專利名稱：一種用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
志賀氏菌是食品中常見的致病菌，是導(dǎo)致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌。志賀氏菌屬中各菌株都有強烈的內(nèi)毒素，作用于腸壁，使通透性增高，從而促進毒素的吸收。繼而作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)，引起臨床上一系列毒血癥癥狀，如發(fā)熱、神志障礙，甚至中毒性休克。其毒素破壞粘膜，形成炎癥、潰瘍，呈現(xiàn)典型的痢疾膿血便。毒素作用于腸壁植物神經(jīng)，使腸道功能紊亂，腸蠕動共濟失調(diào)和痙攣，尤其直腸括約肌最明顯，因而發(fā)生腹痛、里急后重等癥狀。志賀氏菌病常為食物爆發(fā)型或經(jīng)水傳播，與其相關(guān)的食品包括色拉(土豆、金槍魚、蝦、通心粉、雞)、生的蔬菜、奶和奶制品、禽、水果、面包制品、漢堡包和有鰭魚類。志賀氏菌在擁擠和不衛(wèi)生條件下能迅速傳播，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于人員大量集中的地方如餐廳、食堂。食源性志賀氏菌流行的最主要原因是從事食品加工行業(yè)人員患菌痢或帶菌者污染食品，食品接觸人員個人衛(wèi)生差，存放已污染的食品溫度不適當(dāng)?shù)?。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局的2002年第25和26號令中明確規(guī)定志賀氏菌為必檢項目。目前對該菌的檢測，國標(biāo)和行標(biāo)多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)的方法，這些方法步驟煩瑣，費時費力，一般至少要耗時4-6天，且由于多種干擾因素的影響，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性容易降低，給食品的進出口帶來了非常不利的影響。因此，建立一種更加快速、準(zhǔn)確、操作簡便的致病菌檢測方法勢在必行。
目前國內(nèi)外應(yīng)用于食源性病原菌檢測的分子生物學(xué)技術(shù)，主要分為三類普通PCR技術(shù)、熒光PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)?；蛐酒椒z測效率高，但技術(shù)還不成熟，假陽性率和假陰性率都很難控制，而且成本較高，目前還處于研究階段。普通PCR方法技術(shù)成熟，也最早用于食源性病原菌的檢測，但需要對PCR產(chǎn)物進行后處理，極易導(dǎo)致PCR產(chǎn)物污染，而且也有一定的非特異性擴增。熒光PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在擴增反應(yīng)體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點外，它還具有以下優(yōu)點(1)特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實時監(jiān)測熒光，無須PCR產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴增的對數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠。(4)可實現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計針對性內(nèi)標(biāo)，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)?；?、自動化及聯(lián)網(wǎng)管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何細菌的核酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列。
基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列包括由上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCCAGAGGGAGAACCAGTC組成的引物對，以及該引物對的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針SfipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在PCR擴增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。


圖1利用引物對SFipaHpf771/SfipaHpr863和探針SfipaHpb802檢測志賀氏菌陽性樣品的熒光PCR擴增圖。
具體實施例方式
1.引物和探針設(shè)計通過分別對所有已知的志賀氏菌基因組序列進行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段(志賀氏菌ipaH基因，其序列見附錄)，設(shè)計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下上游引物SFipaHpf771AAATGCGTTTCTATGGCGTGT下游引物SFipaHpr863CCCCAGAGGGAGAACCAGTC探針SfipaHpb802AGCAAATGACCTCCGCACT2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得取志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液1ml進行10倍梯度稀釋，選取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6個稀釋度作為系列陽性模板，分別提取基因組核酸，再分別用上述檢測序列區(qū)域中的最長的擴增片段的引物和探針進行PCR擴增，并取其中Ct值24-27之間者作為以后反應(yīng)體系優(yōu)化時的模板。
2.1 引物濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中，將志賀氏菌的引物濃度分別從0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.2μmol/L。
2.2 鎂離子濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中其它條件不變的前提下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增，經(jīng)過多次重復(fù)實驗選定2.5mmol/L為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。
2.3 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化 通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優(yōu)化實驗結(jié)果，選定2U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。
2.4 dNTPs濃度的優(yōu)化 通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選0.2mmol/L作為試劑盒反應(yīng)體系中dNTPs的使用量。
2.5 探針濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中，將志賀氏菌的探針濃度分別從0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.1μmol/L。
利用上述引物和探針進行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的熒光PCR反應(yīng)體系為40μl體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見表1。
表1 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

注a.在熒光PCR反應(yīng)體積不同時，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。
b.使用的儀器不同，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。
3.儀器檢測通道的選擇在進行熒光PCR反應(yīng)時，應(yīng)對所用儀器中反應(yīng)管熒光信號的收集進行設(shè)置，選擇的熒光檢測通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報告基團一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。
4.PCR條件選擇如下95℃2min，1個循環(huán)；95℃5sec，60℃40sec，40個循環(huán)。
5.檢測步驟(1)選取引物和探針；(2)制備待測模板，可采用酚-氯仿法提取各種來源樣品中志賀氏菌的基因組DNA；(3)反應(yīng)體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測。
6.實施例選取引物對SFipaHpf771/SfipaHpr863和探針SfipaHpb802，將待檢的志賀氏菌培養(yǎng)液用酚-氯仿法抽提基因組DNA。具體步驟如下(1)將待檢的志賀氏菌增菌液(約1ml)加入1.5ml的離心管中，12000rpm離心5分鐘，去上清。
(2)加入DNA裂解液700ul，充分混勻重懸，水浴煮沸5分鐘。
(3)加入等體積的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混勻后離心，13000rpm離心5分鐘。
(4)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，13000rpm離心5分鐘。
(5)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心5分鐘。
(6)棄上清后用70％乙醇沖洗，13000rpm離心5分鐘，小心吸棄上清，倒置晾干。
(7)在干燥后的離心管中加入50ul DNA溶解液充分混勻，作為DNA模板待用。在40ul熒光PCR反應(yīng)體系中，加入以上提取的志賀氏菌基因組DNA 2ul，根據(jù)前述PCR反應(yīng)條件進行熒光PCR檢測。經(jīng)檢測，若待檢培養(yǎng)液中含有志賀氏菌則顯示陽性擴增曲線，其檢測靈敏度可達到1000個拷貝/ml；若待檢培養(yǎng)液中不含有志賀氏菌則無擴增信號，提示上述引物對和探針具有良好的靈敏度和特異性。
7.本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達1000個拷貝/ml，說明其具有良好的靈敏度。
(2)本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有志賀氏菌的檢測樣本均無擴增信號，說明其具有良好的特異性。
(3)由于本發(fā)明采用志賀氏菌的內(nèi)源基因ipaH作為擴增的目的基因，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。
(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測方法，整個反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進行，避免了其他核酸檢測方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結(jié)果；由于對PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。
附錄志賀氏菌ipaH基因atgattaaat caaccaatat acaggcaatc ggttctggta ttatgcatca aataaacaat 60atatactcgt taactccatt tcctttacct atggaactga ctccatcttg taatgaattt 120tatttaaaag cctggagtga atgggaaaag aacggtaccc caggcgagca acgcaatatc 180gccttcaata ggctgaaaat atgtttacaa aatcaagagg cagaattaaa tttatctgag 240ttagatttaa aaacattacc agatttaccg cctcagataa caacactgga aataagaaaa 300aacctattaa cacatctccc tgatttacca ccaatgctta aggtaataca tgctcaattt 360aatcaactgg aaagcttacc tgccttaccc gagacgttag aagagcttaa tgcgggtgat 420aacaagataa aagaattacc atttcttcct gaaaatctaa ctcatttacg ggttcataat 480aaccgattgc atattctgcc actattgcca ccggaactaa aattactggt agtttctgga 540aacagattag acagcattcc cccctttcca gataagcttg aagggctggc tatggctaat 600aattttatag aacaactacc ggaattacct tttagtatga acagggctgt gctaatgaat 660aataatctga caacacttcc ggaaagtgtc ctgagattag ctcagaatgc cttcgtaaat 720gttgcaggta atccactgtc tggccatacc atgcgtacac tacaacaaat aaccaccgga 780ccagattatt ctggtcctcg aatatttttc tctatgggaa attctgccac aatttccgct 840ccagaacact ccctggctga tgccgtgaca gcatggttcc cggaaaacaa acaatctgat 900gtatcacaga tatggcatgc ttttgaacat gaagagcacg ccaacacctt ttccgcgttc 960cttgaccgcc tttccgatac cgtctctgca cgcaatacct ccggattccg tgaacaggtc 1020gctgcatggc tggaaaaact cagtgcctct gcggagcttc gacagcagtc tttcgctgtt 1080gctgctgatg ccactgagag ctgtgaggac cgtgtcgcgc tcacatggaa caatctccgg 1140aaaaccctcc tggtccatca ggcatcagaa ggccttttcg ataatgatac cggcgctctg 1200ctctccctgg gcagggaaat gttccgcctc gaaattctgg aggacattgc ccgggataaa 1260gtcagaactc tccattttgt ggatgagata gaagtctacc tggccttcca gaccatgctc 1320gcagagaaac ttcagctctc cactgccgtg aaggaaatgc gtttctatgg cgtgtcggga 1380gtgacagcaa atgacctccg cactgccgaa gccatggtca gaagccgtga agagaatgaa 1440tttaaggact ggttctccct ctggggacca tggcatgctg tactgaagcg tacggaagct 1500gaccgctggg cgcaggcaga agagcagaag tatgagatgc tggagaatga gtactctcag 1560agggtggctg accggctgaa agcatcaggt ctgagcggtg atacggatgc ggagagggaa 1620gccggtgcac aggtgatgcg tgagactgaa cagcagattt accgtcagtt gactgacgag 1680gtactggccc tgcgattgtc tgaaaacggc tcaaatcata tcgcataa 1730
序列表<110>深圳太太基因工程有限公司<120>一種用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物和探針序列<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1aaatgcgttt ctatggcgtg t 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccccagaggg agaaccagtc 20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3agcaaatgac ctccgcact19
權(quán)利要求
1.一種用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCCAGAGGGAGAACCAGTC組成的引物對，以及該引物對的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCCAGAGGGAGAACCAGTC。
3.一種用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針SfipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測志賀氏菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針SfipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT。
全文摘要
一種用于志賀氏菌核苷酸片段的PCR擴增引物和探針序列。引物序列包括由上游引物SFipaHpf771序列為AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列為CCCAGAGGGAGAACCAGTC組成的引物對，以及該引物對的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針SFipaHpb802序列為AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
文檔編號C12Q1/68GK1831141SQ20051012089
公開日2006年9月13日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者肖性龍, 張經(jīng)緯 申請人:深圳太太基因工程有限公司