專利名稱：在輕度低溫下能促進(jìn)基因表達(dá)的序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在輕度低溫下促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的輕度低溫應(yīng)答元件。
背景技術(shù)：
利用生物技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出許多種藥物和分析用試劑，例如單克隆抗體、生長因子和凝血因子。
一般來說，在10-15℃的低溫下，促進(jìn)了異源重組蛋白正確折疊并抑制了蛋白酶降解蛋白(Baneyx，F(xiàn).，In vitro folding of recombinantproteins in Escherichia coli.In Manual of industrial microbiology andbiotechnology，第2版，(Demain，A.L.Davis，J.E.，Altas，R.M.，等，編輯)ASM Press，Washingtonn D.C.，pp.551-1999)。因此，當(dāng)利用細(xì)菌生產(chǎn)重組蛋白時，在低于20℃的低溫而非37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在該情況下，由于在低溫下蛋白合成通常減少，可能出現(xiàn)期望蛋白產(chǎn)量降低。通過在期望蛋白的表達(dá)載體中使用冷激蛋白CspA基因啟動子和CspA mRNA的5`非翻譯區(qū)(UTR)解決了該難題(Baneyx，F(xiàn).和Mujacic，M.，Cold-inducible promoters for heterologous protein expression，Methods in Molecular Biology，205，1-18，2001)。
但是，細(xì)菌與哺乳動物細(xì)胞中的翻譯后修飾明顯不同。特別是對于藥物而言，糖基化狀態(tài)對治療效果是很重要的。因此，哺乳動物細(xì)胞，特別是中國倉鼠細(xì)胞系，被用于制備蛋白質(zhì)藥物。為降低細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)成本，必須要增加蛋白產(chǎn)量。通常在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，但是其缺點在于，因為細(xì)胞在快速生長后死亡，則細(xì)胞存活并產(chǎn)生期望蛋白所持續(xù)的時間就短。因此，通過添加細(xì)胞生長抑制劑、表達(dá)細(xì)胞周期抑制基因p27、在輕度低溫(30-32℃)下培養(yǎng)等以實現(xiàn)抑制細(xì)胞生長并使細(xì)胞存活更長時間的嘗試(參見Schatz SM等，Biotechnol。Bioeng，2003，Nov.433-438)。
其中，在輕度低溫下培養(yǎng)具有如下特征1)較在37℃下培養(yǎng)，細(xì)胞存活及產(chǎn)生重組蛋白的時間更長；
2)蛋白水解酶活性降低以減少期望蛋白降解；3)糖基化和同工蛋白質(zhì)譜(isoprotein pattern)類似于在37℃下培養(yǎng)的那些，且唾液酸化較在37℃下培養(yǎng)的更好；4)可能改善如細(xì)菌中的期望蛋白的正確折疊(Kaufmann H，MazurX，Marone R，Bailey JE，F(xiàn)ussengger M.，Biotech Bioeng.，2001-3-20，72(6)592-602；Yoon SK，Song JY，Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003-5-5，82(3)289-98)。
就重要的重組蛋白產(chǎn)量而論，由于細(xì)胞存活時間延長，總產(chǎn)量通常增加。但是，每單位時間每細(xì)胞蛋白的單位生產(chǎn)率由于未知的原因而改變，可能取決于細(xì)胞類型、期望蛋白類型等等。許多情況下單位生產(chǎn)率較在37℃下更低，難以解決(Kaufmann H，Mazur X，Marone R，Bailey JE，F(xiàn)ussenegger M.，Biotech Bioeng.，2001 Mar.20，72(6)592-602；Yoon SK，Song JY，Lee GM.，Biotech Bioeng.，2003 May.5，82(3)289-98)。因為基因表達(dá)調(diào)控機制不同于細(xì)菌，所以細(xì)菌的冷激蛋白CspA啟動子和CspA mRNA的5`非翻譯區(qū)(UTR)不能用于哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明的目的是提供一種在低溫下增加每單位時間每細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)和總產(chǎn)量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本申請發(fā)明人之前發(fā)現(xiàn)并報道了冷激蛋白Cirp(冷誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白質(zhì))，其基因組DNA序列如SEQ ID No1所示，以及Rbm3(RNA結(jié)合基序蛋白3)(Fujita J.，Cold shock response in mammalian cells，J.Mol Microbiol.Biotechnol.，1999年11月，1(2)243-55)。
現(xiàn)在，本發(fā)明是在這些蛋白基因啟動子的5`端發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)調(diào)控序列的基礎(chǔ)上做出的。
也就是說，本發(fā)明涉及一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包含核苷酸序列X1ccccX6X7X8其中，X1是t，g或a；X6是g，a或c；X7是c，a，或t；以及X8是c，a和t，或與該序列互補的核苷酸序列。
在此術(shù)語“輕度低溫”指15-36℃的溫度，優(yōu)選30-34℃的溫度以及最優(yōu)選32℃的溫度。術(shù)語“輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件”指在輕度低溫下能特異性促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在基因轉(zhuǎn)錄中起輕度低溫特異性增強子的作用。
本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在單獨使用時能起作用。但是，優(yōu)選使用連接的2-50個，優(yōu)選2-10個相同或不同的元件。當(dāng)元件連接使用時，相同或不同的元件可直接連接，或通過任何數(shù)量和類型的核苷酸連接。在本說明書中連接的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件稱為“輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子”。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子并不涉及與啟動子的距離。
本發(fā)明涉及一種包含上述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子的載體。
本發(fā)明涉及上述載體所轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明涉及一種篩選輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別優(yōu)選在32℃的培養(yǎng)溫度下，能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因；2)克隆基因的一部分，從該基因轉(zhuǎn)錄起始位點5’的1.5kb到第一外顯子3`末端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動子插入表達(dá)報道基因的載體中；4)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞；5)在輕度低溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報道基因，來鑒定能在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；和6)對于能促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，截短要被插入載體的核苷酸序列，以鑒定對于在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄必需的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及一種改良輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一個或兩個核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動子整合入表達(dá)報道基因的載體中；3)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞；4)在輕度低溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報道基因，來鑒定在輕度低溫下能促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
發(fā)明人在Cirp基因mRNA的5`非翻譯區(qū)(UTR)中還發(fā)現(xiàn)了能在輕度低溫下促進(jìn)翻譯的基因表達(dá)調(diào)控序列。
更確切地說，本發(fā)明涉及一種輕度低溫翻譯調(diào)控元件，包含核苷酸序列actcg cgcct tagga agctt gggtg tgtgt ggcgc gctgt cttcc cgctcgcgtc aggga cctgc ccgac tcagc ggctg cc(SEQ ID NO23)，置于編碼序列的5`端和啟動子的3`端。
在此術(shù)語“輕度低溫翻譯調(diào)控元件”指在輕度低溫下特異性促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯的元件。當(dāng)輕度低溫翻譯調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄時，其形成mRNA的5`非翻譯區(qū)(UTR)。
在此術(shù)語“輕度低溫應(yīng)答元件”指的是輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和/或輕度低溫翻譯調(diào)控元件。
發(fā)明效果本發(fā)明在輕度低溫下可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。
附圖簡述

圖1是pCAT3基礎(chǔ)載體示意圖。MCS是多克隆位點。CAT是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼序列。PA是來自SV40病毒的多腺苷酸化信號。Ampr是氨芐青霉素抗性基因。
圖2是pCAT3啟動子載體示意圖。MCS是多克隆位點。SV40啟動子是來自SV40病毒的啟動子。CAT是氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼序列。PA是來自SV40病毒的多腺苷酸化信號。Ampr是氨芐青霉素抗性基因。
圖3是pcDNA 3.1(+)載體(Invitrogen)示意圖。MCS是多克隆位點。熒火蟲熒光素酶編碼序列被插入到多克隆位點的EcoRV和XbaI之間。Cirp mRNA的5`非翻譯區(qū)(UTR)的互補DNA(cDNA)被插入到多克隆位點的KpnI和BamHI之間。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的例子包括，但不限于，tcccc gcc(SEQ ID NO2)，gcccc gcc(SEQ ID NO9)，acccc gcc(SEQ IDNO10)，tcccc gtc(SEQ ID NO11)，tcccc gct(SEQ ID NO12)，tcccc gaa(SEQ ID NO21)，ggcgg gga(SEQ ID NO22)，和ggggg gga(SEQ ID NO7)(i)制備輕度低溫應(yīng)答元件可制備本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子和輕度低溫翻譯調(diào)控元件，例如，通過氨基磷酸鹽(phosphoroamidide)法的固相合成法或膦酸氫鹽法的固相合成法，使用四種帶有保護(hù)基團(tuán)的脫氧核糖核苷酸(參見，例如，OligonucleotideSynthesisA practical Approach，IRL Press，35-81，83-115(1984)；J.Org.Chem.，49，2139(1984)；Tetrahedron Lett.，27，469(1986)；TetrahedronLett.，22，1859-1862；Tetrahedron Lett.，21，719-722；J.Am.Chem.Soc.，103，3185-3191(1981).)現(xiàn)今可容易地用可商購的DNA合成儀(例如，Applied Biosystem制造的)合成它們。
ii)要使用的啟動子原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優(yōu)選哺乳動物啟動子和病毒啟動子。優(yōu)選的啟動子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。
(iii)編碼序列要表達(dá)的基因沒有限制，編碼任何蛋白的核苷酸序列都可使用。
(iv)要使用的載體將本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，啟動子和編碼所要表達(dá)的蛋白的編碼序列連接在一起并插入載體中。可以使用原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表達(dá)載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)、pCAT3啟動子載體(Promega)和pSV2-neo載體。
(v)要使用的宿主細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-2OS，Huh-7，Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如COS-7和Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3，Balb/3T3，B-6，Hepal-6和中國倉鼠細(xì)胞系，例如CHO。
轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有DNA(載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
(vi)培養(yǎng)條件宿主細(xì)胞在輕度低溫下培養(yǎng)。無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。可使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的代表例子是補充有10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)。
本發(fā)明涉及一種篩選輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別是優(yōu)選在32℃的培養(yǎng)溫度下，能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因；2)克隆基因的一部分，從距該基因轉(zhuǎn)錄起始位點5’的1.5kb到第一外顯子3`末端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動子插入表達(dá)報道基因的載體中；4)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞；5)在輕度低溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報道基因，來鑒定能在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；和6)對于能促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，截短要被插入載體的核苷酸序列以鑒定對于在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄必需的核苷酸序列。
通過在37℃和輕度低溫下，優(yōu)選在32℃下，培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞并應(yīng)用DNA芯片(微陣列)或cDNA扣除法(參見，例如，Moody，D.E.，Genomic techniquesAn overview of methods for study of geneexpression，J.Anim.Sci.，79(E.Suppl.)E128-E135.2001)于從其中抽提的RNA，可獲得在輕度低溫下能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因。
原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優(yōu)選哺乳動物啟動子和病毒啟動子。優(yōu)選的啟動子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。
報道基因是編碼能容易地被檢測的蛋白的基因，包括但不限于，熒光素酶基因和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因?？墒褂迷思?xì)胞和真核細(xì)胞載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)，pCAT3啟動子載體(Promega)和pSV2-neo載體。
用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-2OS，Huh-7，Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如COS-7和Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3，Balb/3T3，B-6，Hepal-6和中國倉鼠細(xì)胞系，例如CHO。
轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有DNA(載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。可使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的代表例子是補充有10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)。
如果報道基因產(chǎn)物在輕度低溫下，優(yōu)選在32℃下的表達(dá)量，與37℃下的表達(dá)量的比率大于1，則核苷酸序列可以是在輕度低溫下能特異性促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的增強子。截短在輕度低溫下能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列以獲得本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件?？赏ㄟ^確認(rèn)與該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件互補的核苷酸序列在輕度低溫下也可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄來確認(rèn)它是增強子。
本發(fā)明涉及一種改良輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一個或兩個核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動子整合入表達(dá)報道基因的載體中；3)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞；4)在輕度低溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報道基因，來鑒定在輕度低溫下能促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一個或兩個核苷酸為其他核苷酸所取代的突變的核苷酸可通過上述方法合成。
原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優(yōu)選哺乳動物啟動子和病毒啟動子。優(yōu)選的啟動子的例子包括，但不限于，小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。
報道基因是編碼能容易地被檢測的蛋白的基因，包括熒光素酶基因和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。可使用原核細(xì)胞和真核細(xì)胞載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)，pCAT3啟動子載體(Promega)和pSV2-neo載體。
用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-2OS，Huh-7，Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如COS-7和Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3，Balb/3T3，B-6，Hepal-6和中國倉鼠細(xì)胞系，例如CHO。
轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有DNA(載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基?？墒褂貌溉閯游锛?xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的代表例子是補充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)(Invitrogen)。
如果報道基因產(chǎn)物在輕度低溫下，優(yōu)選在32℃下的表達(dá)量，與37℃下的表達(dá)量的比率大于1，則該核苷酸序列可以是在輕度低溫下能特異性促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的增強子?？赏ㄟ^確認(rèn)與該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件互補的核苷酸序列在輕度低溫下也可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄來確認(rèn)它是增強子。
本發(fā)明也涉及一種輕度低溫翻譯調(diào)控元件，包含核苷酸序列actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc(SEQ ID NO23)，置于編碼序列的5`端和啟動子的3`端。
原核啟動子，真核啟動子和病毒啟動子可用作為啟動子。優(yōu)選哺乳動物啟動子和病毒啟動子。優(yōu)選的啟動子的例子包括小鼠胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)啟動子，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和SV40啟動子。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，以及啟動子可與本發(fā)明的輕度低溫翻譯調(diào)控元件一起使用。
可使用原核細(xì)胞和真核細(xì)胞載體。優(yōu)選的載體的例子包括，但不限于，pCMV(Invitrogen)，pCAT3啟動子載體(Promega)和pSV2-neo載體。
用載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。優(yōu)選使用哺乳動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞的例子是人細(xì)胞系，例如293，293T，U-2OS，Huh-7，Hela細(xì)胞；猴細(xì)胞系，例如COS-7和Vero細(xì)胞；小鼠細(xì)胞系，例如NIH/3T3，Balb/3T3，B-6，Hepal-6和中國倉鼠細(xì)胞系，例如CHO。
轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。例如，在磷酸鈣法中，將含有DNA(載體)的氯化鈣溶液逐滴加到攪拌的磷酸溶液中。形成含有DNA-磷酸鈣的精制沉淀物。當(dāng)該溶液添加到宿主細(xì)胞時，DNA-磷酸鈣沉淀物通過吞噬作用進(jìn)入宿主細(xì)胞使得DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
無需使用專用培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基?？墒褂貌溉閯游锛?xì)胞培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的代表例子是補充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)(Invitrogen)。
實施例實施例1假定Cirp基因轉(zhuǎn)錄起始位點的“actcgc...”的“a”為+1，跨越了核苷酸-970(轉(zhuǎn)錄起始位點5’的970個核苷酸)至+56(在第一外顯子內(nèi))的Cirp基因，及其5`端缺失的片段(見表1)被插入pCAT3-基礎(chǔ)載體(Promega)的多克隆位點中。該載體帶有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因作為報道基因。
接著將2.5-5.0μg/35-mm培養(yǎng)皿的質(zhì)粒與0.5-1.0μg/35-mm培養(yǎng)皿的CDM8-LacZ(其為β-半乳糖苷酶表達(dá)載體并用于校正轉(zhuǎn)染效率)共轉(zhuǎn)染入人細(xì)胞系293。
將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分成兩組。一組在32℃下培養(yǎng)，另外一組在37℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)基是補充有10％FCS的D-MEM。
36小時后，離心回收細(xì)胞并制備全細(xì)胞裂解物。使用CAT ELISA試劑盒(Roche Diagnostic)測定每一溫度下所產(chǎn)生的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)蛋白的量，使用β-半乳糖苷酶分析試劑盒(Stratagene)測定β-半乳糖苷酶活性。每一片段的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性如表1所示。將CAT蛋白質(zhì)量除以β-半乳糖苷酶活性計算轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。
表1Cirp基因組5`端片段的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性

轉(zhuǎn)染后24小時的數(shù)據(jù)類似于該結(jié)果。
從這些數(shù)據(jù)中，可以看到基因轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動子可能存在于基因組基因的-220到0，響應(yīng)于32℃促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的增強子可能存在于-340到-220。
實施例2除使用人細(xì)胞系293T，U-2 OS或Huh-7，猴細(xì)胞系COS-7或小鼠細(xì)胞系NIH/3T3，Balb/3T3，B-6或Hepal-6代替人細(xì)胞系293作為宿主細(xì)胞外，重復(fù)實施例1，獲得類似的結(jié)果。
實施例3制備多種來自Cirp基因-340到-240核苷酸的缺失突變體并插入到pCAT3啟動子載體(Promega)的多克隆位點中(圖2)。該載體帶有SV40啟動子。如實施例1所述，在用磷酸鈣法使用人293細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA的基因轉(zhuǎn)移后，在32℃下測定轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。不含有插入片段的pCAT3啟動子載體作為陰性對照(模擬物)。
所示的是轉(zhuǎn)染后36個小時的數(shù)據(jù)。將CAT蛋白質(zhì)量除以β-半乳糖苷酶活性計算轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性(表2)。
表2Cirp基因組5`端片段的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性

從這些結(jié)果中可以看到在2個基因組片段-310到-290和-260到-220中存在增強子，其在32℃應(yīng)答中促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。比較了這兩個片段中的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)tcccc gcc(SEQ ID NO2)的共有序列。
實施例4將含有上述發(fā)現(xiàn)的tcccc gcc的10個核苷酸的三個分子串聯(lián)形成序列ttccc cgccg ttccc cgccg ttccc cgccg(SEQ ID NO3)。如實施例3所述，將該序列插入pCAT3啟動子載體的多克隆位點中。作為陰性對照，使用不含有插入片段的pCAT 3啟動子載體(模擬物)。作為陽性對照，使用含有Cirp基因組的-340到-220位作為增強子的pCAT3啟動子載體和含有SV40增強子的pCAT3啟動子載體。轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞后24小時獲得的結(jié)果示于表3中。
表3

實施例5如果一個序列是增強子，則反向序列也應(yīng)當(dāng)是有效的。將含有cggcg gggaa(SEQ ID NO4)的10個核苷酸的三個分子串聯(lián)形成序列cggcg gggaa cggcg gggaa cggcg gggaa(SEQ ID NO5)，所述cggcggggaa序列是包含tcccc gcc的序列的反向序列。將該序列插入到pCAT3啟動子載體的多克隆位點中，進(jìn)行與實施例4類似的試驗。
在這種情況下，32℃/37℃的比是3.83，證實了該序列為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。
實施例6通過將在小鼠Cirp基因組中發(fā)現(xiàn)的8個核苷酸t(yī)cccc gcc(SEQ IDNO2)的兩個分子串聯(lián)所獲得的序列tcccc gcctc cccgc c(SEQ IDNO6)插入到pCAT3啟動子載體的多克隆位點中，進(jìn)行與實施例4類似的試驗。在這種情況下，32℃/37℃的比是2.51，證實了該序列為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。
實施例7將發(fā)現(xiàn)位于人RBM基因組(GenBank NT 011568)轉(zhuǎn)錄起始位點5`端約260核苷處的8個核苷酸ggggg gga(SEQ ID NO7)的三個分子串聯(lián)形成序列g(shù)gggg ggagg ggggg agggg ggga(SEQ ID NO8)。將該序列插入到pCAT3啟動子載體的多克隆位點中，進(jìn)行與實施例4類似的試驗。
在這種情況下，32℃/37℃的比是2.52，證實了該序列為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。
實施例8將含有在上述發(fā)現(xiàn)的序列tcccc gcc(SEQ ID NO2)中的一個或兩個堿基取代(見下表)的10個核苷酸的3個分子串聯(lián)形成序列。將該序列插入到與實施例4相同的載體中，并用該載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。24小時后，測定CAT/LacZ，各突變體的輕度低溫轉(zhuǎn)錄促進(jìn)(增強)活性示于下表中，當(dāng)使用不含有插入片段的pCAT3啟動子載體時，規(guī)定32℃/37℃的比為1。
表4帶有一個堿基取代的突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(jìn)(增強)活性

表5帶有2個堿基取代的突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(jìn)(增強)活性

第一位堿基被G或A取代的，第七位堿基被T取代的，以及第八位堿基被T取代的突變體與野生型序列相比具有類似的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。盡管與野生型序列相比，第六位堿基被A或C取代降低了活性，但它們也顯示了明顯的活性。第七和第八位堿基被AA取代的突變體78具有與野生型相同程度的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。
因此，序列tcccc gcc是顯示轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的序列，且序列t(或g或a)ccccg(或a或c)c(或a或t)c(或a或t)可具有轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。
因為它們是增強子，所以與它們互補的序列，例如與tcccc gcc(SEQID NO2)互補的ggcgg gga(SEQ ID NO22)也可以使用。
實施例9將從pGL3-基礎(chǔ)質(zhì)粒(Promega)上切除下的螢火蟲熒光素酶cDNA插入到帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen)的多克隆位點(EcoR和XbaI之間)中。然后，將相應(yīng)于Cirp mRNA+1到+82核苷酸的cDNA片段(小鼠Cirp轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)“act...”的“a”假定為+1)，
actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc(SEQ ID NO23)插入到pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen)的多克隆位點(KpnI和BamHI之間)中。在KpnI和BamHI之間無插入片段的質(zhì)粒作為對照。
接著將2.5-5.0μg/35-mm培養(yǎng)皿的這些質(zhì)粒與0.5-1.0μg/35-mm培養(yǎng)皿的pRLTK質(zhì)粒(其為renila熒光素酶表達(dá)載體，用于修正每一轉(zhuǎn)染的效率)共轉(zhuǎn)染入已培養(yǎng)一天的人細(xì)胞系293。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分成兩組。一組在32℃下培養(yǎng)，另外一組在37℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)基為補充有10％FCS的D-MEM。
36小時后，離心回收細(xì)胞，制備全細(xì)胞裂解物。使用雙重?zé)晒馑孛笀蟾嬖噭┖?Promega)測定螢火蟲和renila熒光素酶活性。每一片段的翻譯促進(jìn)活性示于表6中。將螢火蟲熒光素酶活性除以renila熒光素酶活性來計算翻譯促進(jìn)活性。
表6Cirp mRNA的5`非翻譯區(qū)(UTR)的翻譯促進(jìn)活性

上述結(jié)果表明當(dāng)Cirp mRNA的5`UTR存在于載體中時，與不存在其的載體相比，在32℃下所產(chǎn)生的蛋白的量增加到1.7倍，該量與在37℃下用不含Cirp mRNA的5`UTR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所產(chǎn)生的量相當(dāng)。
序列表<110>FUJITA.Jun<120>在輕度低溫下能促進(jìn)基因表達(dá)的序列<130>664998<150>JP2004-084987<151>2004-03-23<160>23<170>Patentln Ver.2.1<210>1<211>2520<212>DNA<213>小鼠<400>1ttgtcagcgc aagataggca agtgctgcat agacattcag gcaaacaccc atatacataa 60aattaaaata cacttttttg ttttgttctc tgtggtgtgt gtgtttaaga aggctaagga 120tgtagcttgg tttagccact acttagaatt ctgcagtgag gggttagggg tgtggctcaa 180ggatagaaat ccttccatgg catgcttgag actctggggt ctcttctaga aaatgcaggt 240acacattgaa aagagtggtg ttttgccatc tgtgtggtaa tgtacacctg gttggagatg 300ggcagaaatc agggttcaaa tggtcgttat acagcaggtt gagatttgta ggaaaactga 360gttgggtgca ggaaatctag agaaaatctt gacattgtga ttaatactgg gatggaaatt 420ttagggctga tcttatggag tgtccttggg gtccaaagaa ctgttaggca gcagttgtat 480tgggaggtac ttttggacta gagtaattcg gtggttttgg tttcatgagc aagaacggag 540aagaggggca agcaagatga ctcagtggat aaagctgctt gtggctaatc ctgagtatga 600tccttaggac ctacatgatg gaaggagaga ctccatctgt cttctggctt cacaaatgcg 660cctcagttaa ataactgtaa ttaaatatta aaagaaaaaa aagaacataa aagtgttgag 720tcgatgagtc aaggttggag ccatatttgg gagtctcatt gaggtagcaa aagctctttg 780ttccccgccg caggacaaac gggtcgggaa cgcggaagtg ggtcagctcc gcctccaaat 840cagctgtccc cgcctcctag tcgctagcgg gcggggggtg ggggggaaaa atgcggccag 900gaaagattcc agccaatcaa aacactcagc gcctccgcgc ggactagggc aaagccaacg 960gagtcccgcc cctccaccga ggcgcagatg ccgaatctaa ggcgtcggat tggtcagcgc 1020ggcgtggtgg gcgggttaag gggcgtggct ccaggagtgg agtatatcag gcgggactct 1080tgcgctcccc ctcgcactcg cgccttagga agcttgggtg tgtgtggcgc gctgtcttcc 1140cgctcgcgtc agggacctgc ccgactcagc ggtgagggct ctggcggcac cggctctgag 1200gggcccgggg cggcgggcgg cctgtgactc tcgggcgagg cggagccgca gcggcacgcc 1260cctgggactt gggggcgggc ccgggttgga gtccgccccg ccggcggcga ggcgggcagc 1320gggacactgg ggcctcacgc ttgtcggagg gcgtcctcca ccgcgcgtca tccccgggcc 1380gaggccgacc ttaacggtgg gctttttttt tttttttttt ttttgtaaaa tggccgccgc 1440gatgctttga aaagcttcgc cggcgaaatg gcgggactgc cgagtgcccg gatggaatgg 1500cgcagggtgc gcgcttggcg catgcgctgc tccgggggcg gggcgctcct acctccaaag 1560tccggttgtc cgcagatgtg gagctgtgtc gcgtgcgacc cttttactcc agctggctct 1620
acctcggttt tctcttccct tgtggttcca cgtggggaac aaaaaagcac atgtaggctt 1680gaatgttgtc cttttgtgcc ccaagtttat tgcccccaag gtagactggt ttcgtggtat 1740agtggactta ttttccaagt tgtcggttgc caataatgac tttgtctaga taccacgccc 1800ctttcgctag ccacgcctct tgggccaacc tcctttctcc cttgagtcca tcgtgcaaaa 1860acatttctct agtccttggc tgagtaagcg aggcatccca caactggcac acctccagac 1920agtaccctaa aagcgtattt cagtagtgaa gtttctctgg cccaacaact ctatgctagt 1980gagggtaggc agtcactatc atttctgtcc ccaaccacac acatttgcaa agtgaccatg 2040ccattttgat cctaaccttg ggattctctg gccaggtgta atcaagacct agaatcattt 2100aaggttagcc tcagctgtat gacaaagtat tccatatgcc tttgggatga taaaagcaaa 2160aagagttccc tcttgtgtag cccagaaggg tattgaactt gctgtgcaat tgtatttggt 2220tttggattct gttcctttgc ctccaactcc cacaggctag gcgagatggg tatttgtttt 2280gaaacagtct ctcaaactga tccacagtgt cctttttctc attgatcttc ccatctcggt 2340gacttgaatg gctggatgag aggtgtgaaa gaaaccccac ttgaagctga ggtttcccag 2400taagaccatg gggtcctctc cccccacccc catgcttccc ccctagcccc ccccccccag 2460tttctttgtg tactcctggt tatcctggac tctctttgca gaccaggctg gcctcaaaac 2520<210>2<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>2tccccgcc 8<210>3<211>30<212>DNA<213>小鼠<400>3ttccccgccg ttccccgccg ttccccgccg 30<210>4<211>10<212>DNA<213>小鼠<400>4cggcggggaa 10<210>5<211>30<212>DNA<213>小鼠<400>5cggcggggaa cggcggggaa cggcggggaa 30<210>6<211>16<212>DNA<213>小鼠
<400>6tccccgcctc cccgcc 16<210>7<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>7ggggggga 8<210>8<211>24<212>DNA<213>小鼠<400>8gggggggagg gggggagggg ggga24<210>9<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>9gccccgcc 8<210>10<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>10accccgcc 8<210>11<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>11tccccgtc 8<210>12<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>12tccccgct 8<210>13<211>8<212>DNA
<213>小鼠<400>13tccccacc8<210>14<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>14tccccccc8<210>15<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>15gacccgcc8<210>16<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>16taaccgcc8<210>17<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>17tcaacgcc8<210>18<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>18tccaagcc8<210>19<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>19tcccatcc8<210>20<211>8
<212>DNA<213>小鼠<400>20tcccctac 8<210>21<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>21tccccgaa 8<210>22<211>8<212>DNA<213>小鼠<400>22ggcgggga 8<210>23<211>92<212>DNA<213>小鼠<400>23actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctc gcgtcaggga 60cctgcccgac tcagcggctg ccatggcatc ag 9權(quán)利要求
1.一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包含核苷酸序列X1ccccX6X7X8其中，X1是t，g，或a；X6是g，a或c；X7是c，a，或t；以及X8是c，a和t，或與該核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是tccccgcc(SEQ ID NO2)。
3.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是gccccgcc(SEQ ID NO9)。
4.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是accccgcc(SEQ ID NO10)。
5.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是tccccgtc(SEQ ID NO11)。
6.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是tccccgct(SEQ ID NO12)。
7.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是tccccgaa(SEQ ID NO21)。
8.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是ggcgggga(SEQ ID NO22)。
9.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中核苷酸序列是ggggggga(SEQ ID NO7)。
10.一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，其中相同或不同的權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件被連接。
11.一種輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，其中相同或不同的權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通過其他核苷酸被連接。
12.一種載體，包含權(quán)利要求1-9任一項的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或權(quán)利要求10或11的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。
13.一種用權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞。
14.一種篩選輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)提供在輕度低溫下，特別是在32℃的培養(yǎng)溫度下，能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基因；2)克隆該基因的一部分，從該基因轉(zhuǎn)錄起始位點5’方向的1.5kb到第一外顯子3’末端；3)將所克隆的核苷酸序列和合適的啟動子插入表達(dá)報道基因的載體中；4)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞；5)在輕度低溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報道基因，來獲得能在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列；和6)截短要被插入載體的該核苷酸序列以鑒定對于在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄必需的核苷酸序列。
15.一種改良輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的方法，包括1)合成突變的核苷酸序列，其中用其他核苷酸取代輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中的一個或兩個核苷酸；2)將突變的核苷酸序列與合適的啟動子整合入表達(dá)報道基因的載體中；3)用所述載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞；4)在輕度低溫或37℃下培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)報道基因，來鑒定在輕度低溫下促進(jìn)報道基因轉(zhuǎn)錄所必需的核苷酸序列。
16.一種輕度低溫翻譯調(diào)控元件，包含核苷酸序列actcgcgcct taggaagctt gggtgtgtgt ggcgcgctgt cttcccgctcgcgtcaggga cctgcccgac tcagcggctg cc(SEQ ID NO23)，置于編碼序列的5`端和啟動子的3`端。
17.一種包含權(quán)利要求16的輕度低溫翻譯調(diào)控元件的載體。
18.一種用權(quán)利要求17的載體轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的一個目的是提供一種在使用哺乳動物細(xì)胞的重組DNA方法中增加蛋白產(chǎn)量的方法。當(dāng)輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其包含至少一個核苷酸序列X
文檔編號C12N5/10GK1938424SQ20058000957
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月23日
發(fā)明者藤田潤 申請人:藤田潤