專利名稱：核酸的純化方法和核酸的純化裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含有核酸的試樣中純化核酸的技術(shù)。本發(fā)明涉及例如從含有DNA和RNA的生物材料中純化RNA的技術(shù)。
背景技術(shù)：
作為承載生物的基因信息的物質(zhì)，有DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)。一般而言DNA是承載生物的全部基因信息的物質(zhì)，另一方面，RNA是基于DNA的基因信息承擔(dān)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)。根據(jù)DNA的分析，主要可以獲得基因序列信息，此外，根據(jù)RNA的分析，主要可以獲得基因表達(dá)信息。它們是對(duì)于分子生物學(xué)極為重要的信息。進(jìn)行DNA分析和RNA分析時(shí)，一般而言，從含有DNA和RNA的生物材料等試樣中分離、純化DNA和RNA的前處理操作是不可缺少的。在DNA和RNA的分離純化中，需要排除阻礙PCR或RT-PCR等分析的物質(zhì)的混入。尤其是，在RNA的分離純化中，重要的是要排除會(huì)阻礙RNA分析的DNA的混入，這需要分離純化高純度的RNA。此外，在有效率地進(jìn)行DNA和RNA分析時(shí)，希望從單一的試樣中同時(shí)分離純化DNA和RNA。
作為從生物材料中分離純化RNA的方法，有Analitycal Biochemistry162，156-159(1989)中記載的方法。該方法是，(1)通過硫氰酸胍溶液溶解生物材料，依次添加酸性緩沖溶液、苯酚溶液、氯仿溶液，并混合；(2)通過離心分離法分離成含有RNA的水相、含有變性蛋白質(zhì)和不溶解的DNA的有機(jī)溶劑相和水相的中間層；(3)在含有RNA的水相中添加乙醇或異丙醇；(4)通過離心分離法選擇性沉淀不溶解的RNA。如果將該方法與以往的超離心分離方法比較，優(yōu)點(diǎn)在于可以有效地分離純化RNA，但是必須使用有害性強(qiáng)的苯酚、氯仿。而且，還不能夠從單一的試樣中同時(shí)分離純化DNA和RNA。
作為不使用苯酚、氯仿等物質(zhì)并且不需要進(jìn)行乙醇沉淀、異丙醇沉淀等操作的核酸的分離純化方法，有利用了核酸在離液劑存在下的與含二氧化硅固相的結(jié)合特性的B.Vogelstein and D.Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(2)，615-619(1979)或者R.Room等人在J.Clin.Microbiol.28(3)，495-503(1990)中記載的方法，但是通過該方法分離純化的RNA含有DNA。而且還不能同時(shí)分離純化DNA和RNA。
作為用離液劑溶解生物材料，在溶解液中添加含有鹽和緩沖劑等的水溶液，使含有DNA的雜質(zhì)不溶解，從除去不溶解物的溶液中提取RNA的方法，有特表2002-507121號(hào)公報(bào)中記載的方法，但是該方法需要在除去不溶解物后，添加乙醇等溶液，以再構(gòu)建RNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合條件，因此純化分離操作變得煩雜。而且，也不能從單一的試樣中同時(shí)分離純化DNA和RNA。
作為利用核酸在離液劑存在下與含二氧化硅固相的結(jié)合特性，來分離純化DNA和RNA的方法，有特開2002-187897號(hào)公報(bào)中記載的方法，但是即使在該方法的RNA的分離純化中RNA的選擇性也不充分，含有DNA。而且，為了同時(shí)從單一的試樣中分離純化DNA和RNA，需要分別構(gòu)建DNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合條件和RNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合條件，因此純化分離操作變得煩雜。
作為從單一的生物試樣中同時(shí)分離純化DNA和RNA的方法，有Molecular Cloning Third edition 7.9中記載的A Single-step Method for theSimultaneous Preparation of DNA，RNA，Protein from Cell and Tissue方法。該方法是，(1)用含有苯酚和硫氰酸胍溶液等的溶解液溶解生物試樣；(2)混合氯仿；(3)通過離心分離法分離成含有RNA的水相和含有DNA和蛋白質(zhì)的有機(jī)相；(4)通過異丙醇沉淀法從水相中純化RNA；(5)通過乙醇沉淀法從有機(jī)相中純化DNA的方法。該方法可以從單一的試樣中同時(shí)分離純化DNA和RNA，但是使用了有害性強(qiáng)的苯酚和氯仿，而且需要進(jìn)行水相和有機(jī)相的分體分離和多次離心分離操作等復(fù)雜的操作。
專利文獻(xiàn)1特表2002-507121號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開2002-187897號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Analytical Biochemistry 162，156-159(1989)非專利文獻(xiàn)2B.Vogelstein and D.Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(2)，615-619(1979)非專利文獻(xiàn)3R.Room et al，J.Clin.Microbiol.28(3)，495-503(1990)非專利文獻(xiàn)4Molecular Cloning Third edition 7.9，A Single-stepMethod for the Simultaneous Preparation of DNA，RNA，Protein from Cell andTissue發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的涉及通過安全又簡(jiǎn)便的操作，從含有核酸的試樣中純化RNA。
本申請(qǐng)的發(fā)明人進(jìn)行深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)如果在含有DNA和RNA的試樣與離液劑的混合液中添加有機(jī)溶劑，則DNA不溶解，RNA維持溶解狀態(tài)。本發(fā)明涉及將含有核酸的試樣、離液劑和有機(jī)溶劑混合，使DNA不溶解，從混合液中分離不溶解物，從殘液中純化RNA。此外，即使不在殘液中加入試劑等，也可以通過與含二氧化硅固相接觸，使RNA與含二氧化硅固相結(jié)合。此外，還可以從不溶解物中純化DNA。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過安全又簡(jiǎn)便的操作從含有DNA和RNA的試樣中純化高純度的RNA。此外，還可以從單一的試樣中同時(shí)純化DNA和RNA。


圖1芯片型DNA純化裝置的示意圖。
圖2柱型RNA純化裝置的示意圖。
圖3芯片型DNA純化裝置的示意圖。
圖4柱型RNA純化裝置的示意圖。
圖5DNA、RNA純化裝置的示意圖。
圖中，10為芯片型DNA純化裝置；11、31為開口部；12、32為前端部；13、23、113為過濾不溶解物的過濾器；20為旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置；21、41、111為第1開口部；22、42、112為第2開口部；30為芯片型RNA純化裝置；33、43、124為含二氧化硅固相；34、44、123為含二氧化硅固相保持構(gòu)件；40為旋轉(zhuǎn)柱型RNA純化裝置；100為DNA、RNA純化裝置；110為上部旋轉(zhuǎn)柱；120為下部旋轉(zhuǎn)柱；121為第3開口部；122為第4開口部。
具體實(shí)施例方式
下面，參照附圖對(duì)上述和其它本發(fā)明的新特征和效果進(jìn)行說明。
實(shí)施例本實(shí)施例中，混合含有核酸的試樣、離液劑和有機(jī)溶劑，使DNA大部分不溶解，從混合液中分離不溶解物。然后，將分離了不溶解物的混合液與含二氧化硅固相接觸，使RNA與含二氧化硅固相結(jié)合，從混合液中分離含二氧化硅固相后，通過清洗液除去與含二氧化硅固相結(jié)合的雜質(zhì)，用洗脫液洗脫與含二氧化硅固相結(jié)合的RNA。而且，還可以從分離自混合液的不溶解物中純化DNA。
為了使DNA不溶解，在含有核酸的試樣中添加離液劑和有機(jī)溶劑而形成的混合液，需要使其有機(jī)溶劑的濃度最適化。當(dāng)有機(jī)溶劑的濃度比最適濃度區(qū)域還低時(shí)DNA無(wú)法不溶解，另一方面當(dāng)有機(jī)溶劑的濃度比最適濃度區(qū)域還高時(shí)DNA和RNA都不溶解。有機(jī)溶劑的最適濃度主要是因有機(jī)溶劑的種類而異。通過添加有機(jī)溶劑后經(jīng)移液操作或采用攪拌器等混合，來促進(jìn)不溶解物的形成。
作為提取純化RNA或DNA的起始材料的含有核酸的試樣，有含有DNA和RNA的溶液或生物材料。作為含有DNA和RNA的溶液，可以使用從含有DNA和RNA的生物材料中以DNA和RNA混合存在的狀態(tài)粗純化核酸的溶液等。此外，作為含有DNA和RNA的生物材料，可以使用血液、生物體組織、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌等。
作為添加于含有核酸的試樣中，促進(jìn)核酸與含二氧化硅固相結(jié)合的離液劑，可以使用硫氰酸胍、硫氰酸鈉、鹽酸胍、碘化鈉、碘化鉀等。作為離液劑的濃度，添加有機(jī)溶劑后的混合液中的濃度，可以使用1.0～4.0mol/l的范圍。但是，以生物材料為對(duì)象時(shí)，優(yōu)選除了離液劑之外，還添加表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑、蛋白質(zhì)裂解酶等，進(jìn)而再用攪拌機(jī)器或勻漿器等進(jìn)行物理處理，促進(jìn)生物材料的溶解和DNA和RNA的分離。
作為有機(jī)溶劑，可以使用選自脂肪醇、脂肪醚、脂肪酸酯、脂肪酮的一種化合物或兩種或兩種以上化合物的組合。作為脂肪醇，可以使用甲醇、乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇等。作為脂肪醚，可以使用二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、四氫呋喃等。作為脂肪酸酯，可以使用乳酸乙酯、丙二醇單甲醚乙酸酯等。作為脂肪酮，可以使用丙酮、羥丙酮、甲基酮等。
根據(jù)過濾混合物的方法或者離心分離混合液的方法，從混合液中分離不溶解物。為了從混合液中分離不溶解物，所采用的構(gòu)件具有用來投入含有核酸試樣、離液劑和有機(jī)溶劑的混合液的混合液投入口；能夠從混合液中分離DNA的不溶解物的過濾器；用來排放流經(jīng)過濾器的混合液的混合液排出口。例如，可以通過流經(jīng)內(nèi)置了由具有用于截留不溶解物的粒子保持直徑并且不與混合液的RNA結(jié)合的含有非二氧化硅的材料構(gòu)成的過濾器的柱、芯片或注射器，來實(shí)施混合液的過濾。作為用于截留不溶解物的粒子保持直徑，可以使用0.1μm～500μm的范圍。此外，作為不結(jié)合混合液的RNA的含有非二氧化硅的材料，可以使用聚丙烯、尼龍、聚酯、聚偏氟乙烯等。
根據(jù)在容器內(nèi)攪拌混合含二氧化硅固相和混合液的方法，或者使混合液流經(jīng)具備用來投入混合液的溶液投入口、以及被安置成與投入到溶液投入口的溶液可以接觸的含二氧化硅固相的構(gòu)件的方法，使從混合液中分離了不溶解物的混合液與含二氧化硅固相接觸。作為具備含二氧化硅固相的構(gòu)件，可以使用固定了含二氧化硅固相的柱、芯片或注射器等。將混合液與含二氧化硅固相接觸后，分離含二氧化硅固相和混合液。作為含二氧化硅固相，可以使用玻璃粒子、二氧化硅粒子、玻璃纖維、二氧化硅纖維、硅藻土、或它們的粉碎物等含有氧化硅的物質(zhì)。
根據(jù)在容器內(nèi)攪拌混合含二氧化硅固相和清洗液的方法，或者使清洗液通過固定有含二氧化硅固相的柱、芯片或注射器等的方法，使清洗液與含二氧化硅固相接觸。在清洗液與含二氧化硅固相接觸后，從含二氧化硅固相分離清洗液。作為清洗液，可以使用能夠維持RNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合，并且可以除去與含二氧化硅固相結(jié)合的雜質(zhì)，而且含有80％(v/v)或其以上乙醇的水溶液或者含有80％(v/v)或其以上EtOH的低鹽濃度的緩沖液。
根據(jù)在容器內(nèi)攪拌混合含二氧化硅固相和洗脫液的方法，或者使洗脫液通過固定有含二氧化硅固相的柱、芯片或注射器等的方法，使洗脫液與含二氧化硅固相接觸。在洗脫液與含二氧化硅固相接觸后，從含二氧化硅固相分離回收洗脫液。作為洗脫液，可以使用能夠洗脫含二氧化硅固相所吸附的RNA，并且無(wú)核酸酶的水溶液或無(wú)核酸酶的低鹽濃度的緩沖液。
當(dāng)根據(jù)過濾混合液來分離不溶解物時(shí)，使清洗液與截留了不溶解物的過濾器接觸而除去雜質(zhì)后，使洗脫液與過濾器接觸，來洗脫DNA，這樣從不溶解物中純化DNA。此外，根據(jù)混合液的離心分離法分離不溶解物時(shí)，通過除去上清，在沉淀的不溶解物中添加清洗液，溶解不溶解物中含有的雜質(zhì)，再次通過離心分離使不溶解物沉淀，除去上清，在沉淀的不溶解物中添加DNA洗脫液，來洗脫DNA。作為清洗液，可以使用不溶解DNA并且溶解不溶解物中所含雜質(zhì)，而且含有70％(v/v)或其以上EtOH的水溶液或者含有70％(v/v)或其以上EtOH的低鹽濃度的緩沖液等。作為洗脫液，可以使用可溶解DNA的無(wú)核酸酶的水溶液或無(wú)核酸酶的低鹽濃度的緩沖液。而且，為了進(jìn)一步提高從不溶解物中純化的DNA的純度和產(chǎn)量，可以在將不溶解物溶解于無(wú)核酸酶的水溶液或無(wú)核酸酶的低鹽濃度的緩沖液后，通過乙醇沉淀等方法再次純化。
通過以上說明，在本實(shí)施例中，用于使DNA不溶解的混合液的組成與用于使含二氧化硅固相與RNA結(jié)合的混合液的組成相同，不需要分別構(gòu)建DNA的不溶解條件和RNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合條件，或者DNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合條件和RNA對(duì)于含二氧化硅固相的結(jié)合條件。因此，可以通過將分離了DNA的不溶解物的混合液直接與含二氧化硅固相結(jié)合，分離純化RNA。作為具體的例子，通過使不溶解DNA的混合液連續(xù)地從能夠截留DNA的不溶解物的過濾器、以及可以與RNA結(jié)合的含有二氧化硅的過濾器，可以分離純化DNA和RNA。通過這些方法，大大提高DNA和RNA分離純化操作的簡(jiǎn)便性。
(實(shí)驗(yàn))下面，對(duì)本實(shí)施例的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說明。
A)下面，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中使用的材料，試劑，裝置進(jìn)行說明。
1.含有DNA和RNA的生物材料1.1白血球使用以EDTA·2Na作為抗凝固劑用真空采血管采取的人全血中分離的白血球。
1.2培養(yǎng)細(xì)胞使用小鼠骨髓瘤(Sp2/0-Ag14)(大日本制藥制造)的培養(yǎng)細(xì)胞。
1.3生物體組織使用小鼠肝臟(ヮナコシ制)。
2.試劑2.1紅血球溶解液155mM NH4Cl10mM KHCO30.1mM EDTA·2Na2.2溶解液4M GuSCN25mM檸檬酸鈉(pH7.5)1％β硫基乙醇2.3有機(jī)溶劑溶液(1)40％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液(2)42.5％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液(3)45％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液(4)47.5％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液(5)50％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液(6)65％(v/v)2-丙醇水溶液(7)67.5％(v/v)2-丙醇水溶液(8)70％(v/v)2-丙醇水溶液(9)72.5％(v/v)2-丙醇水溶液(10)75％(v/v)2-丙醇水溶液(11)77.5％(v/v)乙醇水溶液(12)70％(v/v)2-丁醇水溶液(13)50％(v/v)聚乙二醇(平均分子量為300)水溶液(14)70％(v/v)乳酸乙酯水溶液2.4清洗液
(1)DNA清洗液80％(v/v)乙醇水溶液(2)RNA清洗液80％(v/v)乙醇水溶液2.5洗脫液(1)DNA洗脫液TE(pH8.0)(和光純藥制)(2)RNA洗脫液H2O(無(wú)核酸酶)(和光純藥制)3.DNA純化裝置(1)不溶解物分離過濾器使用粒子保持直徑為100μm的聚丙烯粒子燒結(jié)板(厚度為2mm)。
(2)芯片型DNA純化裝置圖1中表示了芯片型DNA純化裝置的構(gòu)成例。芯片型DNA純化裝置10是分注用芯片那樣的外形，其具有可以投入液體的開口部11，和可以排出液體的前端部12，其內(nèi)部有不溶解物分離過濾器13。該裝置也可以是在壓力控制裝置上裝備開口部，從前端部將液體吸入吐出。在本實(shí)驗(yàn)，在內(nèi)徑4mm的芯片內(nèi)部壓入被切割成直徑4.2mm的圓柱狀的不溶解物分離過濾器來使用。
(3)旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置圖2中表示了旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置的構(gòu)成例。旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置20是旋轉(zhuǎn)柱那樣的外形，其具有用于投入液體的第1開口部21、排出液體的第2開口部22，其內(nèi)部有不溶解物分離過濾器23。該裝置安裝于離心分離器中，通過離心分離，可以使被投入的溶液通過不溶解物分離過濾器，排出。在本實(shí)驗(yàn)中，在內(nèi)徑7.5mm的旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部壓入被切割成直徑7.6mm的圓狀不溶解物分離過濾器來使用。
4.RNA純化裝置(1)含二氧化硅的固相使用玻璃纖維濾紙(GF/D)(Whatman公司制)。
(2)含二氧化硅的固相保持構(gòu)件使用粒子保持直徑為100μm的聚丙烯粒子燒結(jié)板(厚度為1.5mm)。
(3)芯片型RNA純化裝置圖3中表示了芯片型RNA純化裝置的構(gòu)成例。芯片型RNA純化裝置30是分注用芯片那樣的外形，其具有可以安裝于壓力控制裝置的開口部31、可以吸入和排出液體的前端部32，其內(nèi)部有含二氧化硅固相33。含二氧化硅固相的兩側(cè)安裝有圓板狀的含二氧化硅固相保持構(gòu)件34。這些含二氧化硅固相保持構(gòu)件也可形成液體和氣體自由流通的許多小孔。該裝置也可以在壓力控制裝置上裝備開口部，從前端部吸引和排出液體。在本實(shí)驗(yàn)中，將一塊被切割成直徑4.2mm的圓狀的含二氧化硅固相，以被夾在兩塊被切割成直徑4.1mm的圓狀的含二氧化硅固相保持構(gòu)件之間的狀態(tài)，壓入到內(nèi)徑4mm的中空芯片內(nèi)部來使用。
(4)旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置圖4中表示了旋轉(zhuǎn)柱型RNA純化裝置的構(gòu)成例。旋轉(zhuǎn)柱型RNA純化裝置40是旋轉(zhuǎn)柱那樣的外形，其具有用于投入溶液的第1開口部41、排出溶液的第2開口部42，其內(nèi)部有在兩端安裝有含二氧化硅固相保持構(gòu)件44的含二氧化硅固相43。該裝置安裝于離心分離器中，通過離心分離，可以使投入的溶液通過含二氧化硅固相，排出。在本實(shí)驗(yàn)中，將兩塊被切割成直徑7.7mm的圓狀的含二氧化硅固相，以被夾在兩塊被切割成直徑7.6mm的圓狀的含二氧化硅固相保持構(gòu)件之間的狀態(tài)，壓入到內(nèi)徑7.5mm的旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部來使用。
5.DNA、RNA純化裝置圖5中表示DNA、RNA純化裝置的構(gòu)成例。DNA、RNA純化裝置100是組合了旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置和旋轉(zhuǎn)柱型RNA純化裝置，由作為DNA純化裝置的上部旋轉(zhuǎn)柱110和作為RNA純化裝置的下部旋轉(zhuǎn)柱120構(gòu)成。上部旋轉(zhuǎn)柱110具有用于投入溶液的第1開口部111、排出溶液的第2開口部112，在其內(nèi)部有不溶解物分離過濾器113。下部旋轉(zhuǎn)柱120具有與上部旋轉(zhuǎn)柱連接并且用于投入從上部旋轉(zhuǎn)柱排出的溶液的第3開口部121、用于排出溶液的第4開口部122，其內(nèi)部有在兩端安裝有含二氧化硅固相保持構(gòu)件123的含二氧化硅固相124。該裝置安裝于離心分離器中，通過離心分離，可以使投入的溶液連續(xù)地通過不溶解物分離過濾器和含二氧化硅固相，排出。在本實(shí)驗(yàn)中組合使用上部旋轉(zhuǎn)柱和下部旋轉(zhuǎn)柱，其中，上部旋轉(zhuǎn)柱是在內(nèi)徑為6.7mm的旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部壓入被切割成直徑為6.8mm的圓狀的不溶解物分離過濾器而形成，下部旋轉(zhuǎn)柱是將兩塊被切割成直徑7.7mm的圓柱狀的玻璃纖維濾紙，以被夾在兩塊被切割成直徑7.6mm的圓狀的含二氧化硅固相保持構(gòu)件之間的狀態(tài)，壓入到內(nèi)徑7.5mm的旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部而形成。
B)下面顯示的是本實(shí)驗(yàn)中使用的各種方法。從含有DNA和RNA的生物材料中純化分離DNA和RNA的方法是通過對(duì)以下各種方法適當(dāng)組合而進(jìn)行的。
1.從全血中分離白血球的方法(1)在全血中添加全血容量的5倍容量的紅血球溶解液并混合。
(2)在冰上孵育5分鐘。
(3)以400×g進(jìn)行10分鐘離心分離。
(4)除去上清。
(5)在沉淀塊中添加混合全血添加量的2倍容量的紅血球溶解液。
(6)在4℃環(huán)境下以400×g進(jìn)行10分鐘離心分離。
(7)除去上清獲得白血球的沉淀塊。
2.生物材料的溶解方法2.1白血球的溶解方法(1)在白血球沉淀塊中添加分離了白血球的全血量的一半容量的溶解液并混合。
(2)通過勻漿器(QIA shredder homogenizer)(QAIGEN制)使混合液均勻。
2.2培養(yǎng)細(xì)胞的溶解方法(1)對(duì)于細(xì)胞數(shù)為5×105的細(xì)胞塊，添加1ml溶解液并混合。
(2)通過勻漿器(T8 ULTRA-TURRAX)(IKA制)使混合液均勻。
2.3生物體組織的溶解方法(1)對(duì)于1mg生物體組織，添加1ml溶解液并混合。
(2)通過勻漿器(T8 ULTRA-TURRAX)(IKA制)使混合液均勻。
3.不溶解物的形成方法在生物材料中添加與添加的溶解液等量的有機(jī)溶劑并充分混合。
4.DNA純化方法4.1采用芯片型DNA純化裝置對(duì)DNA分離、純化的方法(1)從芯片上部將形成了不溶解物的混合液添加到芯片內(nèi)部。
(2)在芯片上安裝注射器，芯片內(nèi)部的溶液從芯片下部排出。
(3)撤掉注射器，從芯片上部將與混合液等量的DNA清洗液添加到芯片內(nèi)部。
(4)安裝注射器，芯片內(nèi)部的DNA清洗液從芯片下部排出。
(5)重復(fù)操作(3)、(4)兩次。
(6)在純化品容器中添加混合液的1/5容量的DNA洗脫液。
(7)通過芯片下部吸入DNA洗脫液直至通過不溶解物分離過濾器，在室溫下孵育3分鐘。
(8)DNA洗脫液通過芯片下部排出到純化品容器中。
(9)通過芯片下部吸入DNA洗脫液直至通過不溶解物分離過濾器，排出到純化品容器中。
(10)重復(fù)操作(9)九次，在純化品容器中獲得DNA純化溶液。
4.2根據(jù)旋轉(zhuǎn)柱型DNA純化裝置對(duì)DNA分離、純化方法(1)在旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加形成了不溶解物的混合液。
(2)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的容器，以2000×g離心分離10秒，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(3)在旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加與混合液等量的DNA清洗液。
(4)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的容器，以2000×g離心分離10秒，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(5)重復(fù)操作(3)、(4)兩次。
(6)在旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加混合液的1/5容量的DNA洗脫液。
(7)在60℃孵育3分鐘。
(8)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的純化品容器，以2000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的純化品容器中，獲得DNA純化溶液。
4.3根據(jù)離心分離對(duì)DNA分離、純化的方法
(1)以6000×g對(duì)形成了不溶解物的混合液離心分離3分鐘。
(2)將上清轉(zhuǎn)移到其它容器中。
(3)在沉淀物中添加與混合物等量的DNA清洗液并混合。
(4)以10000×g離心分離5分鐘。
(5)棄去上清，在沉淀物中添加與混合物等量的DNA清洗液并混合。
(6)以10000×g離心分離5分鐘。
(7)棄去上清，在沉淀物中添加混合物的1/5容量的DNA洗脫液并混合，獲得DNA純化溶液。
5.RNA純化方法5.1根據(jù)芯片型RNA純化裝置對(duì)RNA分離、純化的方法(1)在芯片上安裝注射器。
(2)從芯片下部吸收流經(jīng)不溶解物分離過濾器的混合液直至通過含二氧化硅固相，排出到容器中。
(3)重復(fù)操作(2)五次。
(4)撤掉注射器，從芯片上部將與混合液等量的RNA清洗液添加到芯片內(nèi)部。
(5)安裝注射器，芯片內(nèi)部的RNA清洗液從芯片下部排出。
(6)重復(fù)操作(4)、(5)兩次。
(7)在純化品容器中添加混合液的1/20容量的RNA洗脫液。
(8)由芯片下部吸入RNA洗脫液直至通過含二氧化硅固相，排出到純化品容器中。
(9)重復(fù)操作(8)十次，在純化品容器中獲得RNA純化溶液。
5.2根據(jù)旋轉(zhuǎn)柱型RNA純化裝置對(duì)RNA分離、純化方法(1)在旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加流經(jīng)不溶解物分離過濾器的混合液。
(2)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的容器，以4000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(3)在旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加與混合液等量的RNA清洗液。
(4)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的容器，以4000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(5)重復(fù)操作(3)、(4)兩次。
(6)在旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加混合液的1/20容量的RNA洗脫液。
(7)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的純化品容器，以4000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的純化品容器中，獲得RNA純化溶液。
6.根據(jù)DNA、RNA純化裝置對(duì)DNA和RNA分離、純化的方法(1)在DNA、RNA純化裝置的上部旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加形成了不溶解物的混合液。
(2)在旋轉(zhuǎn)柱中設(shè)置接收溶液的容器，以4000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(3)分離DNA、RNA連續(xù)純化裝置的上部旋轉(zhuǎn)柱和下部旋轉(zhuǎn)柱。
(4)在上部旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加與混合液等量的DNA清洗液。
(5)在下部旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加與混合液等量的RNA清洗液。
(6)在各個(gè)旋轉(zhuǎn)柱設(shè)置接收溶液的容器，以4000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(7)重復(fù)操作(3)、(4)兩次。
(8)在上部旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加混合液的1/5容量的DNA洗脫液，在65℃孵育3分鐘。
(9)在下部旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部添加混合液的1/20容量的RNA洗脫液。
(10)在各個(gè)旋轉(zhuǎn)柱設(shè)置接收溶液的容器，以4000×g離心分離1分鐘，旋轉(zhuǎn)柱內(nèi)部的溶液排出到各自接收溶液的純化品容器中，獲得DNA純化溶液和RNA純化溶液。
C)下面對(duì)在本實(shí)驗(yàn)中純化的DNA和RNA的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行說明。
1.根據(jù)電泳計(jì)算DNA和RNA的含量比率采用1.25％瓊脂糖凝膠(Reliant RNA Gel System)(FMC制)對(duì)經(jīng)甲酰胺進(jìn)行了變性處理的DNA純化溶液和RNA純化溶液進(jìn)行電泳(10V/cm，40分鐘)。用溴化乙錠對(duì)電泳后的瓊脂糖凝膠染色，在UV照射下通過デンシトグラフ(ATTO制)測(cè)定含有mRNA和rRNA的RNA組的熒光強(qiáng)度和基因組DNA的熒光強(qiáng)度，基于RNA與DNA的熒光強(qiáng)度比，計(jì)算出RNA與DNA的含量比率。
2.DNA和RNA的濃度測(cè)定適量地稀釋DNA純化溶液和RNA純化溶液，用分光光度計(jì)(GeneSpecI)(日立那珂儀器制造)測(cè)定260nm的吸光度，基于根據(jù)デンシトグラヮ分析計(jì)算出的RNA與DNA的含量比率，使RNA和DNA的濃度因子為40μg/ml、50μg/ml，計(jì)算出RNA量和DNA量。
D)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)1在含有DNA和RNA的生物材料和離液劑的混合液中添加有機(jī)溶劑，使DNA不溶，為了分離純化DNA和RNA，需要使有機(jī)溶液的濃度最適化。在本實(shí)驗(yàn)中，為了評(píng)價(jià)DNA和RNA的分離純化效果與有機(jī)溶劑濃度的關(guān)系，使用二乙二醇二甲醚和2-丙醇作為有機(jī)溶劑，變化有機(jī)溶劑濃度，分離純化DNA和RNA，對(duì)有機(jī)溶劑濃度的最適化進(jìn)行研究。
生物材料白血球(相當(dāng)于600μl全血)有機(jī)溶劑二乙二醇二甲醚水溶液、2-丙醇水溶液DNA純化方法通過芯片型DNA純化裝置對(duì)DNA純化的方法RNA純化方法通過旋轉(zhuǎn)柱型RNA純化裝置對(duì)RNA純化的方法下面的表1中，顯示了DNA純化溶液的DNA量和RNA含量，以及RNA純化溶液的RNA量和DNA含量。
在使用二乙二醇二甲醚時(shí)，在濃度45％左右，DNA純化溶液幾乎不含RNA，并且，RNA純化溶液幾乎不含DNA，純化分離出了高純度的DNA和RNA。另一方面，關(guān)于濃度40％，DNA純化溶液的DNA量降低，可認(rèn)為RNA純化溶液的DNA含量有增加的傾向。此外，關(guān)于濃度50％，DNA純化溶液的RNA含量增加，可認(rèn)為RNA純化溶液的RNA含量有降低的傾向。
在使用2-丙醇時(shí)，在濃度70％左右，DNA純化溶液幾乎不含RNA，此外，RNA純化溶液幾乎不含DNA，純化分離出了高純度的DNA和RNA。另一方面，關(guān)于濃度65％，DNA純化溶液的DNA量降低，可認(rèn)為RNA純化溶液的DNA含量有增加的傾向。此外，關(guān)于濃度75％，DNA純化溶液的RNA含量增加，可認(rèn)為RNA純化溶液的RNA含量有降低的傾向。
一般認(rèn)為RNA或DNA的含量比率根據(jù)有機(jī)溶劑濃度而變動(dòng)的原因在于，有機(jī)溶劑濃度比最適濃度域更低時(shí)DNA的不溶解變得不充分，溶解狀態(tài)<p>

適用范圍適用于保溫體系中網(wǎng)格布的粘結(jié)。
優(yōu)點(diǎn)1、比重、導(dǎo)熱系數(shù)遠(yuǎn)低于普通的粘接砂漿，降低了系統(tǒng)對(duì)墻體的負(fù)荷，提高了系統(tǒng)的安全性，同時(shí)也提高了系統(tǒng)整體的保溫效果。
2、抗開裂性能好，粘結(jié)強(qiáng)度高，不開裂、長(zhǎng)期使用不剝落。
3、具有拉伸強(qiáng)度和伸縮率的最佳平衡點(diǎn)，能夠有效的釋放溫度變化和墻體變形所產(chǎn)生的應(yīng)力，從而保證了保溫系統(tǒng)的整體性能。
4、添加高效相變蓄能材料，降低室內(nèi)溫度波動(dòng)，同時(shí)提高材料的抗裂性。
5、無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)異味。
柔性膩?zhàn)硬捎每顾阅軆?yōu)異的高分子聚合物膠粉、優(yōu)質(zhì)低堿水泥、格布，需要注意的是在鋪完網(wǎng)格布后應(yīng)干燥24小時(shí)，然后用錨固件固定加強(qiáng)耐堿玻纖網(wǎng)格布，再刮柔性膩?zhàn)印?br> 本發(fā)明采用的主要產(chǎn)品的性能如下防潮界面劑的主要性能指標(biāo)見下表

全水發(fā)泡硬酯聚氨酯保溫材料的性能指標(biāo)為密度35-40kg/m3；抗壓強(qiáng)度≥250kPa；抗拉強(qiáng)度≥150kPa；吸水率≤3％；導(dǎo)熱系數(shù)≤0.025W/(m·K)；線性尺寸變化率80℃ 24h≤3％；-2 5℃ 24h≤3％；平均燃燒時(shí)間≤90s；平均燃燒范圍≤50mm；燃燒性能采用水平燃燒法試驗(yàn)方法測(cè)定。GB/T 10800-89“建筑物隔熱用硬質(zhì)聚氨酯泡沫塑料”。
界面層的主要性能指標(biāo)見下表

輕質(zhì)防護(hù)砂漿采用進(jìn)口可再分散聚合物膠粉、優(yōu)質(zhì)低堿水泥、無(wú)機(jī)填料以及高效相變蓄能材料等材料經(jīng)過特殊工藝制成，是一種高性能的復(fù)合型外墻節(jié)能系統(tǒng)專用配套材料，無(wú)毒、無(wú)害，為綠色環(huán)保產(chǎn)品。主要性能指標(biāo)見下表
DNA純化溶液的DNA量是，當(dāng)采用離心分離法時(shí)最多，接下來的順序是采用芯片型純化裝置的方法、采用旋轉(zhuǎn)柱型純化裝置的方法。一般認(rèn)為這是由于，盡管在各方法中不溶解DNA的截留效率幾乎相同，但是從不溶解的DNA中洗脫DNA的效率不同。此外，采用芯片型純化裝置的方法時(shí)，RNA純化溶液的RNA量要比采用旋轉(zhuǎn)柱型純化裝置的方法時(shí)更多。一般認(rèn)為這是由于，在各方法中對(duì)于含二氧化硅固相的RNA結(jié)合效率和RNA洗脫效率不同。
另一方面，分離純化DNA和RNA操作需要的時(shí)間是，采用DNA和RNA純化裝置的方法時(shí)最短，接下來的順序是采用旋轉(zhuǎn)柱型純化裝置的方法、采用芯片型純化裝置的方法。這是因?yàn)椴捎弥图兓b置的方法比采用芯片型純化裝置的方法的操作更簡(jiǎn)便。
此外，在純化分離DNA和RNA的操作中簡(jiǎn)便性最高的使用DNA、RNA純化裝置的方法，由于用來形成DNA不溶解物的混合溶液的組成與用來使RNA和含二氧化硅固相結(jié)合的混合溶液的組成相同，因此是可實(shí)施的方法。
表3

G)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)4在含有DNA和RNA的生物材料和離液劑的混合液中添加有機(jī)溶劑，僅使DNA不溶，來分離純化DNA和RNA的方法，可以應(yīng)用于各種含核酸試樣。在本實(shí)驗(yàn)中，為了評(píng)價(jià)DNA和RNA的分離純化效果與含核酸試樣的關(guān)<p>實(shí)施例1本實(shí)施例比較本發(fā)明拋光組合物在經(jīng)拋光的表面涂層上形成的保護(hù)膜的耐久性1.配制拋光組合物按表1所述組成將蠟、溶劑和硅氧烷樹脂液加入攪拌釜中以200-300RPM轉(zhuǎn)速混合，同時(shí)將溫度提高至蠟的熔融溫度，在形成透明溶液后停止加熱；平行地將表1所列的其它組分加入水中，加熱至約40-70℃，隨后在約500-1000RPM的高攪拌速度下加入上面制得的透明蠟溶液。在保持該攪拌速度的同時(shí)將溫度冷卻至室溫，得到均勻的乳液。
表1

(1)該聚二甲基硅氧烷具有通式(CH3)3SiO[SiO(CH3)2]10Si(CH3)3；(2)該氨基聚二甲基硅氧烷具有通式CH3Si(CH3)2[SiO(CH3)2]m[SiO(CH3)(CH2)3NHCH2CH2NH2]nOCH3(M平均值為60；N平均值為1)；(3)無(wú)定形硅酸鋁，中值粒徑為1微米。
權(quán)利要求
1.一種純化核酸的方法，其是將含有核酸的試樣、離液劑和有機(jī)溶劑混合，形成DNA的不溶解物；從混合液中除去不溶解物；將分離了不溶解物的混合液與含二氧化硅固相接觸，使RNA與含二氧化硅固相結(jié)合；從混合液中分離含二氧化硅固相；清洗含二氧化硅固相；從含二氧化硅固相中洗脫RNA的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的純化核酸的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是脂肪醇、脂肪醚、脂肪酸酯、或脂肪酮中的化合物，或者它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1記載的純化核酸的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇、二乙二醇二甲醚、乳酸乙酯。
4.一種純化核酸的方法，其是將含有核酸的試樣、離液劑和有機(jī)溶劑混合，形成DNA的不溶解物；從混合液中分離不溶解物，從不溶解物中純化DNA；將分離了不溶解物的混合液與含二氧化硅固相接觸，使RNA與含二氧化硅固相結(jié)合；從混合液中分離含二氧化硅固相；清洗含二氧化硅固相；從含二氧化硅固相洗脫RNA的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4記載的純化核酸的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是脂肪醇、脂肪醚、脂肪酸酯、或脂肪酮中的化合物，或者它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4記載的純化核酸的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇、二乙二醇二甲醚、乳酸乙酯。
7.一種核酸純化裝置，其含有以下構(gòu)件，分離構(gòu)件具備用來投入含有核酸的試樣、離液劑和有機(jī)溶劑的混合液的混合液投入口；可以從混合液中分離DNA的不溶解物的過濾器；用來排出流經(jīng)過濾器的混合液的混合液排出口，核酸截留構(gòu)件具備可以與分離構(gòu)件的混合液排出口連接的溶液投入口；被安置成可以與投入到溶液投入口的溶液接觸的含二氧化硅固相。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的核酸純化裝置，其是通過離心力使混合液流經(jīng)過濾器，與含二氧化硅固相接觸的核酸純化裝置。
9.根據(jù)權(quán)利要求7記載的核酸純化裝置，其是通過壓力差使混合液流經(jīng)過濾器，與含二氧化硅固相接觸的核酸純化裝置。
全文摘要
本發(fā)明的目的為根據(jù)安全且簡(jiǎn)便的操作，從含有核酸的試樣中純化RNA。本申請(qǐng)的發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果在含有DNA和RNA的試樣與離液劑的混合液中添加有機(jī)溶劑，則DNA不溶解，RNA維持溶解狀態(tài)。本發(fā)明通過將含有核酸的試樣、離液劑和有機(jī)溶劑混合，使DNA不溶解，從混合液中分離不溶解物，從殘液中純化RNA。此外，即使不在殘液中加入試劑等，也可以通過與含二氧化硅固相接觸，使RNA與含二氧化硅固相結(jié)合。而且，還可以從不溶解物中純化DNA。根據(jù)本發(fā)明，可以通過安全又簡(jiǎn)便的操作從含有DNA和RNA的試樣中純化高純度的RNA。此外，還可以從單一的試樣中同時(shí)純化DNA和RNA。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1858057SQ20061007499
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月6日
發(fā)明者山下善寬, 櫻井智也 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立高新技術(shù)