專利名稱：制備人甲狀旁腺素1－34的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的制備技術(shù)，具體地講，涉及利用基因工程技術(shù)制備人甲狀旁腺素1-34(hPTH(1-34))的方法。
背景技術(shù)：
甲狀旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是由甲狀旁腺激素主細(xì)胞合成的，由84個(gè)氨基酸組成。人們逐漸認(rèn)識(shí)到PTH能夠增加在合成新骨基質(zhì)中非常活躍的成骨細(xì)胞的數(shù)量，并且能在體內(nèi)改變骨骼中的基因表達(dá)。PTH還具有降低血壓、調(diào)節(jié)維生素D受體(VDR)表達(dá)、調(diào)節(jié)堿性磷酸酯酶的活性的作用。Tregear等(Tregear GW等，Endocrinology，1973，931349)用實(shí)驗(yàn)證明PTH發(fā)揮鈣磷調(diào)節(jié)分子作用僅需氨基端1-34個(gè)氨基酸殘基。但是，PTH(1-34)不含半胱氨酸，在體內(nèi)較不穩(wěn)定。
PTH的基因工程研究開始于20世紀(jì)80年代。目前制備PTH(1-34)的基因工程方法主要有兩類，一類為以包涵體的形式制備，另一類以可溶蛋白的形式制備。1997年，日本科學(xué)家Yuji Suzuki等將人甲狀旁腺素(hPTH(1-34))與β-半乳糖苷酶融合表達(dá)，但融合蛋白以包涵體形式存在。中國(guó)專利公開號(hào)CN 1417231A也公開了一種以包涵體的形式制備hPTH(1-34)的方法。在這一類的方法中，表達(dá)出的融合蛋白需經(jīng)包涵體提取、稀釋復(fù)性、酶切，然后進(jìn)行離子交換、反相HPLC層析等手段進(jìn)行純化，才能得到hPTH(1-34)，因而這一類方法的制備步驟較為復(fù)雜。
中國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)CN1424325A公開了一種重組人甲狀旁腺素前體肽以及重組人甲狀旁腺素1-34肽的制備工藝。為了制備該甲狀旁腺素1-34肽，需要先使工程菌表達(dá)出GST-Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)這一融合蛋白，再先后用凝血酶和脯氨酸內(nèi)肽酶對(duì)所得融合蛋白進(jìn)行酶切，再經(jīng)分離純化后得到所需的甲狀旁腺素1-34肽。由于需要使用雙酶切，該專利申請(qǐng)公開的制備工藝也較為復(fù)雜。
人們?cè)缫阎懒蜓踹€蛋白(Thiroedoxin，下文有時(shí)簡(jiǎn)稱為“Trx”)是一種普遍存在于酵母、細(xì)菌、動(dòng)物、植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)也是目前常用的PTH(1-34)表達(dá)宿主例如酵母或大腸桿菌的內(nèi)源蛋白，但是至今還沒有人利用該蛋白與PTH(1-34)融合來簡(jiǎn)便地制備hPTH(1-34)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種新的制備hPTH(1-34)方法。該方法包括如下步驟(1)使能表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，所述融合蛋白從N端到C端的序列為Trx-(His)6-腸激酶識(shí)別位點(diǎn)-甲狀旁腺激素1-34肽；(2)用鎳離子螯合親和層析對(duì)步驟(1)得到的融合蛋白進(jìn)行純化；以及(3)將步驟(2)純化得到的融合蛋白用腸激酶酶切，以將甲狀旁腺激素1-34肽從所述融合蛋白中釋放下來。利用本發(fā)明的方法，可快速、簡(jiǎn)便、高效地純化hPTH(1-34)，大大提高了回收率。
為了得到hPTH(1-34)多肽純品，在如上所述利用腸激酶將hPTH(1-34)從所述融合蛋白中釋放下來后，本發(fā)明的方法還優(yōu)選進(jìn)一步包括如下步驟(4)對(duì)步驟(3)酶切得到的混合物用陰離子交換柱進(jìn)行層析，收集穿透蛋白溶液；(5)使步驟(4)收集得到的穿透蛋白溶液過反相層析柱，收集洗脫峰；以及(6)將步驟(5)得到的蛋白溶液過陽離子交換柱。
在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述融合蛋白中腸激酶識(shí)別位點(diǎn)-甲狀旁腺激素1-34肽由下列核苷酸序列編碼GACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTC。
在所述步驟(1)中，可以使用大腸桿菌表達(dá)載體體系，也可以使用酵母表達(dá)體系。如果使用大腸桿菌表達(dá)體系，先構(gòu)建能表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明利用了可自市售購(gòu)得的表達(dá)載體pET32a(+)，將編碼人PTH(1-34)的核苷酸序列插入到該市售載體所含的硫氧還蛋白(Trx)基因的下游，所得表達(dá)載體被命名為pET-PTH(1-34)。優(yōu)選所述步驟(1)是在如下條件下完成的將含有表達(dá)載體pET-PTH(1-34)的大腸桿菌BL21(DE3)在至少一種選自LB、TB和M9CA的培養(yǎng)基中發(fā)酵；發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵液pH為6.5-7.5以及發(fā)酵溶氧DO≥30％。當(dāng)培養(yǎng)至OD600＝4.0時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.3-1.0mM的IPTG，開始誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵誘導(dǎo)時(shí)間為3-5小時(shí)。
在所述步驟(2)中，按1mg腸激酶切割5mg融合蛋白的比例加入腸激酶。優(yōu)選該酶切步驟在下列條件下完成1mg/mL融合蛋白，50mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM CaCl2，約25℃，酶切約20小時(shí)。


圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PTH(1-34)酶切鑒定圖譜。圖1中，各泳道代表的內(nèi)容為M、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(λDNA/Hand III，分子量大小標(biāo)于圖左)；1、重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)；2、重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)經(jīng)EcoR I酶切；3、pET32a(+)質(zhì)粒DNA經(jīng)Pst I酶切；4、重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)經(jīng)Pst I酶切。
圖2為重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)正向測(cè)序結(jié)果。
圖3為重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)反向測(cè)序結(jié)果。
圖4為重組子的表達(dá)篩選的SDS-PAGE電泳圖。圖4中，M、為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(分子量大小標(biāo)于圖左)；泳道1顯示的是誘導(dǎo)前取樣結(jié)果；泳道2-9分別顯示的是1-8號(hào)重組子誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
圖5工程菌發(fā)酵表達(dá)后的SDS-PAGE電泳分析。圖5中，M、為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶分子量大小(kDa)標(biāo)于圖左；泳道1顯示的是收集的發(fā)酵菌體；泳道2顯示的是IPTG誘導(dǎo)前菌體。
圖6rhPTH(1-34)各步純化樣品的SDS-PAGE電泳分析。圖6中，1、發(fā)酵菌體；2、破菌后離心上清；3、鎳離子螯合親和層析樣品；4、融合蛋白的腸激酶酶切樣品；5、Q Sepharose High Performance柱層析樣品；6、反相柱層析樣品；7、SP Sepharose Fast Flow柱層析樣品；M、為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶分子量大小(kDa)標(biāo)于圖右。
圖7是rhPTH(1-34)的RP-HPLC分析圖譜。
圖8是rhPTH(1-34)的質(zhì)譜分析圖譜。
圖9是顯示市售的pET32a(+)質(zhì)粒圖譜。
圖10是人工合成的含有rhPTH(1-34)編碼序列的DNA序列。其中，5′-CTG和AAG-3′為酶切保護(hù)堿基，GGTACC為Kpn I酶切位點(diǎn)，GACGACGACGACAAG為腸激酶酶切位點(diǎn)編碼序列，TCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTC為編碼PTH的序列，TAA為終止密碼子，GTCGAC為Sal I酶切位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
為了獲得本發(fā)明的融合蛋白，需要先構(gòu)建能夠表達(dá)該融合蛋白的表達(dá)載體。該表達(dá)載體可以通過將編碼hPTH(1-34)的DNA序列插入到受啟動(dòng)子控制下的Trx基因的下游而構(gòu)建完成。如背景技術(shù)部分所述，Trx是一種普遍存在于酵母、細(xì)菌、動(dòng)物、植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)也是目前常用的hPTH(1-34)表達(dá)宿主例如酵母或大腸桿菌的內(nèi)源蛋白。該蛋白可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，Trx能與許多蛋白發(fā)生相互作用，增強(qiáng)融合蛋白的溶解性，從而減少了包涵體的形成(Thomas，J.G.等，Appl Biochem Biotechnol.66(3)197-238)。在本發(fā)明中可以使用完整的Trx，也可以使用Trx的一部分或其突變體，所選取的部分或突變體具有與Trx相同或相似的空間結(jié)構(gòu)和功能。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以是酵母的表達(dá)載體，也可以是大腸桿菌的表達(dá)載體。所述的hPTH(1-34)可以是完全人工合成的新DNA序列，也可以為已經(jīng)公開的編碼hPTH(1-34)的DNA序列。為了將編碼hPTH(1-34)的DNA序列插入Trx基因的下游，優(yōu)選使用已經(jīng)含有所述Trx基因或其部分序列的克隆載體。這種載體也可通過購(gòu)買得到。例如，pET32a(+)就是這樣一種載體。pET32a(+)可以高效表達(dá)含有109個(gè)氨基酸的Trx-Tag的多肽，外源基因插入其多克隆位點(diǎn)后，產(chǎn)生的融合蛋白含有可剪切的Trx-Tag和S-Tag序列，便于檢測(cè)和純化。
為了在后續(xù)步驟中將hPTH(1-34)從融合蛋白上釋放下來，優(yōu)選在編碼hPTH(1-34)的DNA序列的5’端引入編碼蛋白水解酶識(shí)別位點(diǎn)核苷酸序列。所述蛋白水解酶可以為凝血酶、Kex2-600、脯氨酸內(nèi)肽酶、腸激酶。腸激酶是優(yōu)選的，因?yàn)樵撁改軌蛟谧R(shí)別位點(diǎn)的C末端水解融合蛋白。因此，更優(yōu)選在編碼腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列的后面直接跟著hPTH(1-34)的編碼序列，這樣腸激酶可以將最終所需的hPTH(1-34)完整、準(zhǔn)確地釋放出來。如果采用人工合成編碼hPTH(1-34)的DNA序列的話，為了便于克隆，在人工合成所述DNA序列時(shí)，還需要在該序列的5’端和3’端引入適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)。為了便于日后的純化，可在融合蛋白的適當(dāng)位置上插入便于純化的序列，例如優(yōu)選在所用Trx的N端或C端插入His-Tag。市售的載體pET32a(+)中不但具有Trx的基因，而且在該基因的上游還具有His-Tag。
本發(fā)明還提供了一種大規(guī)模、高效的hPTH(1-34)表達(dá)方法。為了大量制備hPTH(1-34)，需要將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主的感受態(tài)細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，以收獲融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中采用的宿主細(xì)胞是可市售得到的E.coli BL21(DE3)。該細(xì)胞的胞內(nèi)和胞間周質(zhì)蛋白酶均已失活，這樣當(dāng)進(jìn)行外源蛋白的可溶性表達(dá)時(shí)，不容易被宿主菌的蛋白酶水解，因而可穩(wěn)定存在。
為了在發(fā)酵期間進(jìn)行有效的控制，通常建議可誘導(dǎo)型的表達(dá)載體。pET系列載體就是這樣一類大腸桿菌表達(dá)載體。該載體是利用T7噬菌體RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)構(gòu)建的E.coli表達(dá)載體，即在E.coliBL21(DE3)或JM109(DE3)的染色體上整合了T7 RNA聚合酶基因，而且受lac操縱子調(diào)控。所以，當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，導(dǎo)致T7RNA聚合酶的合成，從而誘導(dǎo)了pET載體上目的基因的表達(dá)。T7噬菌體RNA/啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的啟動(dòng)活性，而且在載體多克隆位點(diǎn)序列上游有強(qiáng)核蛋白體結(jié)合序列(rbs)，所以，pET載體可以高效地表達(dá)外源蛋白。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)宿主的不同而異。在選用大腸桿菌為宿主，以pET系列載體為表達(dá)載體的情況下，發(fā)酵培養(yǎng)基可以為L(zhǎng)B、TB、M9CA等，優(yōu)選為TB培養(yǎng)基。發(fā)酵溫度為30-40℃，優(yōu)選為37℃；pH6.5-7.5，優(yōu)選為pH 7.0；溶氧DO≥30％，誘導(dǎo)用的IPTG終濃度為0.3-1.0mM，優(yōu)選為0.5mM；誘導(dǎo)時(shí)間為3-5h，優(yōu)選為3.5-4h。在上述適宜的條件下，可使發(fā)酵液濃度達(dá)到30g細(xì)菌濕重/L發(fā)酵液以上，目的融合蛋白表達(dá)量在25％以上。
為了得到rhPTH(1-34)多肽純品，首先用高壓勻漿破菌法將胞內(nèi)分泌的融合蛋白溶于裂解液中；然后用鎳離子螯合親和層析進(jìn)行初步純化，將初步純化后的樣品用腸激酶酶切，酶切后的樣品用陰離子交換柱進(jìn)行層析，收集穿透蛋白溶液，將穿透蛋白溶液過反相層析柱，最后將樣品過陽離子交換柱除去有機(jī)溶劑得到rhPTH(1-34)蛋白原液。利用該方法，70升發(fā)酵液可得約2000g濕重菌體，通過純化可得到約3.5g rhPTH(1-34)多肽原液。
臨床前藥效學(xué)試驗(yàn)、毒理學(xué)試驗(yàn)研究表明本發(fā)明制備的rhPTH(1-34)皮下注射具有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成作用，其安全劑量為15μg/kg。因此，本發(fā)明制備的rhPTH(1-34)用于人體治療是安全有效的。
本發(fā)明將hPTH(1-34)與親水性的Trx一段序列融合，該融合蛋白在胞內(nèi)以可溶形式表達(dá)，避免了工藝復(fù)雜且收率較低的包涵體復(fù)性步驟。融合蛋白N端含His-Tag，可以通過Ni2+鰲和親和層析快速、簡(jiǎn)便、高效地純化，大大提高了回收率。Trx與hPTH(1-34)間存在腸激酶切割位點(diǎn)，保證純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶切割可以釋放完整的hPTH(1-34)。采用腸激酶將表達(dá)出的融合蛋白酶解，并利用一系列的柱層析將目的蛋白hPTH(1-34)純化出來，純度可達(dá)到99％以上，甚至達(dá)到100％。
以下將以大腸桿菌作為宿主的例子，通過具體實(shí)施例的方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，但應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例不以任何形式限制本實(shí)施例1表達(dá)hPTH(1-34)的DNA序列的設(shè)計(jì)和人工合成根據(jù)hPTH(1-34)氨基酸序列(見表1)，依據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，人工合成優(yōu)化的適合大腸桿菌表達(dá)的DNA序列。合成hPTH(1-34)基因時(shí)，在該基因的5′端引入Kpn I酶切位點(diǎn)GGTACC，在3′端引入終止密碼TAA和Sal I酶切位點(diǎn)GTCGAC，并在5′端引入的Kpn I酶切位點(diǎn)后面加上腸激酶酶切識(shí)別位點(diǎn)的編碼序列GACGACGACGACAAG，得到序列1(見圖10)。為便于以后的亞克隆，將合成基因克隆到pUC18上，用于保存該合成的DNA序列。質(zhì)粒pUC18含有與質(zhì)粒pET32a(+)相同的Kpn I和Sal I酶切位點(diǎn)。
表1、hPTH(1-34)密碼子使用表


注氨基酸序列是從hPTH多肽的N端開始標(biāo)記的。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程以下分子克隆技術(shù)操作方法，如無特別說明，均參照文獻(xiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(黃培堂等譯，[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社，2002)。DNA操作中所用的DNA提取試劑盒(UNIQ-10)、DNA膠回收試劑盒(UNIQ-10)及連接試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。克隆載體pUC18、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas LifeScience公司。表達(dá)載體pET32a(+)，大腸桿菌TOP10及BL21(DE3)均購(gòu)自Novagen公司。克隆用大腸桿菌宿主為TOP10，表達(dá)用大腸桿菌宿主為BL21(DE3)。BL21(DE3)基因型為hsdS gal(λcIts857ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 geneI)。BL21(DE3)帶有T7 RNA多聚酶基因，在IPTG的誘導(dǎo)下T7 RNA多聚酶大量產(chǎn)生，因而開啟了外源基因的表達(dá)，可使外源基因高效表達(dá)。
1.準(zhǔn)備目的基因片段用DNA抽提試劑盒提取含有hPTH(1-34)編碼序列的pUC18質(zhì)粒DNA，用Kpn I/Sal I雙酶切，在1％的瓊脂糖凝膠電泳分離小片段，切下含有130bp左右片段的凝膠，用凝膠DNA回收試劑盒回收130bp左右片段，電泳驗(yàn)證后備用。
2.準(zhǔn)備表達(dá)載體片段用DNA抽提試劑盒提取pET32a(+)質(zhì)粒DNA，用Kpn I/Sal I雙酶切，1％的瓊脂糖凝膠電泳分離大片段，切下含有大片段的凝膠，用凝膠DNA回收試劑盒回收大片段，電泳驗(yàn)證后備用。
3.構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)將1、2準(zhǔn)備好的DNA片段按不同的體積比(2/8、3/7、4/6、5/5)混合均勻，用T4DNA連接酶在16℃連接30min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有100μg/ml Amp的LB瓊脂糖平板(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl，2％瓊脂))，37℃培養(yǎng)過夜。
4.重組子篩選挑取10個(gè)菌落，在5ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，用DNA抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA。分別用EcoR、PstI對(duì)所提取的DNA酶切，然后進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子。由于EcoR I在pET32a(+)中為單一酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組子時(shí)已被Kpn I/Sal I雙酶切除去，故重組子不能被EcoR I切割；而pET32a(+)中的Pst I單一位點(diǎn)不在多克隆區(qū)，且rhPTH(1-34)基因中含一個(gè)Pst I位點(diǎn)，故用Pst I酶切pET32a(+)載體質(zhì)粒時(shí)，得到分子量為5.9kb的單一DNA片段，而重組質(zhì)粒用Pst I酶切應(yīng)該出現(xiàn)1.2kb和4.7kb左右的兩條DNA片段(請(qǐng)參見圖1)。酶切分析結(jié)果表明，10個(gè)菌落均為正確的重組子，正確的重組質(zhì)粒命名為pET-PTH(1-34)。
5.質(zhì)粒pET-PTH(1-34)的序列測(cè)定將重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，正向測(cè)序結(jié)果見圖2，反向測(cè)序結(jié)果見圖3。其中編碼融合蛋白Trx-含有(His)6和腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的連接肽-甲狀旁腺激素1-34肽的核苷酸序列如下ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtacc TCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTCTAA。其中，非黑體大寫字母組成的序列是Trx編碼序列，小寫字母組成的序列是含有Trx-含有(His)6和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)的連接肽編碼序列，帶有下劃線的斜體字部分是(His)6編碼區(qū)，雙劃線部分是腸激酶識(shí)別位點(diǎn)編碼區(qū)，黑體大寫字母組成的序列是hPTH(1-34)DNA序列，斜體的TAA是終止密碼子。測(cè)序證明構(gòu)建的工程菌中的hPTH(1-34)DNA序列與理論設(shè)計(jì)完全一致。另外，需要說明的是，在上述融合蛋白的編碼序列中，小寫字母所組成的連接肽編碼序列中(His)6-Tag和腸激酶編碼區(qū)對(duì)于獲得純的hPTH(1-34)是必需的序列，因此小寫字母中的其它序列是可有可無的，也可替換為其它有功能的序列。
實(shí)施例3工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)用重組質(zhì)粒pET-PTH(1-34)DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，所得到的即為用于表達(dá)rhPTH(1-34)融合蛋白的基因工程菌。挑取8個(gè)單菌落，在5ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中37℃培養(yǎng)過夜，以1/100的體積轉(zhuǎn)接于50ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，剩余菌液用15％甘油分裝凍存。OD600達(dá)到0.5時(shí)，加入IPTG到終濃度0.5mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4小時(shí)后取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。與未誘導(dǎo)的對(duì)照相比，誘導(dǎo)后的重組子均有預(yù)期分子量20kDa左右的表達(dá)帶，表達(dá)量均為全菌蛋白的25％以上。取產(chǎn)量最高菌6號(hào)作為工程菌，命名為BL21(DE3)-PTH(1-34)，置甘油中保存。蛋白表達(dá)篩選電泳圖見附圖4。
實(shí)施例4工程菌BL21(DE3)-PTH(1-34)的發(fā)酵取表達(dá)Trx-hPTH的工程菌BL21(DE3)-PTH(1-34)的甘油菌種1支(1mL)，接種到400mL LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中，37℃，200rpm搖瓶培養(yǎng)15h，得活化種子。取活化種子按10％接種量接于3.5L TB培養(yǎng)基中(1.2％蛋白胨，2.4％酵母膏，0.4％甘油，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4)(5L B.Braun發(fā)酵罐)，37℃培養(yǎng)4h。然后將此培養(yǎng)液按5％接種量接于70L TB培養(yǎng)基中(100L B.Braun發(fā)酵罐)進(jìn)行發(fā)酵，溫度為37℃、pH7.0、DO≥30％，培養(yǎng)至OD600＝4.0時(shí)開始誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)用的IPTG終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。在此條件下，菌體密度為30g細(xì)菌濕重/L發(fā)酵液，目的融合蛋白表達(dá)量25％。結(jié)果請(qǐng)參見圖5。
實(shí)施例5rhPTH(1-34)的純化采用連速流離心機(jī)(CEPA Z41，B.Braun公司，德國(guó))收集實(shí)施例4中的發(fā)酵菌體，用緩沖液A(10mM PBS(磷酸鹽緩沖液)，500mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0)懸浮，然后用APV-1000高壓勻漿機(jī)(APV Co.丹麥)破菌，將胞內(nèi)分泌的融合蛋白溶于緩沖液A中，9000rpm離心30min。取上清液依次采用以下方法對(duì)rhPTH(1-34)進(jìn)行純化1.鎳離子螯合親和層析將高壓勻漿破菌上清液上于用緩沖液A平衡的鎳離子螯合親和層析(Chelating Sepharose Fast Flow，GE Healthcare)柱，緩沖液A充分洗滌后，用緩沖液B(10mM PB，500mM NaCl，200mM咪唑，pH8.0)洗脫，收集洗脫峰，得到融合蛋白樣品。
2.融合蛋白的酶切配制酶切反應(yīng)液，其組成如下1mg/mL融合蛋白，50mMTris-HCl(pH8.0)，1mM CaCl2，腸激酶(按1mg腸激酶切割5mg融合蛋白的比例加入腸激酶)。25℃酶切20小時(shí)。
3.陰離子交換柱層析將酶切后蛋白溶液上樣于用緩沖液C(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡的Q Sepharose High Performance(GE Healthcare)層析柱。rhPTH(1-34)理論等電點(diǎn)為8.29，在pH8.0時(shí)帶正電荷，不與陰離子交換柱結(jié)合，雜蛋白則因帶負(fù)電荷而與陰離子交換柱結(jié)合。收集穿透液，可得到純度為95％以上的rhPTH(1-34)蛋白樣品。
4.反相柱層析選用反相柱Source 15RPC(GE Healthcare)對(duì)按上文所述經(jīng)離子交換柱層析純化得到的rhPTH(1-34)蛋白樣品進(jìn)行精細(xì)純化，用24-64％乙醇作梯度洗脫，在40-60％乙醇時(shí)出現(xiàn)rhPTH(1-34)蛋白洗脫峰，純度達(dá)到98％以上。
5.陽離子交換柱層析將反相柱洗脫的樣品用緩沖液D(10mM PB，pH7.0)稀釋后，上于經(jīng)緩沖液D平衡的SP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)層析柱，緩沖液D充分洗滌后，用含400mM NaCl的緩沖液D洗脫，得到純度大于99％的rhPTH(1-34)蛋白。
用SDS-PAGE電泳分析各步純化效果(見圖6)。
試驗(yàn)例1 rhPTH(1-34)的檢定1、SDS-PAGE純度分析采用Tris-Tricine SDS-PAGE系統(tǒng)(郭堯君，蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)，科學(xué)出版社，1999)進(jìn)行非還原型電泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)掃描測(cè)定，rhPTH(1-34)純度為100％(見圖6中第7道)。
2、RP-HPLC純度分析用HPLC法測(cè)定蛋白質(zhì)和肽類的純度，準(zhǔn)確度高并且其保留時(shí)間亦可作為定性的一個(gè)指標(biāo)。層析柱為Delta-Pak C18 5μm 3.9×150(Waters Co.)，緩沖液A(0.1％三氟乙酸(TFA)，在95％dH2O和5％乙腈中)到緩沖液B(0.1％TFA，在95％和5％dH2O中)線性梯度洗脫70min，流速1ml/min，220nm紫外檢測(cè)。分析結(jié)果表明，上述工藝制備的rhPTH(1-34)的HPLC圖譜為單一峰，純度為100％。RP-HPLC分析結(jié)果見圖7。
3、N、C末端氨基酸序列分析采用Edman降解法測(cè)定按照實(shí)施例5純化得到rhPTH(1-34)N-末端15個(gè)氨基酸序列為Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu；采用羧肽酶Y法測(cè)定rhPTH(1-34)C-末端3個(gè)氨基酸序列為His-Asn-Phe。N、C末端氨基酸序列分析結(jié)果與理論序列完全相同，說明我們制備的rhPTH(1-34)一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的。
4、rhPTH(1-34)的質(zhì)譜分析采用Finnigan公司的LCQ-Classic質(zhì)譜儀對(duì)純化的rhPTH(1-34)進(jìn)行質(zhì)譜分析，測(cè)得rhPTH(1-34)的分子量為4117.5Da(見圖9)。與rhPTH(1-34)的理論值(4118.8Da)一致。
5、內(nèi)毒素及熱原質(zhì)試驗(yàn)按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》(2000年版)中“生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)規(guī)程”的規(guī)定，用鱟試劑法檢測(cè)所制備的rhPTH(1-34)樣品的內(nèi)毒素含量不高于10EU/20μg rhPTH(1-34)。按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》(2000年版)“生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程”的規(guī)定，采用家兔法測(cè)定其熱原質(zhì)為陰性。
試驗(yàn)例2 PTH活性測(cè)定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種UMR-106-01細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)，接種量為1～2×105個(gè)細(xì)胞/mL，100μL/孔，37℃，5％CO2孵育過夜。用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，加入培養(yǎng)基(含20mM Hepes，0.1％牛血清白蛋白，0.2mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，Sigma)，pH7.4)180μL，再加入20μL用該培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的hPTH(1-34)及其標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自WHO生物制品標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)室(NIBSC))，同時(shí)設(shè)含與不含IBMX的對(duì)照，都作雙復(fù)孔，37℃，5％CO2孵育45min。去除培養(yǎng)基，每孔加200μL 0.1N HCl，溫育30min，充分裂解細(xì)胞，取上清采用cAMP(low pH)KIT(R&D公司，Cat No.DE0355)測(cè)定cAMP值。數(shù)據(jù)利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行處理，并按下式公式計(jì)算結(jié)果 結(jié)果表明，我們制備的rhPTH(1-34)與WHO對(duì)照品具有相同的生物活性，其比活性大于1.0×105U/mg rhPTH(1-34)。
試驗(yàn)例3主要藥效學(xué)試驗(yàn)應(yīng)用大鼠卵巢摘除(ovanceclomiwd，OVX)方法建立模擬原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥模型，給予rhPTH(1-34)治療8周后觀察骨量、骨生物力學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量和骨代謝相關(guān)血、尿生化指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)其治療效果。試驗(yàn)結(jié)果表明1)卵巢摘除12周組大鼠的子宮濕重明顯較假摘卵組降低，骨量(股骨與腰椎骨密度)與骨生物力學(xué)性能(股骨三點(diǎn)彎曲載荷、腰椎壓縮載荷)均較假摘卵組明顯減少，表明雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松大鼠模型成立；2)rhPTH(1-34)對(duì)OVX誘發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠具有明顯治療效果。rhPTH(1-34)治療8周，低劑量(10μg/Kg)組即對(duì)模型骨質(zhì)疏松大鼠的股骨、腰椎骨量(干重、灰重、骨密度)生物力學(xué)性能(股骨三點(diǎn)彎曲最大載荷、腰椎壓縮最大載荷)和腰椎骨小梁面積顯示明顯提高作用，并隨治療劑量增加而提高。
3)本實(shí)驗(yàn)中觀察到rhPTH(1-34)注射4h時(shí)血鈣磷有增高和下降波動(dòng)改變，24h后正常。
因此，rhPTH(1-34)有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成作用，對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠具有明顯治療效果。
序列表<110>深圳華生元基因工程發(fā)展有限公司<120>制備人甲狀旁腺素1-34的方法<130>FI-060213-59<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>117<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>腸激酶識(shí)別位點(diǎn)—人甲狀旁腺素1-34肽的編碼序列<400>1gacgacgacg acaagtccgt ttccgaaatc cagctgatgc acaacctggg taaacacctg60aactccatgg aacgtgttga atggctgcgt aaaaaactgc aggacgttca caacttc 117<210>2<211>576<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>編碼含有硫氧還蛋白和人甲狀旁腺素1-34的融合蛋白的核苷酸序列<400>2atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caagtccgtt480tccgaaatcc agctgatgca caacctgggt aaacacctga actccatgga acgtgttgaa540tggctgcgta aaaaactgca ggacgttcac aacttc 57權(quán)利要求
1.一種制備hPTH(1-34)的方法，該方法包括如下步驟(1)使能表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，所述融合蛋白從N端到C端的序列為硫氧還蛋白-(His)6-腸激酶識(shí)別位點(diǎn)-甲狀旁腺激素1-34肽；(2)用鎳離子螯合親和層析對(duì)步驟(1)得到的融合蛋白進(jìn)行純化；以及(3)將步驟(2)純化得到的融合蛋白用腸激酶酶切，以將甲狀旁腺激素1-34肽從所述融合蛋白中釋放下來。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，還進(jìn)一步包括(4)對(duì)步驟(3)酶切得到的混合物用陰離子交換柱進(jìn)行層析，收集穿透蛋白溶液；以及(5)使步驟(4)收集得到的穿透蛋白溶液過反相層析柱。
3.權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中所述融合蛋白中的腸激酶識(shí)別位點(diǎn)-甲狀旁腺激素1-34肽由下列核苷酸序列編碼GACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTC。
4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述步驟(1)中使用的表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體pET-PTH(1-34)，表達(dá)用宿主為大腸桿菌BL21(DE3)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，所述步驟(1)是在如下條件下完成的將含有表達(dá)載體pET-PTH(1-34)的大腸桿菌BL21(DE3)在至少一種選自LB、TB和M9CA的培養(yǎng)基中發(fā)酵；發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵液pH為6.5-7.5以及發(fā)酵溶氧DO≥30％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中當(dāng)培養(yǎng)至OD600＝4.0時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.3-1.0mM的IPTG，開始誘導(dǎo)表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述的發(fā)酵誘導(dǎo)時(shí)間為3-5小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的制備方法其中培養(yǎng)基為TB，發(fā)酵溫度為約37℃，發(fā)酵液pH為約7.0，IPTG的終濃度為約0.5mM，誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間為約4小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法其中在步驟(2)中，按1mg腸激酶切割5mg融合蛋白的比例加入腸激酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述酶切步驟是在下列條件下完成的1mg/mL融合蛋白，50mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM CaCl2，約25℃，酶切約20小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備重組人甲狀旁腺素1－34[rhPTH(1－34)]的方法，該方法包括如下步驟(1)使能表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，所述融合蛋白從N端到C端的序列為硫氧還蛋白－(His)
文檔編號(hào)C07K19/00GK1916172SQ20061007421
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者楊立明, 張仁懷, 劉社際, 陽勇, 何凱, 黃碧蓮, 劉德林 申請(qǐng)人:深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司