光強(qiáng)度，就得到其中的核酸含量，從而形成DNA和RNA的校正曲線(其中濃度是計算得到的)。表2-1示出回收液中包含的DNA和RNA的濃度，表2-2示出洗滌液中包含的DNA和RNA的濃度。
表2-1

表2-2

表2-1和2-2的結(jié)果清楚地表明，當(dāng)洗滌步驟中的乙醇濃度為50重量％或更低時，DNA混入量低。由此結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法，通過減少含有核酸的回收液中的DNA混入量，可選擇性地回收RNA。
同時還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗滌液中的乙醇濃度高于50重量％時，DNA污染增加。
實施例2-2-1(2-6)核酸溶解試劑溶液和洗滌液的制備根據(jù)以下所示的配方，制備核酸溶解試劑溶液和洗滌液。
(核酸溶解試劑溶液B-2-1)硫氰酸胍(由和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)) 3.5MBisTris(由日本株式會社同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))0.25M使用鹽酸制成pH6.5的溶液在使用核酸溶解試劑B-2-1之前，即刻加入1.0體積％的2-巰基乙醇。
(核酸溶解樣品溶液B-2-2)土溫20(由和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)) 15％BisTris(由日本株式會社同仁化學(xué)研究所生產(chǎn))0.1M使用鹽酸制成pH6.0的溶液
(洗滌液B-2)Tris-HCl(pH7.5) 10mM氯化鈉 0.5M乙醇5％到12.5％(回收液B-2)Tris-HCl(pH 6.5)1mM(2-7)動物組織核酸混合物溶液的制備將在液氮條件下速凍的小鼠肝臟切成小塊，并取5mg在1.5ml的試管中溫育。向試管中加入350μL的核酸溶解試劑B-2-1，并將試管放入轉(zhuǎn)子-定子勻漿器(商品名為Polytron，由KINEMATICA公司制造)中，直到混合物變均勻。然后在室溫下，將溶液在8000×g的條件下離心3分鐘。并將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5mL試管中(不帶入組織碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解試劑B-2-2，并使用渦流混合器攪拌15秒鐘。此外，將175μL的99.5體積％或更高純度的乙醇加入其中，并使用渦流混合器攪拌1分鐘。
(2-8)分離和純化RNA的操作將溶液注入到包括核酸吸附性多孔膜(如上述(2-1)和(2-2)制備)的核酸分離純化柱的第一個開口中，然后將壓力差產(chǎn)生裝置(注射器泵)與該柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，通過使所注入的含有核酸樣品溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而使注入的含有核酸樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，并從核酸分離純化柱的另一個開口排出所述溶液。然后，將750μL含有5％到12.5％乙醇的洗滌液B-2注入核酸分離純化柱的所述第一個開口中，隨后將壓力差產(chǎn)生裝置與所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使注入的洗滌液B-2穿過核酸吸附性多孔膜，并由另一個開口排出所述溶液。該操作被重復(fù)3次。此外，向核酸分離純化柱的所述第一個開口注2入100μL的回收液B-2，然后將壓力差產(chǎn)生裝置與該柱的所述第一個開口連接，使核酸分離純化柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使注入的回收液B-2穿過核酸吸附性多孔膜，并由另一個開口排出所述溶液，由此回收洗脫液。
實施例2-2-2除了在洗滌液B-2中采用30％、2％和0％的乙醇濃度以外，以與上述(2-8)相同的方式實施每一步操作。
(2-9)回收核酸的瓊脂糖凝膠電泳將經(jīng)過實施例2-2-1和實施例2-2-2純化的核酸進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在圖7中。
(2-10)核酸的回收量測量由實施例2-2-1和實施例2-2-2回收得到的含有核酸的回收液的濃度。通過使用在260nm波長處的吸收度來進(jìn)行測量。結(jié)果顯示在表2-3中。
表2-3

如圖7所示發(fā)現(xiàn)，在實施例2-2-1的洗滌步驟(其中，乙醇濃度為5％到12.5％)中，很難識別出DNA的混入。同時，在實施例2-2-2的洗滌步驟(其中，乙醇濃度為20％到30％)中，可識別出DNA的混入。此外，在實施例2-2-2中的乙醇濃度為0％的情況下，盡管沒有識別出DNA的混入，但核酸的排出量降低了。
根據(jù)本發(fā)明，合理地降低回收液中的DNA混入量，可以選擇性地以高收率回收RNA。
工業(yè)實用性通過使用根據(jù)本發(fā)明的多孔膜，可以從DNA和RNA的混合物樣品中，更廉價地以優(yōu)異的純度選擇性地純化RNA，所述多孔膜具有優(yōu)異的分離性能、良好的洗滌效率、簡單快速的可使用性和良好的自動化和小型化的適用性，并且可以批量生產(chǎn)出分離性能基本相同的所述多孔膜。
此外，通過使用本發(fā)明的分離和純化核酸的方法(其中，該方法使用上述核酸吸附性多孔膜)，可以更廉價更容易地從DNA和RNA的混合物樣品中選擇性地回收RNA或DNA。
在本文中所要求的外國優(yōu)先權(quán)中的每個外國專利申請其全部公開內(nèi)容以引用方式并入本文，如同將其全部列出一樣。
權(quán)利要求
1.一種從含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中選擇性地分離和純化RNA的方法，該方法使用包含具有至少兩個開口的容器的核酸分離純化柱，并且該容器容納有溶液能穿過的核酸吸附性多孔膜，其中，所述方法包括以下步驟(1-a)將核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；(1-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期間，使用洗滌液洗滌該核酸吸附性多孔膜；(1-c)對所述核酸吸附性多孔膜進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理；(1-d)用洗滌液洗滌所述核酸吸附性多孔膜；以及(1-e)用回收液使RNA從所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，從而將回收液排出該柱，其中，在步驟(1-c)中，每1cm2的所述核酸吸附性多孔膜使用總量為130μL或更少的脫氧核糖核酸酶溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中脫氧核糖核酸酶溶液中的脫氧核糖核酸酶濃度為10KunitzU/mL到10000Kunitz U/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜包含有機(jī)聚合物，核酸通過基本沒有離子鍵參與的微弱的相互作用被吸附到該有機(jī)聚合物上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜具有羥基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜包含由乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物經(jīng)皂化而得到的有機(jī)材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不對稱的正面區(qū)域和背面區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸混合物溶液是這樣的溶液該溶液是通過向?qū)⒑怂崛芙庠噭┘尤朐囼灅悠分胁⑴c該試驗樣品混合而得到的混合物溶液中，另外再加入水溶性有機(jī)溶劑而得到的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述試驗樣品是培養(yǎng)細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述培養(yǎng)細(xì)胞是在懸浮液中生長的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述培養(yǎng)細(xì)胞是以單層方式生長的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述試驗樣品是動物組織。
12.根據(jù)權(quán)利要求7到11中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，在加入所述核酸溶解試劑之前或之后，將所述試驗樣品均化。
13.根據(jù)權(quán)利要求7到12中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述核酸溶解試劑包含以下試劑中的至少一種離液鹽、核酸穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液以及消泡劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述離液鹽是鹽酸胍和硫氰酸胍中的至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求7到14中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述水溶性有機(jī)溶劑包含以下試劑中的至少一種甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述洗滌液是這樣的溶液其包含選自甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體中的至少一種醇，其中，所述洗滌液所包含的所述至少一種醇其含量為1重量％到100重量％。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到16中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，所述回收液是濃度為0.5mol/L或更低的鹽溶液。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到17中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA的方法，其中，壓力差產(chǎn)生裝置是以可拆裝的方式與所述核酸分離純化柱的一個開口連接的泵。
19.一種用于實施根據(jù)權(quán)利要求1到18中的任意一項所述方法的成套用具，該成套用具由核酸分離純化柱和試劑構(gòu)成。
20.一種用于自動實施根據(jù)權(quán)利要求1到18中的任意一項所述方法的裝置。
21.一種用于自動使用根據(jù)權(quán)利要求19所述的成套用具的裝置。
22.一種選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，該方法包括以下步驟(2-a)通過使含有RNA和DNA的核酸混合物溶液穿過核酸吸附性多孔膜，從而將核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；(2-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期間，使洗滌液穿過所述核酸吸附性多孔膜，從而洗滌該核酸吸附性多孔膜；以及(2-c)通過使回收液穿過所述核酸吸附性多孔膜，從而使核酸從所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，其中，所述洗滌液包含濃度為50重量％或更低的水溶性有機(jī)溶劑，并且所述洗滌液不含離液鹽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液包含濃度為5重量％到40重量％的水溶性有機(jī)溶劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含有機(jī)聚合物的多孔膜，核酸通過基本沒有離子鍵參與的微弱的相互作用被吸附到該有機(jī)聚合物上。
25.根據(jù)權(quán)利要求22到24中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含帶有羥基的有機(jī)聚合物的多孔膜。
26.根據(jù)權(quán)利要求22到25中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜是這樣的多孔膜其包含由乙酰值互不相同的醋酸纖維素的混合物經(jīng)皂化而得到的有機(jī)材料。
27.根據(jù)權(quán)利要求22到26中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不對稱的正面區(qū)域和背面區(qū)域。
28.根據(jù)權(quán)利要求22到27中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述樣品溶液是這樣的溶液該溶液是通過向含有細(xì)胞或病毒的試驗樣品經(jīng)核酸溶解試劑處理而得到的溶液中，加入水溶性有機(jī)溶劑而得到的。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述試驗樣品是培養(yǎng)的細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述試驗樣品是動物組織。
31.根據(jù)權(quán)利要求28到30中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，在加入所述核酸溶解試劑之前或之后，將所述試驗樣品均化。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述核酸溶解試劑包含以下試劑中的至少一種離液鹽、核酸穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液以及消泡劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述離液鹽是鹽酸胍和硫氰酸胍中的至少一種。
34.根據(jù)權(quán)利要求22到33中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述水溶性有機(jī)溶劑是選自甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體中的至少一種醇。
35.根據(jù)權(quán)利要求22到34中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液是這樣的溶液其包含選自甲醇、乙醇、丙醇和其異構(gòu)體、以及丁醇和其異構(gòu)體中的至少一種醇，并且該醇的含量為5重量％到50重量％。
36.根據(jù)權(quán)利要求22到35中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液包含水溶性鹽。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述水溶性鹽的濃度為10mmol/L或更高。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述水溶性鹽的濃度為10mmol/L到1mol/L。
39.根據(jù)權(quán)利要求22到38中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述洗滌液是氯化物的含量為10mmol/L到1mol/L的溶液。
40.根據(jù)權(quán)利要求22到39中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，所述回收液是這樣的溶液該溶液能夠使被吸附的RNA從所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且該溶液的鹽濃度為0.5mol/L或更低。
41.根據(jù)權(quán)利要求22到40中的任意一項所述的選擇性地分離和純化RNA或DNA的方法，其中，在步驟(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，通過使用以下裝置使所述含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述洗脫液穿過所述核酸吸附性多孔膜，所述裝置為(i)核酸分離純化柱，該核酸分離純化柱包含具有至少兩個開口的容器，并且該核酸分離純化柱在所述容器內(nèi)容納有溶液能穿過的核酸吸附性多孔膜；以及(ii)壓力差產(chǎn)生裝置，其中，所述壓力差產(chǎn)生裝置是以可拆裝的方式與核酸分離純化柱的一個開口連接的泵。
42.一種用于實施根據(jù)權(quán)利要求22到41中的任意一項所述方法的成套用具，該成套用具由核酸分離純化柱和試劑構(gòu)成。
43.一種用于自動實施根據(jù)權(quán)利要求22到41中的任意一項所述方法的裝置。
全文摘要
一種從含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中選擇性地分離和純化RNA的方法，其中所述方法包括以下步驟(1－a)吸附核酸；(1－b)洗滌；(1－c)進(jìn)行脫氧核糖核酸酶處理；(1－d)洗滌；以及(1－e)通過回收液使RNA從核酸吸附性多孔膜解吸附，其中在步驟(1－c)中，每1cm
文檔編號C12M1/00GK1938423SQ200580009690
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者豬股弘子, 巖田里江 申請人:富士膠片株式會社