專利名稱：：純化的多孔菌屬漆酶及編碼該酶的核酸的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及編碼一種真菌氧化還原酶的分離核酸片段，以及由該片段所產(chǎn)生的純化酶。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼一種酚氧化酶，特別是擔子菌-多孔菌屬的漆酶的核酸片斷。漆酶(苯二醇氧氧化還原酶)是含多個銅的酶，它能催化酚類物質(zhì)的氧化。漆酶對合適酚類底物的氧化作用，會導致芳氧基中間體的產(chǎn)生，所產(chǎn)生的中間體通過最終聚合，形成由二聚、低聚和多聚反應產(chǎn)物組成的混合物。這種反應在導致黑素、生物堿、毒素、木素和腐殖酸形成的生物合途徑中實際上起著重要作用。漆酶可由很多種真菌產(chǎn)生，包括子囊菌，如曲霉屬(Aspergillus)、脈孢菌屬(Neurospora)和柄孢殼菌屬(Podospora)，半知菌綱的葡萄孢屬(Botrytis)，和擔子菌，如金錢屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、香菇屬(Lentinus)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、多孔菌屬(Polyporus)和完全絲核菌屬(Rhizoctonia)。漆酶具有很大范圍的底物專一性，而且，各種不同真菌的漆酶在其氧化酚類底物的能力方面通常僅有量的差別。由于其底物的多樣性，漆酶一般具有很多潛在的工業(yè)應用前景。其中包括木素改性、紙張強化、洗滌劑中染料轉(zhuǎn)移的抑制、苯酚聚合作用、果汁生產(chǎn)、酚醛樹脂的生產(chǎn)、及廢水處理。由不同真菌菌種制成的漆酶，雖然催化能力相似，但具有不同的溫度和pH最佳值，而且，溫度和pH最佳值也會根據(jù)具體的底物而有所不同。已經(jīng)分離得到多種上述真菌漆酶，而且，編碼其中幾種酶的基因也已被克隆。例如，Choi等(Mol.Plant-MicrobeInteractions5119-128，1992)披露了編碼粟樹枯萎真菌Cryphonectriaparasitica的漆酶的基因的分子特征和克隆。Kojima等(J.Biol.Chem.26515224-15230，1990；JP2-238885)披露了白腐擔子菌Coriolushirsutus漆酶的兩種等位形式。Germann和Lerch(Experientia41801，1985；PNASUSA838854-8858，1986)報道了對粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)漆酶基因的克隆和部分序列分析結(jié)果。Saloheimo等(J.Gen.Microbiol.1371537-1544，1985；WO92/01046)披露了對來自真菌Phlebiaradiata的漆酶基因的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。所做的在異源真菌系統(tǒng)中表達漆酶基因的嘗試，通常獲得極低的產(chǎn)率(Kojima等，Supra；Saloheimo等，Bio/Technol.9987-990，1991)。例如，在實驗室規(guī)模的發(fā)酵中，Phlebiaradiata漆酶在Trichodermareesei中進行的異源表達，在每升發(fā)酵液中僅有20mg活性酶(Saloheimo，1991，supra)。盡管漆酶具有巨大的商業(yè)潛力，但是，能否大量表達這種酶是決定其商業(yè)應用前景的關鍵。以前所做的在重組宿主中表達擔子菌漆酶的嘗試中，只得到極低的產(chǎn)率。本發(fā)明要提供在曲霉屬中表達良好的新的擔子菌漆酶。本發(fā)明涉及一種DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有一段編碼一種多孔菌屬漆酶的核酸序列。本發(fā)明還涉及分離到的由上述核酸序列編碼的漆酶。這種漆酶最好基本上是純的。“基本上是純的”是指一種漆酶中基本上(即≥90％)不含其它非漆酶蛋白。為促進上述新漆酶的生產(chǎn)，本發(fā)明還提供了帶有要求保護的核酸序列的載體和宿主細胞，這種載體和宿主細胞可用于所述漆酶的重組生產(chǎn)。所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄和翻譯信號可操縱地連接，這些信號可指導所述漆酶蛋白在所選擇的宿主細胞中表達。優(yōu)選的宿主細胞是真菌細胞，曲霉屬的細胞為最佳宿主細胞。本發(fā)明漆酶的重組生產(chǎn)是這樣實現(xiàn)的在適合漆酶蛋白表達的條件下培養(yǎng)用本發(fā)明的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，并從培養(yǎng)物中回收所述漆酶蛋白。本發(fā)明的漆酶可用于很多需要對酚類物質(zhì)進行氧化的工業(yè)方法中。所述方法包括木素加工、果汁生產(chǎn)、苯酚聚合和酚醛樹酯生產(chǎn)。圖1表示帶有LCC1(SEQIDNo.1)的基因組克隆21GEN的DNA序列和該序列的翻譯。圖2表示帶有LCC2(SEQIDNo.3)的基因組克隆23GEN的DNA序列和該序列的翻譯。圖3表示帶有LCC3(SEQIDNo.5)的基因組克隆24GEN的DNA序列和該序列的翻譯。圖4表示帶有LCC4(SEQIDNo.7)的基因組克隆31GEN的DNA序列和該序列的翻譯。圖5表示帶有LCC5(SEQIDNo.9)的基因組克隆41GEN的DNA序列和該序列的翻譯。圖6表示載體pMWR1的結(jié)構(gòu)。圖7表示載體pDSY1的結(jié)構(gòu)。圖8表示載體pDSY10的結(jié)構(gòu)。圖9表示由pDSY2所產(chǎn)生的漆酶的pH曲線；(A)丁香醛連氮氧化作用；(B)ABTS氧化作用。圖10表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發(fā)的染料前體的比較，測量DL*。圖11表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發(fā)的染料前體的比較，測量Da*。圖12表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發(fā)的各種染料前體和改性劑的比較，測量DL*。圖13表示分別用漆酶和H2O2染過的頭發(fā)的洗滌穩(wěn)定性的比較。圖14表示分別用漆酶和H2O2染過的頭發(fā)的耐曬性。Polyporuspinsitus是一種擔子菌，又被稱為絨毛樣栓菌(Trametesvillosa)。多孔菌早先就已被確認為漆酶生產(chǎn)菌(Fahraeus和Lindeberg，Physiol.Plant.6150-158，1953)。不過，尚未見從Polyporuspinsitus中提純漆酶的報道。業(yè)已證實Polyporuspinsitus能產(chǎn)生至少兩種不同的漆酶，而且可將編碼這兩種酶的基因用于在簡便的宿主系統(tǒng)，如曲霉屬中以較高的產(chǎn)率生產(chǎn)這種酶。另外，還分離到能編碼漆酶的3個其它基因。通過對各種真菌菌株的初步篩選表明，P.pinsitus是一種漆酶產(chǎn)生菌，P.pinsitus產(chǎn)生漆酶是由2，5-二甲代苯胺誘導的。首先，從誘導的菌株的上清液中分離漆酶。陰離子交換層析證實，一種約為65kD(在SDS-PAGE上測得)的蛋白質(zhì)具有漆酶活性。對該酶進行充分純化，以便得到幾種內(nèi)肽序列，和N-末端序列。初步的序列資料表明，這種漆酶與Coriolushirsutus的漆酶以及一種未鑒定的擔子菌漆酶有明顯的同源性(Coll等，Appl.Environ.Microbiol.594129-4135，1993)。根據(jù)上述序列信息設計出PCR引物，并對從P.pinsitus中分離的cDNA進行PCR。通過PCR獲得了一條預計大小的帶，而且，分離得到的與纖維素酶信號序列連接的片段被證實可在米曲霉(A.Oryzae)中表達一種活性漆酶，但表達水平很低。上述PCR片段之一還被用作篩選P.pinsituscDNA文庫的探針。以這種方式鑒定得到100個以上的陽性克隆。對這些陽性克隆進行特征分析，并對最長克隆的末端測序；在這些克隆中，沒有發(fā)現(xiàn)一個具有完整長度。還進行了分離完整長度克隆的進一步努力。用按上述方法分離到的最完整的cDNA片段檢測一個5-6kbBamHI大小選擇的P.pinsitus基因組文庫。初步篩選證實，克隆24GEN(LCC3)與該cDNA有同源性，但它不是該cDNA編碼的漆酶，而且也不是完整長度。隨后篩選一個7-8kbBamHI/EcoRI大小選擇的文庫表明，至少有兩種漆酶；部分序列分析表明，一種被稱為21GEN(LCC1)的克隆與所分離的原始部分cDNA克隆相同，而另一種被稱為31GEN(LCC4)的克隆是一種新的，以前未鑒定過的漆酶。用LCC1作為探針再次篩選一個EMBL4基因組文庫，鑒定了一類含有完整的LCC1插入片段及其5′和3′側(cè)翼區(qū)的克隆。用LCC3篩選EMBL文庫鑒定了另外兩個編碼漆酶的克隆，這兩個克隆是以前未被鑒定過的，被稱為41GEN(LCC5)和23GEN(LCC2)，它們在結(jié)構(gòu)上也與另外3個克隆LCC1、LCC3和LCC4不同。上述每種漆酶的核酸序列和預測的氨基酸序列分別在圖1-5和序列號SEQIDNo.1-10中給出。在表2中對每種漆酶的結(jié)構(gòu)組織進行了比較。這些漆酶通常在約4-5.5的酸性pH條件下具有最佳活性。將LCC1用于產(chǎn)生表達載體，再將所產(chǎn)生的載體用于轉(zhuǎn)化曲霉屬的各種菌種。在所有試驗過的菌種中轉(zhuǎn)化都取得了成功，但表達水平在黑曲霉(Aspergillusniger)中最高。在搖瓶培養(yǎng)中，能產(chǎn)生濃度為15mg/l或15mg/l以上的漆酶，而在實驗室規(guī)模的發(fā)酵罐中，獲得了超過300mg/l的產(chǎn)率。與先前用其它漆酶和其它真菌宿主細胞獲得的漆酶水平相比，上述產(chǎn)率代表了一種重大改進。根據(jù)本發(fā)明，通過上述方法或本領域中任何其它已知方法，利用本發(fā)明所提供的信息，可獲得編碼一種漆酶的多孔菌屬基因。該基因可利用一種表達載體以活性形式表達。適用的表達載體，帶有一個能使該載體穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組上或能使該載體在宿主細胞中獨立于該宿主細胞的基因組之外進行自主復制的因子，而且最好還帶有一個或一個以上便于選擇轉(zhuǎn)化宿主細胞的表型標記。該表達載體還可以包括編碼啟動子、核糖體結(jié)合位點、翻譯起始信號的各種操縱序列，并可有選擇地帶有一個阻抑基因或各種激活基因。為了讓表達的蛋白能夠分泌，可將編碼一種信號序列的核苷酸插在基因編碼序列之前。為了在操縱序列指導下進行表達，將有待按照本發(fā)明使用的漆酶基因與所述操縱序列在正確的閱讀框架中進行可操縱連接?？山Y(jié)合到質(zhì)粒載體上、并可指導漆酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動子序列，包括但不限于原核β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)和tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。還可從“UsefulProteinsfromrecombinantbacteria”(ScientificAmerican，1980，24274-94)一文和SamDrook等所著的MolecularCloning(1989)一書中找到其它可供參考的信息。攜帶本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的表達載體，可以是有利于進行重組DNA方法的任何載體，載體的選擇通常取決于將被導入所選載體的宿主細胞。因此，所述載體可以是一種自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體復制，如質(zhì)?；蛉旧w外因子，微型染色體或人工染色體。另外，所述載體可以是這樣的當它被導入宿主細胞后能整合到宿主細胞基因組上，并與其所整合的染色體共同復制。在該載體上，漆酶DNA序列與一個合適的啟動子序列可操縱地連接。該啟動子可以是任何在所選擇的宿主細胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可由編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因衍生而來。用于指導本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的例子有大腸桿菌(E.coli)lac操縱子的啟動子、StreptomgcesCoelicolor瓊脂糖酶基因dagA啟動子、地衣型芽胞桿菌(BacillusLicheniformis)α-淀粉酶基因(amgL)啟動子、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)生麥淀粉酶基因(amgM)啟動子、淀粉液化桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)啟動子或枯草桿菌(BacillusSubtilis)xylA和xylB基因啟動子。在酵母宿主中，一種有用的啟動子是eno-1啟動子。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，可以使用的啟動子的例子有由編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucormiehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因衍生而來的啟動子。優(yōu)選TAKA-淀粉酶和glaA啟動子。本發(fā)明的表達載體還可包括一個合適的轉(zhuǎn)錄終止子，而且，在真核生物中，與編碼本發(fā)明漆酶的DNA序列可操縱地連接的聚腺苷酸化序列。終止序列和聚腺苷酸化序列可以源自與上述啟動子相同的來源。所述載體還可以包括一個使該載體能夠在上述宿主細胞中復制的DNA序列。這種序列的例子包括質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復制起點。所述載體還可以包括一個選擇標記，例如一個基因，該基因的產(chǎn)物能夠彌補宿主細胞的某種缺陷，如來自枯草桿菌或地衣型芽胞桿菌的dal基因；或是一種能賦予抗生素抗性，如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。曲霉屬選擇標記的例子包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC和hygB，一種能產(chǎn)生潮霉素抗性的標記。用于曲霉屬宿主細胞的優(yōu)選選擇標記是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標記。常用的哺乳動物標記是二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。另外，還可以通過共轉(zhuǎn)化實現(xiàn)選擇，例如在WO91/17243中所披露的。一般，希望表達能夠產(chǎn)生一種胞外產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的漆酶可以包括一個前導區(qū)，它使得表達的蛋白質(zhì)能分泌到培養(yǎng)基里。如果需要，該前導區(qū)可以是本發(fā)明漆酶的天然前導區(qū)，或是被其它前導區(qū)或信號序列所取代，通過取代編碼相應前導區(qū)的DNA序列可很容易地實現(xiàn)上述目的。例如，所述前導區(qū)可來源于獲自曲霉菌的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、獲自芽胞桿菌的淀粉酶基因、獲自Rhizomucermiehei的脂肪酶或蛋白酶基因、獲自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子編碼基因或小牛前凝乳酶原基因。特別理想的是，當宿主是真菌細胞時，所述前導區(qū)為米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶的信號序列，Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶信號，Rhizomucormiehei脂肪酶信號，芽包桿菌NCIB11837生麥淀粉酶、嗜熱芽胞桿菌α-淀粉酶、或地衣型芽胞桿菌枯草溶菌素的信號序列。用于把本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)分別與啟動子、終止子和其它因子連接的方法，以及將連接后的DNA序列插入帶有復制所需的信息的合適載體的方法，是本領域技術人員所熟知的(例如，Sambrook等，MolecularCloning，1989)。帶有上述本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)或表達載體的本發(fā)明的細胞，能很好地用作重組生產(chǎn)本發(fā)明的酶的宿主細胞。該細胞可用本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)進行轉(zhuǎn)化，通過將DNA結(jié)構(gòu)整合到宿主染色體上而順利地進行。這種整合被一般視為一種優(yōu)點，因為該DNA序列更傾向于穩(wěn)定地維持在細胞中。所述DNA結(jié)構(gòu)與宿主染色體的整合可通過常規(guī)方法實現(xiàn)，例如，通過同源或異源重組。另外，還可用上文中與不同類型宿主細胞一起論及的表達載體轉(zhuǎn)化所述細胞。所述宿主細胞可選自原核細胞，如細菌細胞。合適的細菌的例子包括革蘭氏陽性細菌，如枯草桿菌、地衣型芽胞桿菌、Bacilluslentus、短桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkalophilus)、淀粉液化芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌(BacillusCirculans)、Bacilluslantus、巨大芽胞桿菌(B.megaterium)、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)或鉛色鏈霉菌(Streptomyceslividans)或灰色鏈霉菌(Streptomycesmurinus)，或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。細菌的轉(zhuǎn)化可通過已知方法來實現(xiàn)，例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或通過使用感受態(tài)細胞。所述宿主細胞也可以是真核細胞，如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或最好是真菌細胞，真菌細胞包括酵母和絲狀真菌。例如，可選用的哺乳動物細胞包括CHO或COS細胞。酵母宿主細胞可選自酵母屬或裂殖酵母屬的一個種，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。能采用的絲狀真菌，可選自曲霉屬的一個種，如米曲霉或黑曲霉。另外，還可以把鐮孢菌(Fusariumsp.)，如尖鐮孢(F.oxysporum)用作宿主細胞。真菌細胞可以通過一種包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化，在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化之后，以一種已知方式再生細胞壁。在歐洲專利EP238023中披露了一種轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細胞的適宜方法。Malardier等(1989)披露了一種轉(zhuǎn)化鐮孢菌的合適方法。因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的重組漆酶的方法，該方法包括在有利于所述漆酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)上述宿主細胞，從該細胞和/或培養(yǎng)基中回收所述漆酶。用于培養(yǎng)上述細胞的培養(yǎng)基可以是任何適于這種宿主細胞生長并能表達本發(fā)明的漆酶的常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從供應商那里購買或按照公開的配方(例如，可參看AmericanTypeCultureCollection目錄)制備。在一種優(yōu)選實施方案中，在有過量銅的條件下，在培養(yǎng)中實現(xiàn)了漆酶的重組生產(chǎn)。盡管加入培養(yǎng)基中的微量元素通常含有少量的銅，但結(jié)合本發(fā)明所做的實驗表明，補加銅可以使活性酶的產(chǎn)率增加很多倍。理想的是，以可溶形式把銅加進培養(yǎng)基中，最好是以可溶性銅鹽形式加入，如氯化銅、硫酸銅或乙酸銅。培養(yǎng)基中銅的最終濃度應在0.2～2mM范圍內(nèi)，最好在0.05～0.5mM范圍內(nèi)。這方法可用于提高任何重組生產(chǎn)的真菌漆酶，以及其它含銅酶，特別是氧化還原酶的產(chǎn)率。可通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的酶，該方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞；用鹽，如硫酸氨沉淀上清液或濾液中的蛋白質(zhì)成分；隨后用各種層析方法進行提純，如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。理想的是，通過SDS-PAGE測得所提取的蛋白質(zhì)的純度約為90％，在食品、果汁或洗滌劑方面的應用中，純度最為重要。在一種特別優(yōu)選實施方案中，在真菌宿主細胞，如曲霉屬細胞里實現(xiàn)了漆酶的表達。正如將要在下面的實施例中詳細講述的，把漆酶基因連接在一種帶有米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動子和構(gòu)巢曲霉amdS選擇標記的質(zhì)粒上。另外，admS也可以在另一種質(zhì)粒上，將這種質(zhì)粒用于共轉(zhuǎn)化。按照Yelton等(PNASUSA811470-1474，1984)的方法，用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化曲霉菌宿主細胞，如米曲霉或黑曲霉宿主細胞。特別值得一提的是，在本發(fā)明中以曲霉菌為宿主細胞所得到的多孔菌屬漆酶的產(chǎn)率出乎意料地明顯高于先前報道過的在其它宿主細胞中表達其它漆酶的產(chǎn)率。預計，在生產(chǎn)來自其它擔子菌，如草蓋菌屬(Coriolus)或栓菌屬(Trametes)的漆酶時，將曲霉菌屬用作宿主細胞，也能產(chǎn)生比以前所能達到的量更大的酶。因此，本發(fā)明還包括在曲霉屬重組宿主細胞中生產(chǎn)上述類多孔菌屬漆酶。本領域技術人員可以理解，本發(fā)明并不局限于使用本文所披露的核酸片段，例如在圖1-5中披露的核酸片段。很明顯，本發(fā)明還包括編碼與圖1-5所示相同的氨基酸序列的核苷酸序列，但這種序列由于遺傳密碼的簡并而與圖中所示的核苷酸序列有所不同。此外，在說明書和權利要求書中對圖1-5的說明應當被理解為既包括所示出的基因組序列，又包括相應的cDNA和RNA序列，而本文所采用的“DNA結(jié)構(gòu)”和“核酸序列”應當被理解成包括所有這類變形?！癉NA結(jié)構(gòu)”一般被理解成單鏈或雙鏈DNA分子，這種DNA結(jié)構(gòu)可以從天然存在的基因中分離出它的一部分，或?qū)ζ溥M行修飾，以使其含有以天然狀態(tài)下沒有的方式結(jié)合和并列的DNA片段。另外，本發(fā)明還包括其它多孔菌屬漆酶，如存在于Polyporuspinsitus中的其它形式的漆酶，以及由Fries所定義的多孔菌屬的定義范圍內(nèi)的其它真菌中所存在的漆酶，或Long等(1994，ATCCNamesofIndustrialFungi，ATCC，Rockville，Maryland)所定義的多孔菌屬的同物異名真菌中所存在的漆酶。通過采用在本發(fā)明實施例中所述的方法，可以從本文所列舉的來源之外的、公開銷售的多孔菌屬菌株鑒定和分離漆酶基因。另外，這里所披露的序列可用于設計引物和/或探針，將其用于通過標準PCR或Southern雜交技術分離漆酶基因。其它名稱的多孔菌包括，但不局限于P.zonatus、P.alveolaris、P.arcularius、P.australiensis、P.badius、P.biformis、P.brumalis、P.ciliatus、P.colensoi、P.eucalyptorum、P.meridionalis、P.varius、P.palustris、P.rhizophilus、P.rugulosus、P.squamosus、P.tuberaster和P.tumulosus。還包括同物異名的漆酶，例如，多孔菌屬的種或株的變形或完整形式。公眾可很容易地從很多培養(yǎng)物保藏中心得到多孔菌屬菌株，例如，可從ATCC獲得ATCC26721、9385、11088、22084；可從DSM獲得DSM1021、1023和1182；可從CBS獲得CBS687.70、166.29、101.15、276.31、307.39、334.49和332.49。本發(fā)明還包括任何改變形式的核苷酸序列及其所編碼的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)與圖2-5中所示的任一氨基酸序列的同源性至少約為80％、至少約為85％較為理想，至少約為90-95％最為理想，而且在實質(zhì)上它具有本文所示序列的漆酶活性。上述類型中可以使用的變體包括，例如，已進行過保守氨基酸取代的蛋白質(zhì)，這種取代不會明顯影響該蛋白質(zhì)的活性。保守取代是指同一類型的氨基酸可被這一類型的其它氨基酸所取代。例如，非極性脂族殘基Ala、Val、Leu和Ile之間可以互相替換，堿性殘基Lys和Arg之間或酸性殘基Asp和Glu之間也可以相互替換。類似地，Ser和Thr互為保守取代基，Asn和Gln互為取代基。本領域技術人員可以理解，可以在對該分子的功能起關鍵作用的區(qū)域之外進行這種取代，并且仍能得到有活性的酶。例如用本發(fā)明實施例中所述的標準ABTS氧化方法，能夠很方便地測定所保留的需要的活性。所述蛋白質(zhì)可用在許多不同的工業(yè)方法中。這些方法包括在溶液中的木素聚合，所述木素包括硫酸鹽紙漿和木素硫酸鹽，通過聚合產(chǎn)生具有較高分子量的木素。這種方法披露于下列文獻中Holzforschung(Jin等，45(6)，467-468，1991)；US-4，432，921；EP0275544；PCT/DK93/00217(1992)。本發(fā)明的漆酶還可用于牛皮紙槳中木素的原位解聚，從而產(chǎn)生一種木素含量較低的紙漿。漆酶的這種用途，是對現(xiàn)行用氯解聚木素的一種改進，現(xiàn)行方法會產(chǎn)生氯化芳族化合物，這種化合物是由造紙廠生產(chǎn)的對環(huán)境有害的付產(chǎn)品。這類用途披露于下列文獻中，例如，CurrentOpinioninBiotechnology3261-266，1992；J.Biotechnol.25333-339，1992；Hiroi等，Svenskpapperstidning5162-166，1976。對染料或染料前體及其它有色化合物的氧化作用，會導致該化合物脫色?？蓪⑵崦赣糜谶@種目的，在不希望染料在織物間轉(zhuǎn)移的情況下，使用漆酶特別有利，例如在紡織業(yè)和洗滌劑業(yè)中。用于染料轉(zhuǎn)移抑制和染料氧化的方法披露在以下文件中WO92/01406、WO92/18683、EP0495836和Calvo，MededelingenVandeFaculteitLandbouw-Wetenschappen/RijiksuniversitetGent.561565-1567，1991；Tsujino等，J.Soc.Chem.42273-282，1991。所述漆酶特別適用于染發(fā)。在這一用途中，漆酶與染料前體(最好在毛發(fā)上)接觸，從而實現(xiàn)對染料前體的有控制的氧化，將所述前體轉(zhuǎn)化成染料或色素產(chǎn)生化合物，如醌類化合物。所述染料前體最好是屬于下列三大化合物家族之一的一種芳族化合物二胺、氨基苯酚(或氨基萘酚)和苯酚。上述染料前體可單獨使用或組合使用。共聚作用的中間體，至少有一種必須是鄰-或?qū)?二胺或氨基苯酚(主要中間體)。其例子見下文的第V部分，而且還披露在US-3,251,742中，該專利的內(nèi)容被用作本文的參考。在一種實施方案中，原料不僅包括所述酶和主要中間體，而且還包括一種改性劑(成色劑)(或多種成色劑的組合物)，所述改性劑通常是間-二胺、間-氨基苯酚、或多酚。在所述漆酶的存在下，所述改性劑再與主要中間體反應，將其轉(zhuǎn)化成有色化合物。在另一種實施方案中，所述漆酶可直接用于所述主要中間體，將中間體氧化成有色化合物。在任何情況下，所述染色方法都可用一種或一種以上主要中間體單獨進行或與一種或一種以上改性劑一起進行。各種成分的用量與類似成分的常見商業(yè)用量一致，而各種成分的比例可相應變化。所述漆酶的應用，是對傳統(tǒng)的H2O2的使用的一各種改進，在使用H2O2時會損傷毛發(fā)，而且使用它還需要高pH，這樣也會損傷毛發(fā)。相反，與漆酶的反應可在堿性、中性或者甚至在酸性pH條件下進行，而且氧化所需的氧氣來自空氣，而不是進行苛刻的化學氧化作用。使用所述多孔菌屬漆酶所產(chǎn)生的結(jié)果，不論在顯色方面，還是在耐洗性和耐曬性方面，都可與使用H2O2所產(chǎn)生的效果媲美。另一種商業(yè)優(yōu)勢是，可用一個容器包裝在沒有氧氣的條件下同時盛放漆酶及其前體，這種安排不可能用于H2O2的包裝。本發(fā)明的漆酶還可用于存在于液體中的酚類或苯胺類化合物的聚合作用。這種用途的一個例子是，用它處理果汁，如蘋果汁，這樣，所述漆酶可加快果汁中的酚類化合物的沉淀，從而產(chǎn)生一種更為穩(wěn)定的果汁。這類應用披露了下列文獻中Stutz，F(xiàn)ruitProcessing7/93，248～252，1993；Maier等，Dt.Lebensmittel-rindschau86(5)137-142，1990；Dietrich等，F(xiàn)luss.Obst57(2)67-73，1990。漆酶，如多孔菌屬漆酶還可用于土壤解毒(Nannipieri等，J.Environ.Qual.20510-517，1991；Dec和Bollag，Arch.Environ.Contam.Toxicol.19543-550，1990)。通過下面的非限定實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I.分離Polyporuspinsitus漆酶材料和方法1.酶促試驗除非另有說明，在本申請的所有實施例中，漆酶活性是按下述方法用丁香醛連氮和2，2′-雙連氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)測定的。使用19μM底物，在530nm波長處監(jiān)測丁香醛連氮的氧化。在30℃溫度下，在25mM乙酸鈉、40μM硫酸銅、pH5.5的溶液中，其活性用LACU(μmole/分鐘)表示。采用Britton和Robison(B&R)緩沖液進行pH特征研究，這種緩沖液是按照披露于Quelle，BiochemischesTaschenbuch，H.M.Raven，II.Teil，s.93u.102，1964中的方法制備的。ABTS氧化作用，是使用0.1mMABTS，在0.1MNaAc(pH5.0)中，在室溫下進行的，通過在96孔滴定板(Costar)上監(jiān)測ΔAbs405或在石英比色杯中監(jiān)測ΔAbs418。重疊ABTS氧化酶活性試驗是這樣進行的將冷卻的ABTS-瓊脂糖(0.03～0.1gABTS，1g瓊脂糖、50mlH2O、加熱溶化瓊脂糖)傾注在天然IEF凝膠或PAGE上，并在室溫下保溫。2.漆酶的初步分離為了提取所述漆酶，在一個超濾器(緩慢過濾)上用HFSC過濾800ml培養(yǎng)液。在一個帶有GR81PP膜的Amiconcell上，將所得到的澄清濾液濃縮并洗滌至72ml的體積。將1ml漆酶試樣同用0.1M磷酸鹽(pH7)平衡過的Q-SepharoseHP(Pharmacia，Sweden)柱結(jié)合，并用NaCl梯度液洗脫結(jié)合上去的漆酶?？偣矊?0×1ml的樣品進行提純，收集，濃縮并通過超濾洗滌，超濾時使用分子量截斷值為6kD的膜。3.二次提純在二次提純時，通過超濾對發(fā)酵液進行過濾和濃縮。原料中含187LACU/ml。所得濃縮液在一個Propex23濾器(P&SFiltration)上，用3％HyfloCuper-Cel(HSC；CeliteCorporation)進行快速過濾，隨后在一個Filtron濾器上進行兩次超濾，使用兩個膜，每個膜的分子量截斷值為3kD。把所得到的樣品(2.5mS/cm，pH7.0，4℃)加到一個130mlQ-Sepharose柱上，該柱用磷酸鈉(1.1mS/cm，pH7.0)平衡過。在這種條件下，漆酶不與上述柱結(jié)合，但在加入并用平衡緩沖液洗滌時緩慢地從柱上洗脫，以致只能與其它棕色材料部分分離。將這種部分提純的1.0mS的制劑(在20℃下pH7.0)加到Q-Sepharose柱上。該柱用20mM磷酸鈉(2.2mS，pH7.0)平衡。在這種條件下，漆酶與柱結(jié)合，并可由0-1MNaCl梯度以20倍的柱體積洗脫。3、序列分析為了進行內(nèi)肽序列分析，用胰蛋白酶消化純化的蛋白質(zhì)，然后用HPLC提純肽。在一臺AppliedBiosystem473A序列測定儀上分析純化的肽的序列。B、結(jié)果和討論1、初步特征分析初步提純的總產(chǎn)率大約為50mg(在A280nm處測得)。純化的酶為濃藍色，而且在SDS-PAGE上大約65kd的位置僅有兩條極為接近的帶。用含有底物的天然PAGE進行的疊層試驗表明，兩條帶對ABTS都有漆酶活性。吸收光譜表明，除了在A280nm處有吸收外，純化的漆酶在約600nm處也有吸收。2、序列分析對初步純化的蛋白質(zhì)進行N-末端測定表明，有一個單一序列Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-Ala-Val-Ser-Pro-Asp-Gly-Phe-Pro…由于該N-末端序列并非可用于構(gòu)建探針的理想序列，又進行了胰蛋白酶消化的其它試驗，隨后再對所得片段進行進一步提純(按上述方法)和測序。2、二次提純和特征分析在二次提純時，由另一個Q-Sepharose層析步驟產(chǎn)生以下洗脫庫(pools)。Q-Sepharose-2-庫-140ml112LACU47LACU/A280Q-Sepharose-2-庫-380ml385LACU65LACU/A280洗脫產(chǎn)率大于加樣量的80％。高度純化的制劑Q-Sepharose-2-庫-3的A280＝5.9，而A280/A260＝1.4。以蛋白質(zhì)計算，原料中漆酶的純度極高，但原料為非常深的棕色。在SDS-PAGE上可見到兩條帶，一條65kD的主帶，和一條較小的62kD的帶。采用陰離子層析，在第一個峰(Q-Sepharose-2-庫-1)中，僅能看到主帶，而在第二個峰(Q-Sepharose-2-庫-3)中，兩條帶都可以看到。3、序列測定了若干內(nèi)肽序列，并與Coriolushirsutus(Ch)漆酶序列進行比較。鑒定的片段如下Tryp13Ser-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Ala-Ala-Asp-LeuTryp14Ser-Ala-Gly-Ser-Thr-Val-Tyr-Asn-Tyr-Asp-Asn-Pro-Ile-PheArgTryp16序列1Ser-Thr-Ser-Ile-His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-Gln-Lys序列2Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-ValTryp18Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-AsnTryp19序列1Leu-Gly-Pro-Ala-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Leu-Ile-序列2Phe-Gln-Leu-Asn-Val-Ile-Asp-Ash-Asn-Thr-Thr-His-Thr-MetTryp25Tyr-Ser-Phe-Val-Leu-Glu-Ala-Asn-Gln-Ala-Val-Asp-Asn-Tyr-Trp-Ile-ArgTryp27Gly-Thr-Asn-Trp-Ala-Asp-Gly-Pro-Ala-PheII.Polyporuspinsitus漆酶cDNA克隆的分離A、材料和方法1、RNA制備用鈲鹽/CsCl緩沖法，從10g在有二甲代苯胺誘導的條件下生長6.5小時的P.pinsitus菌絲體中提取RNA。在一個寡脫氧胸苷酸柱上對所得RNA進行聚腺苷酸(Poly-A)選擇，采用標準條件。得到120μgmRNA，并以5μg的試樣在-80℃下呈冷凍顆粒形式保存。2、單鏈cDNA按照生產(chǎn)商的說明，用反轉(zhuǎn)錄酶“SuperScript”(BRL)合成單鏈cDNA。3、cDNA文庫的構(gòu)建用庫存的IVcDNA試劑盒(Invitrogen)構(gòu)建一個cDNA文庫。得到50個cDNA庫，每庫含有大約5000個轉(zhuǎn)化體。4、PCR在下列標準條件下進行PCR100pmol各種引物，10μl10×PCR緩沖液(Perkin-Elmer)，40μldNTP0.5mM，2μl單鏈cDNA(或約100ng染色體DNA或100ngPCR片段)，用H2O把體積調(diào)至100μl，2.5UTaq聚合酶。進行3次。(40℃/2分鐘，72℃/2分鐘，94℃/1分鐘)循環(huán)，接著再進行30次(60℃/2分鐘，72℃/2分鐘，94℃/1分鐘)循環(huán)。B、結(jié)果和討論1、克隆P.pinsitus漆酶用引物#3331ACCAGNCTAGACACGGGNTC/AGATACTG/ACGNGAGAGCGGAC/TTGCTGGTCACTATCTTCGAAGATCTCG和引物#3332CGCGGCCGCTAGGATCCTCACAAGGCCAA/CTCTCTG/CCTCG/ACCTTC.進行PCR。獲得一條清晰的約1500bp的帶。用NotI/HindIII消化這種DNA，并在瓊脂糖凝膠上進行分離。對上帶(片段#42)進行提純，并將其克隆到曲霉屬載體pHD423上。未得到轉(zhuǎn)化體。為了克隆該片段，進行了幾種試驗，包括用限制酶進行再消化，末端磷酸化，補充克列諾(Klenow)片段，和在SmaI裂解的puC18上進行平端克隆，但均未成功。用根據(jù)Coll等披露的漆酶制備的漆酶探針雜交，結(jié)果表明，上述PCR產(chǎn)物可能是P.pinsitus漆酶。在試圖克隆該PCR片酸的新的努力中，進行一種新的PCR反應，采用與片段#42相同的條件。結(jié)果又得到約為1500bp的片段(片段#43)。這一次是用HindIII/BamHI裂解該片斷，并將其同HindIII/BamHI裂解的pUC18連接。發(fā)現(xiàn)3個克隆#43-/A，-B、-G中帶有1500bp的片段。部分序列分析結(jié)果表明，這些片段與漆酶有關。2、P.pinsitus漆酶的表達為了表達所述漆酶，將片段#43與來自一種43KD纖維素酶的信號序列連接，將引物pHD433(TAGCGGATCCCACAATGCGTTCCTCCCCCCTCCTCCCGTCCGCCGTTGTGGCCGCCCTGCCGGTGTTGGCCCTTGCCGGCATTGGGCCCGTCGCGGACC)用于進行標準的PCR反應，采用一種pUC正向引物(NewEnglandBiolabs)。為了減少用到有錯誤的DNA的危險，將3個克隆都用作模板。在PCR反應中產(chǎn)生的DNA帶有引物pHD433和模板43-A和43-G，用HindIII/BamHI對所得DNA進行裂解，并將其克隆到曲霉屬表達載體pHD414(在下文詳細講述)上。得到了幾個轉(zhuǎn)化子。將克隆pHD433/43A-1，2，pHD433/43G-2，-3轉(zhuǎn)入米曲霉中。對每種轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體(3-10個)的漆酶產(chǎn)生進行分析。僅在pHD433/43G-3的轉(zhuǎn)化體上測得活力。在amdS平皿上對陽性轉(zhuǎn)化體(編號1，4，6)進行再次分離，并再次試驗。在另一輪轉(zhuǎn)化中，又得到10個pHD433/43G-3的轉(zhuǎn)化體?？寺?20、23、26、28和29為陽性。對這些克隆進行再次分離，并通過在ABTS分析(pH4.5)中的顯色反應，對兩個分離克隆的漆酶表達進行半定量分析。有幾個克隆以+-+++的規(guī)模表現(xiàn)出中到強的漆酶表達力。進行進一步克隆，以鑒定完整長度的克隆。以片段#42-4為探針，對由大約350,000個轉(zhuǎn)化體組成的二甲苯胺誘導的cDNA文庫進行篩選。檢測到100個以上陽性克隆。對這些克隆進行純化、再篩選，并用Southern印跡進行分析。通過DNA序列測定對最長的兩個克隆作進一步分析。發(fā)現(xiàn)最長的兩個克隆相同，而且，在其3′末端有一個聚腺苷酸片段，并且是在氨基酸末端的第4個氨基酸開始。由不同的克隆測定部分DNA序列。然后，將pHD433/43G-3用于進一步的克隆研究，如在下面的第IV部分將要講到的。III.其它P.pinsitus漆酶野生型酶的純化和特征分析A、材料和方法1、培養(yǎng)條件用幾個取自一周齡P.pinsitus的PDA培養(yǎng)皿的瓊脂塊接種搖瓶(250ml培養(yǎng)基/2.8升體積的擋板式搖瓶)。每升培養(yǎng)基中含有10g葡萄糖、2.5gL-天冬酰胺、0.2gL-苯丙氨酸、2.0g酵母提取物、2.0gKH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、2.0mlAMG微量金屬元素、0.002gCuSO4·7H2O、1.0g檸檬酸，用自來水配制，高壓滅菌之前pH5.0。培養(yǎng)物在18～22℃溫度下在一臺旋轉(zhuǎn)搖床上以較低的速度(～100rpm)振蕩。7天以后，通過加入0.25ml5NNaOH把每只搖瓶里的pH調(diào)至6.0左右，并通過向每只搖瓶中添加0.5ml2，5-二甲代苯胺儲液(以1∶10的比例把二甲代苯胺稀釋在乙醇中)誘導所述培養(yǎng)物。將搖瓶再培養(yǎng)24小時，這時，回收每只搖瓶里的培養(yǎng)上清液。2、材料用作緩沖液的化學試劑起碼是試劑級的商業(yè)化產(chǎn)品。Endo/N-葡糖苷酶F購自Boehringer-Mannheim公司。在PharmaciaFPLC上進行層析。光譜分析是在一臺分光光度計(ShimadzuPC160)上進行，或是在一臺微量板閱讀儀(MolecularDevice)上進行。3、純化先用紗布過濾培養(yǎng)液，并以1000×g的速度離心，以除去膠凝狀粉紅色二甲代苯胺聚合物。隨后用Whatman#2濾紙過渡上清液，并在4℃溫度下，在S1Y100(Amicon，Spiralconcentrater)上由1500ml濃縮至250ml體積。用水稀釋濃縮液，直到0.8mS(從2.5mS開始)，然后在S1Y100上濃縮至250ml。將在-20℃下冷凍過夜的洗滌液解凍，并用Whatman#濾紙過濾，以除去殘余的粉紅色材料，然后用NaOH把pH值從6.1調(diào)整到7.7。得到275ml、0.8mS的黃色液體，將其加到Q-SepharoseXK-26柱(約有64ml凝膠)，該柱用10mMTris-HCL，pH7.7，0.7mS平衡過。通過用平衡緩沖液加注和洗滌，得到第一份流經(jīng)該柱的活性漆酶部分。用由平衡緩沖液配成的0-0.5M的線性梯度NaCl溶液，以8.8倍的床體積進行洗脫。第二和第二份活性部分分別被0.15M和0.35M的NaCl洗脫。隨后在用2MNaCl和1mMNaOH依次洗脫時，未再檢測到活性部分。收集活性部分，調(diào)至約10mS，在Centricon-10(Amicon)上濃縮，然后上Superdex75(HR10/30，24ml，Pharmacia)柱，該柱用10mMTris-HCl、0.15MNaCl、pH8，14mS平衡過。在用加樣緩沖液洗脫時，所有3個Q-Sepharose洗脫的漆酶部分都被以相同的洗脫體積洗脫，表明它們具有極為相似的天然分子量。在SDS-PAGE上測定所得漆酶的純度。4、蛋白質(zhì)分析在一個MiniProteanII和一個Model111MiniIEFCell(Bio-Rad)上進行PAGE和天然IEF。在一個Minitrans-blotCell(Bio-Rad)上，用堿性磷酸酶分析試劑盒(Bio-Rad)進行Western吸印。在吸印期間，把一級抗體稀釋1000倍。在一臺AppliedBiosystems(ABT)476A蛋白質(zhì)測序儀上進行N-末端測序，采用液相TFA輸送進行裂解，并用聯(lián)機HPLC鑒定PTH-氨基酸。按照生產(chǎn)商的說明使用StandardFastCycle和Pre-MixBufferSystem.按下述方法用糖苷酶進行脫糖基化將3μg蛋白質(zhì)和3.6單位的糖苷酶在含0.25MNaAc，pH5，20mMEDTA，0.05％2-巰基乙醇的溶液中在37℃下保溫18小時，分別將卵清蛋白和牛血清白蛋白用作正、負對照，并通過SDS-PAGE測遷移率。用購自HewlettPackand的AminoQuant1090HPLC系統(tǒng)進行氨基酸分析，以測定消光系數(shù)。用MDS-2000hydrolysis-station(CEM，Matthews，NC)對凍干的樣品進行由微波促進的蒸汽相水解。以含有1％苯酚的6NHCl作為清除劑，將其用于產(chǎn)生酸蒸汽。在70psi(約148℃)壓力下，水解時間為20分鐘。將水解過的樣品凍干，并再溶解于20μl500pmol/μl肌氨酸和正纈氨酸溶液中，并把這兩種氨基酸作為內(nèi)標。按照生產(chǎn)商的說明注射1μl樣品，并進行分析。B、結(jié)果和討論1、純化前面進行過特征分析的P.pinsitus漆酶的PI值大約為3.5。不過，在以pH7.7預平衡過的Q-Sepharose的流通部分中，檢測到顯著的漆酶活性。在進行梯度洗脫時，在原先預計的活性部分之前，一個更有活性的部分被從柱上洗脫。UV-可見光譜和SDS-PAGE分析表明，3個部分都是主要含有漆酶。經(jīng)凝膠過濾進一步提純之后，在天然未變性條件下檢測兩個新部分的不同pI值，發(fā)現(xiàn)與洗脫順序一致。2、特征分析從Q-Sepharose洗脫液中產(chǎn)生的純漆酶制劑，在SDS-PAGE上，在大約63kDa處有一條相當完美的帶。根據(jù)在SDS-PAGE上遷移率的變化，脫糖基化檢測到約14％(w/w)的碳水化合物。在進行天然-IEF分析時，上述漆酶制劑具有pI6～6.5、5～6.5和3.5的幾條帶。ABTS-瓊脂糖重疊試驗表明，所有的帶都有活性。在IEF條件下，每一種形式又表現(xiàn)出多種同工型。中性和酸性形式在605和275nm處有典型的UV-可見光譜。A275/A605之比為30～40。酸-中性型在276nm處有一個峰，而在600nm左右有一個峰肩。N-末端序列分析表明，中性型中-酸性型的前29個殘基相同(表1)。酸型的N-末端與先前分析過的特征型100％的相符。三種型都能與用先前的特征型制備出的抗體進行相當好的交叉反應性。表1P.pinsitus漆酶的結(jié)構(gòu)和酶解特性型N-末端LACUΔA405min-1(ABTS)酸性GIGPVADLTITNAAVSPDGFSRQAVVVNG924000酸性A*****(*)*VVA**P******L*D*I****754000中性中性A*****(*)*VVA**P******L*D*I****321000*與酸性型比較為相同殘基()弱信號3、漆酶活性通過ABTS和丁香醛連氮氧化作用試驗3種型的比活性(每A275)。3種型的pH活性曲線的形狀和最佳值非常相近在進行ABTS和丁香醛連氮氧化時，均分別在pH≤4和pH5～5.5處最佳。IV.多拷貝P.pinsitus漆酶和基因的分離A、材料和方法1、菌株將下列菌株用在以下所述方法中E.coliK802(el4-(mrca)，mcrB，hsdR2，galK2，galT22，supE44，metB1；Clonetech)；E.coliXL-1Blue(recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Lac〔F′proAB，lacIqZDM15，Tn10(tetr)〕；Stratagene)和P.pinsitusCBS678.70。2.基因組DNA分離讓P.pinsitus培養(yǎng)物在500mlYG(0.5％酵母提取物，2％葡萄糖)中，在室溫下生長3-4天。通過米拉布(miracloth)收集菌絲體，用TE洗兩遍，并在液氮中快速冷凍。將冷凍的菌絲體放在-80℃下保存。為了分離DNA，用電動咖啡磨把菌絲體磨成細末。將粉末狀菌絲體再懸浮于TE中，使終體積為22ml。加入4ml20％SDS，并通過倒位混合，然后在室溫下保溫10分鐘。用苯酚/氯仿溫和提取所得樣品，并離心分離水相和有機相。收集水相，加入400μl蛋白酶A(10mg/ml儲液)。將樣品在37℃下保溫30分鐘，然后用苯酚/氯仿抽提。往水相里加入0.1體積3MNaAc，pH5.2和2.5體積的95％乙醇，并在-20℃下冷凍1小時。離心沉淀DNA后，將沉淀物再懸浮于6mlTE中，加入200μl煮沸的RNaseA(10mg/ml儲液)。在37℃下保溫之后，加入100μl蛋白酶A(10mg/ml儲液)，隨后在37℃下保溫30分鐘。用苯酚/氯仿將該樣品抽提2次。向水相中加入0.1體積的3MNaAc和2.5體積95％的乙醇，并將樣品在-20℃下冷凍1小時。離心以后，將沉淀輕輕地懸浮在400μlTE中，并加入40μlNaAc和1ml95％乙醇。離心使DNA沉淀，并用70％乙醇洗滌沉淀。將最終的沉淀再懸浮于250μlTE中。3、RNA制備從菌絲體中提取RNA，菌絲體是從P.pinsitus培養(yǎng)物中獲得，培養(yǎng)物通過加入2，5-二甲代苯胺的方式誘導過漆酶的表達，或未誘導過。洗滌菌絲體，并在液氮中快速冷凍。用一臺電動咖啡磨把冷凍的菌絲體磨成細末。馬上把菌絲體末懸浮于20ml抽提緩沖液(0.2MTris-HCl，0.25MNaCl，50mMEGTA，0.8％萘磺酸三-異丙酯，4.8％對-氨基水楊酸pH8.5)中。所有用于提取RNA的溶液都是用由焦碳酸二乙酯(DEP)處理過的水配制的。將樣品放置在冰上，并加入0.5體積TE飽和的苯酚/氯仿。倒位2分鐘充分混合樣品，并通過離心進行相分離。保留水相，用2ml抽提緩沖液抽提有機相兩次，并在68℃下保溫5分鐘。離心進行相分離，爾后收集水相，并用苯酚/氯仿抽提幾次，直至界面上不再有任何蛋白質(zhì)。向水相中加入0.1體積的3MNaAc，pH5.2和2.5體積的95％乙醇，使RNA沉淀，并把樣品放在-20℃下冷凍2小時。沉淀RNA，并再懸浮于含有RNase抑制劑的DEP水中。4、DNA序列分析核苷酸序列是這樣測定的利用TAQ聚合酶循環(huán)測序法，用熒光標記的核苷酸進行測序，而且，反應是在一臺AppliedBiosystems自動DNA測序儀(Model363A，Version1.2.0)上電泳進行。5、制備基因組文庫構(gòu)建2個大小選擇的P.pinsitus基因組文庫。一個5～6kbBamHI片段的文庫建在pBlueseript+上。用BamHI消化基因組DNA，并在制備瓊脂糖(IBI)凝膠上對消化產(chǎn)物進行電泳。將帶有5-6BamHI片段的部分從電泳凝膠上切下來。用Geneclean試劑盒(BIO101)從凝膠中分離DNA。將得到的DNA連接到預先用BamHI消化過的pBluescript質(zhì)粒上，并用BAP(GIBCOBRL)脫磷酸化，用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliXL-1Blue感受態(tài)細胞(Stratagene)，得到12,000個白色菌落。一個7-8kb的BamHI/EcoRI片段的文庫建在pUC118上。用BamHI和EcoRI消化10μg基因組DNA，并用BAP(GIBCOBRL)進行處理。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliXL-1Blue細胞(Stratagene)，所得文庫中含有大約8000個轉(zhuǎn)化體。為了在λEMBL4上構(gòu)建總基因組文庫，用Sau3A對P.pinsitus基因組DNA進行部分消化。消化以后，在制備低熔點瓊脂糖凝膠上對DNA進行電泳，并把含有9～23kb大小的DNA的帶從凝膠上切下來。用瓊脂糖(NeWEnglandBiolabs)從凝膠中提取DNA。按照供應商的說明分離EMBL4臂(Clonetech)。用GigapackII試劑盒(Stratagene)在體外包裝連接產(chǎn)物。用E.coliK802細胞滴定所建的文庫。估計未擴增的文庫中具有35,000個獨立的重組體。用E.coliK802細胞擴增該文庫。6、Southern和Northern吸印在瓊脂糖凝膠上，在TAE緩沖液中使用標準方法對DNA樣品進行電泳。RNA樣在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳。通過在堿性條件下的毛細作用或一個真空印跡裝置把DNA和RNA凝膠轉(zhuǎn)移到Zeta-Probe膜(BIO-RAD)上。轉(zhuǎn)移之后，對DNA凝膠進行UV交聯(lián)。在65℃下對轉(zhuǎn)移的印跡進行預雜交，預雜交在1.5XSSPE，1％SDS，0.5％脫脂奶粉和200μg/ml鮭精DNA的溶液中進行1小時。將放射性探針直接加入預雜交溶液里，在65℃下繼續(xù)進行雜交過夜。在65℃下用2XSSC洗滌印跡5分鐘，再在65℃下用0.2XSSC，1％SDS，0.1％焦磷酸鈉洗滌30分鐘，兩次。放射性標記的探針是用α-32P-dCTD和一種切口平移試劑盒(GIBCO-BRL)制備的。7、文庫篩選為了篩選大小選擇的5-6kbBamHI和7-8kbBamHI/EcoRI文庫，將LBcarb平皿上的大約500個菌落轉(zhuǎn)移到HybondN+濾膜(Amersham)上，采用的是標準方法。在中和以后，對上述濾膜進行UV交聯(lián)。在65℃下對該濾膜進行預雜交，預雜交在1.5XSSPE，1％SDS，0.5％脫脂奶粉，200μg/ml鮭精DNA中進行1小時。將切口平移探針直接加進預雜交溶液時，在65℃下進行雜交過夜。為了篩選EMBL里的基因組文庫，將擴增文庫的適當稀釋液與E.coliK802細胞一起在100mMNZY頂層瓊脂糖上進行平皿培養(yǎng)。用標準方法把菌斑轉(zhuǎn)移到HybondN+膜(Amersham)上。用標準的UV交聯(lián)法把DNA交聯(lián)在上述膜上。用與上文相同的條件對該膜進行預雜交和雜交。結(jié)果和討論1、多拷貝漆酶基因的分離為了進行Southern分析，用幾種不同的限制酶消化P.pinsitus基因組DNA。用由α-32P-dCTP標記過的cDNA插入片段(從PYES載體上分離的BamHI/SphI片段)檢測印跡。按上文所述方法對印跡進行雜交和洗滌。cDNA能與大多數(shù)酶的幾種限制片段雜交，這意味著在該基因組中有多個漆酶基因。因為cDNA可與一個約5.5kb的BamHI片段雜交，所以構(gòu)建了一個來自P.pinsitus的5-6kbBamHI片段的文庫。2、基因組文庫的篩選篩選基因組文庫的結(jié)果歸納在表2中。用由32P標記過的原始cDNA克隆篩選5-6kb的BamHI大小選擇文庫。通過在65℃下雜交篩選到大約30,000個克隆。從兩個陽性克隆中分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI消化，以檢測插入片段的大小。這兩個克隆都帶有大約5.5kb的BamHI插入片段。從兩端對克隆的插入片段(LCC3)進行測序；該序列與所述cDNA有同源性，但很顯然不是該cDNA所編碼的漆酶。LCC3的部分序列還表明，LCC3pUC118克隆不具有完整的基因。通過對BamHI/EcoRI雙消化的DNA進行的Southern印跡分析表明，該cDNA能同一個大約7.7kb的片段雜交。在pUC118上構(gòu)建的一個大小選擇的文庫帶有7-8的BamHI/EcoRI片段?？偣搏@得大約8000個獨立的克隆，并用由32P標記的插入片段進行雜交。從陽性菌落中分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI和EcoRI進行消化。對質(zhì)粒進行的限制分析表明，可將其分成兩類。一類(LCC4)帶有四個相同的克隆，并有一個能與所述cDNA雜交的約7.7kb的BamHI/EcoRI插入片段。另一類(LCC1)帶有兩個相同的克隆，并有一個能與所述cDNA雜交的約7.2kb的插入片段。對克隆LCC1和LCC4進行的部分DNA序列分析表明，克隆21是原始cDNA的基因組克隆，而LCC4編碼另一種漆酶。LCC1的部分DNA序列顯示，pUC118克隆不具有完整的基因，而且，需要在EcoRI位點上游的一個片段。同時，構(gòu)建了大小選擇的7-8kbBamHI/EcoRI文庫，在EMBL4上構(gòu)建的P.pinisitus基因組文庫帶有大約35,000個獨立的重組噬菌體。挑選陽性噬菌斑，并進行純化。從純化的噬菌體裂解物中提取DNA。對EMBLDNAs的限制消化證實，有三類克隆。第一類(11GEN)由兩個同胞構(gòu)成，其插入片段帶有大小與LCC1相同的BamHI/EcoRI片段，它能與LCCI插入片段雜交。另一類(12GEN)帶有一個克隆，它具有不同于11GEN類型的限制圖譜，而且，其插入片段帶有一個約5.7kb的BamHI/EcoRI片段。第三類由一個單一克隆形成，其插入片段帶有一個大約3.2kb的BamHI/EcoRI片段，它能與LCC1插入片段雜交。DNA序列分析證實，克隆11GEN帶有LCC1BamHI/EcoRI片段和5′與3′側(cè)翼區(qū)。還證實克隆12GEN帶有一部分LCC1插入片段。為了克隆完整基因，還用LCC3BamHI插入片段篩選P.pinisitusEMBL基因組文庫。平皿培養(yǎng)大約30,000個噬菌斑并轉(zhuǎn)移用于進行雜交。鑒定并提純5個能與LCC3(BamHI/EcoRI)插入片段雜交的噬菌斑。從純化的噬菌體儲液中提取DNA。對P.pinisitus基因組DNA所做的Southern分析表明，LCC3BamHI插入片段能與一個大約7kb的EcoRI片段雜交。限制消化和Southern分析表明，上述克隆中有4個帶有能與EcoRI/BamHI(1.6kb)片段雜交的片段，而且，這些克隆分成3種類型。第一類由一個單一的克隆(LCC5)構(gòu)成，其插入片段帶有一個能與LCC3BamHI/EcoRI片段雜交的3kb的EcoRI片段。另一類是由克隆(LCC2)構(gòu)成，其插入片段帶有一個能與LCC3BamHI/EcoRI插入片段雜交的大約11kb的EcoRI片段。第三類由兩個克隆構(gòu)成，這兩個克隆不同，但帶有很多相同的限制片段，這兩個克隆都帶有能與LCC3插入片段雜交的大約7.5kb的EcoRI片段。對第三種類型進行進一步分析還表明，它們與克隆LCC4相同。對LCC5和LCC2所進行的部分DNA序列分析證實，這兩個克隆都編碼漆酶；但它們都不與上面提到的任何漆酶基因(LCC1、LCC3或LCC4)相同。就此而言，克隆了5個不同的漆酶基因；不過，由LCC5和LCC2亞克隆的片段上不具有完整基因。通過對來自克隆LCC5的3kbEcoRI片段進行的DNA序列分析證實，N-末端的大約200bp的片段在E.coRI位點的上游。將一個來自LCC5的380bp的EcoRI/MluI片段用于鑒定一個Mlu1片段的亞克隆，該片段來自LCC5EMBL克隆。對來自LCC5EMBL克隆的一個約4.5kb的MluI片段進行亞克隆，以便進行序列分析，證實其帶有N-末端序列。為了克隆半個LCC3漆酶基因的N-末端，用一個來自LCC3pUC118克隆的約750bp的BamHI/StuI限制片段檢測P.pinsitusEMBE基因組文庫。對大約25,000個噬菌斑進行篩選，有5個能與上述探針雜交。在進行進一步的提純時，這些克隆中僅有3個仍為陽性。其中，有兩個克隆產(chǎn)生極強的信號，而對從這些噬菌體中分離出的DNA所做的限制消化表明，在這兩個克隆的插入片段上都有一個約750bp的BamHI/StuI片段，而且，這兩個克隆不相同，但重疊。根據(jù)Southern分析的結(jié)果，對來自這些克隆的一個約8.5kb的片段進行亞克隆，以便作序列分析。證實EcoRI片段帶有完整的基因。為了克隆半個LCC2漆酶基因的N-末端，用一個來自EMBLLCC2克隆的約680bp的EcoRI/PvuI片段檢測建在EMBL4上的P.pinsitus基因組文庫。通過在65℃下雜交對30,000個噬菌斑進行篩選，有15個噬菌斑能與上述探針雜交。對所有15個噬菌斑進行純化，并提取DNA。根據(jù)限制圖譜，可將這些克隆分成4種類型，這些克隆中的7個均為同胞，并且與LCC2的原始EMBL克隆相同。第二種類型由3個同胞克隆構(gòu)成。對來自這一類型的一個約4kb的HindIII片段進行亞克隆，以便進行序列分析，證實其帶有半個LCC2的N-末端。第三種類型由一個單一的克隆構(gòu)成，不再對其作進一步特征分析。3、DNA序列分析按照在材料和方法部分所述的方法，測定5個基因組克隆的全DNA序列。對克隆LCC2的序列分析表明，它可能編碼從培養(yǎng)液中提取的第二種形式的漆酶(中性pI)，所述培養(yǎng)液來自按上述方法誘導過的P.pinsitus培養(yǎng)物。對所述中性pI漆酶的N-末端蛋白質(zhì)序列和預測的由LCC2編碼的蛋白質(zhì)的N-末端進行比較，發(fā)現(xiàn)它們相同。由克隆LCC2所編碼的蛋白質(zhì)的預測pI為5.95，它與測定的所述第二種形式的漆酶的實驗pI(5.0～6.5)恰好吻合。圖1-5(SEQIDNOS.1-5)表示DNA序列和基因組克隆的預測翻譯產(chǎn)物。對于LCC1來說，其成熟蛋白質(zhì)的N-末端通過蛋白質(zhì)測序和根據(jù)VonHeijne規(guī)則預測在位置22上是Gly。所述N-末端為Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。對于LCC2來說，通過蛋白質(zhì)測序測定在其成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸的位置21上是Ala。所述N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。對于LCC3來說，預計其成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸在位置22上是Ser，其N-末端為Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Glu-Leu-。對于LCC4來說，預計其N-末端氨基酸在位置23上是Ala，N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-。對于LCC5來說，預計其N-末端氨基酸在位置24上是Ala，N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp。將所述基因的結(jié)構(gòu)組織和預測的由這些基因編碼的蛋白質(zhì)在表1中列出進行比較。可以看出，所列出的5個基因具有不同的結(jié)構(gòu)，并編碼大小稍有差別的蛋白質(zhì)。還對預測的基因組克隆的蛋白質(zhì)和其它真菌漆酶進行了比較。在表2中列表對預測的漆酶相互進行了比較，并與其它真菌漆酶進行了比較?？寺CC1(最先作過特征分析的誘導漆酶)與Coriolushirsutus漆酶和PM1擔子菌漆酶(Coll等，Supra)之間的同一性最大(90％)。其它四種漆酶與C.hirsutus漆酶之間的同一性在64～80％之間。由LCC3編碼的漆酶與LCC1漆酶和表2中其它真菌漆酶的同一性最低。LCC2是按上述方法分離的另一種野生型漆酶；根據(jù)所分離克隆的N-末端序列還可以看出，“中性”和“酸中性”野生型漆酶是由LCC2序列編碼的同一種酶。表1P.pinsitus基因組克隆的結(jié)構(gòu)組織與預測的蛋白質(zhì)的比較基因#內(nèi)含子預計蛋白前體的大小預計成熟蛋白的大小預計的等電點21GEN85204994.4923GEN105194985.9524GEN125164955.2331GEN115104884.0641GEN115275044.07表2P.pinsitus漆酶與其它真菌漆酶的氨基酸同一性比較21GEN23GEN24GEN31GEN41GENCRIPHACRIPHEPBILACPM121GEN--79％64％70％72％90％91％64％80％23GEN79％--65％66％69％80％81％62％74％24GEN64％65％--61％65％64％65％61％63％31GEN70％66％61％--75％69％70％64％69％41GEN72％69％65％75％--71％72％64％71％CRIPHA90％80％64％69％71％--99％64％80％CRIPHE91％81％65％70％72％99％--65％81％PBILAC64％62％61％64％64％64％65％--65％PMI80％74％63％69％71％80％81％65％--21GEN，23GEN，24GEN，31GEN和41GEN＝P.pinsiti.s漆酶克隆CRIPHA＝Coriolushirsutis漆酶ACRIPHE＝C.hirsutis漆酶BPBILAC＝Phlebiaradiata漆酶PM1＝擔子菌PM1漆酶(CECT2971)5、Northern印跡分析從菌絲體中提取RNA，菌絲體來自二甲代苯胺誘導過的培養(yǎng)物和未誘導過的培養(yǎng)物。電泳以后把RNA吸印到膜上，并用所述cDNA插入片段或一個帶有約100bp的23GEN啟動子和其編碼區(qū)的前100個bp的小片段檢測所得印跡。一個大約1.8kb的轉(zhuǎn)錄物能同時與誘導的和非誘導的RNA樣品雜交；不過，該信息的轉(zhuǎn)錄，明顯會被向培養(yǎng)物中添加二甲代苯胺所誘導。III.P.pinsitus漆酶在曲霉屬中的表達材料和方法1、菌株米曲霉A1560、米曲霉HowB104(fungamyl缺陷型，Pyrg)、米曲霉HowB101Pyrg、黑曲霉Bo-1、黑曲霉B0-80、黑曲霉ATCC1040、黑曲霉NRRL337、黑曲霉NRRL326、黑曲霉NRRL2295、黑曲霉ATCC11358、黑曲霉NRRL322、黑曲霉AT10864、日本曲霉(A.japonicus)A1438、紅曲霉(A.phoenicis)、臭曲霉(A.foetidus)N953。2、培養(yǎng)基用MY50培養(yǎng)基(每1升中含50g麥芽糖糊精，2gMgSO4·H2O、10gKH2PO4、2gK2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、2g尿素、pH6.0)對黑曲霉、臭曲霉和紅曲霉進行搖瓶培養(yǎng)。用MY51(每1升中含30g麥芽糖糊精、2mgMgSO4、10gKH2PO4、2gK2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、1g尿素、2g(NH4)2SO4、pH6.0)對米曲霉A1560和HowB101菌株進行搖瓶培養(yǎng)。為了對米曲霉HoWB104菌株進行搖瓶分析，使用MY51麥芽糖培養(yǎng)基(與MY51相同，但含有50g麥芽糖而不是麥芽糖糊精)。為了對日本曲霉菌株進行搖瓶分析，使用M400培養(yǎng)基(每1升中含50g麥芽糖糊精、2gMgSO4、2gKH2PO4、4g檸檬酸、8g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、2g尿素、pH6.0)。將用于形成原生質(zhì)體和接下來的轉(zhuǎn)化的生長過夜的培養(yǎng)物生長在YEG(0.5％酵母提取物、2％葡萄糖)上。對于pyrg菌株來說，補充尿苷，使其終濃度為10mM。3、篩選漆酶產(chǎn)生首先，在基本培養(yǎng)基平皿上篩選一級轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)基中含有1％葡萄糖，作為碳源，并含有1mMABTS，用于檢驗漆酶的產(chǎn)生。挑出能在平皿上產(chǎn)生綠色部分的轉(zhuǎn)化體，并在進行搖瓶分析之前進行孢子純化。對搖瓶培養(yǎng)樣品進行離心，以澄清培養(yǎng)液。用ABTS對稀釋或未稀釋過的培養(yǎng)液樣品進行分析。結(jié)果和討論1、在搖瓶中表達構(gòu)建的第一個表達載體是pDSY1，它帶有TAKA啟動子、TAKA信號序列、P.pinsitus漆酶cDNA，在成熟N-末端的起始部分和AMG終止子。TAKA信號序列漆酶插入片段是分兩步構(gòu)建的。首先通過定點誘變，改變一個堿基，在漆酶成熟編碼區(qū)的bp107處開始產(chǎn)生一個AgeI位點，并在該漆酶終止子下游約120bp處產(chǎn)生一個NsiI位點(改變分別為ACGGGT→ACCGGT和TTCGCT→ATGCAT)。對漆酶上從SfiI位點開始并在107bp處的AgeI位點結(jié)束的一個小PCR片段進行PCR擴增。該片段帶有一段TAKA信號序列，以及成熟漆酶cDNA的前面的約107bp。對該片段進行的進一步DNA序列分析表明，它發(fā)生了單一的堿基改變，這種堿基變化導致在成熟漆酶的位置9上Asn取代Thr。這種取代產(chǎn)生出一個潛在的N-連接糖基化位點。將該PCR片段和AgeI/NsiI片段克隆到用SfiI/NsiI消化過的pMWR1(圖6)上。載體pMR1帶有TAKA啟動子，一部分TAKA信號序列(它在一個SfiI位點結(jié)束)，以及TAKA終止子，一個NsiI位點直接插在該終止子的5′末端。將所得到的表達載體(圖7)用于共轉(zhuǎn)化幾個宿主。用于曲霉屬菌株共轉(zhuǎn)化的方法如Christensen等(Supra)所述。在第二個漆酶表達載體上，在DSY1上所發(fā)生的導致氨基酸位置9上Asn取代Thr的堿基變化，在PCR反應中又恢復到野生型。除了上述單一堿基變化之外，第二個表達載體pDSY2與pDSY1相同。用pDSY2和帶有構(gòu)巢曲霉amdS基因的pTO90(WO91/17243)或帶有米曲霉PyrG基因的pSO2一起對3種不同的米曲霉菌株和幾個黑曲霉菌株進行共轉(zhuǎn)化。在用DSY1和DSY2試驗過的所有宿主中都觀察到漆酶的表達。產(chǎn)率范圍為0.1～12.0Δabs/分鐘/ml，在黑曲霉菌株中觀察到最高產(chǎn)率。構(gòu)建一個pDSY10結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有TAKA啟動子，漆酶全長cDNA，包括其信號序列及AMG終止子。以lac1為模板對一個200bp的BamHI/AgeI片段進行擴增，該片段在緊鄰起始密碼子ATG的5′末端處有一個BamHI位點，而在與pDSY1上相同的位置上有一個AgeI位點。以pDSY2為模板對一個MluI/HindIII片段進行PCR擴增，從在cDNA上的MluI位點開始，至漆酶終止密碼子3′末端處的一個HindII位點處結(jié)束。將上述兩個片段與來自pDSY2的AgeI/MluI片段連接在pHD414上，得到pDSY10(圖8)。用于漆酶表達的載體pHD414是質(zhì)粒p775(EP238023)的衍生物。與所述質(zhì)粒相反，pHD414在TAKA啟動子和AMG終止子之間有一串相同的限制位點。該質(zhì)粒是這樣構(gòu)建的在終止子的3′末端去掉一段大約200bp長的片段(帶有不需要的RE位點)，隨后再除去啟動子5′末端的一個大約250bp長的片段(也帶有不需要的位點)。所述200bp的片段是通過用NarI(作用位點在pUC載體部分)和XbaI(就在終止子的3′末端)裂解而被除去的，隨后用克列諾(Klenow)DNA聚合酶+dNTP補充所產(chǎn)生的末端，在凝膠上純化該載體片段，并重新連接該載體片段。所得質(zhì)粒被稱為pHD413。用StuI(作用位點在啟動子的5′末端)和PvuII(作用位點在pUC載體上)裂解pHD413，在凝膠上分級分離，并進行重新連接，得到pHD414。以pToC90為選擇質(zhì)粒，對米曲霉HowB104和黑曲霉B0-1進行共轉(zhuǎn)化。在搖瓶培養(yǎng)中的產(chǎn)率與用pDSY2轉(zhuǎn)化時的產(chǎn)率相當。2、在發(fā)酵罐中表達將1ml黑曲霉轉(zhuǎn)化體Bo-1-pDSY10-4孢子懸浮液試樣(大約109個孢子/ml)在無菌條件下加入盛有100ml無菌搖瓶培養(yǎng)基(葡萄糖，75g/l；大豆粉，20g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，10g/l；K2SO4，2g/l；CaCl2·2H2O，0.5g/l；檸檬酸，2g/l；酵母提取物，10g/l；微量金屬元素〔ZnSO4·7H2O，14.3g/l；CuSO4·5H2O，2.5g/l；NiCl2·6H2O，0.5g/l；FeSO4·7H2O，13.8g/l；MnSO4·H2O，8.5g/l；檸檬酸3.0g/l〕，0.5ml/l；尿素，2g/l；用自來水配制，并在高壓滅菌之前把pH調(diào)至6.0)的500ml搖瓶中，并在37℃溫度下，在一臺以200rpm的速度轉(zhuǎn)動的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)18小時。在無菌條件下把50ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個盛有1.8升發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽糖糊精MD01300g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，2g/l；檸檬酸，2g/l；K2SO4，2.7g/l；CaCl2·2H2O，2g/l；微量金屬元素，0.5ml/l；pluronic消泡劑，1ml/l；用自來水配制，并在高壓滅菌之前把pH調(diào)至6.0)的體積為3升的發(fā)酵罐中。通過使冷卻水在發(fā)酵罐夾套中循環(huán)，把發(fā)酵罐溫度維持在34℃。以1.8升/分鐘(1v/v/m)的速度將無菌空氣通入發(fā)酵罐中。在接種后的前24小時把攪拌速度維持在800rpm，而在其后的發(fā)酵時間里以1300rpm的速度攪拌。通過自動添加5NNaOH或H3PO4把發(fā)酵的pH維持在4.0。用一臺蠕動泵把消毒的進料(尿素50g/l；pluronic消泡劑1.5ml/l；用蒸餾水配制并高壓滅菌)加入發(fā)酵罐中。發(fā)酵期間的供料速度設計如下在接種之前先加入40g進料；接種之后，以2.5g/升小時的恒速供料。用水或合適的緩沖液把銅配制成400X儲液，過濾消毒并在無菌條件下加入罐中，使最終濃度為0.5mM。取出用于進行酶活性測定的樣品，并通過米拉布(Miracloth)過濾，以除去菌絲體。通過LACU試驗分析這些樣品的漆酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程的進行，漆酶活性連續(xù)升高，190小時之后獲得大約55LACU/ml的活性值。這相當于有大約350mg/l的重組漆酶表達。IV.重組漆酶的提純材料和方法1、材料用作緩沖液和底物的化合物，是起碼為試劑級別的商品化產(chǎn)品。Endo/N-糖苷酶G購自Boehringer-Mannheim公司。層析是在一個Pharmacia′sFPLC或一個常規(guī)的開放柱低壓系統(tǒng)上進行。在一臺ShimadzuPC160分光光度計上進行分光分析。2、提純(a)DSY2按照上述方法用紗布過濾米曲霉pDSY2轉(zhuǎn)化體，得到2.8升濾液(pH7，19mS)。所得濾液在0.45μ的Corning濾器上過濾，并在使用S1Y30膜的SpiralConcentrator(Amicon)上濃縮至200ml體積。將濃縮液調(diào)至pH7.5，用4.8升水稀釋至1.2mS，并在S1Y30上濃縮至200ml體積。將50ml的上述溶液加注到一個Q-Sepharose柱(XK16，34ml凝膠)上，該柱用10mMTris(pH7.5，0.7mS)(緩沖液A)預平衡過。在用一種線性梯度的緩沖液B(緩沖液A+0.5MNaCl)洗脫加樣期間緩慢地移動的藍色的漆酶帶。將24ml所收集的漆酶部分在Centricon-100(Amicon)上濃縮至4.5ml，并上一個Superdex200柱(Hiload16/10，120ml凝膠)。在用緩沖液C(緩沖液A+0.15MNaCl，14.4mS)洗脫時，在藍色漆酶洗脫物部分之后為棕色混雜部分。只有洗脫帶的前半部(通過Abs600檢測)表現(xiàn)出較高的漆酶與混雜物之比，收集這部分洗脫液。將所收集的部分在10mMBis-Tris(pH6.8，0.6mS)(緩沖液D)中透析，上一個用緩沖液D平衡過的Mono-Q柱(Mono-Q5/5，1ml)，并用一種線性梯度的緩沖液E(緩沖液D+0.5MNaCl)進行洗脫。通過SDS-PAGE判斷得知，由27％左右的緩沖液E洗脫的漆酶部分是純的。在每一步都對漆酶部分進行常規(guī)ABTS氧化作用、SDS-PAGE和Western印跡檢測。(b)DSY10用紗布過濾HowB104-pDSY10，得到2.8升濾液(pH7.3，24mS)。用Whatman#2濾紙過濾上述濾液，并在帶有S1Y100膜的SpiralConcentrator(Amicon)上濃縮至210ml。用水稀釋上述濃縮液，使其達到1.2mS，在S1Y100上濃縮至328ml。將所得液體上Q-Sepharose柱(XK26，120ml凝膠)，該柱用10mMTris(pH7.5，0.7mS)(緩沖液A)預平衡過。用一種線性梯度的緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)洗脫加樣期間緩慢移動的藍色漆酶帶。用水稀釋所收集的120ml漆酶部分，使其達到1.1mS，并在SIY100上濃縮至294ml，再上一個用緩沖液A預平衡過的Mono-Q柱(Hiload16/10，40ml凝膠)。在上樣和用緩沖液A液脫期間，漆酶緩慢地從柱中通過。將所收集的pH讀數(shù)為5.6的部分上一個用緩沖液C(10mMMES，pH5.5，0.1mS)預平衡過的Mono-Q柱。漆酶部分被一種梯度很小的緩沖液D(緩沖液C+1MNaCl)所洗脫。按上述方法進行酶促試驗。3、蛋白質(zhì)分析按上述方法進行全氨基酸分析、N-末端序列分析、脫糖基化分析、SDS-PAGE、IEF和Western印跡分析。B、結(jié)果和討論1、提純和特征分析對于DSY10來說，獲得了256倍的純化液和37％的產(chǎn)率，而對于DSY2來說，獲得了246倍的純化液和14％的產(chǎn)率。就電泳特征、光譜特征和活性而言，純化的DSY2和DSY10沒有區(qū)別。在凝膠過濾時，純化的重組漆酶表現(xiàn)為一種雙體，而且，其亞單位分子量稍大于野生型漆酶的分子量，這表明在米曲霉中發(fā)生的翻譯后加工導致在重組體上發(fā)生額外的糖基化作用。脫糖基化作用已證實了由額外糖所產(chǎn)生的質(zhì)量差異(表3)。表3重組和野生型添酶的分子量和光譜特征MW，kDa碳水化合物pIλmax，nm(ε，1/g*cm)天然分子亞單位w/w％野生型～130～63～73.5275(1.8)615(0.12)重組型～130～67～133.5275(1.7)615(0.11)提純的酶的光譜在615nm和275nm處有最大光吸收值，275nm的光吸收值與615nm的光吸收值之比為16，這表明，每個亞單位上有一個I型Cu。330nm的光吸收值與615nm的吸光值之比為1.0，接近Rhusvernicefera漆酶的0.75的比值，暗示每個亞單位上存在一個II型和兩個III型銅離子。通過氨基酸分析測得的消光系數(shù)為1.71/(g*cm)。3、活性通過丁香醛連氮和ABTS氧化作用測定漆酶活性。每一A275單位表示漆酶的LACU值為83。每一mg單位表示其LACU值為141。圖9中示出了所述漆酶的pH曲線。V、將多孔菌屬漆酶用于染發(fā)在多種染料前體(在下面列出)上試驗Polyporuspinsitus漆酶的染色效果，并與3％H2O2的染色效果進行比較。并進一步試驗其在0.1％對苯二胺上的染色效果，與多種改性劑進行比較。材料染料前體用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對-苯二胺，pH7.0(pPD)。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對-甲代苯二胺，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％氯-對-苯二胺，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對-氨基苯酚，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％鄰-氨基苯酚，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％3，4-二氨基甲苯，pH7.0。改性劑用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％間苯二胺，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％2，4-二氨基茴香醚，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％α-萘酚，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％氫醌，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％鄰苯二酚，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％間苯二酚，pH7.0。用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％4-氯代間苯二酚，pH7.0。當使用改性劑時，將染料前體對苯二胺與上述改性劑中的一種混合使用，使染液中前體的濃度為0.1％，改性劑的濃度也為0.1％。所用的酶是濃度為10LACU/ml的來自P.pinisitus的重組漆酶。用于該方法中的其它溶液有3％H2O(在最終染液中的濃度)，以及一種市售香波。在一臺DatacolerTextflash2000(CIE-Lab)上，采用CIE-Lab參數(shù)L*(“0”＝黑，“100”＝白)和a*(“-”＝綠，“+”＝紅)測定發(fā)束的定量化顏色。DL*和Da*分別表示一種樣品與未處理過毛發(fā)的L*和a*進行比較時的L*和a*的Δ值。在日光燈(D65)下以1000LUX的強度測定耐曬性。使用一束金黃色歐洲人的頭發(fā)(1g)。在一臺Whirley攪拌器上將4ml染料前體溶液(包括改性劑)與1ml漆酶或1mlH2O2混合，將其涂在上述發(fā)束上，并在30℃下保持60分鐘。然后用流動水漂洗染過的發(fā)束，梳理并風干。染色作用試驗的結(jié)果在下面的表4-6以及圖10-12中列出。表4</tables>L*0＝黑100＝白a*-＝綠+＝紅表5</tables>L*0＝黑100＝白a*-＝綠+＝紅表6</tables>L*0＝黑100＝白a*-＝綠+＝紅按上述方法進行氧化染發(fā)，所不同的是，使用50LACU/ml的P.pinsitus漆酶。為了試驗耐洗性，將所染過的發(fā)束弄濕，并用50μl市售香波洗15秒鐘，再用水漂洗1分鐘。將該發(fā)束洗20遍。洗發(fā)試驗的結(jié)果如圖13所示。由圖13可以看出，當使用P.pinsitus漆酶進行氧化染色時，洗滌多達20遍后的頭發(fā)的耐洗性仍然良好。為了試驗耐曬性，使用歐洲人的金黃色頭發(fā)作試驗材料，對用P.pinsitus漆酶染過的頭發(fā)與用H2O2染過的頭發(fā)進行比較。將對苯二胺用作染料前體。按上述方法進行染發(fā)。將一個發(fā)束放置在黑暗中，而另一個發(fā)束放置在日光下(即在日光燈(D65)下，光照強度大約為1000LUX)長達275小時。在染發(fā)后馬上測定CIE-Lab值，并在暴露于日光期間進一步測定。試驗結(jié)果在圖14中給出。圖14顯示，以對苯二胺為染料前體用P.pinsitus漆酶染過的頭發(fā)與用H2O2染過的頭發(fā)的耐曬性相同。生物材料的保藏已按照布達佩斯條約規(guī)定，于1994年5月25日將下列生物材料交由AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter(1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604)保藏，并被賦予下列入藏號。保藏物入藏號帶有pDSY22(41GEN；約3.0kb的NRRLB-21263EcoRI插入片段)的E.coliDH5α帶有pDSY23(41GEN；約4.5kb的NRRLB-21268MluI插入片段；插入片段帶有pDSY22EcoRI片段的一小部分和EcoRI片段5′端的序列)的E.coliDH5α帶有pDSY21(31GEN；約7.7kb的NRRLB-21264EcoRI/BamHI插入片段)的E.coliXL-1Blue帶有pDSY18(21GEN；約8.0kb的NRRLB-21265BamHI插入片段)的E.coliXL-1Blue帶有pDSY19(23GEN；約4kb的HindNRRLB-21266III插入片段)的E.coliDH5α帶有pDSY20(24GEN；約8.5kb的NRRLB-21267EcoRI插入片段)的E.coliDH5α序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱NovoNordisk生物技術公司(B)街道1445Drew大街(C)城市Davis，California(D)國家美國(E)郵編(ZIP)95616-4880(F)電話(916)757-8100(G)傳真(916)758-0317(i)申請人(A)名稱NovoNordiskA/S(B)街道NovoAlle(C)城市Bagsvrd(D)國家丹麥(E)郵編(ZIP)DK-2880(F)電話+4544448888(G)傳真+4544493256(F)電傳37304(ii)發(fā)明名稱純化的多孔屬漆酶及編碼該酶的核酸(iii)序列數(shù)10(iv)相關地址(A)收件人NovoNordiskofNorthAmerica，Inc.(B)街道405LexingtonAvenue，Suite6400(C)城市和州NewYork，NewYork(D)國家U.S.A.(E)ZIP10174-6401(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎?B)申請日1995年6月15日(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/265,534(B)申請日1994年6月24日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Lowney，KarenA.(B)登記號31,274(C)文件/檔案號4185.204-WO(ix)電信信息(A)電話2128670123(B)傳真2128789655(2)序列1的信息(i)序列特征(A)長度2418bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)起源(A)生物Polyporuspinsitus(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置414..464(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置534..589(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置710..764(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置879..934(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1001..1050(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1147..1197(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1354..1410(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1609..1662(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置join(413..465，533..590，709..765，878..935，1000..1051，1146..1198，1353..1411，1608..1663)(xi)序列表述序列1AGATTTCTGACACCGGTGCAATCTTGACACTGTACCAACCGGGCAAGTCTCGTCCTTGGT60TCTCGGGGACTGGCGCCGGTCGCTACCCCTTGGTCATTCACTCTACCAGAGCGCTGGCTT120CGCCGAGGTATAAAGGATGTTGCGCGACACCCTCAACACCCCAACTCAAGCCCCACTTGA180GCTTTTGCGAGATCCTCCACATACCACTCACTACTTTCAAGTTCTTCAACAGTCGAGG239MetSerArg1TTTCACTCTCTTCTCGCTTTCGTCGTTGCTTCCCTTACGGCTGTGGCC287PheHisSerLeuLeuAlaPheValValAlaSerLeuThrAlaValAla51015CACGCTGGTATCGGTCCCGTCGCCGACCTAACCATCACCAACGCAGCG335HisAlaGlyIleGlyProValAlaAspLeuThrIleThrAsnAlaAla20253035GTCAGCCCCGACGGGTTTTCTCGCCAGGCCGTCGTCGTGAACGGCGGC383ValSerProAspGlyPheSerArgGlnAlaValValValAsnGlyGly354045ACCCCTGGCCCTCTCATCACGGGTAACATGGTTCGTCTCGGCTCGCACTA433ThrProGlyProLeuIleThrGlyAsnMet5055GGGGGTTGTATCGTTCCTGACGTTGTTGGAGGGGGATCGCTTCCAGCTCAATGTCATC491GlyAspArgPheGlnLeuAsnValIle6065GACAACCTTACCAACCACACGATGGTGAAGAGCACGAGTATTGTGAGCTGCT543AspAsnLeuThrAsnHisThrMetValLysSerThrSerIle7075ATTTCTCCGGACGGGGCTTCATTGTGCTAATAATCGTCGTGTGCAGCACTGGCACGGT601HisTrpHisGly80TTCTTCCAGAAGGGTACCAACTGGGCCGACGGTCCCGCCTTCATCAAC649PhePheGlnLysGlyThrAsnTrpAlaAspGlyProAlaPheIleAsn859095CAGTGCCCGATCTCATCTGGTCACTCGTTCCTGTACGACTTCCAGGTT697GlnCysProIleSerSerGlyHisSerPheLeuTyrAspPheGlnVal100105110115CCTGACCAGGCTGTAAGTACGGTCGTTATGGAGTATACTGCGCATTGCTAAA749ProAspGlnAlaCCACATGGTGAACAGGGTACCTTCTGGTATCACAGTCACTTGTCTACGCAG800GlyThrPheTrpTyrHisSerHisLeuSerThrGln120125130TACTGTGATGGTTTGAGGGGTCCGTTCGTTGTTTACGACCCGAATGAC848TyrCysAspGlyLeuArgGlyProPheValValTyrAspProAsnAsp135140145CCGGCCGCCGACCTGTACGACGTCGACAACGTAAGGACGAATTCGAACCG898ProAlaAlaAspLeuTyrAspValAspAsn150155TAAATACTTGCTTACTGATACTTCTCGATGAATTAGGACGACACTGTCATT949AspAspThrValIle160ACCCTTGTGGATTGGTACCACGTCGCCGCGAAGCTGGGCCCCGCATTC997ThrLeuValAspTrpTyrHisValAlaAlaLysLeuGlyProAlaPhe165170175CCTGTAAGTCCATGAGTATTCTGCTGTTGAATCTGTCTTAACTGTGCATATCACTC1053ProLeu180GGCGCCGACGCCACCCTCATCAACGGTAAGGGACGCTCCCCCAGCACG1101GlyAlaAspAlaThrLeuIleAsnGlyLysGlyArgSerProSerThr185190195ACCACCGCGGACCTCTCAGTTATCAGCGTCACCCCGGGTAAACGC1146ThrThrAlaAspLeuSerValIleSerValThrProGlyLysArg200205210GTATGCTATATCTTATCTTATCTGATGGCATTTCTCTGAGACATTCTCCAG1197TACCGTTTCCGCCTGGTGTCCCTGTCGTGCGACCCCAACTACACGTTC1245TyrArgPheArgLeuValSerLeuSerCysAspProAsnTyrThrPhe215220225AGCATCGATGGTCACAACATGACGATCATCGAGACCGACTCAATCAAC1293SerIleAspGlyHisAsnMetThrIleIleGluThrAspSerIleAsn230235240ACGGCGCCCCTCGTCGTCGACTCCATTCAGATCTTCGCCGCCCAGCGT1341ThrAlaProLeuValValAspSerIleGlnIlePheAlaAlaGlnArg245250255TACTCCTTCGTGGTAAGTTCGATTCATCCTCTAACGTTGGTCGCTGTTAGTG1393TyrSerPheVal260ATCGTATGGTCATGTAGCTCGAGGCCAACCAGGCCGTCGACAACTACTGG1443LeuGluAlaAsnGlnAlaValAspAsnTyrTrp265270ATTCGCGCCAACCCGAACTTCGGTAACGTCGGGTTCACCGGCGGCATT1491IleArgAlaAsnProAsnPheGlyAsnValGlyPheThrGlyGlyIle275280285290AACTCGGCTATCCTCCGCTACGATGGTGCCGCTGCCGTGGAGCCCACC1539AsnSerAlaIleLeuArgTyrAspGlyAlaAlaAlaValGluProThr295300305ACAACGCAAACCACGTCGACTGCGCCGCTCAACGAGGTCAACCTGCAC1587ThrThrGlnThrThrSerThrAlaProLeuAsnGluValAsnLeuHis310315320CCGCTGGTTACCACCGCTGTGGTATGTAATATTGTCGGTAATGTAATACAT1638ProLeuValThrThrAlaVal325TGTTGCTGACCTCGACCCCCACAGCCTGGCTCGCCCGTCGCTGGTGGTGTC1689ProGlySerProValAlaGlyGlyVal330335GACCTGGCCATCAACATGGCGTTCAACTTCAACGGCACCAACTTCTTC1737AspLeuAlaIleAsnMetAlaPheAsnPheAsnGlyThrAsnPhePhe340345350ATCAACGGCACGTCTTTCACGCCCCCGACCGTGCCTGTCCTGCTCCAG1785IleAsnGlyThrSerPheThrProProThrValProV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snLeuValPro305310315320LeuAspSerProAlaAlaProGlyAspProAsnIleGlyGlyValAsp325330335TyrAlaLeuAsnLeuAspPheAsnPheAspGlyThrAsnPhePheIle340345350AsnAspValSerPheValSerProThrValProValLeuLeuGlnIle355360365LeuSerGlyThrThrSerAlaAlaAspLeuLeuProSerGlySerLeu370375380PheAlaValProSerAsnSerThrIleGluIleSerPheProIleThr385390395400AlaThrAsnAlaProGlyAlaProHisProPheHisLeuHisGlyHis405410415ThrPheSerIleValArgThrAlaGlySerThrAspThrAsnPheVal420425430AsnProValArgArgAspValValAsnThrGlyThrValGlyAspAsn435440445ValThrIleArgPheThrThrAspAsnProGlyProTrpPheLeuHis450455460CysHisIleAspPheHisLeuGluAlaGlyPheAlaIleValPheSer465470475480GluAspThrAlaAspValSerAsnThrThrThrProSerThrAlaTrp485490495GluAspLeuCysProThrTyrAsnAlaLeuAspSerSerAspLeu500505510(2)序列9的信息(i)序列特征(A)長度2925bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)起源(A)生物Polyporuspinsitus(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置734..808(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置878..932(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1051..1104(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1219..1270(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1336..1397(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置1713..7744(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置2030..2085(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置2308..2375(ix)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置2492..2569(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置join(733..809，877..933，1050..1105，1218..1271，1335..1398，1712..1775，2029..2086，2307..2376，2492..2570)，2542..2600).(xi)序列表述序列9CTCATAACTCTTCGCTTCTAGCATGGGGGCTGCGCACACCTGACAGACCCTTCGGGAGGC60GAACTCGAATGCAGCGTACTCTATCNCACCTCCAGGAAAGGTAGGGATGGACNCCGTGCA120CCAACAACTGTCTCTCCACCAGCAACCATCCCTTGGATATGTCTCCACACACCCGGTGTC180TACAAGCGGGGATCTGTGCTGGTGAAGTGCTGTCTCCGGAGCGGCGGCGGCGAGCGACCA240GAACCCGAACCAGTGCTAGTGCCCGACACCCGCGAGACAATTGTGCAGGGTGAGTTATAT300TCTTCGTGAGACGGCGCTGCGCGTCGGCACTGAAAGCGTCGCAGTTAGGTGATGCAGCGG360TCCGCGCTATTTTTGACGTCTGGCAGCTATCCTAAGCCGCGCCTCCATACACCCCAGGCG420CTCTCGTTTGCTATAGGTATAAATCCCTCAGCTTCAGAGCGTCGATCCTCATCCCACACG480ACACCCGTTTCAGTCTTCTCGTAGCGCATTCCCTAGCCGCCCAGCCTCCGCTTTCGTTTT540CAACATGGGCAAGTATCACTCTTTTGTGAACGTCGTCGCCCTTAGTCTT589MetGlyLysTyrHisSerPheValAsnValValAlaLeuSerLeu151015TCTTTGAGCGGTCGTGTGTTCGGCGCCATTGGGCCCGTCACCGACTTG637SerLeuSerGlyArgValPheGlyAlaIleGlyProValThrAspLeu202530ACTATCTCTAACGCCGATGTTACGCCTGACGGCATTACTCGTGCTGCT685ThrIleSerAsnAlaAspValThrProAspGlyIleThrArgAlaAla354045GTCCTCGCGGGCGGCGTTTTCCCCGGGCCCCTCATTACCGGCAACAAG733ValLeuAlaGlyGlyValPheProGlyProLeuIleThrGlyAsnLys505560GTGAGCCGCGAAACCTTCTACTAGCGCGCTCGTACGGTGCACCGTTACTGAAGCCACACT793TTGCGCTGTCAACAGGGGGATGAATTCCAGATCAATGTCATCGACAACCTG844GlyAspGluPheGlnIleAsnValIleAspAsnLeu657075ACCAACGAGACCATGTTGAAGTCGACCACAATCGTAAGGTGCTTGCTCCCATA897ThrAsnGluThrMetLeuLysSerThrThrIle8085ATTAAGCCCGTCGCTGACTCGAAGTTTATCTGTAGCACTGGCATGGTATCTTC950HisTrpHisGlyIlePhe90CAGGCCGGCACCAACTGGGCAGACGGCGCGGCCTTCGTGAACCAGTGC998GlnAlaGlyThrAsnTrpAlaAspGlyAlaAlaPheValAsnGlnCys95100105CCTATCGCCACGGGAAACTCGTTCTTGTACGACTTCACCGTTCCTGAT1046ProIleAlaThrGlyAsnSerPheLeuTyrAspPheThrValProAsp110115120CAAGCCGTACGTTTATACACTTCCCTTTCTGCGGCATACTCTGACGCGCCGCTGGA1102GlnAla125TCAGGGCACCTTCTGGTACCACAGCCACCTGTCCACCCAGTACTGTGAC1151GlyThrPheTrpTyrHisSerHisLeuSerThrGlnTyrCysAsp130135140GGCCTGCGCGGTCCTCTTGTGGTCTACGACCCCGACGATCCCAACGCG1199GlyLeuArgGlyProLeuValValTyrAspProAspAspProAsnAla145150155TCTCTTTACGACGTCGATGACGTAAGCAGGCTACTTGTGGACTTGTATGGA1250SerLeuTyrAspValAspAsp160TGTATCTCACGCTCCCCTACAGGATACTACGGTTATTACGCTTGCGGACTGG1302AspThrThrValIleThrLeuAlaAspTrp165170TACCACACTGCGGCGAAGCTGGGCCCTGCCTTCCCCGTGAGTCTAC1348TyrHisThrAlaAlaLysLeuGlyProAlaPhePro175180185TCTTCCTCGTGTGTTAACATAGGTGACGGCCGCTGATACGAGAGCTACCAGGCGGGT1405AlaGlyCCGGATAGCGTCTTGATCAATGGTCTTGGTCGGTTCTCCGGCGATGGT1453ProAspSerValLeuIleAsnGlyLeuGlyArgPheSerGlyAspGly190195200GGAGGAGCGACAAACCTCACCGTGATCACCGTCACGCAAGGCAAACGG1501GlyGlyAlaThrAsnLeuThrValIleThrValThrGlnGlyLysArg205210215220GTGAGTCCGCCCTGAGCTGGCCTCAATAGCGATATTGACGAGTCCATGCCCTCCCAG1558TACCGCTTCCGCCTTGTGTCGATCTCGTGCGACCCCAACTTCACGTTC1606TyrArgPheArgLeuValSerIleSerCysAspProAsnPheThrPhe225230235TCGATCGACGGGCACAACATGACCATCATCGAGGTGGACGGTGTCAAC1654SerIleAspGlyHisAsnMetThrIleIleGluValAspGlyValAsn240245250CACGAGGCCTTGGACGTCGACTCCATTCAGATTTTTGCGGGGCAGCGG1702HisGluAlaLeuAspValAspSerIleGlnIlePheAlaGlyGlnArg255260265TACTCCTTCATCGTACGTTCCCTTGCCCTCGTGCTATATCCGCCCGTCTGCT1754TyrSerPheIle270CACAGAGGCTTCTATATCGCAGCTCAACGCCAACCAGTCCATCGACAAC1803LeuAsnAlaAsnGlnSerIleAspAsn275280TACTGGATCCGCGCGATCCCCAACACCGGTACCACCGACACCACGGGC1851TyrTrpIleArgAlaIleProAsnThrGlyThrThrAspThrThrGly285290295GGCGTGAACTCTGCTATTCTTCGCTACGACACCGCAGAAGATATCGAG1899GlyValAsnSerAlaIleLeuArgTyrAspThrAlaGluAspIleGlu300305310CCTACGACCAACGCGACCACCTCCGTCATCCCTCTCACCGAGACGGAT1947ProThrThrAsnAlaThrThrSerValIleProLeuThrGluThrAsp315320325CTGGTGCCGCTCGACAACCCTGCGGCTCCCGGTGACCCCCAGGTCGGC1995LeuValProLeuAspAsnProAlaAlaProGlyAspProGlnValGly330335340345GGTGTTGACCTGGCTATGAGTCTCGACTTCTCCTTCGTGAGTCCCA2041GlyValAspLeuAlaMetSerLeuAspPheSerPhe350355CAGCACTCCGCGCCATTTCGCTTATTTACGCAGGAGTATTGTTCAGAACGGTTCC2096AsnGlySer360AACTTCTTTATCAACAACGAGACCTTCGTCCCGCCCACAGTTCCCGTG2144AsnPhePheIleAsnAsnGluThrPheValProProThrValProVal365370375CTCCTGCAGATTTTGAGTGGTGCGCAGGACGCGGCGAGCCTGCTCCCC2192LeuLeuGlnIleLeuSerGlyAlaGlnAspAlaAlaSerLeuLeuPro380385390AACGGGAGTGTCTACACACTCCCTTCGAACTCGACCATTGAGATCTCG2240AsnGlySerValTyrThrLeuProSerAsnSerThrIleGluIleSer395400405TTCCCCATCATCACCACCGACGGTGTTCTGAACGCGCCCGGTGCTCCG2288PheProIleIleThrThrAspGlyValLeuAsnAlaProGlyAlaPro410415420CACCCGTTCCATCTCCACGGCGTAAGTCCTTGCTTTCCTCAGTGCCTCGCT2339HisProPheHisLeuHisGly425430TCCACGACGTCCACTGATCCCACACATCCCATGTGCAGCACACCTTCTCGGTG2392HisThrPheSerVal435GTGCGCAGCGCCGGGAGCTCGACCTTCAACTACGCCAACCCAGTCCGC2440ValArgSerAlaGlySerSerThrPheAsnTyrAlaAsnProValArg440445450CGGGACACCGTCAGTACTGGTAACTCTGGCGACAACGTCACTATCCGC2488ArgAspThrValSerThrGlyAsnSerGlyAspAsnValThrIleArg455460465TTCACGGTACGTCTTCTCCGGAGCCCTCCCACCCGTGTGTCCGCTGAGCGCTGAAC2544PheThr470ACCGCCCACCGTGCTGCTGCTGCGCAGACCGACAACCCAGGCCCGTGGTTC2595ThrAspAsnProGlyProTrpPhe475CTCCACTGCCACATCGACTTCCACCTGGAGGCCGGCTTCGCCATCGTC2643LeuHisCysHisIleAspPheHisLeuGluAlaGlyPheAlaIleVal480485490TGGGGGGAGGACACTGCGGACACCGCGTCCGCGAATCCCGTTCCT2688TrpGlyGluAspThrAlaAspThrAlaSerAlaAsnProValPro495500505GTACGTCGTGCCTGCTGAGCTCTTTGTGCCCGAACAGGGTGCTGATCGTGCCTTCCTCCG2748TGCAGACGGCGTGGAGCGATTTGTGCCCCACTTACGATGCTTTGGACTCG2798ThrAlaTrpSerAspLeuCysProThrTyrAspAlaLeuAspSer510515520TCCGACCTCTGATCGACAAGGCATGAAGGCTGAAGCAGCTGCGGTCAAT2847SerAspLeu525TCTCGAACACACTTTACTCGAACATTCATTTTTCTTTGGCTCGGGATCGGAACAAATCAT2907GGGGGGGCCGGACCGTCT2925(2)序列10的信息(i)序列特征(A)長度527個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)起源(A)生物Polyporuspinsitus(xi)序列表述序列10MetGlyLysTyrHisSerPheValAsnValValAlaLeuSerLeuSer151015LeuSerGlyArgValPheGlyAlaIleGlyProValThrAspLeuThr202530IleSerAsnAlaAspValThrProAspGlyIleThrArgAlaAlaVal354045LeuAlaGlyGlyValPheProGlyProLeuIleThrGlyAsnLysGly505560AspGluPheGlnIleAsnValIleAspAsnLeuThrAsnGluThrMet65707580LeuLysSerThrThrIleHisTrpHisGlyIlePheGlnAlaGlyThr859095AsnTrpAlaAspGlyAlaAlaPheValAsnGlnCysProIleAlaThr100105110GlyAsnSerPheLeuTyrAspPheThrValProAspGlnAlaGlyThr115120125PheTrpTyrHisSerHisLeuSerThrGlnTyrCysAspGlyLeuArg130135140GlyProLeuValValTyrAspProAspAspProAsnAlaSerLeuTyr145150155160AspValAspAspAspThrThrValIleThrLeuAlaAspTrpTyrHis165170175ThrAlaAlaLysLeuGlyProAlaPheProAlaGlyProAspSerVal180185190LeuIleAsnGlyLeuGlyArgPheSerGlyAspGlyGlyGlyAlaThr195200205AsnLeuThrValIleThrValThrGlnGlyLysArgTyrArgPheArg210215220LeuValSerIleSerCysAspProAsnPheThrPheSerIleAspGly225230235240HisAsnMetThrIleIleGluValAspGlyValAsnHisGluAlaLeu245250255AspValAspSerIleGlnIlePheAlaGlyGlnArgTyrSerPheIle260265270LeuAsnAlaAsnGlnSerIleAspAsnTyrTrpIleArgAlaIlePro275280285AsnThrGlyThrThrAspThrThrGlyGlyValAsnSerAlaIleLeu290295300ArgTyrAspThrAlaGluAspIleGluProThrThrAsnAlaThrThr305310315320SerValIleProLeuThrGluThrAspLeuValProLeuAspAsnPro325330335AlaAlaProGlyAspProGlnValGlyGlyValAspLeuAlaMetSer340345350LeuAspPheSerPheAsnGlySerAsnPhePheIleAsnAsnGluThr355360365PheValProProThrValProValLeuLeuGlnIleLeuSerGlyAla370375380GlnAspAlaAlaSerLeuLeuProAsnGlySerValTyrThrLeuPro385390395400SerAsnSerThrIleGluIleSerPheProIleIleThrThrAspGly405410415ValLeuAsnAlaProGlyAlaProHisProPheHisLeuHisGlyHis420425430ThrPheSerValValArgSerAlaGlySerSerThrPheAsnTyrAla435440445AsnProValArgArgAspThrValSerThrGlyAsnSerGlyAspAsn450455460ValThrIleArgPheThrThrAspAsnProGlyProTrpPheLeuHis465470475480CysHisIleAspPheHisLeuGluAlaGlyPheAlaIleValTrpGly485490495GluAspThrAlaAspThrAlaSerAlaAsnProValProThrAlaTrp500505510SerAspLeuCysProThrTyrAspAlaLeuAspSerSerAspLeu51552052權利要求1.一種DNA結(jié)構(gòu)，帶有一段編碼一種多孔菌屬(Polyporus)漆酶的序列。2.如權利要求1的結(jié)構(gòu)，它包括一段編碼Polyporuspinsitus漆酶的序列。3.如權利要求1的結(jié)構(gòu)，它包括一段編碼序列2所示氨基酸序列的核酸序列。4.如權利要求1所述的結(jié)構(gòu)，它包括序列1所示的核酸序列。5.如權利要求1所述的結(jié)構(gòu)，它包括一段編碼序列4所示氨基酸序列的核酸序列。6.如權利要求1所述的結(jié)構(gòu)，它包括序列3所示的核酸序列。7.如權利要求1所述的結(jié)構(gòu)，它包括一段編碼序列6所示氨基酸序列的核酸序列。8.如權利要求1所述的結(jié)構(gòu)，它包括序列5所示的核酸序列。9.如權利要求1所述的結(jié)構(gòu)，它包括一段編碼序列8所示氨基酸序列的核酸序列。10.如權利要求1的結(jié)構(gòu)，它包括序列7所示的核酸序列。11.如權利要求1的結(jié)構(gòu)，它包括一段編碼序列10所示氨基酸序列的核酸序列。12.如權利要求1的結(jié)構(gòu)，它包括序列9所示的核酸序列。13.如權利要求1的結(jié)構(gòu)，它包括選自包含于NRRLB-21263、21264、21265、21266、21267和21268中的核酸序列。14.一種基本上純的多孔菌屬漆酶。15.如權利要求14的酶，它是Polyporuspinsitus漆酶。16.如權利要求14的酶，它包括選自序列4、6、8和10所示序列或一段與上述序列的同源性至少約為80％的序列的氨基酸序列。17.一種重組載體，包括一種帶有一段編碼一種多孔菌屬漆酶的序列的DNA結(jié)構(gòu)。18.如權利要求17的載體，其中，所述結(jié)構(gòu)與一個啟動子序列可操縱地連接。19.如權利要求18的載體，其中，所述啟動子是一種真菌或酵母啟動子。20.如權利要求19的載體，其中，所述啟動子是米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶啟動子。21.如權利要求18的載體，其中，所述啟動子是黑曲霉(A.niger)或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)啟動子。22.如權利要求17的載體，它還包括一個選擇標記。23.如權利要求22的載體，其中，所述選擇標記選自amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC和hygB。24.如權利要求22的載體，其中，所述選擇標記為構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)或米曲霉amdS標記，或構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉pyrG標記。25.如權利要求18的載體，它同時包括米曲霉TAKA淀粉酶啟動子和構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS或pyrG標記。26.一種重組宿主細胞，包括一種異源DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有一段編碼一種多孔菌屬漆酶的序列。27.如權利要求26的細胞，它是一種真菌細胞。28.如權利要求27的細胞，它是一種曲霉屬(Aspergillus)細胞。29.如權利要求26的細胞，其中，所述結(jié)構(gòu)被整合到宿主細胞基因組上。30.如權利要求26的細胞，其中，所述結(jié)構(gòu)被攜帶在一種載體上。31.如權利要求26的細胞，它包括一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有一段編碼一種選自序列2、4、6、8和10所示氨基酸序列的序列。32.一種獲取漆酶的方法，它包括在有利于所述漆酶表達的條件下培養(yǎng)一種重組宿主細胞，該細胞包括一種帶有一段編碼一種多孔菌屬漆酶的核酸序列的DNA結(jié)構(gòu)，以及從培養(yǎng)物中回收漆酶。33.一種獲取漆酶的方法，它包括在有利于所述漆酶表達的條件下培養(yǎng)一種重組曲霉屬宿主細胞，該細胞包括一種帶有一段編碼一種類多孔菌屬漆酶的核酸序列的DNA結(jié)構(gòu)，以及從培養(yǎng)物中回收漆酶。34.一種用權利要求33的方法獲取的多孔菌屬酶。35.一種用于在溶液中聚合木素或木素硫酸鹽底物的方法，包括讓所述底物與一種多孔菌屬漆酶接觸。36.一種用于在牛皮紙漿中進行原位解聚的方法，包括讓所述紙漿與一種多孔菌屬漆酶接觸。37.一種氧化染料或染料前體的方法，包括讓所述染料或染料前體接觸一種多孔菌屬漆酶。38.一種染發(fā)的方法，它包括在有或沒有至少一種改性劑的條件下讓一種多孔菌屬漆酶與至少一種染料前體接觸一段時間，而且在足以把所述染料前體氧化成染料的條件下進行接觸。39.如權利要求38的方法，其中，所述染料前體選自二胺、氨基苯酚和苯酚。40.如權利要求38的方法，其中，使用改性劑時，它是間二胺、間氨基苯酚或多酚。41.如權利要求38的方法，其中，所述染料前體是選自鄰-或?qū)?二胺或氨基苯酚的主要中間體。42.如權利要求38的方法，其中，使用了一種以上的染料前體。43.如權利要求38的方法，其中，使用了一種以上的改性劑。44.如權利要求38的方法，其中，同時使用一種主要中間體和一種改性劑。45.一種染料組合物，包括一種多孔菌屬漆酶和至少一種染料前體。46.一種染料組合物，包括一種多孔菌屬漆酶和至少一種主要中間體和至少一種改性劑。47.一種盛有一種染料組合物的容器，它包括一種多孔菌屬漆酶和至少一種染料前體，容器中沒有氧氣。48.如權利要求47的容器，它盛有至少一種主要中間體染料前體和至少一種改性劑。49.一種聚合或氧化酚類或苯胺化合物的方法，它包括讓所述酚類或苯胺化合物與一種多孔菌屬漆酶接觸。全文摘要本發(fā)明涉及帶有一段編碼多孔菌屬(Plyporus)漆酶序列的分離的核酸，以及所編碼的漆酶蛋白。文檔編號A61K8/00GK1157636SQ95194301公開日1997年8月20日申請日期1995年6月15日優(yōu)先權日1994年6月24日發(fā)明者D·S·亞夫爾,F·許,H·達爾伯吉,P·施耐德,D·A·阿斯林格申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司