專利名稱：純化的多孔菌屬漆酶及編碼該酶的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼一種真菌氧化還原酶的分離核酸片段，以及由該片段所產(chǎn)生的純化酶。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼一種酚氧化酶，特別是擔(dān)子菌-多孔菌屬的漆酶的核酸片段。
背景技術(shù)：
漆酶(苯二醇氧氧化還原酶)是含多個(gè)銅的酶，它能催化酚類物質(zhì)的氧化。漆酶對(duì)合適酚類底物的氧化作用，會(huì)導(dǎo)致芳氧基中間體的產(chǎn)生，所產(chǎn)生的中間體通過最終聚合，形成由二聚、低聚和多聚反應(yīng)產(chǎn)物組成的混合物。這種反應(yīng)在導(dǎo)致黑素、生物堿、毒素、木素和腐殖酸形成的生物合途徑中實(shí)際上起著重要作用。漆酶可由很多種真菌產(chǎn)生，包括子囊菌，如曲霉屬(Aspergillus)、脈孢菌屬(Neurospora)和柄孢殼菌屬(Podospora)，半知菌綱的葡萄孢屬(Botrytis)，和擔(dān)子菌，如金錢屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、香菇屬(Lentinus)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、多孔菌屬(Polyporus)和完全絲核菌屬(Rhizoctonia)。漆酶具有很大范圍的底物專一性，而且，各種不同真菌的漆酶在其氧化酚類底物的能力方面通常僅有量的差別。由于其底物的多樣性，漆酶一般具有很多潛在的工業(yè)應(yīng)用前景。其中包括木素改性、紙張強(qiáng)化、洗滌劑中染料轉(zhuǎn)移的抑制、苯酚聚合作用、果汁生產(chǎn)、酚醛樹脂的生產(chǎn)、及廢水處理。
由不同真菌菌種制成的漆酶，雖然催化能力相似，但具有不同的溫度和pH最佳值，而且，溫度和pH最佳值也會(huì)根據(jù)具體的底物而有所不同。已經(jīng)分離得到多種上述真菌漆酶，而且，編碼其中幾種酶的基因也已被克隆。例如，Choi等(Mol.Plant-Microbe Interactions 5119-128，1992)披露了編碼粟樹枯萎真菌Cryphonectria parasitica的漆酶的基因的分子特征和克隆。Kojima等(J.Biol. Chem.26515224-15230，1990；JP2-238885)披露了白腐擔(dān)子菌Coriolus hirsutus漆酶的兩種等位形式。Germann和Lerch(Experientia 41801，1985；PNAS USA 838854-8858，1986)報(bào)道了對(duì)粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)漆酶基因的克隆和部分序列分析結(jié)果。Saloheimo等(J. Gen.Microbiol.1371537-1544，1985；WO 92/01046)披露了對(duì)來自真菌Phlebia radiata的漆酶基因的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。
所做的在異源真菌系統(tǒng)中表達(dá)漆酶基因的嘗試，通常獲得極低的產(chǎn)率(Kojima等，Supra；Saloheimo等，Bio/Technol.9987-990，1991)。例如，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵中，Phlebia radiata漆酶在Trichoderma reesei中進(jìn)行的異源表達(dá)，在每升發(fā)酵液中僅有20mg活性酶(Saloheimo，1991，supra)。盡管漆酶具有巨大的商業(yè)潛力，但是，能否大量表達(dá)這種酶是決定其商業(yè)應(yīng)用前景的關(guān)鍵。以前所做的在重組宿主中表達(dá)擔(dān)子菌漆酶的嘗試中，只得到極低的產(chǎn)率。本發(fā)明要提供在曲霉屬中表達(dá)良好的新的擔(dān)子菌漆酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有一段編碼一種多孔菌屬漆酶的核酸序列。本發(fā)明還涉及分離到的由上述核酸序列編碼的漆酶。這種漆酶最好基本上是純的?！盎旧鲜羌兊摹笔侵敢环N漆酶中基本上(即≥90％)不含其它非漆酶蛋白。
為促進(jìn)上述新漆酶的生產(chǎn)，本發(fā)明還提供了帶有要求保護(hù)的核酸序列的載體和宿主細(xì)胞，這種載體和宿主細(xì)胞可用于所述漆酶的重組生產(chǎn)。所述核酸序列與轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)可操縱地連接，這些信號(hào)可指導(dǎo)所述漆酶蛋白在所選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，曲霉屬的細(xì)胞為最佳宿主細(xì)胞。本發(fā)明漆酶的重組生產(chǎn)是這樣實(shí)現(xiàn)的在適合漆酶蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)用本發(fā)明的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述漆酶蛋白。
本發(fā)明的漆酶可用于很多需要對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行氧化的工業(yè)方法中。所述方法包括木素加工、果汁生產(chǎn)、苯酚聚合和酚醛樹酯生產(chǎn)。


圖1表示帶有LCC1(SEQ ID No.1)的基因組克隆21GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖2表示帶有LCC2(SEQ ID No.3)的基因組克隆23GEN的DNA序列和該序列的翻譯。
圖3表示帶有LCC3(SEQ ID No.5)的基因組克隆24GEN的DNA序列和該序列的翻譯.
圖4表示帶有LCC4(SEQ ID No.7)的基因組克隆31GEN的DNA序列和該序列的翻譯.
圖5表示帶有LCC5(SEQ ID No.9)的基因組克隆41GEN的DNA序列和該序列的翻譯.
圖6表示載體pMWR1的結(jié)構(gòu)。
圖7表示載體pDSY1的結(jié)構(gòu)。
圖8表示載體pDSY10的結(jié)構(gòu)。
圖9表示由pDSY2所產(chǎn)生的漆酶的pH曲線；(A)丁香醛連氮氧化作用；(B)ABTS氧化作用。
圖10表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發(fā)的染料前體的比較，測(cè)量DL*。
圖11表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發(fā)的染料前體的比較，測(cè)量Da*。
圖12表示用漆酶和H2O2分別處理各種用于染發(fā)的各種染料前體和改性劑的比較，測(cè)量DL*。
圖13表示分別用漆酶和H2O2染過的頭發(fā)的洗滌穩(wěn)定性的比較。
圖14表示分別用漆酶和H2O2染過的頭發(fā)的耐曬性。
具體實(shí)施例方式
Polyporus pinsitus是一種擔(dān)子菌，又被稱為絨毛樣栓菌(Trametesvillosa)。多孔菌早先就已被確認(rèn)為漆酶生產(chǎn)菌(Fahraeus和Lindeberg，Physiol. Plant.6150-158，1953)。不過，尚未見從Polyporus pinsitus中提純漆酶的報(bào)道。業(yè)已證實(shí)Polyporus pinsitus能產(chǎn)生至少兩種不同的漆酶，而且可將編碼這兩種酶的基因用于在簡(jiǎn)便的宿主系統(tǒng)，如曲霉屬中以較高的產(chǎn)率生產(chǎn)這種酶。另外，還分離到能編碼漆酶的3個(gè)其它基因。
通過對(duì)各種真菌菌株的初步篩選表明，P.pinsitus是一種漆酶產(chǎn)生菌，P.pinsitus產(chǎn)生漆酶是由2，5-二甲代苯胺誘導(dǎo)的。首先，從誘導(dǎo)的菌株的上清液中分離漆酶。陰離子交換層析證實(shí)，一種約為65kD(在SDS-PAGE上測(cè)得)的蛋白質(zhì)具有漆酶活性。對(duì)該酶進(jìn)行充分純化，以便得到幾種內(nèi)肽序列，和N-末端序列。初步的序列資料表明，這種漆酶與Coriolus hirsutus的漆酶以及一種未鑒定的擔(dān)子菌漆酶有明顯的同源性(Coll等，Appl.Environ.Microbiol.594129-4135，1993)。根據(jù)上述序列信息設(shè)計(jì)出PCR引物，并對(duì)從P.pinsitus中分離的cDNA進(jìn)行PCR。通過PCR獲得了一條預(yù)計(jì)大小的帶，而且，分離得到的與纖維素酶信號(hào)序列連接的片段被證實(shí)可在米曲霉(A.Oryzae)中表達(dá)一種活性漆酶，但表達(dá)水平很低。上述PCR片段之一還被用作篩選P.pinsitus cDNA文庫(kù)的探針。以這種方式鑒定得到100個(gè)以上的陽(yáng)性克隆。對(duì)這些陽(yáng)性克隆進(jìn)行特征分析，并對(duì)最長(zhǎng)克隆的末端測(cè)序；在這些克隆中，沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有完整長(zhǎng)度。
還進(jìn)行了分離完整長(zhǎng)度克隆的進(jìn)一步努力。用按上述方法分離到的最完整的cDNA片段檢測(cè)一個(gè)5-6kb BamHI大小選擇的P.pinsitus基因組文庫(kù)。初步篩選證實(shí)，克隆24GEN(LCC3)與該cDNA有同源性，但它不是該cDNA編碼的漆酶，而且也不是完整長(zhǎng)度。隨后篩選一個(gè)7-8kb BamHI/EcoRI大小選擇的文庫(kù)表明，至少有兩種漆酶；部分序列分析表明，一種被稱為21GEN(LCC1)的克隆與所分離的原始部分cDNA克隆相同，而另一種被稱為31GEN(LCC4)的克隆是一種新的，以前未鑒定過的漆酶。用LCC1作為探針再次篩選一個(gè)EMBL4基因組文庫(kù)，鑒定了一類含有完整的LCC1插入片段及其5′和3′側(cè)翼區(qū)的克隆。用LCC3篩選EMBL文庫(kù)鑒定了另外兩個(gè)編碼漆酶的克隆，這兩個(gè)克隆是以前未被鑒定過的，被稱為41GEN(LCC5)和23GEN(LCC2)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上也與另外3個(gè)克隆LCC1、LCC3和LCC4不同。上述每種漆酶的核酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列分別在圖1-5和序列號(hào)SEQ ID No.1-10中給出。在表2中對(duì)每種漆酶的結(jié)構(gòu)組織進(jìn)行了比較。這些漆酶通常在約4-5.5的酸性pH條件下具有最佳活性。
將LCC1用于產(chǎn)生表達(dá)載體，再將所產(chǎn)生的載體用于轉(zhuǎn)化曲霉屬的各種菌種。在所有試驗(yàn)過的菌種中轉(zhuǎn)化都取得了成功，但表達(dá)水平在黑曲霉(Aspergillus niger)中最高。在搖瓶培養(yǎng)中，能產(chǎn)生濃度為15mg/l或15mg/l以上的漆酶，而在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中，獲得了超過300mg/l的產(chǎn)率。與先前用其它漆酶和其它真菌宿主細(xì)胞獲得的漆酶水平相比，上述產(chǎn)率代表了一種重大改進(jìn)。
根據(jù)本發(fā)明，通過上述方法或本領(lǐng)域中任何其它已知方法，利用本發(fā)明所提供的信息，可獲得編碼一種漆酶的多孔菌屬基因。該基因可利用一種表達(dá)載體以活性形式表達(dá)。適用的表達(dá)載體，帶有一個(gè)能使該載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組上或能使該載體在宿主細(xì)胞中獨(dú)立于該宿主細(xì)胞的基因組之外進(jìn)行自主復(fù)制的因子，而且最好還帶有一個(gè)或一個(gè)以上便于選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型標(biāo)記。該表達(dá)載體還可以包括編碼啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)的各種操縱序列，并可有選擇地帶有一個(gè)阻抑基因或各種激活基因。為了讓表達(dá)的蛋白能夠分泌，可將編碼一種信號(hào)序列的核苷酸插在基因編碼序列之前。為了在操縱序列指導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，將有待按照本發(fā)明使用的漆酶基因與所述操縱序列在正確的閱讀框架中進(jìn)行可操縱連接?？山Y(jié)合到質(zhì)粒載體上、并可指導(dǎo)漆酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，包括但不限于原核β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)和tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。還可從“Useful Proteins from recombinant bacteria”(Scientific American，1980，24274-94)一文和SamDrook等所著的Molecular Cloning(1989)一書中找到其它可供參考的信息。
攜帶本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體，可以是有利于進(jìn)行重組DNA方法的任何載體，載體的選擇通常取決于將被導(dǎo)入所選載體的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是一種自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，如質(zhì)?；蛉旧w外因子，微型染色體或人工染色體。另外，所述載體可以是這樣的當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞后能整合到宿主細(xì)胞基因組上，并與其所整合的染色體共同復(fù)制。
在該載體上，漆酶DNA序列與一個(gè)合適的啟動(dòng)子序列可操縱地連接。該啟動(dòng)子可以是任何在所選擇的宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可由編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因衍生而來。用于指導(dǎo)本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動(dòng)子的例子有大腸桿菌(E.coli)lac操縱子的啟動(dòng)子、StreptomgcesCoelicolor瓊脂糖酶基因dagA啟動(dòng)子、地衣型芽胞桿菌(BacillusLicheniformis)α-淀粉酶基因(amgL)啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥淀粉酶基因(amgM)啟動(dòng)子、淀粉液化桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)啟動(dòng)子或枯草桿菌(Baciiius Subtiiis)xyiA和xyiB基因啟動(dòng)子。在酵母宿主中，一種有用的啟動(dòng)子是eno-1啟動(dòng)子。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，可以使用的啟動(dòng)子的例子有由編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因衍生而來的啟動(dòng)子。優(yōu)選TAKA-淀粉酶和glaA啟動(dòng)子。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可包括一個(gè)合適的轉(zhuǎn)錄終止子，而且，在真核生物中，與編碼本發(fā)明漆酶的DNA序列可操縱地連接的聚腺苷酸化序列。終止序列和聚腺苷酸化序列可以源自與上述啟動(dòng)子相同的來源。所述載體還可以包括一個(gè)使該載體能夠在上述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列的例子包括質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
所述載體還可以包括一個(gè)選擇標(biāo)記，例如一個(gè)基因，該基因的產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)宿主細(xì)胞的某種缺陷，如來自枯草桿菌或地衣型芽胞桿菌的dal基因；或是一種能賦予抗生素抗性，如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。曲霉屬選擇標(biāo)記的例子包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC和hygB，一種能產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記。用于曲霉屬宿主細(xì)胞的優(yōu)選選擇標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記。常用的哺乳動(dòng)物標(biāo)記是二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。另外，還可以通過共轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)選擇，例如在WO91/17243中所披露的。
一般，希望表達(dá)能夠產(chǎn)生一種胞外產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的漆酶可以包括一個(gè)前導(dǎo)區(qū)，它使得表達(dá)的蛋白質(zhì)能分泌到培養(yǎng)基里。如果需要，該前導(dǎo)區(qū)可以是本發(fā)明漆酶的天然前導(dǎo)區(qū)，或是被其它前導(dǎo)區(qū)或信號(hào)序列所取代，通過取代編碼相應(yīng)前導(dǎo)區(qū)的DNA序列可很容易地實(shí)現(xiàn)上述目的。例如，所述前導(dǎo)區(qū)可來源于獲自曲霉菌的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、獲自芽胞桿菌的淀粉酶基因、獲自Rhizomucer miehei的脂肪酶或蛋白酶基因、獲自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子編碼基因或小牛前凝乳酶原基因。特別理想的是，當(dāng)宿主是真菌細(xì)胞時(shí)，所述前導(dǎo)區(qū)為米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶的信號(hào)序列，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信號(hào)，Rhizomucor miehei脂肪酶信號(hào)，芽包桿菌NCIB11837生麥淀粉酶、嗜熱芽胞桿菌α-淀粉酶、或地衣型芽胞桿菌枯草溶菌素的信號(hào)序列。
用于把本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)分別與啟動(dòng)子、終止子和其它因子連接的方法，以及將連接后的DNA序列插入帶有復(fù)制所需的信息的合適載體的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(例如，Sambrook等，MolecularCloning，1989)。
帶有上述本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)或表達(dá)載體的本發(fā)明的細(xì)胞，能很好地用作重組生產(chǎn)本發(fā)明的酶的宿主細(xì)胞。該細(xì)胞可用本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過將DNA結(jié)構(gòu)整合到宿主染色體上而順利地進(jìn)行。這種整合被一般視為一種優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵揇NA序列更傾向于穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中。所述DNA結(jié)構(gòu)與宿主染色體的整合可通過常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過同源或異源重組。另外，還可用上文中與不同類型宿主細(xì)胞一起論及的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。
所述宿主細(xì)胞可選自原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌的例子包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如枯草桿菌、地衣型芽胞桿菌、Bacillus lentus、短桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌、嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkalophilus)、淀粉液化芽胞桿菌、凝固芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus Circulans)、Bacillus lantus、巨大芽胞桿菌(B.megaterium)、蘇云金桿菌(Bacillusthuriugiensis)或鉛色鏈霉菌(Streptomyces lividans)或灰色鏈霉菌(Streptomyces murinus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可通過已知方法來實(shí)現(xiàn)，例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或通過使用感受態(tài)細(xì)胞。
所述宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或最好是真菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞包括酵母和絲狀真菌。例如，可選用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括CHO或COS細(xì)胞。酵母宿主細(xì)胞可選自酵母屬或裂殖酵母屬的一個(gè)種，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。能采用的絲狀真菌，可選自曲霉屬的一個(gè)種，如米曲霉或黑曲霉。另外，還可以把鐮孢菌(Fusarium sp.)，如尖鐮孢(F.oxysporum)用作宿主細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以通過一種包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化，在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化之后，以一種已知方式再生細(xì)胞壁。在歐洲專利EP238023中披露了一種轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的適宜方法。Malardier等(1989)披露了一種轉(zhuǎn)化鐮孢菌的合適方法。
因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的重組漆酶的方法，該方法包括在有利于所述漆酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，從該細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收所述漆酶。用于培養(yǎng)上述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于這種宿主細(xì)胞生長(zhǎng)并能表達(dá)本發(fā)明的漆酶的常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商那里購(gòu)買或按照公開的配方(例如，可參看American TypeCulture Collection目錄)制備。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在有過量銅的條件下，在培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)了漆酶的重組生產(chǎn)。盡管加入培養(yǎng)基中的微量元素通常含有少量的銅，但結(jié)合本發(fā)明所做的實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)加銅可以使活性酶的產(chǎn)率增加很多倍。理想的是，以可溶形式把銅加進(jìn)培養(yǎng)基中，最好是以可溶性銅鹽形式加入，如氯化銅、硫酸銅或乙酸銅。培養(yǎng)基中銅的最終濃度應(yīng)在0.2～2mM范圍內(nèi)，最好在0.05～0.5mM范圍內(nèi)。這方法可用于提高任何重組生產(chǎn)的真菌漆酶，以及其它含銅酶，特別是氧化還原酶的產(chǎn)率。
可通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的酶，該方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞；用鹽，如硫酸氨沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)成分；隨后用各種層析方法進(jìn)行提純，如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。理想的是，通過SDS-PAGE測(cè)得所提取的蛋白質(zhì)的純度約為90％，在食品、果汁或洗滌劑方面的應(yīng)用中，純度最為重要。
在一種特別優(yōu)選實(shí)施方案中，在真菌宿主細(xì)胞，如曲霉屬細(xì)胞里實(shí)現(xiàn)了漆酶的表達(dá)。正如將要在下面的實(shí)施例中詳細(xì)講述的，把漆酶基因連接在一種帶有米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子和構(gòu)巢曲霉amdS選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上。另外，admS也可以在另一種質(zhì)粒上，將這種質(zhì)粒用于共轉(zhuǎn)化。按照Yelton等(PNAS USA811470-1474，1984)的方法，用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化曲霉菌宿主細(xì)胞，如米曲霉或黑曲霉宿主細(xì)胞。
特別值得一提的是，在本發(fā)明中以曲霉菌為宿主細(xì)胞所得到的多孔菌屬漆酶的產(chǎn)率出乎意料地明顯高于先前報(bào)道過的在其它宿主細(xì)胞中表達(dá)其它漆酶的產(chǎn)率。預(yù)計(jì)，在生產(chǎn)來自其它擔(dān)子菌，如草蓋菌屬(Coriolus)或栓菌屬(Trametes)的漆酶時(shí)，將曲霉菌屬用作宿主細(xì)胞，也能產(chǎn)生比以前所能達(dá)到的量更大的酶。因此，本發(fā)明還包括在曲霉屬重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)上述類多孔菌屬漆酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明并不局限于使用本文所披露的核酸片段，例如在圖1-5中披露的核酸片段。很明顯，本發(fā)明還包括編碼與圖1-5所示相同的氨基酸序列的核苷酸序列，但這種序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而與圖中所示的核苷酸序列有所不同。此外，在說明書和權(quán)利要求書中對(duì)圖1-5的說明應(yīng)當(dāng)被理解為既包括所示出的基因組序列，又包括相應(yīng)的cDNA和RNA序列，而本文所采用的“DNA結(jié)構(gòu)”和“核酸序列”應(yīng)當(dāng)被理解成包括所有這類變形?！癉NA結(jié)構(gòu)”一般被理解成單鏈或雙鏈DNA分子，這種DNA結(jié)構(gòu)可以從天然存在的基因中分離出它的一部分，或?qū)ζ溥M(jìn)行修飾，以使其含有以天然狀態(tài)下沒有的方式結(jié)合和并列的DNA片段。
另外，本發(fā)明還包括其它多孔菌屬漆酶，如存在于Polyporuspinsitus中的其它形式的漆酶，以及由Fries所定義的多孔菌屬的定義范圍內(nèi)的其它真菌中所存在的漆酶，或Long等(1994，ATCC Names ofIndustrial Fungi，ATCC，Rockville，Maryland)所定義的多孔菌屬的同物異名真菌中所存在的漆酶。通過采用在本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法，可以從本文所列舉的來源之外的、公開銷售的多孔菌屬菌株鑒定和分離漆酶基因。另外，這里所披露的序列可用于設(shè)計(jì)引物和/或探針，將其用于通過標(biāo)準(zhǔn)PCR或Southern雜交技術(shù)分離漆酶基因。其它名稱的多孔菌包括，但不局限于P.zonatus、P.alveolaris、P.arcularius、P.australiensis、P.badius、P.biformis、P.brumalis、P.ciliatus、P.colensoi、P.eucalyptorum、P.meridionalis、P.varius、P.palustris、P.rhizophilus、P. rugulosus、P.squamosus、P.tuberaster和P.tumulosus.還包括同物異名的漆酶，例如，多孔菌屬的種或株的變形或完整形式。公眾可很容易地從很多培養(yǎng)物保藏中心得到多孔菌屬菌株，例如，可從ATCC獲得ATCC26721、9385、11088、22084；可從DSM獲得DSM1021、1023和1182；可從CBS獲得CBS687.70、166.29、101.15、276.31、307.39、334.49和332.49。本發(fā)明還包括任何改變形式的核苷酸序列及其所編碼的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)與圖2-5中所示的任一氨基酸序列的同源性至少約為80％、至少約為85％較為理想，至少約為90-95％最為理想，而且在實(shí)質(zhì)上它具有本文所示序列的漆酶活性。上述類型中可以使用的變體包括，例如，已進(jìn)行過保守氨基酸取代的蛋白質(zhì)，這種取代不會(huì)明顯影響該蛋白質(zhì)的活性。保守取代是指同一類型的氨基酸可被這一類型的其它氨基酸所取代。例如，非極性脂族殘基Ala、Val、Leu和Ile之間可以互相替換，堿性殘基Lys和Arg之間或酸性殘基Asp和Glu之間也可以相互替換。類似地，Ser和Thr互為保守取代基，Asn和Gln互為取代基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以在對(duì)該分子的功能起關(guān)鍵作用的區(qū)域之外進(jìn)行這種取代，并且仍能得到有活性的酶。例如用本發(fā)明實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)ABTS氧化方法，能夠很方便地測(cè)定所保留的需要的活性。
所述蛋白質(zhì)可用在許多不同的工業(yè)方法中。這些方法包括在溶液中的木素聚合，所述木素包括硫酸鹽紙漿和木素硫酸鹽，通過聚合產(chǎn)生具有較高分子量的木素。這種方法披露于下列文獻(xiàn)中Holzforschung(Jin等，45(6)，467-468，1991)；US-4,432,921；EP 0275 544；PCT/DK93/00217(1992)。
本發(fā)明的漆酶還可用于牛皮紙槳中木素的原位解聚，從而產(chǎn)生一種木素含量較低的紙漿。漆酶的這種用途，是對(duì)現(xiàn)行用氯解聚木素的一種改進(jìn)，現(xiàn)行方法會(huì)產(chǎn)生氯化芳族化合物，這種化合物是由造紙廠生產(chǎn)的對(duì)環(huán)境有害的付產(chǎn)品。這類用途披露于下列文獻(xiàn)中，例如，CurrentOpinion in Biotechnology 3261-266，1992；J.Biotechnol.25333-339，1992；Hiroi等，Svensk papperstidning 5162-166，1976。
對(duì)染料或染料前體及其它有色化合物的氧化作用，會(huì)導(dǎo)致該化合物脫色。可將漆酶用于這種目的，在不希望染料在織物間轉(zhuǎn)移的情況下，使用漆酶特別有利，例如在紡織業(yè)和洗滌劑業(yè)中。用于染料轉(zhuǎn)移抑制和染料氧化的方法披露在以下文件中WO 92/01406、WO 92/18683、EP 0495836和Calvo，Mededelingen Van de Faculteit Landbouw-Wetenschappen/Rijiksuniversitet Gent.561565-1567，1991；Tsujino等，J.Soc.Chem.42273-282，1991。
所述漆酶特別適用于染發(fā)。在這一用途中，漆酶與染料前體(最好在毛發(fā)上)接觸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)染料前體的有控制的氧化，將所述前體轉(zhuǎn)化成染料或色素產(chǎn)生化合物，如醌類化合物。所述染料前體最好是屬于下列三大化合物家族之一的一種芳族化合物二胺、氨基苯酚(或氨基萘酚)和苯酚。上述染料前體可單獨(dú)使用或組合使用。共聚作用的中間體，至少有一種必須是鄰-或?qū)?二胺或氨基苯酚(主要中間體)。其例子見下文的第V部分，而且還披露在US-3,251,742中，該專利的內(nèi)容被用作本文的參考。在一種實(shí)施方案中，原料不僅包括所述酶和主要中間體，而且還包括一種改性劑(成色劑)(或多種成色劑的組合物)，所述改性劑通常是間-二胺、間-氨基苯酚、或多酚。在所述漆酶的存在下，所述改性劑再與主要中間體反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化成有色化合物。在另一種實(shí)施方案中，所述漆酶可直接用于所述主要中間體，將中間體氧化成有色化合物。在任何情況下，所述染色方法都可用一種或一種以上主要中間體單獨(dú)進(jìn)行或與一種或一種以上改性劑一起進(jìn)行。各種成分的用量與類似成分的常見商業(yè)用量一致，而各種成分的比例可相應(yīng)變化。
所述漆酶的應(yīng)用，是對(duì)傳統(tǒng)的H2O2的使用的一各種改進(jìn)，在使用H2O2時(shí)會(huì)損傷毛發(fā)，而且使用它還需要高pH，這樣也會(huì)損傷毛發(fā)。相反，與漆酶的反應(yīng)可在堿性、中性或者甚至在酸性pH條件下進(jìn)行，而且氧化所需的氧氣來自空氣，而不是進(jìn)行苛刻的化學(xué)氧化作用。使用所述多孔菌屬漆酶所產(chǎn)生的結(jié)果，不論在顯色方面，還是在耐洗性和耐曬性方面，都可與使用H2O2所產(chǎn)生的效果媲美。另一種商業(yè)優(yōu)勢(shì)是，可用一個(gè)容器包裝在沒有氧氣的條件下同時(shí)盛放漆酶及其前體，這種安排不可能用于H2O2的包裝。
本發(fā)明的漆酶還可用于存在于液體中的酚類或苯胺類化合物的聚合作用。這種用途的一個(gè)例子是，用它處理果汁，如蘋果汁，這樣，所述漆酶可加快果汁中的酚類化合物的沉淀，從而產(chǎn)生一種更為穩(wěn)定的果汁。這類應(yīng)用披露了下列文獻(xiàn)中Stutz，F(xiàn)ruit Processing 7/93，248～252，1993；Maier等，Dt.Lebensmittel-rindschau 86(5)137-142，1990；Dietrich等，F(xiàn)luss.Obst 57(2)67-73，1990。
漆酶，如多孔菌屬漆酶還可用于土壤解毒(Nannipieri等，J.Environ.Qual.20510-517，1991；Dec和Bollag，Arch.Environ.Contam.Toxicol.19543-550，1990).
通過下面的非限定實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例I.分離Polyporus pinsitus漆酶材料和方法1.酶促試驗(yàn)除非另有說明，在本申請(qǐng)的所有實(shí)施例中，漆酶活性是按下述方法用丁香醛連氮和2，2′-雙連氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)測(cè)定的。使用19μM底物，在530nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)丁香醛連氮的氧化。在30℃溫度下，在25mM乙酸鈉、40μM硫酸銅、pH5.5的溶液中，其活性用LACU(μmole/分鐘)表示。采用Britton和Robison(B&R)緩沖液進(jìn)行pH特征研究，這種緩沖液是按照披露于Quelle，Biochemisches Taschenbuch，H.M.Raven，II.Teil，s.93u.102，1964中的方法制備的。ABTS氧化作用，是使用0.1mM ABTS，在0.1MNaAc(pH5.0)中，在室溫下進(jìn)行的，通過在96孔滴定板(Costar)上監(jiān)測(cè)ΔAbs405或在石英比色杯中監(jiān)測(cè)ΔAbs418。重疊ABTS氧化酶活性試驗(yàn)是這樣進(jìn)行的將冷卻的ABTS-瓊脂糖(0.03～0.1gABTS，1g瓊脂糖、50ml H2O、加熱溶化瓊脂糖)傾注在天然IEF凝膠或PAGE上，并在室溫下保溫。
2.漆酶的初步分離為了提取所述漆酶，在一個(gè)超濾器(緩慢過濾)上用HFSC過濾800ml培養(yǎng)液。在一個(gè)帶有GR81PP膜的Amicon cell上，將所得到的澄清濾液濃縮并洗滌至72ml的體積。
將1ml漆酶試樣同用0.1M磷酸鹽(pH7)平衡過的Q-SepharoseHP(Pharmacia，Sweden)柱結(jié)合，并用NaCl梯度液洗脫結(jié)合上去的漆酶?？偣矊?duì)10×1ml的樣品進(jìn)行提純，收集，濃縮并通過超濾洗滌，超濾時(shí)使用分子量截?cái)嘀禐?kD的膜。
3.二次提純?cè)诙翁峒儠r(shí)，通過超濾對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾和濃縮。原料中含187LACU/ml。所得濃縮液在一個(gè)Propex23濾器(P&S Filtration)上，用3％Hyflo Cuper-Cel(HSC；Celite Corporation)進(jìn)行快速過濾，隨后在一個(gè)Filtron濾器上進(jìn)行兩次超濾，使用兩個(gè)膜，每個(gè)膜的分子量截?cái)嘀禐?kD。把所得到的樣品(2.5mS/cm，pH7.0，4℃)加到一個(gè)130ml Q-Sepharose柱上，該柱用磷酸鈉(1.1mS/cm，pH7.0)平衡過。在這種條件下，漆酶不與上述柱結(jié)合，但在加入并用平衡緩沖液洗滌時(shí)緩慢地從柱上洗脫，以致只能與其它棕色材料部分分離。
將這種部分提純的1.0mS的制劑(在20℃下pH7.0)加到Q-Sepharose柱上。該柱用20mM磷酸鈉(2.2mS，pH7.0)平衡。在這種條件下，漆酶與柱結(jié)合，并可由0-1 M NaCl梯度以20倍的柱體積洗脫。
3、序列分析為了進(jìn)行內(nèi)肽序列分析，用胰蛋白酶消化純化的蛋白質(zhì)，然后用HPLC提純肽。在一臺(tái)Applied Biosystem473A序列測(cè)定儀上分析純化的肽的序列。
B、結(jié)果和討論1、初步特征分析初步提純的總產(chǎn)率大約為50mg(在A280nm處測(cè)得)。純化的酶為濃藍(lán)色，而且在SDS-PAGE上大約65kd的位置僅有兩條極為接近的帶。用含有底物的天然PAGE進(jìn)行的疊層試驗(yàn)表明，兩條帶對(duì)ABTS都有漆酶活性。吸收光譜表明，除了在A280nm處有吸收外，純化的漆酶在約600nm處也有吸收。
2、序列分析對(duì)初步純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行N-末端測(cè)定表明，有一個(gè)單一序列
Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-Ala-Val-Ser-Pro-Asp-Gly-Phe-Pro…由于該N-末端序列并非可用于構(gòu)建探針的理想序列，又進(jìn)行了胰蛋白酶消化的其它試驗(yàn)，隨后再對(duì)所得片段進(jìn)行進(jìn)一步提純(按上述方法)和測(cè)序。
2、二次提純和特征分析在二次提純時(shí)，由另一個(gè)Q-Sepharose層析步驟產(chǎn)生以下洗脫庫(kù)(pools)。
Q-Sepharose-2-庫(kù)-1 40ml 112LACU 47LACU/A280Q-Sepharose-2-庫(kù)-3 80ml 385LACU 65LACU/A280洗脫產(chǎn)率大于加樣量的80％。高度純化的制劑 Q-Sepharose-2-庫(kù)-3的A280＝5.9，而A280/A260＝1.4。以蛋白質(zhì)計(jì)算，原料中漆酶的純度極高，但原料為非常深的棕色。在SDS-PAGE上可見到兩條帶，一條65kD的主帶，和一條較小的62kD的帶。采用陰離子層析，在第一個(gè)峰(Q-Sepharose-2-庫(kù)-1)中，僅能看到主帶，而在第二個(gè)峰(Q-Sepharose-2-庫(kù)-3)中，兩條帶都可以看到。
3、序列測(cè)定了若干內(nèi)肽序列，并與Coriolus hirsutus(Ch)漆酶序列進(jìn)行比較。鑒定的片段如下Tryp 13Ser-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Ala-Ala-Asp-LeuTryp 14Ser-Ala-Gly-Ser-Thr-Val-Tyr-Asn-Tyr-Asp-Asn-Pro-Ile-Phe ArgTryp 16序列1Ser-Thr-Ser-Ile-His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-Gln-Lys序列2Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-ValTryp 18Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-AsnTryp 19序列1Leu-Gly-Pro-Ala-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Leu-Ile-序列2Phe-Gln-Leu-Asn-Val-Ile-Asp-Asn-Asn-Thr-Thr-His-Thr-MetTryp 25Tyr-Ser-phe-Val-Leu-Glu-Ala-Asn-Gln-Ala-Val-Asp-Asn-Tyr-Trp-Ile-ArgTryp 27Gly-Thr-Asn-Trp-Ala-Asp-Gly-Pro-Ala-pheII.Polyporus pinsitus漆酶cDNA克隆的分離A、材料和方法1、RNA制備用鈲鹽/CsCl緩沖法，從10g在有二甲代苯胺誘導(dǎo)的條件下生長(zhǎng)6.5小時(shí)的P.pinsitus菌絲體中提取RNA.在一個(gè)寡脫氧胸苷酸柱上對(duì)所得RNA進(jìn)行聚腺苷酸(Poly-A)選擇，采用標(biāo)準(zhǔn)條件。得到120μg mRNA，并以5μg的試樣在-80℃下呈冷凍顆粒形式保存。
2、單鏈cDNA按照生產(chǎn)商的說明，用反轉(zhuǎn)錄酶“Super Script”(BRL)合成單鏈cDNA。
3、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建用庫(kù)存的IV cDNA試劑盒(Invitrogen)構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù)。得到50個(gè)cDNA庫(kù)，每庫(kù)含有大約5000個(gè)轉(zhuǎn)化體。
4、PCR在下列標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR100pmol各種引物，10μl10×PCR緩沖液(Perkin-Elmer)，40μl dNTP 0.5mM，2μl單鏈cDNA(或約100ng染色體DNA或100ngPCR片段)，用H2O把體積調(diào)至100μl，2.5UTaq聚合酶。進(jìn)行3次。(40℃/2分鐘，72℃/2分鐘，94℃/1分鐘)循環(huán)，接著再進(jìn)行30次(60℃/2分鐘，72℃/2分鐘，94℃/1分鐘)循環(huán)。
B、結(jié)果和討論1、克隆P.pinsitus漆酶用引物#3331ACCAGNCTAGACACGGGNTC/AGATACTG/ACGNGAGAGCGGAC/TTGCTGGTCACTATCTTCGAAGATCTCG和引物#3332CGCGGCCGCTAGGATCCTCACAATGGCCAA/CTCTCTG/CCTCG/ACCTTC.進(jìn)行PCR。獲得一條清晰的約1500bp的帶。用NotI/Hind III消化這種DNA，并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離。對(duì)上帶(片段#42)進(jìn)行提純，并將其克隆到曲霉屬載體pHD423上。未得到轉(zhuǎn)化體。為了克隆該片段，進(jìn)行了幾種試驗(yàn)，包括用限制酶進(jìn)行再消化，末端磷酸化，補(bǔ)充克列諾(Klenow)片段，和在SmaI裂解的puC18上進(jìn)行平端克隆，但均未成功。用根據(jù)Coll等披露的漆酶制備的漆酶探針雜交，結(jié)果表明，上述PCR產(chǎn)物可能是P.pinsitus漆酶。在試圖克隆該P(yáng)CR片酸的新的努力中，進(jìn)行一種新的PCR反應(yīng)，采用與片段#42相同的條件。結(jié)果又得到約為1 500bp的片段(片段#43)。這一次是用Hind III/BamHI裂解該片斷，并將其同Hind III/BamHI裂解的pUC18連接。發(fā)現(xiàn)3個(gè)克隆#43-/A，-B、-G中帶有1500bp的片段。部分序列分析結(jié)果表明，這些片段與漆酶有關(guān)。
2、P.pinsitus漆酶的表達(dá)為了表達(dá)所述漆酶，將片段#43與來自一種43 KD纖維素酶的信號(hào)序列連接，將引物pHD433(TAGCGGATCCCACAATGCGTTCCTCCCCCCTCCTCCCGTCCGCCGTTGTGGCCGCCCTGCCGGTGTTGGCCCTTGCCGGCATTGGGCCCGTCGCGGACC)用于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)，采用一種pUC正向引物(NewEngland Biolabs)。為了減少用到有錯(cuò)誤的DNA的危險(xiǎn)，將3個(gè)克隆都用作模板。
在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的DNA帶有引物pHD433和模板43-A和43-G，用Hind III/BamHI對(duì)所得DNA進(jìn)行裂解，并將其克隆到曲霉屬表達(dá)載體pHD414(在下文詳細(xì)講述)上。得到了幾個(gè)轉(zhuǎn)化子。
將克隆pHD433/43A-1，2，pHD433/43G-2，-3轉(zhuǎn)入米曲霉中。對(duì)每種轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體(3-10個(gè))的漆酶產(chǎn)生進(jìn)行分析。僅在pHD433/43G-3的轉(zhuǎn)化體上測(cè)得活力。在amdS平皿上對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體(編號(hào)1，4，6)進(jìn)行再次分離，并再次試驗(yàn)。在另一輪轉(zhuǎn)化中，又得到10個(gè)pHD433/43G-3的轉(zhuǎn)化體?？寺?20、23、26、28和29為陽(yáng)性。對(duì)這些克隆進(jìn)行再次分離，并通過在ABTS分析(pH4.5)中的顯色反應(yīng)，對(duì)兩個(gè)分離克隆的漆酶表達(dá)進(jìn)行半定量分析。有幾個(gè)克隆以+-+++的規(guī)模表現(xiàn)出中到強(qiáng)的漆酶表達(dá)力。
進(jìn)行進(jìn)一步克隆，以鑒定完整長(zhǎng)度的克隆。以片段#42-4為探針，對(duì)由大約350,000個(gè)轉(zhuǎn)化體組成的二甲苯胺誘導(dǎo)的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。檢測(cè)到100個(gè)以上陽(yáng)性克隆。對(duì)這些克隆進(jìn)行純化、再篩選，并用Southern印跡進(jìn)行分析。通過DNA序列測(cè)定對(duì)最長(zhǎng)的兩個(gè)克隆作進(jìn)一步分析。發(fā)現(xiàn)最長(zhǎng)的兩個(gè)克隆相同，而且，在其3′末端有一個(gè)聚腺苷酸片段，并且是在氨基酸末端的第4個(gè)氨基酸開始。由不同的克隆測(cè)定部分DNA序列。
然后，將pHD433/43G-3用于進(jìn)一步的克隆研究，如在下面的第IV部分將要講到的。
III.其它P.pinsitus漆酶野生型酶的純化和特征分析A、材料和方法1、培養(yǎng)條件用幾個(gè)取自一周齡P.pinsitus的PDA培養(yǎng)皿的瓊脂塊接種搖瓶(250ml培養(yǎng)基/2.8升體積的擋板式搖瓶)。每升培養(yǎng)基中含有10g葡萄糖、2.5gL-天冬酰胺、0.2g L-苯丙氨酸、2.0g酵母提取物、2.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、2.0mlAMG微量金屬元素、0.002g CuSO4·7H2O、1.0g檸檬酸，用自來水配制，高壓滅菌之前pH5.0。培養(yǎng)物在18～22℃溫度下在一臺(tái)旋轉(zhuǎn)搖床上以較低的速度(～100rpm)振蕩。7天以后，通過加入0.25ml5N NaOH把每只搖瓶里的pH調(diào)至6.0左右，并通過向每只搖瓶中添加0.5ml 2，5-二甲代苯胺儲(chǔ)液(以1∶10的比例把二甲代苯胺稀釋在乙醇中)誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物。將搖瓶再培養(yǎng)24小時(shí)，這時(shí)，回收每只搖瓶里的培養(yǎng)上清液。
2、材料用作緩沖液的化學(xué)試劑起碼是試劑級(jí)的商業(yè)化產(chǎn)品。Endo/N-葡糖苷酶F購(gòu)自Boehringer-Mannheim公司。在PharmaciaFPLC上進(jìn)行層析。光譜分析是在一臺(tái)分光光度計(jì)(ShimadzuPC160)上進(jìn)行，或是在一臺(tái)微量板閱讀儀(Molecular Device)上進(jìn)行。
3、純化先用紗布過濾培養(yǎng)液，并以1000×g的速度離心，以除去膠凝狀粉紅色二甲代苯胺聚合物。隨后用Whatman#2濾紙過渡上清液，并在4℃溫度下，在S1 Y100(Amicon，Spiral concentrater)上由1500ml濃縮至250ml體積。用水稀釋濃縮液，直到0.8mS(從2.5mS開始)，然后在S1Y100上濃縮至250ml。將在-20℃下冷凍過夜的洗滌液解凍，并用Whatman#濾紙過濾，以除去殘余的粉紅色材料，然后用NaOH把pH值從6.1調(diào)整到7.7。得到275ml、0.8mS的黃色液體，將其加到Q-Sepharose XK-26柱(約有64ml凝膠)，該柱用10mM Tris-HCL，pH7.7，0.7mS平衡過。通過用平衡緩沖液加注和洗滌，得到第一份流經(jīng)該柱的活性漆酶部分。用由平衡緩沖液配成的0-0.5M的線性梯度NaCl溶液，以8.8倍的床體積進(jìn)行洗脫。第二和第二份活性部分分別被0.15M和0.35M的NaCl洗脫。隨后在用2M NaCl和1mM NaOH依次洗脫時(shí)，未再檢測(cè)到活性部分。收集活性部分，調(diào)至約10mS，在Centricon-10(Amicon)上濃縮，然后上Superdex75(HR10/30，24ml，Pharmacia)柱，該柱用10mM Tris-HCl、0.15M NaCl、pH8，14mS平衡過。在用加樣緩沖液洗脫時(shí)，所有3個(gè)Q-Sepharose洗脫的漆酶部分都被以相同的洗脫體積洗脫，表明它們具有極為相似的天然分子量。在SDS-PAGE上測(cè)定所得漆酶的純度。
4、蛋白質(zhì)分析在一個(gè)Mini Protean II和一個(gè)Model 111 Mini IEFCell(Bio-Rad)上進(jìn)行PAGE和天然IEF。在一個(gè)Mini trans-blotCell(Bio-Rad)上，用堿性磷酸酶分析試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行Western吸印。在吸印期間，把一級(jí)抗體稀釋1000倍。在一臺(tái)Applied Biosystems(ABT)476A蛋白質(zhì)測(cè)序儀上進(jìn)行N-末端測(cè)序，采用液相TFA輸送進(jìn)行裂解，并用聯(lián)機(jī)HPLC鑒定PTH-氨基酸。按照生產(chǎn)商的說明使用Standard Fast Cycle和Pre-MixBuffer System。按下述方法用糖苷酶進(jìn)行脫糖基化將3μg蛋白質(zhì)和3.6單位的糖苷酶在含0.25M NaAc，pH5，20mM EDTA，0.05％2-巰基乙醇的溶液中在37℃下保溫18小時(shí)，分別將卵清蛋白和牛血清白蛋白用作正、負(fù)對(duì)照，并通過SDS-PAGE測(cè)遷移率。
用購(gòu)自Hewlett Packand的Amino Quant 1090 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行氨基酸分析，以測(cè)定消光系數(shù)。用MDS-2000 hydrolysis-station(CEM，Matthews，NC)對(duì)凍干的樣品進(jìn)行由微波促進(jìn)的蒸汽相水解。以含有1％苯酚的6N HCl作為清除劑，將其用于產(chǎn)生酸蒸汽。在70psi(約148℃)壓力下，水解時(shí)間為20分鐘。將水解過的樣品凍干，并再溶解于20μl 500pmol/μl肌氨酸和正纈氨酸溶液中，并把這兩種氨基酸作為內(nèi)標(biāo)。按照生產(chǎn)商的說明注射1μl樣品，并進(jìn)行分析。
B、結(jié)果和討論1、純化前面進(jìn)行過特征分析的P.pinsitus漆酶的PI值大約為3.5。不過，在以pH7.7預(yù)平衡過的Q-Sepharose的流通部分中，檢測(cè)到顯著的漆酶活性。在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，在原先預(yù)計(jì)的活性部分之前，一個(gè)更有活性的部分被從柱上洗脫。UV-可見光譜和SDS-PAGE分析表明，3個(gè)部分都是主要含有漆酶。經(jīng)凝膠過濾進(jìn)一步提純之后，在天然未變性條件下檢測(cè)兩個(gè)新部分的不同pI值，發(fā)現(xiàn)與洗脫順序一致。
2、特征分析從Q-Sepharose洗脫液中產(chǎn)生的純漆酶制劑，在SDS-PAGE上，在大約63kDa處有一條相當(dāng)完美的帶。根據(jù)在SDS-PAGE上遷移率的變化，脫糖基化檢測(cè)到約14％(w/w)的碳水化合物。在進(jìn)行天然-IEF分析時(shí)，上述漆酶制劑具有pI6～6.5、5～6.5和3.5的幾條帶。ABTS-瓊脂糖重疊試驗(yàn)表明，所有的帶都有活性。在IEF條件下，每一種形式又表現(xiàn)出多種同工型。
中性和酸性形式在605和275nm處有典型的UV-可見光譜。A275/A605之比為30～40。酸-中性型在276nm處有一個(gè)峰，而在600nm左右有一個(gè)峰肩。
N-末端序列分析表明，中性型中-酸性型的前29個(gè)殘基相同(表1)。酸型的N-末端與先前分析過的特征型100％的相符。三種型都能與用先前的特征型制備出的抗體進(jìn)行相當(dāng)好的交叉反應(yīng)性。
表1P.pinsitus漆酶的結(jié)構(gòu)和酶解特性型 N-末端LACUΔA405min-1(ABTS)酸性GIGPVA D LTITNAAVSPDGFSRQAVVVNG 92 4000酸性A*****(*)*VVA**P******L*D*I****75 4000中性中性A*****(*)*VVA**P******L*D*I****32 1000*與酸性型比較為相同殘基 ()弱信號(hào)3、漆酶活性通過ABTS和丁香醛連氮氧化作用試驗(yàn)3種型的比活性(每A275).3種型的pH活性曲線的形狀和最佳值非常相近在進(jìn)行ABTS和丁香醛連氮氧化時(shí)，均分別在pH≤4和pH5～5.5處最佳。
IV.多拷貝P.pinsitus漆酶和基因的分離A、材料和方法1、菌株將下列菌株用在以下所述方法中E.coli K 802(el4-(mrca)，mcrB，hsdR2，galK2，galT22，supE44，metB1；Clonetech)；E.coli XL-1 Blue(recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Lac〔F′proAB，lacIqZDM15，Tn10(tetr)〕；Stratagene)和P.pinsitus CBS 678.70。
2.基因組DNA分離讓P.pinsitus培養(yǎng)物在500mlYG(0.5％酵母提取物，2％葡萄糖)中，在室溫下生長(zhǎng)3-4天。通過米拉布(miracloth)收集菌絲體，用TE洗兩遍，并在液氮中快速冷凍。將冷凍的菌絲體放在-80℃下保存。為了分離DNA，用電動(dòng)咖啡磨把菌絲體磨成細(xì)末。將粉末狀菌絲體再懸浮于TE中，使終體積為22ml。加入4ml 20％SDS，并通過倒位混合，然后在室溫下保溫10分鐘。用苯酚/氯仿溫和提取所得樣品，并離心分離水相和有機(jī)相。收集水相，加入400μl蛋白酶A(10mg/ml儲(chǔ)液)。將樣品在37℃下保溫30分鐘，然后用苯酚/氯仿抽提。往水相里加入0.1體積3MNaAc，pH5.2和2.5體積的95％乙醇，并在-20℃下冷凍1小時(shí)。離心沉淀DNA后，將沉淀物再懸浮于6mlTE中，加入200μl煮沸的RNase A(10mg/ml儲(chǔ)液)。在37℃下保溫之后，加入100μl蛋白酶A(10mg/ml儲(chǔ)液)，隨后在37℃下保溫30分鐘。用苯酚/氯仿將該樣品抽提2次。向水相中加入0.1體積的3M NaAc和2.5體積95％的乙醇，并將樣品在-20℃下冷凍1小時(shí)。離心以后，將沉淀輕輕地懸浮在400μlTE中，并加入40μlNaAc和1ml95％乙醇。離心使DNA沉淀，并用70％乙醇洗滌沉淀。將最終的沉淀再懸浮于250μl TE中。
3、RNA制備從菌絲體中提取RNA，菌絲體是從P.pinsitus培養(yǎng)物中獲得，培養(yǎng)物通過加入2，5-二甲代苯胺的方式誘導(dǎo)過漆酶的表達(dá)，或未誘導(dǎo)過。洗滌菌絲體，并在液氮中快速冷凍。用一臺(tái)電動(dòng)咖啡磨把冷凍的菌絲體磨成細(xì)末。馬上把菌絲體末懸浮于20ml抽提緩沖液(0.2M Tris-HCl，0.25M NaCl，50mM EGTA，0.8％萘磺酸三-異丙酯，4.8％對(duì)-氨基水楊酸pH8.5)中。所有用于提取RNA的溶液都是用由焦碳酸二乙酯(DEP)處理過的水配制的。將樣品放置在冰上，并加入0.5體積TE飽和的苯酚/氯仿。倒位2分鐘充分混合樣品，并通過離心進(jìn)行相分離。保留水相，用2ml抽提緩沖液抽提有機(jī)相兩次，并在68℃下保溫5分鐘。離心進(jìn)行相分離，爾后收集水相，并用苯酚/氯仿抽提幾次，直至界面上不再有任何蛋白質(zhì)。向水相中加入0.1體積的3M NaAc，pH5.2和2.5體積的95％乙醇，使RNA沉淀，并把樣品放在-20℃下冷凍2小時(shí)。沉淀RNA，并再懸浮于含有RNase抑制劑的DEP水中。
4、DNA序列分析核苷酸序列是這樣測(cè)定的利用TAQ聚合酶循環(huán)測(cè)序法，用熒光標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行測(cè)序，而且，反應(yīng)是在一臺(tái)AppliedBiosystems自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Model 363A，Version 1.2.0)上電泳進(jìn)行。
5、制備基因組文庫(kù)構(gòu)建2個(gè)大小選擇的P.pinsitus基因組文庫(kù)。一個(gè)5～6kbBam HI片段的文庫(kù)建在p Bluescript+上。用BamHI消化基因組DNA，并在制備瓊脂糖(IBI)凝膠上對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳。將帶有5-6BamHI片段的部分從電泳凝膠上切下來。用Geneclean試劑盒(BIO 101)從凝膠中分離DNA.將得到的DNA連接到預(yù)先用Bam HI消化過的p Bluescript質(zhì)粒上，并用BAP(GIBCOBRL)脫磷酸化，用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli XL-1 Blue感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)，得到12,000個(gè)白色菌落。
一個(gè)7-8kb的Bam HI/Eco RI片段的文庫(kù)建在pUC118上。用Bam HI和Ec0RI消化10μg基因組DNA，并用BAP(GIBCOBRL)進(jìn)行處理。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli XL-1 Blue細(xì)胞(Stratagene)，所得文庫(kù)中含有大約8000個(gè)轉(zhuǎn)化體。
為了在λEMBL4上構(gòu)建總基因組文庫(kù)，用Sau 3A對(duì)P。pinsitus基因組DNA進(jìn)行部分消化。消化以后，在制備低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上對(duì)DNA進(jìn)行電泳，并把含有9～23kb大小的DNA的帶從凝膠上切下來。用瓊脂糖(New England Biolabs)從凝膠中提取DNA。按照供應(yīng)商的說明分離EMBL4臂(Clonetech)。用Gigapack II試劑盒(Stratagene)在體外包裝連接產(chǎn)物。用E.coliK802細(xì)胞滴定所建的文庫(kù)。估計(jì)未擴(kuò)增的文庫(kù)中具有35,000個(gè)獨(dú)立的重組體。用E.coli K802細(xì)胞擴(kuò)增該文庫(kù)。
6、Southern和Northern吸印在瓊脂糖凝膠上，在TAE緩沖液中使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)DNA樣品進(jìn)行電泳。RNA樣在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。通過在堿性條件下的毛細(xì)作用或一個(gè)真空印跡裝置把DNA和RNA凝膠轉(zhuǎn)移到Zeta-Probe膜(BIO-RAD)上。轉(zhuǎn)移之后，對(duì)DN A凝膠進(jìn)行UV交聯(lián)。在65℃下對(duì)轉(zhuǎn)移的印跡進(jìn)行預(yù)雜交，預(yù)雜交在1.5×SSPE，1％SDS，0.5％脫脂奶粉和200μg/ml鮭精DNA的溶液中進(jìn)行1小時(shí)。將放射性探針直接加入預(yù)雜交溶液里，在65℃下繼續(xù)進(jìn)行雜交過夜。在65℃下用2×SSC洗滌印跡5分鐘，再在65℃下用0.2×SSC，1％SDS，0.1％焦磷酸鈉洗滌30分鐘，兩次。
放射性標(biāo)記的探針是用α-32P-d CTD和一種切口平移試劑盒(GIBCO-BRL)制備的。
7、文庫(kù)篩選為了篩選大小選擇的5-6kb BamHI和7-8kb BamHI/EcoRI文庫(kù)，將LB carb平皿上的大約500個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到Hybond N+濾膜(Amersham)上，采用的是標(biāo)準(zhǔn)方法。在中和以后，對(duì)上述濾膜進(jìn)行UV交聯(lián)。在65℃下對(duì)該濾膜進(jìn)行預(yù)雜交，預(yù)雜交在1.5×SSPE，1％SDS，0.5％脫脂奶粉，200μg/ml鮭精DNA中進(jìn)行1小時(shí)。將切口平移探針直接加進(jìn)預(yù)雜交溶液時(shí)，在65℃下進(jìn)行雜交過夜。
為了篩選EMBL里的基因組文庫(kù)，將擴(kuò)增文庫(kù)的適當(dāng)稀釋液與E.coli K802細(xì)胞一起在100mM NZY頂層瓊脂糖上進(jìn)行平皿培養(yǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)方法把菌斑轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜(Amersham)上。用標(biāo)準(zhǔn)的UV交聯(lián)法把DNA交聯(lián)在上述膜上。用與上文相同的條件對(duì)該膜進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。結(jié)果和討論1、多拷貝漆酶基因的分離為了進(jìn)行Southern分析，用幾種不同的限制酶消化P.pinsitus基因組DNA。用由α-32P-dCTP標(biāo)記過的cDNA插入片段(從PYES載體上分離的Bam HI/SphI片段)檢測(cè)印跡。按上文所述方法對(duì)印跡進(jìn)行雜交和洗滌。cDNA能與大多數(shù)酶的幾種限制片段雜交，這意味著在該基因組中有多個(gè)漆酶基因。因?yàn)閏DNA可與一個(gè)約5.5kb的BamHI片段雜交，所以構(gòu)建了一個(gè)來自P.pinsitus的5-6kb BamHI片段的文庫(kù)。
2、基因組文庫(kù)的篩選篩選基因組文庫(kù)的結(jié)果歸納在表2中。用由32P標(biāo)記過的原始cDNA克隆篩選5-6kb的BamHI大小選擇文庫(kù)。通過在65℃下雜交篩選到大約30,000個(gè)克隆。從兩個(gè)陽(yáng)性克隆中分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI消化，以檢測(cè)插入片段的大小。這兩個(gè)克隆都帶有大約5.5kb的BamHI插入片段。從兩端對(duì)克隆的插入片段(LCC3)進(jìn)行測(cè)序；該序列與所述cDNA有同源性，但很顯然不是該cDNA所編碼的漆酶。LCC3的部分序列還表明，LCC3pUC118克隆不具有完整的基因。
通過對(duì)BamHI/EcoRI雙消化的DNA進(jìn)行的Southern印跡分析表明，該cDNA能同一個(gè)大約7.7kb的片段雜交。在pUC118上構(gòu)建的一個(gè)大小選擇的文庫(kù)帶有7-8的Bam HI/EcoRI片段?？偣搏@得大約8000個(gè)獨(dú)立的克隆，并用由32P標(biāo)記的插入片段進(jìn)行雜交。從陽(yáng)性菌落中分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI和EcoRI進(jìn)行消化。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行的限制分析表明，可將其分成兩類。一類(LCC4)帶有四個(gè)相同的克隆，并有一個(gè)能與所述cDNA雜交的約7.7kb的Bam HI/EcoRI插入片段。另一類(LCC1)帶有兩個(gè)相同的克隆，并有一個(gè)能與所述cDNA雜交的約7.2kb的插入片段。對(duì)克隆LCC1和LCC4進(jìn)行的部分DNA序列分析表明，克隆21是原始cDNA的基因組克隆，而LCC4編碼另一種漆酶。LCC1的部分DNA序列顯示，pUC118克隆不具有完整的基因，而且，需要在EcoRI位點(diǎn)上游的一個(gè)片段。
同時(shí)，構(gòu)建了大小選擇的7-8kb BamHI/EcoRI文庫(kù)，在EMBL4上構(gòu)建的P.pinisitus基因組文庫(kù)帶有大約35,000個(gè)獨(dú)立的重組噬菌體。挑選陽(yáng)性噬菌斑，并進(jìn)行純化。從純化的噬菌體裂解物中提取DNA。對(duì)EMBL DNAs的限制消化證實(shí)，有三類克隆。第一類(11GEN)由兩個(gè)同胞構(gòu)成，其插入片段帶有大小與LCC1相同的BamHI/EcoRI片段，它能與LCCI插入片段雜交。另一類(12GEN)帶有一個(gè)克隆，它具有不同于11GEN類型的限制圖譜，而且，其插入片段帶有一個(gè)約5.7kb的BamHI/EcoRI片段。第三類由一個(gè)單一克隆形成，其插入片段帶有一個(gè)大約3.2kb的Bam HI/EcoRI片段，它能與LCC1插入片段雜交。DNA序列分析證實(shí)，克隆11GEN帶有LCC1 BamHI/EcoRI片段和5′與3′側(cè)翼區(qū)。還證實(shí)克隆12GEN帶有一部分LCC1插入片段。
為了克隆完整基因，還用LCC3 BamHI插入片段篩選P.pinisitus EMBL基因組文庫(kù)。平皿培養(yǎng)大約30,000個(gè)噬菌斑并轉(zhuǎn)移用于進(jìn)行雜交。鑒定并提純5個(gè)能與LCC3(BamHI/EcoRI)插入片段雜交的噬菌斑。從純化的噬菌體儲(chǔ)液中提取DNA。對(duì)P.pinisitus基因組DNA所做的Southern分析表明，LCC3 BamHI插入片段能與一個(gè)大約7kb的EcoRI片段雜交。限制消化和Southern分析表明，上述克隆中有4個(gè)帶有能與EcoRI/BamHI(16kb)片段雜交的片段，而且，這些克隆分成3種類型。第一類由一個(gè)單一的克隆(LCC5)構(gòu)成，其插入片段帶有一個(gè)能與LCC3 BamHI/EcoRI片段雜交的3kb的EcoRI片段。另一類是由克隆(LCC2)構(gòu)成，其插入片段帶有一個(gè)能與LCC3BamHI/EcoRI插入片段雜交的大約11kb的EcoRI片段。第三類由兩個(gè)克隆構(gòu)成，這兩個(gè)克隆不同，但帶有很多相同的限制片段，這兩個(gè)克隆都帶有能與LCC3插入片段雜交的大約7.5kb的EcoRI片段。對(duì)第三種類型進(jìn)行進(jìn)一步分析還表明，它們與克隆LCC4相同。對(duì)LCC5和LCC2所進(jìn)行的部分DNA序列分析證實(shí)，這兩個(gè)克隆都編碼漆酶；但它們都不與上面提到的任何漆酶基因(LCC1、LCC3或LCC4)相同。就此而言，克隆了5個(gè)不同的漆酶基因；不過，由LCC5和LCC2亞克隆的片段上不具有完整基因。
通過對(duì)來自克隆LCC5的3kb EcoRI片段進(jìn)行的DNA序列分析證實(shí)，N-末端的大約200bp的片段在E.coRI位點(diǎn)的上游。將一個(gè)來自LCC5的380bp的EcoRI/MluI片段用于鑒定一個(gè)Mlu1片段的亞克隆，該片段來自LCC5 EMBL克隆。對(duì)來自LCC5 EMBL克隆的一個(gè)約4.5kb的MluI片段進(jìn)行亞克隆，以便進(jìn)行序列分析，證實(shí)其帶有N-末端序列。
為了克隆半個(gè)LCC3漆酶基因的N-末端，用一個(gè)來自LCC3pUC118克隆的約750bp的BamHI/StuI限制片段檢測(cè)P.pinsitusEMBL基因組文庫(kù)。對(duì)大約25,000個(gè)噬菌斑進(jìn)行篩選，有5個(gè)能與上述探針雜交。在進(jìn)行進(jìn)一步的提純時(shí)，這些克隆中僅有3個(gè)仍為陽(yáng)性。其中，有兩個(gè)克隆產(chǎn)生極強(qiáng)的信號(hào)，而對(duì)從這些噬菌體中分離出的DNA所做的限制消化表明，在這兩個(gè)克隆的插入片段上都有一個(gè)約750bp的BamHI/StuI片段，而且，這兩個(gè)克隆不相同，但重疊。根據(jù)Southern分析的結(jié)果，對(duì)來自這些克隆的一個(gè)約8.5kb的片段進(jìn)行亞克隆，以便作序列分析。證實(shí)EcoRI片段帶有完整的基因。
為了克隆半個(gè)LCC2漆酶基因的N-末端，用一個(gè)來自EMBLLCC2克隆的約680bp的EcoRI/PvuI片段檢測(cè)建在EMBL4上的P.pinsitus基因組文庫(kù)。通過在65℃下雜交對(duì)30,000個(gè)噬菌斑進(jìn)行篩選，有15個(gè)噬菌斑能與上述探針雜交。對(duì)所有15個(gè)噬菌斑進(jìn)行純化，并提取DNA。根據(jù)限制圖譜，可將這些克隆分成4種類型，這些克隆中的7個(gè)均為同胞，并且與LCC2的原始EMBL克隆相同。第二種類型由3個(gè)同胞克隆構(gòu)成。對(duì)來自這一類型的一個(gè)約4kb的Hind III片段進(jìn)行亞克隆，以便進(jìn)行序列分析，證實(shí)其帶有半個(gè)LCC2的N-末端。第三種類型由一個(gè)單一的克隆構(gòu)成，不再對(duì)其作進(jìn)一步特征分析。
3、DNA序列分析按照在材料和方法部分所述的方法，測(cè)定5個(gè)基因組克隆的全DNA序列。對(duì)克隆LCC2的序列分析表明，它可能編碼從培養(yǎng)液中提取的第二種形式的漆酶(中性pI)，所述培養(yǎng)液來自按上述方法誘導(dǎo)過的P.pinsitus培養(yǎng)物。對(duì)所述中性pI漆酶的N-末端蛋白質(zhì)序列和預(yù)測(cè)的由LCC2編碼的蛋白質(zhì)的N-末端進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們相同。由克隆LCC2所編碼的蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)pI為5.95，它與測(cè)定的所述第二種形式的漆酶的實(shí)驗(yàn)pI(5.0～6.5)恰好吻合。圖1-5(SEQ ID NOS.1-5)表示DNA序列和基因組克隆的預(yù)測(cè)翻澤產(chǎn)物。對(duì)于LCC1來說，其成熟蛋白質(zhì)的N-末端通過蛋白質(zhì)測(cè)序和根據(jù)Von Hei jne規(guī)則預(yù)測(cè)在位置22上是Gly。所述N-末端為Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。對(duì)于LCC2來說，通過蛋白質(zhì)測(cè)序測(cè)定在其成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸的位置21上是Ala。所述N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-.對(duì)于LCC3來說，預(yù)計(jì)其成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸在位置22上是Ser，其N-末端為Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Glu-Leu-。對(duì)于LCC4來說，預(yù)計(jì)其N-末端氨基酸在位置23上是Ala，N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-。對(duì)于LCC5來說，預(yù)計(jì)其N-末端氨基酸在位置24上是Ala，N-末端為Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp。將所述基因的結(jié)構(gòu)組織和預(yù)測(cè)的由這些基因編碼的蛋白質(zhì)在表1中列出進(jìn)行比較。可以看出，所列出的5個(gè)基因具有不同的結(jié)構(gòu)，并編碼大小稍有差別的蛋白質(zhì)。還對(duì)預(yù)測(cè)的基因組克隆的蛋白質(zhì)和其它真菌漆酶進(jìn)行了比較。在表2中列表對(duì)預(yù)測(cè)的漆酶相互進(jìn)行了比較，并與其它真菌漆酶進(jìn)行了比較?？寺CC1(最先作過特征分析的誘導(dǎo)漆酶)與Coriolus hirsutus漆酶和PM1擔(dān)子菌漆酶(Coll等，Supra)之間的同一性最大(90％)。其它四種漆酶與C.hirsutus漆酶之間的同一性在64～80％之間。由LCC3編碼的漆酶與LCC1漆酶和表2中其它真菌漆酶的同一性最低。LCC2是按上述方法分離的另一種野生型漆酶；根據(jù)所分離克隆的N-末端序列還可以看出，“中性”和“酸中性”野生型漆酶是由LCC2序列編碼的同一種酶。表1P.pinsitus基因組克隆的結(jié)構(gòu)組織與預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的比較基因 #內(nèi)含子 預(yù)計(jì)蛋白前體的大小 預(yù)計(jì)成熟蛋白的大小預(yù)計(jì)的等電點(diǎn)21GEN8520499 4.4923GEN10 519498 5.9524GEN12 516495 5.2331GEN11 510488 4.0641GEN11 527504 4.07表2P.pinsitus漆酶與其它真菌漆酶的氨基酸同一性比較21GEN 23CEN 24GEN 31GEN 41GEN CRIPHA CRIPHE PBILAC PM121GEN ＿＿79％64％70％72％90％91％64％80％23GEN 79％＿＿65％66％69％80％81％62％74％24GEN 64％65％＿＿61％65％64％65％61％63％31GEN 70％66％61％＿＿75％69％70％64％69％41GEN 72％69％65％75％＿＿71％72％64％71％CRIPHA 90％80％64％69％71％＿＿99％64％80％CRIPHE 91％81％65％70％72％99％＿＿65％81％PBILAC 64％62％61％64％64％64％65％＿＿65％PM180％74％63％69％71％80％81％65％＿＿21GEN.23GEN.24GEN.31GEN和41GEN＝P.pinsitis漆酶克隆CRIPHA＝Coriolus hirsutis漆酶 ACRIPHE＝C.hirsutis漆酶 BPBILAC＝Phlebia radiata漆酶PM1＝擔(dān)子菌 PM1漆酶(CECT2971)
5、Northern印跡分析從菌絲體中提取RNA，菌絲體來自二甲代苯胺誘導(dǎo)過的培養(yǎng)物和來誘導(dǎo)過的培養(yǎng)物。電泳以后把RNA吸印到膜上，并用所述cDNA插入片段或一個(gè)帶有約100bp的23GEN啟動(dòng)子和其編碼區(qū)的前100個(gè)bp的小片段檢測(cè)所得印跡。一個(gè)大約1.8kb的轉(zhuǎn)錄物能同時(shí)與誘導(dǎo)的和非誘導(dǎo)的RNA樣品雜交；不過，該信息的轉(zhuǎn)錄，明顯會(huì)被向培養(yǎng)物中添加二甲代苯胺所誘導(dǎo)。
III.P.pinsitus漆酶在曲霉屬中的表達(dá)材料和方法1、菌株米曲霉A1560、米曲霉How B104(fungamy1缺陷型，pyrg)、米曲霉How B101 pyrg、黑曲霉Bo-1、黑曲霉B0-80、黑曲霉ATCC1040、黑曲霉NRRL337、黑曲霉NRRL326、黑曲霉NRRL2295、黑曲霉ATCC11358、黑曲霉NRRL322、黑曲霉AT10864、日本曲霉(A.japonicus)A1438、紅曲霉(A.phoenicis)、臭曲霉(A.foetidus)N953。
2、培養(yǎng)基用MY50培養(yǎng)基(每1升中含50g麥芽糖糊精，2gMgSO4·H2O、10g KH2PO4、2g K2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、2g尿素、pH6.0)對(duì)黑曲霉、臭曲霉和紅曲霉進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。用MY51(每1升中含30g麥芽糖糊精、2mg MgSO4、10gKH2PO4、2gK2SO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、1g尿素、2g(NH4)2SO4、pH6.0)對(duì)米曲霉A1560和HowB101菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。為了對(duì)米曲霉HowB104菌株進(jìn)行搖瓶分析，使用MY51麥芽糖培養(yǎng)基(與MY51相同，但含有50g麥芽糖而不是麥芽糖糊精)。為了對(duì)日本曲霉菌株進(jìn)行搖瓶分析，使用M400培養(yǎng)基(每1升中含50g麥芽糖糊精、2gMgSO4、2gKH2PO4、4g檸檬酸、8g酵母提取物、0.5ml微量金屬元素、2g尿素、pH6.0)。
將用于形成原生質(zhì)體和接下來的轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)過夜的培養(yǎng)物生長(zhǎng)在YEG(0.5％酵母提取物、2％葡萄糖)上。對(duì)于pyrg菌株來說，補(bǔ)充尿苷，使其終濃度為10mM。
3、篩選漆酶產(chǎn)生首先，在基本培養(yǎng)基平皿上篩選一級(jí)轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)基中含有1％葡萄糖，作為碳源，并含有1mM ABTS，用于檢驗(yàn)漆酶的產(chǎn)生。挑出能在平皿上產(chǎn)生綠色部分的轉(zhuǎn)化體，并在進(jìn)行搖瓶分析之前進(jìn)行孢子純化。
對(duì)搖瓶培養(yǎng)樣品進(jìn)行離心，以澄清培養(yǎng)液。用ABTS對(duì)稀釋或未稀釋過的培養(yǎng)液樣品進(jìn)行分析。
結(jié)果和討論1、在搖瓶中表達(dá)構(gòu)建的第一個(gè)表達(dá)載體是pDSY1，它帶有TAKA啟動(dòng)子、TAKA信號(hào)序列、P.pinsitus漆酶cDNA，在成熟N-末端的起始部分和AMG終止子。TAKA信號(hào)序列漆酶插入片段是分兩步構(gòu)建的。首先通過定點(diǎn)誘變，改變一個(gè)堿基，在漆酶成熟編碼區(qū)的bp107處開始產(chǎn)生一個(gè)AgeI位點(diǎn)，并在該漆酶終止子下游約120bp處產(chǎn)生一個(gè)NsiI位點(diǎn)(改變分別為ACG GGT→ACC GGT和TTC GCT→ATG CAT)。對(duì)漆酶上從SfiI位點(diǎn)開始并在107bp處的AgeI位點(diǎn)結(jié)束的一個(gè)小PCR片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該片段帶有一段TAKA信號(hào)序列，以及成熟漆酶cDNA的前面的約107bp。對(duì)該片段進(jìn)行的進(jìn)一步DNA序列分析表明，它發(fā)生了單一的堿基改變，這種堿基變化導(dǎo)致在成熟漆酶的位置9上Asn取代Thr。這種取代產(chǎn)生出一個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。將該P(yáng)CR片段和AgeI/NsiI片段克隆到用SfiI/NsiI消化過的pMWR1(圖6)上。載體pMR1帶有TAKA啟動(dòng)子，一部分TAKA信號(hào)序列(它在一個(gè)SfiI位點(diǎn)結(jié)束)，以及TAKA終止子，一個(gè)NsiI位點(diǎn)直接插在該終止子的5′末端。將所得到的表達(dá)載體(圖7)用于共轉(zhuǎn)化幾個(gè)宿主。用于曲霉屬菌株共轉(zhuǎn)化的方法如Christensen等(Supra)所述。
在第二個(gè)漆酶表達(dá)載體上，在DSY1上所發(fā)生的導(dǎo)致氨基酸位置9上Asn取代Thr的堿基變化，在PCR反應(yīng)中又恢復(fù)到野生型。除了上述單一堿基變化之外，第二個(gè)表達(dá)載體pDSY2與pDSY1相同。用pDSY2和帶有構(gòu)巢曲霉amdS基因的pTO90(WO91/17243)或帶有米曲霉pyrG基因的pSO2一起對(duì)3種不同的米曲霉菌株和幾個(gè)黑曲霉菌株進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。
在用DSY1和DSY2試驗(yàn)過的所有宿主中都觀察到漆酶的表達(dá)。產(chǎn)率范圍為0.1～12.0Δabs/分鐘/ml，在黑曲霉菌株中觀察到最高產(chǎn)率。
構(gòu)建一個(gè)pDSY10結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有TAKA啟動(dòng)子，漆酶全長(zhǎng)cDNA，包括其信號(hào)序列及AMG終止子。以lac1為模板對(duì)一個(gè)200bp的BamHI/AgeI片段進(jìn)行擴(kuò)增，該片段在緊鄰起始密碼子ATG的5′末端處有一個(gè)BamHI位點(diǎn)，而在與pDSY1上相同的位置上有一個(gè)AgeI位點(diǎn)。以pDSY2為模板對(duì)一個(gè)Mlu I/Hind III片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從在cDNA上的MluI位點(diǎn)開始，至漆酶終止密碼子3′末端處的一個(gè)Hind II位點(diǎn)處結(jié)束。將上述兩個(gè)片段與來自pDSY2的AgeI/MluI片段連接在pHD414上，得到pDSY10(圖8)。
用于漆酶表達(dá)的載體pHD414是質(zhì)粒p775(EP238023)的衍生物。與所述質(zhì)粒相反，pHD414在TAKA啟動(dòng)子和AMG終止子之間有一串相同的限制位點(diǎn)。該質(zhì)粒是這樣構(gòu)建的在終止子的3′末端去掉一段大約200bp長(zhǎng)的片段(帶有不需要的RE位點(diǎn))，隨后再除去啟動(dòng)子5′末端的一個(gè)大約250bp長(zhǎng)的片段(也帶有不需要的位點(diǎn))。所述200bp的片段是通過用NarI(作用位點(diǎn)在pUC載體部分)和XbaI(就在終止子的3′末端)裂解而被除去的，隨后用克列諾(Klenow)DNA聚合酶+dNTP補(bǔ)充所產(chǎn)生的末端，在凝膠上純化該載體片段，并重新連接該載體片段。所得質(zhì)粒被稱為pHD413。用StuI(作用位點(diǎn)在啟動(dòng)子的5′末端)和PvuII(作用位點(diǎn)在pUC載體上)裂解pHD413，在凝膠上分級(jí)分離，并進(jìn)行重新連接，得到pHD414。以pToC90為選擇質(zhì)粒，對(duì)米曲霉How B104和黑曲霉B0-1進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。在搖瓶培養(yǎng)中的產(chǎn)率與用pDSY2轉(zhuǎn)化時(shí)的產(chǎn)率相當(dāng)。
2、在發(fā)酵罐中表達(dá)將1ml黑曲霉轉(zhuǎn)化體Bo-1-pDSY10-4孢子懸浮液試樣(大約109個(gè)孢子/ml)在無菌條件下加入盛有100ml無菌搖瓶培養(yǎng)基(葡萄糖，75g/l；大豆粉，20g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，10g/l；K2SO4，2g/l；CaCl2·2H2O，0.5g/l；檸檬酸，2g/l；酵母提取物，10g/l；微量金屬元素〔ZnSO4·7H2O，14.3g/l；CuSO4·5H2O，2.5g/l；NiCl2·6H2O，0.5g/l；FeSO4·7H2O，13.8g/l；MnSO4·H2O，8.5g/l；檸檬酸3.0g/l〕，0.5ml/l；尿素，2g/l；用自來水配制，并在高壓滅菌之前把pH調(diào)至6.0)的500ml搖瓶中，并在37℃溫度下，在一臺(tái)以200rpm的速度轉(zhuǎn)動(dòng)的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)18小時(shí)。在無菌條件下把50ml上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有1.8升發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽糖糊精MD01 300g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，2g/l；檸檬酸，2g/l；K2SO4，2.7g/l；CaCl2·2H2O，2g/l；微量金屬元素，0.5ml/l；pluronic消泡劑，1ml/l；用自來水配制，并在高壓滅菌之前把pH調(diào)至6.0)的體積為3升的發(fā)酵罐中。通過使冷卻水在發(fā)酵罐夾套中循環(huán)，把發(fā)酵罐溫度維持在34℃。以1.8升/分鐘(1v/v/m)的速度將無菌空氣通入發(fā)酵罐中。在接種后的前24小時(shí)把攪拌速度維持在800rpm，而在其后的發(fā)酵時(shí)間里以1300rpm的速度攪拌。通過自動(dòng)添加5N NaOH或H3PO4把發(fā)酵的pH維持在4.0。用一臺(tái)蠕動(dòng)泵把消毒的進(jìn)料(尿素50g/l；pluronic消泡劑1.5ml/l；用蒸餾水配制并高壓滅菌)加入發(fā)酵罐中。發(fā)酵期間的供料速度設(shè)計(jì)如下在接種之前先加入40g進(jìn)料；接種之后，以2.5g/升小時(shí)的恒速供料。
用水或合適的緩沖液把銅配制成400X儲(chǔ)液，過濾消毒并在無菌條件下加入罐中，使最終濃度為0.5mM。取出用于進(jìn)行酶活性測(cè)定的樣品，并通過米拉布(Miracloth)過濾，以除去菌絲體。通過LACU試驗(yàn)分析這些樣品的漆酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，漆酶活性連續(xù)升高，190小時(shí)之后獲得大約55LACU/ml的活性值。這相當(dāng)于有大約350mg/l的重組漆酶表達(dá)。
IV.重組漆酶的提純材料和方法1、材料用作緩沖液和底物的化合物，是起碼為試劑級(jí)別的商品化產(chǎn)品。Endo/N-糖苷酶G購(gòu)自Boehringer-Mannheim公司。層析是在一個(gè)Pharmacia′s FPLC或一個(gè)常規(guī)的開放柱低壓系統(tǒng)上進(jìn)行。在一臺(tái)Shimadzu PC160分光光度計(jì)上進(jìn)行分光分析。
2、提純(a)DSY2按照上述方法用紗布過濾米曲霉pDSY2轉(zhuǎn)化體，得到2.8升濾液(pH7，19mS)。所得濾液在0.45μ的Corning濾器上過濾，并在使用S1Y30膜的Spiral Concentrator(Amicon)上濃縮至200ml體積。將濃縮液調(diào)至pH7.5，用4.8升水稀釋至1.2mS，并在S1Y30上濃縮至200ml體積。將50ml的上述溶液加注到一個(gè)Q-Sepharose柱(XK16，34ml凝膠)上，該柱用10mM Tris(pH7.5，0.7mS)(緩沖液A)預(yù)平衡過。在用一種線性梯度的緩沖液B(緩沖液A+0.5M NaCl)洗脫加樣期間緩慢地移動(dòng)的藍(lán)色的漆酶帶。將24ml所收集的漆酶部分在Centricon-100(Amicon)上濃縮至4.5ml，并上一個(gè)Superdex 200柱(Hiload 16/10，120ml凝膠)。在用緩沖液C(緩沖液A+0.15M NaCl，14.4mS)洗脫時(shí)，在藍(lán)色漆酶洗脫物部分之后為棕色混雜部分。只有洗脫帶的前半部(通過Abs600檢測(cè))表現(xiàn)出較高的漆酶與混雜物之比，收集這部分洗脫液。將所收集的部分在10mM Bis-Tris(pH6.8，0.6mS)(緩沖液D)中透析，上一個(gè)用緩沖液D平衡過的Mono-Q柱(Mono-Q 5/5，1ml)，并用一種線性梯度的緩沖液E(緩沖液D+0.5M NaCl)進(jìn)行洗脫。通過SDS-PAGE判斷得知，由27％左右的緩沖液E洗脫的漆酶部分是純的。在每一步都對(duì)漆酶部分進(jìn)行常規(guī)ABTS氧化作用、SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)。
(b)DSY10
用紗布過濾H0wB104-pDSY10，得到2.8升濾液(pH7.3，24mS)。用Whatman # 2濾紙過濾上述濾液，并在帶有S1Y100膜的Spiral Concentrator(Amicon)上濃縮至210ml。用水稀釋上述濃縮液，使其達(dá)到1.2mS，在S1Y100上濃縮至328ml。將所得液體上Q-Sepharose柱(XK26，120ml凝膠)，該柱用10mMTris(pH7.5，0.7mS)(緩沖液A)預(yù)平衡過。用一種線性梯度的緩沖液B(緩沖液A+2M NaCl)洗脫加樣期間緩慢移動(dòng)的藍(lán)色漆酶帶。用水稀釋所收集的120ml漆酶部分，使其達(dá)到1.1mS，并在SIY100上濃縮至294ml，再上一個(gè)用緩沖液A預(yù)平衡過的M0no-Q柱(Hiload 16/10，40ml凝膠)。在上樣和用緩沖液A液脫期間，漆酶緩慢地從柱中通過。將所收集的pH讀數(shù)為5.6的部分上一個(gè)用緩沖液C(10mM MES，pH5.5，0.1mS)預(yù)平衡過的Mono-Q柱。漆酶部分被一種梯度很小的緩沖液D(緩沖液C+1M NaCl)所洗脫。按上述方法進(jìn)行酶促試驗(yàn)。
3、蛋白質(zhì)分析按上述方法進(jìn)行全氨基酸分析、N-末端序列分析、脫糖基化分析、SDS-PAGE、IEF和Western印跡分析。
B、結(jié)果和討論1、提純和特征分析對(duì)于DSY10來說，獲得了256倍的純化液和37％的產(chǎn)率，而對(duì)于DSY2來說，獲得了246倍的純化液和14％的產(chǎn)率。就電泳特征、光譜特征和活性而言，純化的DSY2和DSY10沒有區(qū)別。在凝膠過濾時(shí)，純化的重組漆酶表現(xiàn)為一種雙體，而且，其亞單位分子量稍大于野生型漆酶的分子量，這表明在米曲霉中發(fā)生的翻譯后加工導(dǎo)致在重組體上發(fā)生額外的糖基化作用。脫糖基化作用已證實(shí)了由額外糖所產(chǎn)生的質(zhì)量差異(表3)。表3重組和野生型漆酶的分子量和光譜特征MW，kDa 碳水化合物 pIλmax，nm(ε，l/g*cm)天然分子 亞單位 w/w％野生型 ～130～63～7 3.5275(1.8)615(0·12)重組型 ～130～67～133.5275(1.7)615(0.11)提純的酶的光譜在615nm和275nm處有最大光吸收值，275nm的光吸收值與615nm的光吸收值之比為16，這表明，每個(gè)亞單位上有一個(gè)I型Cu.330nm的光吸收值與615nm的吸光值之比為1.0，接近Rhus vernicefera漆酶的0.75的比值，暗示每個(gè)亞單位上存在一個(gè)II型和兩個(gè)III型銅離子。通過氨基酸分析測(cè)得的消光系數(shù)為1.71/(g*cm)。
3、活性通過丁香醛連氮和ABTS氧化作用測(cè)定漆酶活性。每一A275單位表示漆酶的LACU值為83。每一mg單位表示其LACU值為141。圖9中示出了所述漆酶的pH曲線。
V、將多孔菌屬漆酶用于染發(fā)在多種染料前體(在下面列出)上試驗(yàn)Polyporus pinsitus漆酶的染色效果，并與3％H2O2的染色效果進(jìn)行比較。并進(jìn)一步試驗(yàn)其在0.1％對(duì)苯二胺上的染色效果，與多種改性劑進(jìn)行比較。
材料染料前體用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對(duì)-苯二胺，pH7.0(pPD).
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對(duì)-甲代苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％氯-對(duì)-苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％對(duì)-氨基苯酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％鄰-氨基苯酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％3，4-二氨基甲苯，pH7.0。
改性劑用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％間苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％2，4-二氨基茴香醚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％α-萘酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％氫醌，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％鄰苯二酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖波制備的0.1％間苯二酚，pH7.0。
用0.1M磷酸鉀緩沖液制備的0.1％4-氯代間苯二酚，pH7.0。
當(dāng)使用改性劑時(shí)，將染料前體對(duì)苯二胺與上述改性劑中的一種混合使用，使染液中前體的濃度為0.1％，改性劑的濃度也為0.1％。所用的酶是濃度為10LACU/ml的來自P.pinisitus的重組漆酶。
用于該方法中的其它溶液有3％H2O(在最終染液中的濃度)，以及一種市售香波。
在一臺(tái)Datacoler Textflash 2000(CIE-Lab)上，采用CIE-Lab參數(shù)L*(“0”＝黑，“100”＝白)和a*(“-”＝綠，“+”＝紅)測(cè)定發(fā)束的定量化顏色。DL*和Da*分別表示一種樣品與未處理過毛發(fā)的L*和a*進(jìn)行比較時(shí)的L*和a*的Δ值。在日光燈(D65)下以1000LUX的強(qiáng)度測(cè)定耐曬性。
使用一束金黃色歐洲人的頭發(fā)(1g)。在一臺(tái)Whirley攪拌器上將4ml染料前體溶液(包括改性劑)與1ml漆酶或1ml H2O2混合，將其涂在上述發(fā)束上，并在30℃下保持60分鐘。然后用流動(dòng)水漂洗染過的發(fā)束，梳理并風(fēng)干。
染色作用試驗(yàn)的結(jié)果在下面的表4-6以及圖10-12中列出。表4

L*0＝黑100＝白a* -＝綠+＝紅表5

L*0＝黑100＝白a* -＝綠+＝紅表6

L*0＝黑100＝白a* -＝綠+＝紅按上述方法進(jìn)行氧化染發(fā)，所不同的是，使用50LACU/ml的P.pinsitus漆酶。
為了試驗(yàn)?zāi)拖葱?，將所染過的發(fā)束弄濕，并用50μl市售香波洗15秒鐘，再用水漂洗1分鐘。將該發(fā)束洗20遍。
洗發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果如圖13所示。由圖13可以看出，當(dāng)使用P.pinsitus漆酶進(jìn)行氧化染色時(shí)，洗滌多達(dá)20遍后的頭發(fā)的耐洗性仍然良好。
為了試驗(yàn) 耐曬性，使用歐洲人的金黃色頭發(fā)作試驗(yàn)材料，對(duì)用P.pinsitus漆酶染過的頭發(fā)與用H2O2染過的頭發(fā)進(jìn)行比較。將對(duì)苯二胺用作染料前體。按上述方法進(jìn)行染發(fā)。將一個(gè)發(fā)束放置在黑暗中，而另一個(gè)發(fā)束放置在日光下(即在日光燈(D65)下，光照強(qiáng)度大約為1000LUX)長(zhǎng)達(dá)275小時(shí)。在染發(fā)后馬上測(cè)定CIE-Lab值，并在暴露于日光期間進(jìn)一步測(cè)定。
試驗(yàn)結(jié)果在圖14中給出。圖14顯示，以對(duì)苯二胺為染料前體用P.pinsitus漆酶染過的頭發(fā)與用H2O2染過的頭發(fā)的耐曬性相同。
生物材料的保藏已按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定，于1994年5月25日將下列生物材料交由Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center(1815 University Street，Peoria，Illinois，61604)保藏，并被賦予下列入藏號(hào)。
保藏物入藏號(hào)帶有pDSY22(41GEN；約3.0kb的NRRL B-21263EcoRI插入片段)的E.coli DH5α帶有pDSY23(41GEN；約4.5kb的NRRL B-21268MluI插入片段；插入片段帶有pDSY22 EcoRI片段的一小部分和EcoRI片段5′端的序列)的E.coli DH5α帶有pDSY21(31GEN；約7.7kb的NRRL B-21264EcoRI/BamHI插入片段)的E.coliXL-1 Blue帶有p DSY18(21GEN；約8.0kb的 NRRL B-21265BamHI插入片段)的E.coli XL-1Blue帶有pDSY19(23GEN；約4kb的HindNRRL B-21266III插入片段)的E.coli DH5α帶有pDSY20(24GEN；約8.5kb的 NRRL B-21267EcoRI插入片段)的E.coli DH5α
序列表<110>諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司諾沃奇梅茲有限公司<120>純化的多孔菌屬漆酶及編碼該酶的核酸<130>4185.204-WO<140>PCT/US95/07536<141>1995-06-15<150>US 08/265,534<151>1994-06-24<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2418<212>DNA<213>Polyporus pinsitus<400>1agatttctga caccggtgca atcttgacac tgtaccaacc gggcaagtct cgtccttggt 60tctcggggac tggcgccggt cgctacccct tggtcattca ctctaccaga gcgctggctt 120cgccgaggta taaaggatgt tgcgcgacac cctcaacacc ccaactcaag ccccacttga 180gcttttgcga gatcctccac ataccactca ctactttcaa gttcttcaac atgtcgaggt 240ttcactctct tctcgctttc gtcgttgctt cccttacggc tgtggcccac gctggtatcg 300gtcccgtcgc cgacctaacc atcaccaacg cagcggtcag ccccgacggg ttttctcgcc 360aggccgtcgt cgtgaacggc ggcacccctg gccctctcat cacgggtaac atggttcgtc 420tcggctcgca ctagggggtt gtatcgttcc tgacgttgtt ggagggggat cgcttccagc 480tcaatgtcat cgacaacctt accaaccaca cgatggtgaa gagcacgagt attgtgagct 540gctatttctc cggacggggc ttcattgtgc taataatcgt cgtgtgcagc actggcacgg 600tttcttccag aagggtacca actgggccga cggtcccgcc ttcatcaacc agtgcccgat 660ctcatctggt cactcgttcc tgtacgactt ccaggttcct gaccaggctg taagtacggt 720cgttatggag tatactgcgc attgctaaac cacatggtga acagggtacc ttctggtatc 780acagtcactt gtctacgcag tactgtgatg gtttgagggg tccgttcgtt gtttacgacc 840cgaatgaccc ggccgccgac ctgtacgacg tcgacaacgt aaggacgaat tcgaaccgta 900aatacttgct tactgatact tctcgatgaa ttaggacgac actgtcatta cccttgtgga 960ttggtaccac gtcgccgcga agctgggccc cgcattccct gtaagtccat gagtattctg 1020ctgttgaatc tgtcttaact gtgcatatca ctcggcgccg acgccaccct catcaacggt 1080aagggacgct cccccagcac gaccaccgcg gacctctcag ttatcagcgt caccccgggt 1140aaacgcgtat gctatatctt atcttatctg atggcatttc tctgagacat tctccagtac 1200cgtttccgcc tggtgtccct gtcgtgcgac cccaactaca cgttcagcat cgatggtcac 1260aacatgacga tcatcgagac cgactcaatc aacacggcgc ccctcgtcgt cgactccatt 1320cagatcttcg ccgcccagcg ttactccttc gtggtaagtt cgattcatcc tctaacgttg 1380gtcgctgtta gtgatcgtat ggtcatgtag ctcgaggcca accaggccgt cgacaactac 1440tggattcgcg ccaacccgaa cttcggtaac gtcgggttca ccggcggcat taactcggct 1500atcctccgct acgatggtgc cgctgccgtg gagcccacca caacgcaaac cacgtcgact 1560gcgccgctca acgaggtcaa cctgcacccg ctggttacca ccgctgtggt atgtaatatt 1620gtcggtaatg taatacattg ttgctgacct cgacccccac agcctggctc gcccgtcgct 1680ggtggtgtcg acctggccat caacatggcg ttcaacttca acggcaccaa cttcttcatc 1740aacggcacgt ctttcacgcc cccgaccgtg cctgtcctgc tccagatcat cagcggcgcg 1800cagaacgcgc aggacctcct gccctccggt agcgtctact cgcttccctc gaacgccgac 1860atcgagatct ccttccccgc caccgccgcc gcccccggtg cgccccaccc cttccacttg 1920cacgggcacg cgttcgcggt cgtccgcagc gccggcagca cggtttacaa ctacgacaac 1980cccatcttcc gcgacgtcgt cagcacgggg acgcctgcgg ccggtgacaa cgtcaccatc 2040cgcttccgca ccgacaaccc cggcccgtgg ttcctccact gccacatcga cttccacctc 2100gaggccggct tcgccgtcgt gttcgcggag gacatccccg acgtcgcgtc ggcgaacccc 2160gtcccccagg cgtggtccga cctctgtccg acctacgacg cgctcgaccc gagcgaccag 2220taaatggctt gcgccggtcg atgataggat atggacggtg agttcgcact tgcaatacgg 2280actctcgcct cattatggtt acacactcgc tctggatctc tcgcctgtcg acagaacaaa 2340cttgtataat tcgcttaatg gttgaaacaa atggaatatt ggggtactat gcacgcatct 2400cgctgggtga gctttcgt 2418<210>2<211>520<212>PRT<213>Polyporus pinsitus<400>2Met Ser Arg Phe His Ser Leu Leu Ala Phe Val Val Ala Ser Leu Thr1 5 10 15Ala Val Ala His Ala Gly Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Thr
20 25 30Asn Ala Ala Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Gln Ala Val Val Val35 40 45Asn Gly Gly Thr Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Met Gly Asp Arg50 55 60Phe Gln Leu Asn Val Ile Asp Asn Leu Thr Asn His Thr Met Val Lys65 70 75 80Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn Trp85 90 95Ala Asp Gly Pro Ala Phe Ile Asn Gln Cys Pro Ile Ser Ser Gly His100 105 110Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp115 120 125Iyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro130 135 140Phe Val Val Tyr Asp Pro Asn Asp Pro Ala Ala Asp Leu Tyr Asp Val145 150 155 160Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Val Asp Trp Tyr His Val Ala165 170 175Ala Lys Leu Gly Pro Ala Phe Pro Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile180 185 190Asn Gly Lys Gly Arg Ser Pro Ser Thr Thr Thr Ala Asp Leu Ser Val195 200 205Ile Ser Val Thr Pro Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu210 215 220Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr225 230 235 240Ile Ile Glu Thr Asp Ser Ile Asn Thr Ala Pro Leu Val Val Asp Ser245 250 255Ile Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Glu Ala Asn
260 265 270Gln Ala Val Asp Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Asn275 280 285Val Gly Phe Thr Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly290 295 300Ala Ala Ala Val Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Thr Ser Thr Ala Pro305 310 315 320Leu Asn Glu Val Asn Leu His Pro Leu Val Thr Thr Ala Val Pro Gly325 330335Ser Pro Val Ala Gly Gly Val Asp Leu Ala Ile Asn Met Ala Phe Asn340 345 350Phe Asn Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Gly Thr Ser Phe Thr Pro Pro355 360 365Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Ile Ser Gly Ala Gln Asn Ala Gln370 375 380Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Val Tyr Ser Leu Pro Ser Asn Ala Asp385 390 395 400Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ala Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Pro His405 410 415Pro Phe His Leu His Gly His Ala Phe Ala Val Val Arg Ser Ala Gly420 425 430Ser Thr Val Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Phe Arg Asp Val Val Ser435 440 445Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Arg Thr450 455 460Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu465 470 475 480Glu Ala Gly Phe Ala Val Val Phe Ala Glu Asp Ile Pro Asp Val Ala485 490 495Ser Ala Asn Pro Val Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr
500 505510Asp Ala Leu Asp Pro Ser Asp Gln515 520<210>3<211>2880<212>DNA<213>Polyporus pinsitus<400>3gcggcgcaca aaccgtggga gccaacacac tcccgtccac tctcacactg gccagattcg 60cgcgaccgcc gcctttcagg cccaaacaga tctggcaggt ttcgatggcg cacgccgccg 120tgcctgccgg attcaattgt gcgccagtcg ggcatccgga tggctctacc agcgcggttg 180actggaagag aacaccgagg tcatgcattc tggccaagtg cggccaaagg accgctcgct 240ggtgcggata cttaaagggc ggcgcgggga ggcctgtcta ccaagctcaa gctcgccttg 300ggttcccagt ctccgccacc ctcctcttcc cccacacagt cgctccatag caccgtcggc 360gccatgggtc tgcagcgatt cagcttcttc gtcaccctcg cgctcgtcgc tcgctctctt 420gcagccatcg ggccggtggc gagcctcgtc gtcgcgaacg cccccgtctc gcccgacggc 480ttccttcggg atgccatcgt ggtcaacggc gtggtccctt ccccgctcat caccgggaag 540aaggtcggcg tgttcgtcgt cgtcctactc ctttgctgac agcgatctac agggagaccg 600cttccagctc aacgtcgtcg acaccttgac caaccacagc atgctcaagt ccactagtat 660cgtaagtgtg acgatccgaa tgtgacatca atcggggcta attaaccgcg cacagcactg 720gcacggcttc ttccaggcag gcaccaactg ggcagaagga cccgcgttcg tcaaccagtg 780ccctattgct tccgggcatt cattcctgta cgacttccat gtgcccgacc aggcagtaag 840caggattttc tggggtcccc gtgtgatgca atgttctcat gctccgacgt gatcgacagg 900ggacgttctg gtaccacagt catctgtcta cgcagtactg tgacgggctg cgggggccgt 960tcgtcgtgta cgaccccaag gacccgcacg ccagccgtta cgatgttgac aatgtacgtg 1020cgccacggag tatatcacac agcatgcgtt gacgtcgggc caacaggaga gcacggtcat 1080cacgttgacc gactggtacc acaccgctgc ccggctcggt cccaagttcc cagtaagctc 1140gcaatggctt agtgttcaca ggttctttgc ttatgttgct tcgatagctc ggcgcggacg 1200ccacgctcat caacggtctg gggcggtcgg cctcgactcc caccgctgcg cttgccgtga 1260tcaacgtcca gcacggaaag cgcgtgagca ttctcttgta tgccatttca atgctttgtg 1320ctgacctatc ggaaccgcgc agtaccgctt ccgtctcgtt tcgatctcgt gtgacccgaa 1380ctacacgttc agcatcgacg ggcacaacct gaccgtcatc gaggtcgacg gcatcaatag 1440ccagcctctc cttgtcgact ctatccagat cttcgccgca cagcgctact ccttcgtggt 1500aagtcctggc ttgtcgatgc tccaaagtgg cctcactcat atactttcgt tagttgaatg 1560cgaatcaaac ggtgggcaac tactgggttc gtgcgaaccc gaacttcgga acggttgggt 1620tcgccggggg gatcaactcc gccatcttgc gctaccaggg cgcaccggtc gccgagccta 1680ccacgaccca gacgccgtcg gtgatcccgc tcatcgagac gaacttgcac ccgctcgcgc 1740gcatgccagt ggtatgtctc tttttctgat catctgagtt gcccgttgtt gaccgcatta 1800tgtgttacta tctagcctgg cagcccgaca cccgggggcg tcgacaaggc gctcaacctc 1860gcgtttaact tcgtaagtat ctctactact taggctggag gctcgtcgct gatcatacgg 1920tgcttcagaa cggcaccaac ttcttcatca acaacgcgac tttcacgccg ccgaccgtcc 1980cggtactcct ccagattctg agcggtgcgc agaccgcaca agacctgctc cccgcaggct 2040ctgtctaccc gctcccggcc cactccacca tcgagatcac gctgcccgcg accgccttgg 2100ccccgggtgc accgcacccc ttccacctgc acggtgtatg ttcccctgcc ttcccttctt 2160atccccgaac cagtgctcac gtccgtccca tctagcacgc cttcgcggtc gttcgcagcg 2220cggggagcac cacgtataac tacaacgacc cgatcttccg cgacgtcgtg agcacgggca 2280cgcccgccgc gggcgacaac gtcacgatcc gcttccagac ggacaacccc gggccgtggt 2340tcctccactg ccacatcgac ttccacctcg acgcaggctt cgcgatcgtg ttcgcagagg 2400acgttgcgga cgtgaaggcg gcgaacccgg ttccgaaggc gtggtcggac ctgtgcccga 2460tctacgacgg gctgagcgag gctaaccagt gagcggaggg cgtggtgttg agcgtaaagc 2520tcgggcgtcg acctgggggg ttgaaggtgt tctgattgaa atggtctttg ggtttatttg 2580ttgttattct aactcggttc tctacgcaag gaccgaggat tgtataggat gaagtaactt 2640ccctaatgta ttatgatatc aattgacgga ggcatggact gcgaagtgtg tacaatgtgg 2700tagtggtcta ggccttggag acaagctgtg gatttttctt gggggatgaa gaggcgtgaa 2760ggctgagagc tatgctatgc ctagtgacgt ggttatagta aatgtccatt acattgacca 2820agaacgacaa gaaccataag cttgctgagg atagatgggg gcgcgtccgc gaacgacttg 2880<210>4<211>519<212>PRT<213>Polyporus pinsitus<400>4Met Gly Leu Gln Arg Phe Ser Phe Phe Val Thr Leu Ala Leu Val Ala1 5 10 15Arg Ser Leu Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Ser Leu Val Val Ala Asn20 25 30Ala Pro Val Ser Pro Asp Gly Phe Leu Arg Asp Ala Ile Val Val Asn35 40 45Gly Val Val Pro Ser Pro Leu Ile Thr Gly Lys Lys Gly Asp Arg Phe50 55 60Gln Leu Asn Val Val Asp Thr Leu Thr Asn His Ser Met Leu Lys Ser65 70 75 80Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Ala Gly Thr Asn Trp Ala85 90 95Glu Gly Pro Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Ser Gly His Ser100 105 110Phe Leu Tyr Asp Phe His Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp Tyr115 120 125His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro Phe130 135 140Val Val Tyr Asp Pro Lys Asp Pro His Ala Ser Arg Tyr Asp Val Asp145 150 155 160Asn Glu Ser Thr Val Ile Thr Leu Thr Asp Trp Tyr His Thr Ala Ala165 170175Arg Leu Gly Pro Lys Phe Pro Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile Asn180 185 190Gly Leu Gly Arg Ser Ala Ser Thr Pro Thr Ala Ala Leu Ala Val Ile195 200 205Asn Val Gln His Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Ile Ser210 215 220Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Leu Thr Val225 230 235 240Ile Glu Val Asp Gly Ile Asn Ser Gln Pro Leu Leu Val Asp Ser Ile245 250 255Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asn Gln260 265 270Thr Val Gly Asn Tyr Trp Val Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Thr Val275 280 285Gly Phe Ala Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Gln Gly Ala290295 300Pro Val Ala Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Pro Ser Val Ile Pro Leu305 310 315 320Ile 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pinsitus<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>N＝a，c，g或t<400>5tttcccgact aaaccaatct cagnccgctt cctcctaggg aaccgagcga tgtggcggcc60ctctctatcc aagctgtcca taagaagacg ttcaaatgcc gcagcaagcg aggaaataag120catctaacag tgtttttccc atagtcgcat ttgcgccgcc tgtcggaccg acgcccctag180agcgctttgg gaaacgtcgc aagtggcggg tgttattcgt gtagacgaga cggtatttgt240ctcatcattc ccgtgcttca ggttgacaca gcccaaaggt ctatgtacgg cccttcacat300tccctgacac attgacgcaa ccctcggtgc gcctccgaca gtgcctcggt tgtagtatcg360ggacgcccta ggatgcaaga ttggaagtca ccaaggcccg aagggtataa aataccgaga420ggtcctacca cttctgcatc tccagtcgca gagttcctct cccttgccag ccacagctcg480agatgtcctt ctctagcctt cgccgtgcct tggtcttcct gggtgcttgc agcagtgcgc540tggcctccat cggcccagtc actgagctcg acatcgttaa caaggtcatc gccccggatg600gcgtcgctcg tgatacagtc ctcgccgggg gcacgttccc gggcccactc atcacaggaa660agaaggtatg ctaagtagtc ccgcccccat catcctgtgg ctgacgttcg acgccgccag720ggtgacaact tccgcatcaa cgtcgtcgac aagttggtta accagactat gctgacatcc780accaccattg tatgtcacta gctctcgcta tctcgagacc cgctgaccga caacatttgc840cgtagcactg gcacgggatg ttccagcata cgacgaactg ggcggatggt cccgcctttg900tgactcaatg ccctatcacc actggtgatg atttcctgta caacttccgc gtgcccgacc960agacagtacg caaagggcag catgcgtact caaagacatc tctaagcatt tgctacctag1020ggaacgtact ggtaccatag ccatctggcc ttgcagtact gtgatgggct tcgcggcccc1080ctggtgattt acgatcccca tgatccgcag gcatacctgt atgacgtcga tgacgtacgc1140agcacagttt ccctaaaacg gttaacttct aattctgtaa atatcttcat aggagagcac1200cgttatcact ctggcagact ggtaccatac cccggcgcct ctgctgccgc ctgccgcggt 1260acgcctccac acatctgcac agcgttccgt atctcatacc cttaaagttt atcggacaac 1320tttgattaat ggcctgggtc gctggcctgg caaccccacc gccgacctag ccgtcatcga 1380agtccagcac ggaaagcgcg tatgtcatag ctcggttatc tattcatact cgcggcctcg 1440aagctaaaac cttgttccag taccggttcc gactggtcag cacctcatgc gaccccaact 1500acaacttcac tatcgatggc cacaccatga caatcatcga ggcggatggg cagaacaccc 1560agccacacca agtcgacgga cttcagatct tcgcggcaca gcggtactcc ttcgttgtat 1620gttttccgca tttcgggaaa aggaattgcg ctgacagctc gagtgtgcgt agcttaacgc 1680taaccaagcg gtcaacaact actggatccg tgcgaaccct aaccgtgcta acactacggg 1740cttcgccaac ggcatcaact ccgccatcct gcgctacaag ggggcgccga ttaaggagcc 1800tacgacgaac cagactacca tccggaactt tttgtgggag acggacttgc acccgctcac 1860tgacccacgt gcagtaagtt ctacacagtc accaacggtg agctgttgtc tgattgcact 1920gtgttatagc ctggccttcc tttcaagggg ggcgttgacc acgctttgaa cctcaacctc 1980actttcgtac gtagcgcctc agatatcgag tagtctatct cctgaccgat tgacagaatg 2040gatcggagtt cttcatcaac gatgcgcctt tcgtccctcc gactgtcccg gtgctactgc 2100agatcctgaa cggaacgctc gacgcgaacg acctcctgcc gcccggcagc gtctacaacc 2160ttcctccgga ctccaccatc gagctgtcca ttcccggagg tgtgacgggt ggcccgcacc 2220cattccattt gcacggggta ataatctctc tttatacttt ggtctcccga tgctgacttt 2280cactgctcat cttcagcacg ctttctccgt cgtgcgtagc gccggcagca ccgaatacaa 2340ctacgcgaac ccggtgaagc gcgacacggt cagcattggt cttgcgggcg acaacgtcac 2400cgtgcgcttc gtggtatgtt ttacagcctc tctatctccg tgggcgttcg gaagttgact 2460ggggcgtaga ccgacaaccc cggcccgtgg ttcctccact gtcacatcga cttccatttg 2520caagcaggcc tcgccatcgt gttcgcggag gacgcgcagg acacgaagct tgtgaacccc 2580gtccctgtac gtcttctgga tgcatgcgct ccgcacagtg actcatcttt tgcaacagga 2640ggactggaac aagctgtgcc ccaccttcga taaggcgatg aacatcacgg tttgagcgat 2700gcgtggcgct catggtcatt ttcttggaat ctttgcatag ggctgcagca cgctggatac 2760tctttccctt agcaggatat tatttaatga cccctgcgtt tagtgcttag ttagctttac 2820tactggttgt aatgtacgca gcatgcgtaa ttcggataat gctatcaatg tgtatattat 2880gacacgcgtc atgcgcgatg cttgagttgc aaggtcggtt tccgatgctc gacataaacg 2940tttcacttac atacacattg ggtctagaac tggatctatc catgtataca aaaactcctc 3000atacagctga ctggggcgct ctagagcatg ggtccgattg atcagatgtc gcgaacacga 3060gcctcctgag ctcgaggact ctgagaagcg gcggtgcgtt ct 3102<210>6<211>512<212>PRT<213>Polyporus pinsitus<400>6Met Ser Phe Ser Ser Leu Arg Arg Ala Leu Val Phe Leu Gly Ala Cys1 5 10 15Ser Ser Ala Leu Ala Ser Ile Gly Pro Val Thr Glu Leu Asp Ile Val20 25 30Asn Lys Val Ile Ala Pro Asp Gly Val Ala Arg Asp Thr Val Leu Ala35 40 45Gly Gly Thr Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Lys Lys Gly Asp Asn50 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tcagtctaca ccctacaagc cttctaactc ttttaccaca 780gggcgacaac ttccagatca atgttatcga caacctctct aacgagacga tgttgaagtc 840gacctccatc gtatgtgctt ctactgcttc ttagtcttgg caatggctca aggtctcctc 900cgcagcattg gcacggcttc ttccagaagg gtactaactg ggctgatgga gctgccttcg 960tcaaccagtg ccctatcgcg acggggaact ctttccttta cgacttcacc gcgacggacc 1020aagcagtcag tgcctgtggc gcttatgttt tcccgtaatc agcagctaac actccgcacc 1080cacagggcac cttctggtac cacagtcact tgtctacgca gtactgcgat ggtttgcggg 1140gcccgatggt cgtatacgac ccgagtgacc cgcatgcgga cctttacgac gtcgacgacg 1200agaccacgat catcacgctc tctgattggt atcacaccgc tgcttcgctc ggtgctgcct 1260tcccggtaag tttaccccag cgcacggagt taagaccgga tctaactgta atacgttcag 1320attggctcgg actctaccct gattaacggc gttggccgct tcgcgggtgg tgacagactg 1380accttgcggt tatcactgtc gagcagggca agcgcgttag tgataccctc tacagttgac 1440actgtgccat tgctgacagt actctcagta ccgtatgcgt cttctctcgc tgtcttgcga 1500ccccaactat gtcttctcca ttgacggcca caacatgacc atcatcgagg ccgacgccgt 1560caaccacgag cccctcacgg ttgactccat ccagatctac 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tccactgcca 2460catcgacttc cacttggagg ccggtttcgc catcgtcttc agcgaggaca ccgccgacgt 2520ctcgaacacg accacgccct cggtacgttg tgctcccgtg cccatctccg cgcgcctgac 2580taacgagcac cccttacaga ctgcttggga agatctgtgc cccacgtaca acgctcttga 2640ctcatccgac ctctaatcgg ttcaaagggt cgctcgctac cttagtaggt agacttatgc 2700accggacatt atctacaatg gactttaatt tgggttaacg gccgttatac atacgcgcac 2760gtagtataaa ggttctctgg attggtcgga cctacagact gcaattttcg tgacctatca 2820actgtatatt gaagcacgac agtgaatgga aatagagaca2860<210>8<211>511<212>PRT<213>Polyporus pinsitus<400>8Met Gly Arg Phe Ser ser Leu Cys Ala Leu Thr Ala Val Ile His Ser1 5 10 15Phe Gly Arg Val Ser Ala Ala Ile Gly Pro Val Thr Asp Leu Thr Ile20 25 30Ser Asn Gly Asp Val Ser Pro Asp Gly Phe Thr Arg Ala Ala Val Leu35 40 45Ala Asn Gly Val Phe Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Lys Gly Asp50 55 60Asn Phe Gln Ile Asn Val Ile Asp Asn Leu Ser Asn Glu Thr Met Leu65 70 75 80Lys Ser Thr ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn85 90 95Trp Ala Asp Gly Ala Ala Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ala Thr Gly100 105 110Asn Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Thr Ala Thr Asp Gln Ala Gly Thr Phe115 120 125Trp Tyr His ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly130 135 140Pro Met Val Val Tyr Asp Pro Ser Asp Pro His Ala Asp Leu Tyr Asp145 150 155 160Val Asp Asp Glu Thr Thr Ile Ile Thr Leu Ser Asp Trp Tyr His Thr165 170 175Ala Ala Ser Leu Gly Ala Ala Phe Pro Ile Gly Ser Asp Ser Thr Leu180 185 190Ile Asn Gly Thr Asp Leu Ala Val Ile Thr Val Glu Gln Gly Lys Arg
195 200 205Tyr Arg Met Arg Leu Leu Ser Leu Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Val Phe210 215 220Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr Ile Ile Glu Ala Asp Ala Val Asn225 230 235 240His Glu Pro Leu Thr Val Asp Ser Ile Gln Ile Tyr Ala Gly Gln Arg245 250 255Tyr Ser Phe Val Leu Thr Ala Asp Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Phe Ile260 265270Arg Ala Leu Pro Ser Ala Gly Thr Thr Ser Phe Asp Gly Gly Ile Asn275 280285Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Ser Glu Val Asp Pro Thr Thr290 295 300Thr Glu Thr Thr Ser Val Leu Pro Leu Asp Glu Ala Asn Leu Val Pro305 310 315 320Leu Asp Ser Pro Ala Ala Pro Gly Asp Pro Asn Ile Gly Gly Val Asp325 330 335Tyr Ala Leu Asn Leu Asp Phe Asn Phe Asp Gly Thr Asn Phe Phe Ile340 345 350Asn Asp Val Ser Phe Val Ser Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile355 360 365Leu Ser Gly Thr Thr Ser Ala Ala Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Leu370 375 380Phe Ala Val Pro Ser Asn Ser Thr Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ile Thr385 390 395 400Ala Thr Asn Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His405 410 415Thr Phe Ser Ile Val Arg Thr Ala Gly Ser Thr Asp Thr Asn Phe Val420 425 430Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Val Asn Thr Gly Thr Val Gly Asp Asn
435 440 445Val Thr Ile Arg Phe Thr Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His450 455 460Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Gly Phe Ala Ile Val Phe Ser465 470 475 480Glu Asp Thr Ala Asp Val Ser Asn Thr Thr Thr Pro Ser Thr Ala Trp485 490 495Glu Asp Leu Cys Pro Thr Tyr Asn Ala Leu Asp Ser Ser Asp Leu500 505 510<210>9<211>2925<212>DNA<213>Polyporus pinsitus<220><221>misc_feature<222>(86)..(86)<223>N＝a，c，g，或t<220><221>misc_feature<222>(113)..(113)<223>N＝a，c，g，或t<400>9ctcataactc ttcgcttcta gcatgggggc tgcgcacacc tgacagaccc ttcgggaggc60gaactcgaat gcagcgtact ctatcncacc tccaggaaag gtagggatgg acnccgtgca120ccaacaactg tctctccacc agcaaccatc ccttggatat gtctccacac acccggtgtc180tacaagcggg gatctgtgct ggtgaagtgc tgtctccgga gcggcggcgg cgagcgacca240gaacccgaac cagtgctagt gcccgacacc cgcgagacaa ttgtgcaggg tgagttatat300tcttcgtgag acggcgctgc gcgtcggcac tgaaagcgtc gcagttaggt gatgcagcgg360tccgcgctat ttttgacgtc tggcagctat cctaagccgc gcctccatac accccaggcg420ctctcgtttg ctataggtat aaatccctca gcttcagagc gtcgatcctc atcccacacg480acacccgttt cagtcttctc gtagcgcatt ccctagccgc ccagcctccg ctttcgtttt540caacatgggc aagtatcact cttttgtgaa cgtcgtcgcc cttagtcttt ctttgagcgg600tcgtgtgttc ggcgccattg ggcccgtcac cgacttgact atctctaacg ccgatgttac660gcctgacggc attactcgtg ctgctgtcct cgcgggcggc gttttccccg ggcccctcat720taccggcaac aaggtgagcc gcgaaacctt ctactagcgc gctcgtacgg tgcaccgtta 780ctgaagccac actttgcgct gtcaacaggg ggatgaattc cagatcaatg tcatcgacaa 840cctgaccaac gagaccatgt tgaagtcgac cacaatcgta aggtgcttgc tcccataatt 900aagcccgtcg ctgactcgaa gtttatctgt agcactggca tggtatcttc caggccggca 960ccaactgggc agacggcgcg gccttcgtga accagtgccc tatcgccacg ggaaactcgt 1020tcttgtacga cttcaccgtt cctgatcaag ccgtacgttt atacacttcc ctttctgcgg 1080catactctga cgcgccgctg gatcagggca ccttctggta ccacagccac ctgtccaccc 1140agtactgtga cggcctgcgc ggtcctcttg tggtctacga ccccgacgat cccaacgcgt 1200ctctttacga cgtcgatgac gtaagcaggc tacttgtgga cttgtatgga tgtatctcac 1260gctcccctac aggatactac ggttattacg cttgcggact ggtaccacac tgcggcgaag 1320ctgggccctg ccttccccgt gagtctactc ttcctcgtgt gttaacatag gtgacggccg 1380ctgatacgag agctaccagg cgggtccgga tagcgtcttg atcaatggtc ttggtcggtt 1440ctccggcgat ggtggaggag cgacaaacct caccgtgatc accgtcacgc aaggcaaacg 1500ggtgagtccg ccctgagctg gcctcaatag cgatattgac gagtccatgc cctcccagta 1560ccgcttccgc cttgtgtcga tctcgtgcga ccccaacttc acgttctcga tcgacgggca 1620caacatgacc atcatcgagg tggacggtgt caaccacgag gccttggacg tcgactccat 1680tcagattttt gcggggcagc ggtactcctt catcgtacgt tcccttgccc tcgtgctata 1740tccgcccgtc tgctcacaga ggcttctata tcgcagctca acgccaacca gtccatcgac 1800aactactgga tccgcgcgat ccccaacacc ggtaccaccg acaccacggg cggcgtgaac 1860tctgctattc ttcgctacga caccgcagaa gatatcgagc ctacgaccaa cgcgaccacc 1920tccgtcatcc ctctcaccga gacggatctg gtgccgctcg acaaccctgc ggctcccggt 1980gacccccagg tcggcggtgt tgacctggct atgagtctcg acttctcctt cgtgagtccc 2040acagcactcc gcgccatttc gcttatttac gcaggagtat tgttcagaac ggttccaact 2100tctttatcaa caacgagacc ttcgtcccgc ccacagttcc cgtgctcctg cagattttga 2160gtggtgcgca ggacgcggcg 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Ser Ile Asp Gly225 230 235 240His Asn Met Thr Ile Ile Glu Val Asp Gly Val Asn His Glu Ala Leu245 250 255Asp Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Ile260 265 270Leu Asn Ala Asn Gln Ser Ile Asp Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Ile Pro275 280 285Asn Thr Gly Thr Thr Asp Thr Thr Gly Gly Val Asn Ser Ala Ile Leu290 295 300Arg Tyr Asp Thr Ala Glu Asp Ile Glu Pro Thr Thr Asn Ala Thr Thr305 310 315 320Ser Val Ile Pro Leu Thr Glu Thr Asp Leu Val Pro Leu Asp Asn Pro325 330 335Ala Ala Pro Gly Asp Pro Gln Val Gly Gly Val Asp Leu Ala Met Ser340 345 350Leu Asp Phe Ser Phe Asn Gly Ser Asn Phe Phe Ile Asn Asn Glu Thr355 360 365Phe Val Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala370 375 380Gln Asp Ala Ala Ser Leu Leu Pro Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Pro385 390 395 400Ser Asn Ser Thr Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ile Ile Thr Thr Asp Gly405 410 415Val Leu Asn Ala Pro Gly Ala Pro His Pro Phe His Leu His Gly His420 425 430Thr Phe Ser Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Ser Thr Phe Asn Tyr Ala435 440 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1.一種DNA結(jié)構(gòu)，它包含選自下組的編碼多孔菌屬漆酶的核酸序列(a)編碼序列4、序列6、序列8或序列10的氨基酸序列的核酸序列；和(b)能夠在高嚴(yán)格性條件下與下列序列雜交的核酸序列(i)序列3、序列5、序列7或序列9的核酸序列，或(ii)它們的任一互補(bǔ)鏈。
2.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列編碼序列4的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列是序列3。
4.權(quán)利要求3的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列包含在含于大腸桿菌NRRL B-21266的質(zhì)粒pDSY19中。
5.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列編碼序列6的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列是序列5。
7.權(quán)利要求6的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列包含在含于大腸桿菌NRRL B-21267的質(zhì)粒pDSY20中。
8.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列編碼序列8的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列是序列7。
10.權(quán)利要求9的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列包含在含于大腸桿菌NRRL B-21264的質(zhì)粒pDSY21中。
11.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列編碼序列10的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列是序列9。
13.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列包含在含于大腸桿菌NRRL B-21263的質(zhì)粒pDSY22中以及含于大腸桿菌NRRL B-21268的質(zhì)粒pDSY23中。
14.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列能夠在高嚴(yán)格性條件下與序列3的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
15.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列能夠在高嚴(yán)格性條件下與序列5的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
16.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列能夠在高嚴(yán)格性條件下與序列7的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
17.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列能夠在高嚴(yán)格性條件下與序列9的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交。
18.權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述核酸序列編碼得自Polyporus pinsitus的漆酶。
19.一種重組載體，它包含權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)。
20.一種重組宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求1的核酸結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是曲霉屬細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是鐮孢屬細(xì)胞。
24.一種生產(chǎn)漆酶的方法，它包括(a)在適合漆酶表達(dá)的條件下，培養(yǎng)一種包含權(quán)利要求1的結(jié)構(gòu)的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述漆酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及帶有一段編碼多孔菌屬(Plyporus)漆酶序列的分離的核酸，以及所編碼的漆酶蛋白。
文檔編號(hào)A61K8/00GK1478895SQ0314256
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期1995年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月24日
發(fā)明者D·S·亞夫爾, F·許, H·達(dá)爾伯吉, P·施耐德, D·A·阿斯林格, D S 亞夫爾, 偷, 阿斯林格 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司, 諾沃奇梅茲有限公司